ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ
УМАНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ
УНІВЕРСИТЕТ
КОВАЛЕНКО Тетяна Мефодіївна
УДК 631.461.5: 631.8: 633.32
ОПТИМІЗАЦІЯ ФУНКЦІОНУВАННЯ СИМБІОТИЧНОЇ СИСТЕМИ
RHIZOBIUM – TRIFOLIUM ПОЛІФУНКЦІОНАЛЬНИМ
КОМПЛЕКСОМ МІКРООРГАНІЗМІВ
03.00. 07 – мікробіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата сільськогосподарських наук
Умань – 2007
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в лабораторії екології ґрунтових мікроорганізмів
Інституту агроекології УААН
Науковий керівник – |
доктор сільськогосподарських наук,
старший науковий співробітник
Шерстобоєва Олена Володимирівна,
Інститут агроекології УААН,
завідувач лабораторії екології
ґрунтових мікроорганізмів |
Офіційні опоненти: |
доктор сільськогосподарських наук,
старший науковий співробітник
Малиновська Ірина Михайлівна,
Національний науковий центр
“Інститут землеробства УААН„,
головний науковий співробітник
лабораторії ґрунтової мікробіології;
кандидат сільськогосподарських наук,
старший науковий співробітник,
Мельничук Тетяна Миколаївна,
Південної дослідної станції Інституту
сільськогосподарської мікробіології УААН,
директор. |
Провідна установа – Харківський національний аграрний університет
ім. В.В. Докучаєва Мінагрополітики України,
кафедра генетики, селекції та насінництва, м. Харків
Захист відбудеться 23березня 2007 р. об 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 74.844.02 в Уманському державному аграрному університеті за адресою: вул. Інститутська, 1, м. Умань, Черкаська обл., Україна 20305.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Уманського державного аграрного університету за адресою: вул. Давиденка, 2, м. Умань.
Автореферат розісланий “20 лютого 2007 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради В.П. Карпенко
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Біологічна фіксація молекулярного азоту є єдиним економічно і енергетично доцільним шляхом постачання рослинам зв’язаного азоту, при якому неможливе забруднення оточуючого середовища.
Створення високоефективних азотофіксувальних систем рослина-мікроорганізм досягається інтродукцією в ризосферу рослин активних, конкурентноздатних, комплементарних до даної культури та сорту штамів мікроорганізмів азотфіксаторів. Інтродукція штамів мікроорганізмів з агрономічно-корисними властивостями дає можливість замінити менш активні за потрібною ознакою штами місцевих мікроорганізмів на споріднені, які більш активно взаємодіють з рослинами (Патика В.П. та ін., 2003; Dobereiner J. та ін., 1993).
Селекція високоактивних штамів бульбочкових бактерій та підбір комплементарних мікро- і макросимбіонтів ведеться для багатьох бобових культур, зокрема сої (Толкачов М.З., 2001; Evans H.J. and all., 1976), гороху (Антипчук А.Ф. и др., 1990; Lie T.A., 1981), люцерни (Петерсон Н.В., Коць С.Я., 1989), кормових бобів (Лісова Н.Ю. та ін., 1998) тощо. Для цих же культур розроблено шляхи посилення активності симбіотичної азотофіксації. Проте, для традиційної культури України - конюшини, яка є однією з основних кормових ку-льтур Лісостепу, подібних досліджень практично не проводилось.
Якщо ефективність інтродукції окремих мікроорганізмів: азотфіксаторів, фосформобілізаторів і продуцентів речовин з антибіотичною дією, вивчено доволі повно, то комплексне їх застосування, досліджено недостатньо. Зокрема, в літературі відсутні експериментальні дані з вивчення впливу інокуляції насіння конюшини поліфункціональним комплексом мікроорганізмів з метою підвищення її продуктивності.
Тому, селекція конкурентоспроможних і високоефективних штамів бульбочкових бактерій конюшини та дослідження з оптимізації умов функціонування симбіотичної системи Rhizobium leguminosarum bv. trifolii - Trifolium pratense L. поліфункціональними мікробними комплексами є актуальними.
Зв’язок роботи з науковими програмами. Дисертаційна робота виконана згідно тематичних планів Інституту агроекології УААН НТП “Агроекосистеми” за завданням “Теоретично обґрунтувати і застосувати на практиці методи сільськогосподарської технології для цілеспрямованого формування сталих агроекосистем” (№ державної реєстрації 0101U003296).
Мета і завдання досліджень. Мета досліджень - виділення високоактивних і конкурентноздатних штамів Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, створення препарату на їх основі і активізація функціонування азотофіксувальної симбіотичної системи Rhizobium - Trifolium застосуванням поліфункціонального комплексу мікроорганізмів в умовах Лісостепу.
Для досягнення поставленої мети вирішували наступні завдання:
Ш виділити високоактивні штами Rhizobium leguminosarum bv. trifolii з бульбочок конюшини лучної природних біоценозів;
Ш вивчити морфологічні, фізіолого-біохімічні і культуральні властивості нових штамів Rh. leguminosarum bv. trifolii;
Ш встановити вплив штамів Rh. leguminosarum bv. trifolii на формування і функціонування азотофіксувальної симбіотичної системи Rhizobium - Trifolium;
Ш дослідити вплив інокуляції насіння конюшини поліфункціональним комплексом мікроорганізмів на основні показники симбіозу на фоні спонтанної інокуляції ґрунтовими ризобіями;
Ш розробити технологію одержання препаративної форми найбільш активних штамів Rh. leguminosarum bv. trifolii;
Ш встановити вплив комплексу мікробних препаратів на продуктивність конюшини в умовах зони Лісостепу;
Ш визначити економічну і енергетичну ефективність застосування поліфункціонального комплексу біопрепаратів в умовах зони Лісостепу.
Об’єкт досліджень: симбіотична взаємодія конкурентноздатних і високоактивних штамів Rhizobium leguminosarum bv. trifoliі з Trifolium pratense L. та вплив поліфункціонального комплексу мікроорганізмів на формування і функціонування симбіотичної системи.
