НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ

КУЦЯБА Василь Іванович

УДК 582.282.23:017.7:546.72:577.164.12+577.21

ВЗАЄМОДІЯ РЕГУЛЯТОРНИХ ГЕНІВ БІОСИНТЕЗУ РИБОФЛАВІНУ І КОНСТРУЮВАННЯ ШТАМІВ-НАДСИНТЕТИКІВ ЦЬОГО ВІТАМІНУ

У ДРІЖДЖІВ PICHIA GUILLIERMONDII

03.00.07 – мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2007

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті біології клітини НАН України.

Науковий керівник: член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор Сибірний Андрій Андрійович,

Інститут біології клітини НАН України, директор,

завідувач відділу молекулярної генетики і біотехнології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Варбанець Людмила Дмитрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів

доктор медичних наук, професор Данилейченко Валерій Васильович, Львівський національний медичний університет ім. Д. Галицького МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології

Провідна установа: Національний університет харчових технологій МОН України, м. Київ

Захист відбудеться “ 3 “ липня 2007 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.246.01 при Інституті біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

Автореферат розісланий “ 18 “ травня 2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Убийвовк В.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження біосинтезу рибофлавіну (РФ, вітамін В2) та його регуляції у дріжджів є фундаментальною науковою проблемою, яка має також біотехнологічне значення. Мутантний штам аспорогенних флавіногенних дріжджів Candida famata dep8, отриманий лише методами класичної селекції, використовується у США для промислового виробництва РФ. Характерною особливістю флавіногенних дріжджів є надсинтез РФ у відповідь на дефіцит заліза у середовищі [Tanner et al., 1945], але механізми його виникнення не встановлені.

Зручною моделлю для дослідження цього феномену є спорогенні флавіногенні дріжджі Pichia guilliermondii, для яких на початок виконання дисертаційної роботи були розроблені методи гібридизації та аналізу мейотичних сегрегантів [Сибирный с соавт., 1977], виявлено 6 структурних (RIB1, RIB2, RIB3, RIB5, RIB6, RIB7) і 5 регуляторних (RIB80, RIB81, HIT1 – негативного типу дії, та RIB83, RIB84 – позитивного типу дії) генів флавіногенезу [Шавловский, Логвиненко, 1985, 1988], виділено і досліджено ферменти біосинтезу РФ, здійснено синтез РФ in vitro [Логвиненко с соавт., 1982]. Дослідження мутантів rib80, rib81 і hit1 показало, що крім надсинтезу РФ у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза вони характеризувалися вищою, ніж клітини дикого типу, швидкістю поглинання 55Fe, а мутанти rib80 ще й акумулювали підвищені кількості заліза у клітинах [Шавловский с соавт., 1985, 1988, 1993; Стенчук с соавт., 1991]. Вищу швидкість поглинання 55Fe мали також клітини дикого типу при вирощуванні їх у залізодефіцитному середовищі. Ці факти могли свідчити про взаємозв’язок регуляції флавіногенезу і асиміляції заліза у дріжджів. Але через недостатнє дослідження властивостей мутантів з пошкодженими регуляторними генами флавіногенезу, характеру взаємодії регуляторних генів між собою, відсутність інформації про моногенність мутацій, які приводили до згаданих фенотипів регуляторних мутантів, було неможливо однозначно говорити про властивості і роль окремо взятих регуляторних генів у регуляції синтезу ферментів флавіногенезу і асиміляції заліза.

Додаткові дослідження властивостей регуляторних мутантів P. guilliermondii є необхідними для більш глибокого розуміння регуляції експресії структурних генів флавіногенезу на генетичному рівні та для з’ясування молекулярних механізмів контролю біосинтезу РФ і асиміляції заліза, взаємозв’язку між цими процесами у флавіногенних дріжджів. Проведені дослідження є необхідні також для створення наукових підходів до конструювання продуцентів вітаміну В2, виробництво якого в Україні відсутнє.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота була виконана в рамках науково-дослідних робіт відділу регуляції клітинного синтезу низькомолекулярних сполук Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України (зараз відділу регуляторних систем клітини Інституту біології клітини НАН України) за програмою “Молекулярна біологія” під час виконання таких тем: 1. Шифр теми 2.2.1.10, № держреєстрації 01930034441 “Порівняльне дослідження біохімічних і генетичних факторів, що контролюють біосинтез рибофлавіну у дріжджів” (1993-1995 рр); 2. № держреєстрації 0299U000571 “Вплив порушення регуляції біосинтезу ферментів флавіногенезу і пуринового обміну на нагромадження рибофлавіну у дріжджів” в 1996-1998 рр.; 3. Шифр теми 2.2.1.10, № держреєстрації 0199U000954 “Дослідження біохімічних і генетичних механізмів регуляції біосинтезу вітаміну В2 і асиміляції заліза у дріжджів” (1999-2001 рр.), а також конкурсних тем Державного фонду фундаментальних досліджень № 5.2/72 “Дослідження транспорту і акумуляції заліза у флавіногенних дріжджів” та № 5.3/352 “Дослідження сумісної дії мутацій регуляторних генів флавіногенезу, біосинтезу пуринів, а також трансформації геном RIB1 на утворення рибофлавіну”.