Предмет досліджень: штами бульбочкових бактерій конюшини, симбіотична система конюшини лучної сортів Анітра, Спарта і Носівська 5.
Методи досліджень:
- лабораторні – визначення морфологічних, культуральних і фізіолого-біохімічних властивостей, нодулюючої здатності та нітрогеназної активності нових штамів бульбочкових бактерій конюшини; вмісту хлорофілу та білка у зеленій масі конюшини; фітотоксичності ґрунту; чисельності мікроорганізмів основних еколого-трофічних груп у ризосфері конюшини;
- вегетаційні і польові – вивчення ефективності бактеризації насіння за кількісними та якісними показниками продуктивності конюшини лучної;
- математично-статистичний – оцінка достовірності отриманих результатів, розрахунково-порівняльні методи аналізу.
Наукова новизна одержаних результатів. Уперше було виділено конкурентноздатні у ґрунтах зони Лісостепу штами Rhizobium leguminosarum bv. trifolii 11 і 20, які утворюють високоактивну азотофіксувальну симбіотичну систему з Trifolium pratense L., що сприяє підвищенню її врожайності та якості одержаної кормової сировини. Встановлена властивість штамів Rh. leguminosarum bv. trifolii 11 і 20 регулювати ростові процеси конюшини, пригнічуючи або стимулюючи їх залежно від концентрації метаболітів у культуральній рідині, а також здатність штаму 20 пригнічувати ріст фітопатогенних грибів. На цей штам одержано Патент України.
Вперше показано, що застосування штамів Rh. leguminosarum bv. trifolii 11 і 20 у комплексі зі штамом фосформобілізівних бактерій Enterobacter nimipressuralis 32-3 та штамом-антагоністом фітопатогенних грибів Paenibacillus polymyxa 6М на фоні спонтанної інокуляції в умовах зони Лісостепу підвищує їхню нодуляційну і нітрогеназну активність, вміст хлорофілу у фітомасі, продуктивність конюшини та якість одержаної кормової сировини.
Вивчена динаміка і технологічні параметри росту штаму Rh. leguminosarum bv. trifolii 20 та створено препаративну форму, яка дає можливість зберігати життєздатність бактеріальних клітин у субстраті впродовж 5 місяців.
Практичне значення одержаних результатів. Виробництву рекомендовано препарат під конюшину на основі високоактивного штаму Rh. leguminosarum bv. trifolii 20, застосування якого у зоні Лісостепу дає змогу формувати високопродуктивну симбіотичну азотофіксувальну систему.
Для посилення позитивного ефекту нітрагінізації рекомендовано обробляти насіння конюшини перед посівом мікробним комплексом, який містить штами: бульбочкових бактерій конюшини Rh. leguminosarum bv. trifolii 20, фосформобілізівних бактерій Enterobacter nimipressuralis 32-3 і антагоніста фітопатогенних грибів Paenibacillus polymyxa 6М. Пропонований агроприйом сприяє підвищенню продуктивності рослин на 27 – 29% і якості кормів за вмістом білка на 2,8 - 3,2% порівняно зі спонтанною інокуляцією конюшини місцевими расами ризобій.
Результати експериментів впроваджені у виробництво на площі 5 га і використані при розробці методичних рекомендацій “Вирощування конюшини лучної із застосуванням мікробних препаратів”.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійною працею автора. Автором проаналізовано, відповідно обраної теми, наукову літературу, розроблено програму досліджень, проведені лабораторні, вегетаційні і польові дослідження. Проаналізовано та узагальнено одержані результати експериментів, які оформлені у наукові звіти, публікації та рекомендації виробництву. Показники продуктивності конюшини в польовому досліді Національного аграрного університету надані професором кафедри землеробства і гербології Маньком Юрієм Прокоповичем і доцентом Цюком Олексієм Анатолійовичем, за що висловлюємо їм щиру подяку.
Апробація дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на: Науково-практичній конференції молодих вчених “Стабілізація землекористування та сучасні агротехнології” (м. Київ, 24-26 листопада 2003 р.); Міжнародній науково-практичній конференції “Екологічна безпека об’єктів господарської діяльності” (м. Миколаїв, 2-4 червня 2004 р.); Х-му з’їзді Товариства мікробіологів України (м. Одеса, 15-17 вересня 2004 р.); П’ятій міжвузівській науково-практичній конференції аспірантів “Сучасна аграрна наука: напрями досліджень, стан і перспективи” (м. Вінниця, 17-19 травня 2005 р.); Науково-практичній конференції ”Біологічний азот в умовах євроінтеграції” (м. Київ, 2006 р.).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 наукових праць, з них: 7 статей у фахових виданнях, один патент, 2 методичні рекомендації, 4 тези доповідей.
Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 138 сторінках комп’ютерного набору, складається зі вступу, 6 розділів, 4 з яких є експериментальною частиною роботи, загальних висновків, рекомендацій виробництву, списку використаних 247 літературних джерел, з яких 55 – іноземною мовою.
Дисертацію ілюстровано 19 таблицями, 49 рисунками, містить 16 додатків.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури
У розділі розглянуто роль азотофіксувальних мікроорганізмів, особливо мікросимбіонтів бобових культур, у формуванні родючості ґрунту і продуктивності рослин, висвітлено вплив зовнішніх факторів і агроприйомів на активність процесу азотфіксації, доведено значення кормової культури конюшини для сільського господарства зони Лісостепу. На основі аналізу робіт вітчизняних і зарубіжних вчених, що досліджували функціонування бобово-ризобіальних симбіотичних систем, обґрунтовано вибір теми досліджень.