Мета та завдання роботи. Метою даної роботи було дослідження властивостей регуляторних мутантів біосинтезу РФ та взаємодії регуляторних генів флавіногенезу дріжджів P. guilliermondii шляхом конструювання гаплоїдних штамів з різними комбінаціями мутантних алелів регуляторних генів, а також впливу мутацій резистентності до аналогів пуринів на продуктивність флавіногенезу. Відповідно до поставленої мети основними завданнями роботи було:

1. перевірити мутації деяких регуляторних генів на моногенність;

2. отримати генетичні докази участі генів, що контролюють біосинтез РФ, у регуляції асиміляції заліза;

3. сконструювати мутанти, які б містили в одному гаплоїдному геномі пошкоджені гени біосинтезу РФ негативного і позитивного типу дії, і дослідити їх властивості;

4. дослідити можливість посилення надсинтезу РФ у мутантів, що містять пошкоджені регуляторні гени біосинтезу РФ негативного типу дії, введенням у їх геном муацій резистентності до аналогів пуринів;

5. перевірити біологічну ефективність РФ, синтезованого сконструйованими штамами-надсинтетиками цього вітаміну, на курах.

Об’єкт дослідження - регуляція біосинтезу РФ та асиміляції заліза у дріжджів P. guilliermondii. Предмет дослідження - властивості мутантів дріжджів з порушеною регуляцією біосинтезу РФ і пуринів; ферменти флавіногенезу; транспорт заліза; регуляторні гени біосинтезу РФ; селекція дріжджів-надсинтетиків РФ. Методи дослідження: кількісна оцінка флавіногенної активності дріжджів та асиміляції заліза із застосуванням методів флуориметрії, хроматографічного аналізу, ізотопних методів, спектрофотометрії; селекція та генетичний аналіз мутантів дріжджів з пошкодженою регуляцією біосинтезу РФ і асиміляції заліза з використанням методів класичної (мутагенізація, комплементаційний та сегрегаційний аналізи) та молекулярної генетики (конструювання та аналіз геномної бібліотеки дріжджів P. guilliermondii у гомологічній системі, виділення і ретрансформація плазмідної ДНК), а також мікробної біотехнології (культивування продуцентів у лабораторному ферментері).

Наукова новизна отриманих результатів.

Отримано прямі докази плейотропної дії гена RIB80, який бере участь у регуляції як біосинтезу РФ, так і асиміляції заліза.

Вперше показано, що гени RIB80 і RIB81 та RIB81 і HIT1 взаємодіють у процесі біосинтезу РФ за типом синергізму.

Вперше показано, що ген RIB83 здійснює позитивний контроль як біосинтезу РФ, так і транспорту заліза. Мутація rib83-6 блокує надсинтез РФ і дерепресію синтезу ферментів флавіногенезу не тільки у мутантів rib80 чи rib81, але й у подвійних мутантів rib80 rib81 і навіть у залізодефіцитних умовах. Вона також знижує швидкість поглинання заліза клітинами і їх фериредуктазну активність.

Сконструйовано стабільний штам-реципієнт генотипу rib1-86 rib81 rib83 і на його основі створено систему для клонування регуляторного гена RIB83.

Показано, що введення у геном мутанта генотипу rib80 rib81 мутацій резистентності до 8-азагуаніну і 4-амінопіразол[3,4-d]піримідину веде до значного посилення надсинтезу РФ, очевидно, внаслідок кращого постачання цього процесу пуринами. В такий спосіб отримано штами, які синтезують до 1,7 г РФ в 1 л синтетичного середовища при вирощуванні у лабораторному ферментері.