Матеріали й методи проведення досліджень
У дослідженнях використовували: азотофіксувальні бактерії виду Rhizobium leguminosarum bv. trifolii (далі: Rlt), що виділяли з кореневих бульбочок конюшини, та симбіотичну азотофіксувальну систему, яку вони утворювали з Trifolium pratense L. сортів Анітра, Спарта і Носівська 5; штам фосформобілізівних бактерій Enterobacter nimipressuralis 32-3, який продукує фітогормони (автор Л.О. Чайковська та ін.) та штам асоціативних азотофіксувальних бактерій Paenibacillus polymyxa 6M, який є антагоністом фітопатогенних грибів (автор М.К. Шерстобоєв та ін.).
Морфологію клітин ізолятів вивчали, використовуючи мікроскоп Laboval-4 з фазово-контрастним пристроєм фірми Carl Zeiss. Родову та видову належність бактерій встановлювали за здатністю утворювати бульбочки на коренях конюшини та за морфологічними, фізіолого-біохімічними і культуральними ідентифікаційними ознаками (Берджі, 1997).
Здатність нових штамів бульбочкових бактерій до продукції рістрегулюючих речовин, визначали згідно методичних рекомендацій під ред. Ю.М. Возняковської (Некоторые новые методы количественного учета почвенных микроорганизмов и изучения их свойств, 1982).
Антифунгальну активність штамів бульбочкових бактерій конюшини визначали методом зустрічних культур (Н.С. Егоров, 1957). Як тест-культури використовували фітопатогенні мікроміцети Trichotecium roseum, Bipolaris sorokiniana і Fusarium avenaceum, які одержали з колекції Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН.
Динаміку росту культур визначали за І.Л. Работновою (1989) при періодичному культивуванні у виробничих середовищах (Хотянович А.В., 1991). Технологічні параметри росту культур визначали за Г.А. Нікітіним (1981).
Виділення ізолятів з бульбочок конюшини, техніку відбору зразків ґрунту, виготовлення послідовних граничних розведень мікробних і ґрунтових суспензій в стерильній воді і посіви їх на поживні середовища, здійснювали загальноприйнятими у грунтовій мікробіології методами (Д.Г. Звягінцев, 1991).
Нітрогеназну активність визначали методом ацетиленредукції, за допомогою газового хроматографа “Chrom 5” з іонізаційно-полум’яним детектором (R. Hardy, 1968).
Вміст хлорофілу в зеленій фітомасі визначали спектрофотометричним методом згідно посібника Фотосинтез и биопродуктивность: методы определения(1989).
Біодіагностику фітотоксичності ризосферного ґрунту робили за інгібуванням проростання насіння на ґрунтових пластинках (Мочалов Ю.М. та ін., 1982).
Модельні і вегетаційні досліди проводили на агаровому, вермикулітному та піщаному субстратах, просочених мінеральним середовищем Прянишнікова (Гродзинський А.М., Гродзинський Д.М., 1973). Вирощували по 2 рослини у посудині ємністю 0,5 л у 8-разовому повторенні.
Польовий дослід з конюшиною лучною сорту Анітра проводили на базі Інституту кормів УААН у Вінницькій області. Ґрунт - сірий лісовий опідзолений середньосуглинковий, вміст гумусу – 2,06%, pH 4,8, гідролітична кислотність – 3,24 мг екв./100 г ґрунту, сума ввібраних основ – 19,2 мг екв./100 г ґрунту, вміст доступного для рослин азоту – 74,2 мг/кг ґрунту (за Корнфільдом), рухомого фосфору – 173 мг/кг ґрунту і обмінного калію – 88 мг/кг ґрунту (за Кірсановим).
Площа дослідної ділянки - 1,5 м2. Повторення досліду восьмиразове. Розміщення ділянок систематичне. Схема досліду: 1. Контроль (спонтанна інокуляція); 2. Rlt 11; 3. Rlt 16; 4. Rlt 18; 5. Rlt 20; 6. Rlt 11+E. nimipressuralis 32-3+P. polymyxa 6М; 7. Rlt 16+E. nimipressuralis 32-3+P. polymyxa 6М; 8. Rlt 18+E. nimipressuralis 32-3+P. polymyxa 6М; 9. Rlt 20+E. nimipressuralis 32-3+P. polymyxa 6М.
Польовий дослід проводили на базі Інституту агроекології УААН у Київській області. Ґрунт сірий лісовий опідзолений супіщаний, слабоглеюватий на перемитій карбонатній супіщаній морені. Вміст гумусу – 0,93%, pH 4,9; гідролітична кислотність – 2,49 мг-екв. /100 г ґрунту, сума ввібраних основ – 3,7 мг-екв./100 г ґрунту, вміст доступного для рослин азоту – 53 мг/кг ґрунту (за Корнфільдом), рухомого фосфору 281 мг/кг ґрунту і обмінного калію 152 мг/кг ґрунту (за Кірсановим).
Площа дослідної ділянки - 2,6 м2. Повторення – восьмиразове. Розміщення ділянок систематичне. Схема досліду: 1. Контроль (без інокуляції); 2. Rlt 11; 3. Rlt 20; 4. Rlt 11+E. nimipressuralis 32-3 + P. polymyxa 6М; 5. Rlt 20+ E. nimipressuralis 32-3 + P. polymyxa 6М (конюшина сорту Анітра); аналогічні варіанти: 6, 7, 8, 9, 10 (конюшина сорту Спарта).
Поліфункціональний комплекс біопрепаратів був переданий для обробки насіння конюшини у польовому досліді Національного аграрного університету з вивчення впливу різних систем удобрення на продуктивність рослин і екологічний стан ґрунту. Ґрунт – чорнозем типовий середньосуглинковий. Вміст гумусу в орному шарі – 4,38-4,53%, рН сольове – 6,9-7,3; ємність поглинання – 32 мг.-екв. на 100 г ґрунту. Площа дослідної ділянки 75 м2. Сорт конюшини лучної Носівська 5. Розміщення ділянок систематичне.
Закладку польових і вегетаційних дослідів, спостереження, обліки і відбори проб проводили за Б.А. Доспеховим (1985). Математичний аналіз експериментальних даних проводили за допомогою стандартних комп’ютерних програм Excel і “Статистика”.
Виділення штамів Rh. leguminosarum bv. trifolii та визначення їх властивостей
З бульбочок на коренях конюшини, яку відбирали в природних умовах і в агробіоценозах за кращими фенотиповими ознаками, було виділено 22 бактеріальні ізоляти. Дослідження здатності ізолятів утворювати бульбочки на коренях конюшини у модельних дослідах, вивчення їх морфологічних, культуральних і фізіолого-біохімічних властивостей дали змогу встановити таксономічну належність 15-ти ізолятів до виду Rhizobium leguminosarum bv. trifolii (Rlt).
Дослідження у вегетаційних дослідах показали, що інокуляція стерильного насіння штамами Rlt 11, 16, 18 і 20 спричиняє утворення на коренях конюшини найбільшої кількості активних бульбочок, а інокуляція штамами 11 і 20 обумовлює найбільший приріст сухої фітомаси, відповідно, на 91 і 96%.
Встановили, що метаболіти штамів Rlt 11 і 20 ідентично впливають на проростання насіння і ріст проростків конюшини. Так, обробка насіння нативною культуральною рідиною штамів Rlt 11 і 20 знижує схожість насіння, але обробка розведеною у 50 100 разів культуральною рідиною стимулює проростання насіння на 3 8% (рис. 1).
Рис. 1. Вплив метаболітів штаму Rlt 20 на схожість насіння конюшини лучної сорту Анітра
Також інокуляція насіння нативними культурами штамів Rlt 11 і 20 негативно впливає й на накопичення сухої маси проростків конюшини, а інокуляція розведеною у 100 – 250 разів культуральною рідиною збільшує масу проростків на 10,3 – 13,8%.
Методом зустрічних культур встановлено, що штам Rlt 20 володіє здатністю пригнічувати розвиток фітопатогенних мікроміцетів, і найбільш – збудника гельмінтоспоріозної гнилі Bipolaris sorokiniana.
Динаміка зберігання життєздатності Rh. leguminosarum bv. trifolii 20 на поверхні насіння
До закладки польових дослідів визначили динаміку титру життєздатних клітин Rlt 20 на поверхні насіння конюшини за умов моноштамової інокуляції і в складі поліфункціонального комплексу мікроорганізмів. В обох варіантах інокуляційне навантаження Rlt 20 складало 8,8 · 103 клітини на 1 насінину. У перші 2 години чисельність Rlt 20 знижується до 3,4 · 103 клітин на 1 насінині при моноінокуляції і до 5,9 · 103 клітин при інокуляції у складі комплексу (рис. 2).
Рис. 2. Динаміка чисельності Rh. leguminosarum bv. trifolii 20 на поверхні
насіння конюшини за умов моно інокуляції і у складі ПКМ
Уповільненню зниження титру бульбочкових бактерій на насінні при комплексній інокуляції сприяє можливо наявність в’язкого полісахаридного слизу штаму P. polymyxa 6М, який захищає від факторів, що пошкоджують бактеріальні клітини, та забезпечує утримання клітин на поверхні насіння. Отже, за 12 годин кількість клітин Rlt 20 на 1 насинині знижується до 0,9 · 103 при моноінокуляції і тільки до 2 · 103 клітин при інокуляції у складі комплексу.
Вплив інокуляції насіння бульбочковими бактеріями конюшини
та поліфункціональним комплексом мікроорганізмів на формування
і функціонування симбіотичної системи Rhizobium – Trifolium
У фазі кущення конюшини спостерігали суттєвий вплив штучної інокуляції штамами Rlt на нодуляцію на фоні спонтанної інокуляції місцевими расами бульбочкових бактерій конюшини. При штучній інокуляції насіння конюшини штамами Rlt 11, 16 і 18 кількість утворених бульбочок зростала на 6 – 7 од./рослину, а при застосуванні штаму Rlt 20 – на 11 од./рослину. Проте, на коренях рослин інокульованих штамами Rlt у складі поліфункціонального комплексу мікроорганізмів при застосуванні штаму 11 кількість бульбочок на 1 рослині ще зросла на 10 одиниць, штамів 16 і 18 – на 3 і 5, а штаму 20 – на 5 бульбочок порівняно з моноінокуляцією (табл. 1).
Таблиця 1
Нодулююча здатність штамів Rhizobium leguminosarum bv. trifolii щодо
конюшини лучної сорту Анітра (дослідне поле Інституту кормів УААН, 2004 р.)
Варіант | Кількість бульбочок
одиниць/рослину | %
Контроль | 16 ± 1,6 | 0
Rlt 11 | 23 ± 0,4 | 44
Rlt 16 | 23 ± 0,5 | 44
Rlt 18 | 22 ± 2,0 | 38
Rlt 20 | 27 ± 1,5 | 69
Rlt 11+E. nimipressuralis 32-3+P. polymyxa 6М | 33 ± 2,0 | 106
Rlt 16+E. nimipressuralis 32-3+P. polymyxa 6М | 26 ±0,9 | 63
Rlt 18+E. nimipressuralis 32-3+P. polymyxa 6М | 27 ± 1,6 | 69
Rlt 20+E. nimipressuralis 32-3+P. polymyxa 6М | 32 ± 1,0 | 100
НІР05 (Fф.>Fт.) | 2,62
Найбільш суттєвий позитивний вплив нових штамів Rlt на нітрогеназну активність бульбочок проявляється у фазі бутонізації рослин, коли активно фотосинтезує максимально розвинута вегетативна маса (табл. 2). У цей період нітрогеназна активність кореневих бульбочок конюшини зросла відповідно при інокуляції штамами Rlt 11 і 20 на 1,7 і 2,2 мкмоль С2Н4/рослину/годину. При застосуванні штамів Rlt 16 і 18 нітрогеназна активність бульбочок майже не відрізнялася від показників контрольних рослин. Бактеризація насіння конюшини штами Rlt у складі комплексу мікроорганізмів сприяла підвищенню нітрогеназної активності бульбочок при дії штамів 16 і 18, відповідно, на 1,9 і 2,1 мкмоль С2Н4 /росл./год., штаму Rlt 11 – на 2,9, а при застосуванні штаму Rlt 20 – на 4,3 мкмоль, у порівнянні до варіанту моноінокуляції даними штамами.
Таблиця 2
Нітрогеназна активність бульбочок конюшини лучної за інокуляції Rhizobium
leguminosarum bv. trifolii і комплексом мікроорганізмів
(ґрунти сірі лісові опідзолені середньосуглинкові)
Варіант | Нітрогеназна активність,
мкмоль С2Н4 /рослину/годину | 2004 р. | 2005 р. | СереднєІІІ декада
липня | ІІІ декада
червня | І декада
вересня | Контроль | 0,9 ± 0,2 | 9,9 ± 0,3 | 3,3 ± 0,2 | 4,7 | Rlt 11 | 4,0 ± 0,5 | 10,8 ± 0,4 | 4,3 ± 0,1 | 6,4 | Rlt 16 | 2,2 ± 0,5 | 7,8 ± 0,4 | 3,4 ± 0,3 | 4,5 | Rlt 18 | 1,7 ± 0,5 | 9,8 ± 0,3 | 3,4 ± 0,2 | 5,0 | Rlt 20 | 2,9 ± 0,5 | 13,7 ± 0,3 | 4,0 ± 0,2 | 6,9 | Rlt 11+E. nimipressuralis 32-3
+P. polymyxa 6М | 8,1 ± 0,7 | 15,9 ±0,3 | 3,9 ± 0,2 | 9,3 | Rlt 16+E. nimipressuralis 32-3
+P. polymyxa 6М | 2,8 ± 0,5 | 12,5 ± 0,4 | 3,5 ± 0,2 | 6,4 | Rlt 18+E. nimipressuralis 32-3
+P. polymyxa 6М | 4,1 ± 0,4 | 13,8 ± 0,3 | 3,4 ± 0,2 | 7,1 | Rlt 20+E. nimipressuralis 32-3
+P. polymyxa 6М | 12,2 ± 2,2 | 17,3 ± 0,3 | 4,0 ± 0,2 | 11,2 | НІР05 (Fф. > Fт.) | 1,5 | 0,58 | 0,36 |
Поліпшення азотного живлення конюшини сприяло формуванню більш потужного фотосинтетичного апарату, адже вміст сумарного хлорофілу в листях зріс під впливом інокуляції всіма штамами. Штами Rlt 11 і 20 найбільш сприяли синтезу пігментів, вміст яких збільшився, у порівнянні до контролю (рис. 3).
Рис. 3. Вплив інокуляції насіння штамами Rhizobium leguminosarum bv. trifolii
на вміст сумарного хлорофілу в зеленій масі конюшини лучної сорту Анітра
При інокуляції насіння конюшини штамами Rlt у складі комплексу мікроорганізмів, штами 16 і 18 стимулювали синтез хлорофілу у листях відповідно на 5,7 і 8,1 мг/кг, при застосуванні штаму Rlt 11 – на 8,6 мг/кг, а штаму Rlt 20 – на 10,8 мг/кг порівняно з моноінокуляцією.
Аналіз надземної маси рослин виявив позитивний вплив штучної інокуляції насіння виділеними штамами Rlt на продуктивність конюшини (табл. 3). Середній урожай повітряно сухої маси сіна по трьом укосам конюшини, при інокуляції насіння штамами Rlt 16 і 18 переважав контрольний рівень на 7,4 – 7,8%, штамом Rlt 11 – на 14%, штамом 20 – на 18%.
Таблиця 3
Вплив інокуляції насіння Rhizobium leguminosarum bv. trifolii на урожайність конюшини лучної на фоні спонтанної інокуляції
(дослідне поле Інститут кормів УААН)
Варіант | Урожайність, ц/га | 2004 р. | 2005 р. | 2006 р. | СереднєСума | 1 - укіс | 2 - укіс | 1 - укіс | 2 - укіс | Контроль | 30,3±1,8 | 63,9±3,2 | 48,0±1,9 | 55,7±1,9 | 39,1±2,2 | 47,4 | 237,0 | Rlt 11 | 36,4±0,7 | 70,9±1,7 | 55,3±1,8 | 65,5±2,7 | 42,8±1,8 | 54,2 | 270,9 | Rlt 16 | 35,8±0,4 | 67,2±2,2 | 49,7±1,9 | 62,4±2,2 | 39,4±2,1 | 50,9 | 254,5 | Rlt 18 | 36,0±0,8 | 66,4±1,6 | 50,7±1,8 | 61,6±2,6 | 40,7±2,0 | 51,1 | 255,4 | Rlt 20 | 36,5±0,5 | 74,9±1,0 | 56,9±2,0 | 68,7±2,5 | 43,5±1,8 | 56,1 | 280,5 | Rlt 11 + E. nimipressuralis 32-3 + P. polymyxa 6М | 37,6±0,5 | 79,3±1,4 | 59,0±1,9 | 72,8±2,4 | 44,6±2,3 | 58,7 | 293,3 | Rlt 16 + E. nimipressuralis 32-3 + P. polymyxa 6М | 36,9±0,5 | 76,0±1,5 | 56,2±1,0 | 71,1±3,1 | 41,8±1,9 | 56,4 | 282,0 | Rlt 18 + E. nimipressuralis 32-3 +P. polymyxa 6М | 37,1±0,9 | 76,3±1,9 | 53,3±1,5 | 71,8±2,2 | 39,2±1,3 | 55,5 | 277,7 | Rlt 20 + E. nimipressuralis 32-3 +P. polymyxa 6М | 39,1±0,7 | 79,7±2,2 | 60,0±1,2 | 75,2±1,6 | 50,6±2,0 | 60,9 | 304,6 | НІР05 (Fф. > Fт.) | 1,27 | 2,62 | 2,55 | 3,47 | 2,84 |
Бактеризація насіння конюшини комплексом мікроорганізмів стимулювала збільшення біомаси рослин при застосуванні штаму Rlt 16 на 11%, штаму 18 – на 9, штаму 11 – на 8, а штаму 20 – на 9%, у порівнянні з моноінокуляцією.
Аналогічні дані були одержані в досліді, що був проведений на дослідному полі Інституту агроекології УААН. При інокуляції насіння штамами Rlt 11 і 20 всі основні показники, що характеризують активність формування і функціонування симбіотичної системи, переважали отримані за спонтанної інокуляції.
У польовому досліді Національного аграрного університету визначили, що кількість бульбочок на одній рослині за умов біологічної системи удобрення конюшини (поліфункціональний комплекс мікроорганізмів) була у середньому на 9,4 бульбочки більша, за мінеральну (табл. 4).
Проте, найбільша активність нодуляції була відзначена за умов інтегрованої системи (комплекс мікроорганізмів + NPK), тобто бульбочок утворювалось більше на 12,3 і 2,9 од./рослину порівняно з даними отриманими відповідно при мінеральній та біологічній системах удобрення.
Таблиця 4
Бульбочкоутворення на коренях конюшини лучної сорту Носівська 5
за різних систем удобрення (польовий дослід НАУ)
Система удобренняКількість бульбочок на 1 рослині | 2003 р. | 2004 р. | 2005 р. | СереднєМінеральна | 23,3 ± 1,3 | 17,5 ± 1,4 | 27,6 ± 0,5 | 22,8 | Інтегрована | 34,9 ± 3,0 | 32,1 ± 2,0 | 35,1 ± 1,2 | 34,0 | Біологічна | 31,8 ± 3,5 | 27,3 ± 2,7 | 31,3 ± 0,5 | 30,1 | НІР05 (Fф. > Fт.) | 4,46 | 3,41 | 1,28 |
Аналіз складу мікробного угруповання ризосфери конюшини показав, що за інтегрованої та біологічної систем удобрення у ризосфері конюшини знижується кількість стрептоміцетів та мікроміцетів (табл. 5), що опосередковано свідчить про позитивний вплив на санітарний стан ґрунту (Полянская Л.М. та ін, 2003).
Збільшення кількості азотофіксувальних та фосформобілізівних мікроорганізмів сприяє забезпеченню рослин основними біогенними елементами.
За вмістом кормових одиниць в урожаї, мінеральна система удобрення забезпечує одержання 48 ц/га, що переважає інтегровану (46 ц/га) і біологічну (45 ц/га) системи. Але ця перевага обумовлена внесенням мінеральних добрив, які інгібують біологічні азотфіксацію і фосформобілізацію, що економічно недоцільно. Крім того, недоцільно й у екологічному аспекті: за мінеральної системи удобрення виявлена висока фітотоксичність ризосферного ґрунту конюшини щодо зернових культур, проте за умов інтегрованої системи удобрення вона практично відсутня, а за умов біологічної системи удобрення спостерігали навіть стимулюючий вплив ґрунту на проростання насіння ячменю (рис. 4).
Рис. 4. Вплив систем удобрення на фітотоксичність ґрунту ризосфери
конюшини лучної сорту Носівська 5 (польовий дослід НАУ)
Таблиця 5
Чисельність мікроорганізмів основних еколого-трофічних груп у ризосфері конюшини лучної у фазу
стеблування (польовий дослід НАУ, середні дані за 2003 – 2005 р.)
Системи
удобрення | Амоніфікатори,
млн. КУО/г
ґрунту | Бактерії, що використовують мінеральні форми азоту, млн. КУО/г ґрунту
Стрептоміцети, млн. КУО/г
ґрунту | Азотофіксу-вальні бактерії, млн. КУО/г ґрунту
Мікроміцети тис. КУО/г ґрунту | Фосформо-білізівні
бактерії, тис. КУО/г
ґрунту
Мінеральна | 7,0 | 50,9 | 7,4 | 0,58 | 18,8 | 2,1 | Інтегрована | 8,0 | 48,0 | 4,2 | 0,63 | 10,8 | 3,5 | Біологічна | 6,0 | 31,4 | 3,4 | 0,73 | 11,2 | 4,2 |
Одержання препаративної форми Rhizobium leguminosarum bv. trifolii 20
У вегетаційних і польових дослідах як найбільш активний мікросимбіонт вирізнявся штам Rlt 20, і на його основі розробляли технологію одержання препарату для підвищення продуктивності конюшини.
Встановили, що оптимальним для початку росту штаму Rlt 20 є інтервал рН від 7,4 до 7,8. Розвиток культури починається, якщо рН середовища не нижче 5,5 і припиняється, якщо рН збільшити до 9,0. Внесення у середовище 1-2% інокулюму штаму Rlt 20, який знаходиться у стадії активного росту, дозволяє мінімалізувати тривалість лаг-фази і досягти стаціонарної фази розвитку культури за 12 годин (рис. 5). Під час розвитку культура виділяє кислі продукти обміну і рН культуральної рідини знижується з 7,6 до 6,5.
Рис. 5. Динаміка росту Rhizobium leguminosarum bv. trifolii 20 та рН
культуральної рідини при періодичному культивуванні
Отже, штам швидкорослий, технологічний, має питому швидкість росту 0,37 год.-1. Це дозволило отримати препарат, використовуючи основні вимоги регламенту виробництва препарату ризобофіт на основі швидкорослих бульбочкових бактерій у вермикулітному живильному субстраті, в якому джерелами вуглецю та азоту є меляса та кукурудзяний екстракт (ТУУ 319.00494456-006-2002).
Дослідження динаміки титру життєздатних клітин у живильному субстраті показало, що наприкінці 5 місяців в ньому залишається 2,3 млрд./г життєздатних клітин бульбочкових бактерій, що є достатнім за вимогами технічних умов для інокуляції 1 гектарної порції насіння (табл. 6).
Таблиця 6
Показники якості препарату на основі Rhizobium leguminosarum bv. trifolii 20
Наповнювач | Термін зберігання, місяці | 0,5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | Rlt 20, млрд./г | 3,1 | 3,4 | 3,7 | 2,8 | 2,9 | 2,3 | Стороння мікрофлора, % | бактерії | 0 | 0 | 0,1 | 0,3 | 0,2 | 0,2 | мікроміцети0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | Вологість, % | 71 | - | - | 43 | - | 40 | Економічна та енергетична ефективність застосування комплексу
мікроорганізмів при вирощуванні конюшини
Розрахунки економічної, енергетичної ефективності та конкурентоспроможності застосування мікробних препаратів, при вирощуванні конюшини лучної сорту Анітра, показали переваги використання штаму Rlt 20, застосування якого дало змогу знизити собівартість продукції на 19%, підвищити прибуток на 559,7 грн/га, підняти рівень рентабельності на 57,4%, коефіцієнт енергетичної ефективності зріс на 0,58, а комплексний коефіцієнт конкурентоспроможності на 0,16 у порівнянні до контролю. Передпосівна бактеризація насіння поліфункціональним комплексом мікроорганізмів Rlt 20, E. nimipressuralis 32-3 і P. polymyxa 6М дала можливість знизити собівартість на 8%, підвищити прибуток на 191,8 грн/га, підняти рівень рентабельності на 19,6%, коефіцієнт енергетичної ефективності зріс на 0,2, а комплексний коефіцієнт конкурентоспроможності на 0,05 у порівнянні з моноінокуляцією.
ВИСНОВКИ
Науково і практично обґрунтовано, що селекціоновані штами Rhizobium leguminosarum bv. trifolii формують активну азотофіксувальну сиcтему з Trifolium pratense L., а застосування їх у складі поліфункціонального комплексу мікроорганізмів дозволяє значно посилити ефективність їх взаємодії з конюшиною.
1. З поверхнево стерилізованих бульбочок конюшини виділено 22 бактеріальних ізоляти, з яких 15 проявили здатність утворювати бульбочки на коренях конюшини, і за основними тестами ідентифіковані як Rhizobium leguminosarum bv. trifolii.
2. Штами Rh. leguminosarum bv. trifolii 11 і 20 утворюють найбільш активну азотофіксувальну симбіотичну систему, забезпечуючи підвищення нітрогеназної активності бульбочок, відповідно на 36 і 47%, приріст вмісту сумарного хлорофілу в біомасі на 16,2 і 19,7 мг/кг та урожайність конюшини на 6,8 і 8,7 ц/га, у порівнянні зі спонтанною інокуляцією.
3. Штами Rh. leguminosarum bv. trifolii 11 і 20 продукують рістрегулюючі метаболіти, які сприяють підвищенню схожості насіння на 3 і 8% та накопиченню більшої на 10,3 і 13,8% фітомаси. Крім того, Rhizobium leguminosarum bv. trifolii 20 виявив здатність пригнічувати ріст фітопатогенних мікроміцетів.
4. Комплексна інокуляція насіння конюшини сорту Анітра штамами Rh. leguminosarum bv. trifolii 11 і 20 зі штамом фосформобілізівних бактерій Enterobacter nimipressuralis 32-3 і антагоністом фітопатогенних мікроміцетів Paenibacillus polymyxa 6M значно посилює позитивну дію бульбочкових бактерій на показники симбіозу: нітрогеназна активність бульбочок підвищується на 57 і 105 %, вміст сумарного хлорофілу – на 7 і 5 %, урожайність конюшини – на 12 і 8 %, вміст білка у фітомасі – на 0,7 і 1,3 %, порівняно з моноінокуляцією даними штамами відповідно.
5. Передпосівна інокуляція насіння конюшини сортів Анітра і Спарта штамами Rh. leguminosarum bv. trifolii 11 та 20 стимулює накопичення у сухій масі більшої кількості білка, відповідно, на 0,7 і 1,3% та 0,5 і 0,8%, вмісту фосфору – на 0,05 і 0,06%, вмісту калію – на 0,04 і 0,05% та 0,03 і 0,05%, у порівнянні з моноінокуляцією даними штамами.
6. Інокуляція насіння конюшини Rh. leguminosarum bv. trifolii 20 у складі комплексного препарату мікроорганізмів уповільнює зниження титру життєздатних бульбочкових бактерій на поверхні насіння, – через 10 годин після інокуляції їх залишається у 2 рази більше, ніж при моноінокуляції.
7. Розроблено технологію одержання вермикулітної препаративної форми Rh. leguminosarum bv. trifolii 20, яка сприяє збереженню 2 млрд./г клітин життєздатних бульбочкових бактерій впродовж 5 місяців.
8. Уведення в технологію вирощування конюшини елемента застосування поліфункціонального комплексу мікроорганізмів при біологічній технології вирощування конюшини, підвищує чисельність азотфіксувальних бактерій – на 26 і 16% порівняно з промисловою і інтегрованою технологіями, фосформобілізівних бактерій, відповідно на 100 і 20%, знижує чисельність мікроорганізмів, що засвоюють мінеральні форми азоту – на 38 і 35%, мікроміцетів – на 40 і 1%, і стрептоміцетів, відповідно, на 54 і 19 %.
9. Застосування поліфункціонального комплексу мікроорганізмів при біологічній і інтегрованій технологіях вирощування конюшини сприяє зниженню фітотоксичності ризосферного ґрунту та стимуляції проростання насіння тест-культури.
10. Застосування поліфункціонального комплексу мікроорганізмів дає змогу знизити собівартість продукції на 8%, підняти рівень рентабельності на 19,6%, коефіцієнт енергетичної ефективності на 0,2, а комплексний коефіцієнт конкурентоспроможності на 0,05 у порівнянні з моноінокуляцією.
ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ
Сільськогосподарському виробництву рекомендовано новий штам бульбочкових бактерій конюшини Rh. leguminosarum bv. trifolii 20 та препарат на його основі, який забезпечує формування активної симбіотичної системи Rh. leguminosarum bv. trifolii – Trifolium pratense L. і внаслідок покращення азотного живлення підвищує урожайність конюшини на 11 – 21%, вміст білка у фітомасі на 1,4 – 2,0%, заощадження коштів і енергії на виробництво та застосування мінеральних добрив.
Виробництву запропоновано вирощування конюшини із застосовуванням поліфункціонального комплексу мікроорганізмів, який складається з препаратів азотофіксувальної, фосформобілізівної та захисної від хвороб дії, що дає змогу підвищити урожайність повітряно сухої маси конюшини на 21 – 35%, вмісту білка у фітомасі на 2,2 – 3,2% порівняно зі спонтанною інокуляцією.
Список РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Коваленко Т.М., Шерстобоєва О.В. Ефективність поліфункціонального комплексу біопрепаратів у посівах конюшини / Зб. наук. праць Інституту землеробства УААН. - К. – 2004. – Вип. 4. – С. 94 – 98. (Збір експериментальних і літературних даних, їх аналіз та написання статті).
2. Коваленко Т.М., Шерстобоєва О.В., Лісова Н.Ю. Конкурентоспроможні штами Rhizobium trifolii для підвищення продуктивності конюшини лучної //Агроекологічний журнал. – 2005. – № 1. – С. 46 – 50. (Збір експериментальних даних, написання статті).
3. Коваленко Т.М. Підвищення ефективності функціонування симбіотичної системи конюшини – Rhizobium trifolii мікробними препаратами // Корми і кормовиробництво. – Вінниця. – 2005. – Вип. 55. – С. 24 – 31.
4. Шерстобоєва О.В., Коваленко Т.М. Алелопатичні властивості нових штамів Rhizobium trifolii / Зб. наук. праць Інституту землеробства УААН. – К. – 2005. – Вип. 4. – С. 98 – 102. (Збір експериментальних даних, їх аналіз та написання статті).
5. Шерстобоєва О.В., Коваленко Т.М. Вирощування конюшини за використання мікробних препаратів / Зб. наук. праць Національного наукового центру „Інститут землеробства УААН”. – К. – 2006. – Спецвипуск. – С. 235 – 238. (Збір експериментальних і літературних даних, їх аналіз та написання статті).
6. Шерстобоєва О.В., Коваленко Т.М. Функціонування симбіотичної системи Trifolium – Rhizobium при застосуванні комплексу біопрепаратів //Агроекологічний журнал. - 2006. - № 4. – С. 67 – 71. (Збір експериментальних і літературних даних та їх аналіз).
7. Шустерук Т.З., Коваленко Т.М., Польовий В.М., Потапенко Л.В., Шевченко А.І. Мікробіологічна трансформація органічної речовини ґрунту //Агроекологічний журнал. – 2006. – №4. – С. 59 – 65. (Збір експериментальних даних та їх аналіз).
8. Деклараційний Патент України на корисну модель. Штам бульбочкових бактерій Rhizobium trifolii 20, який використовують для приготування препарату для підвищення продуктивності конюшини / В.П. Патика, Т.М. Коваленко, О.В. Шерстобоєва, Н.Ю. Лісова. Опубл. 15.07.2005. Бюл. №7.
9. *Гуцол Т.М. Нодулююча здатність штаму Rhizobium trifolii 124 при вирощуванні конюшини за різних систем удобрення //Науково-практична конференція молодих вчених (24 - 26 листопада 2003 р., с. Чабани, Київської обл.). – Чабани. – 2003. – С. 86 – 87.
10. Москалець В.В., Коваленко Т.М., Пічкур В.О. Агроекологічні аспекти впливу мікробних препаратів на продуктивність бобових рослин //Х з’їзд Товариства мікробіологів України (15 – 17 вересня 2004 р., м. Одеса). – Одеса: “Астропринт”, 2004. – С. 288.
11. Тертична О.В., Пономаренко С.В., Чайковська В.В., Коваленко Т.М. Екологічні аспекти застосування мікробних біотехнологій в сільському господарстві //Тези доп. Міжнар. наук.-практ. конф. (2 – 4 червня 2004 р., м. Миколаїв). – Миколаїв. – 2004. – С. 155 – 157.
12. Коваленко Т.М., Тертична О.В., С.В., Чайковська В.В. Екологічно безпечні елементи технології вирощування сільськогосподарських культур / Збірник матеріалів П’ятої міжвузівської науково-практичної конференції аспірантів “Сучасна аграрна наука: напрями досліджень, стан і перспективи” (17 – 19 травня 2005 р., м. Вінниця). – Вінниця. – 2005. – С. 46 – 47.
13. Патика В.П., Шерстобоєва О.В., Коваленко Т.М. та ін. Вирощування сої із застосуванням мікробних препаратів - ризобофіту та альбобактерину в умовах північної частини Лісостепу України /Методичні рекомендації. – К. – 2004. – 24 с.
14. Вирощування конюшини лучної із застосуванням мікробних препаратів /Методичні рекомендації. – К. – 2006. – 16 с.
Примітка. * – прізвище Гуцол змінено на прізвище Коваленко.
Анотація
Коваленко Т.М. Оптимізація функціонування симбіотичної системи Rhiz- Trifolium поліфункціональним комплексом мікроорганізмів. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.07. – мікробіологія. – Уманський державний аграрний університет , Умань, 2007.
Дисертація присвячена дослідженню можливості оптимізації функціонування симбіотичної системи Rhizobium leguminosarum bv. trifolii – Trifolium pratense L. застосуванням нових, високоактивних та конкурентоздатних щодо аборигенних ґрунтових ризобій азотофіксувальних бактерій Rhizobium trifolii у комплексі зі штамом фосформобілізівних бактерій Enterobacter nimipressuralis 32-3 та антагоністом фітопатогенних грибів штамом Paenibacillus polymyxa 6М.
Показано, що метаболіти