Практичне значення одержаних результатів. Результати роботи є важливими для розуміння механізму виникнення надсинтезу РФ і науково обгрунтованого конструювання штамів-надсинтетиків РФ у флавіногенних дріжджів. Детальна характеристика властивостей регуляторних мутантів біосинтезу РФ є основою для досліджень молекулярних механізмів регуляції флавіногенезу і асиміляції заліза.

Виготовлено препарат кормового РФ з використанням одного із сконструйованих штамів-надсинтетиків вітаміну. Отримано позитивні результати при дослідженні біологічної ефективності РФ з препарату на курах. Селекціоновано штами, які синтезують до 800 мг РФ в 1 л середовища, що містить зернове сусло, післяспиртову зернову барду, меласу. Вони можуть бути використані для розробки технології виробництва кормових дріжджів, збагачених вітаміном В2.

Особистий внесок здобувача. Під час виконання дисертаційної роботи автором особисто відібрано та проаналізовано наукову літературу за темою наукового дослідження, а також виконано майже весь обсяг експериментальних досліджень. Дослідження швидкості транспорту заліза у регуляторних мутантів проводились спільно із пров.н.с. Федорович Д.В. Визначення активностей ферментів флавіногенезу частково були проведені спільно з пров. інженером Кшановською Б.В. Клонування фрагментів ДНК з банку генів дріжджів P. guilliermondii, які комплементували/супресували РФ-залежність сконструйованого штама-реципієнта rib1-86 rib81 rib83, виконано разом з інженером Пинягою Ю.В. та с.н.с. Борецьким Ю.Р. з відділу молекулярної генетики і біотехнології. Дослідження біологічної ефективності РФ, синтезованого сконструйованим штамом-надсинтетиком цього вітаміну Agur-125 Appr-3, проводились в Інституті біології тварин УААН та особисто автором на пташнику ТзОВ “Еней-Пласт”. Планування дослідів, аналіз та обговорення отриманих результатів були проведені спільно з науковим керівником. Написання та оформлення публікацій здобувач здійснював разом з співавторами.

Апробація результатів досліджень. Основні положення роботи доповідались і були представлені на з’їздах Товариства мікробіологів України (Одеса, 1993; Чернігів, 2000; Одеса, 2004), Українських біохімічних з’їздах (Київ, 1992; Чернівці, 2002; Харків, 2006), Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), всесоюзній конференції “Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов” (Пущино, СРСР, 1989), науково-практичній конференції “Новые технологии получения и применения биологически активных веществ” (Алушта, Україна, 2002), всеукраїнській конференції з фізіології і біохімії тварин (Львів, Україна, 1994), VII міжнародному симпозіумі з генетики промислових мікроорганізмів GIM-94 (Монреаль, Канада, 1994), XXI міжнародному спеціалізованому симпозіумі по дріжджах (Львів, Україна, 2001), міжнародному конгресі “Bioiron 2003” (Бетесда, США, 2003), ХХІ міжнародній конференції по генетиці і молекулярній біології дріжджів (Гетеборг, Швеція, 2003).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 28 наукових праць, у тому числі 8 статей у співавторстві, та тези 20 доповідей на міжнародних і українських наукових конференціях.

Cтруктура та обсяг дисертації. Дисертація містить такі розділи: вступ, аналітичний огляд літератури, матеріали та методи досліджень, аналіз і узагальнення результатів досліджень, висновки, список використаних джерел та додатки. Дисертацію викладено на 174 сторінках і проілюстровано 20 рисунками та 18 таблицями. Список літератури включає 255 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури складається з 5 розділів, в яких охарактеризовано біосинтез РФ та його регуляцію у дріжджів, міцелійних грибів та бактерій. Розглянуто сучасні уявлення про загальні закономірності регуляції експресії генів вищих еукаріот і дріжджів.

Матеріали та методи дослідженнь. У роботі були використані такі штами дріжджів Pichia guilliermondii: АТСС 9058 – дикий тип; штами генетичної лінії L1 ade2-19 MAT+, L2 hisX-17 MAT-, L3 metX-1 MAT+, L4 cytX-1 MAT-; регуляторні мутанти 1018/33 metX-1 rib80-22 MAT+, S131/6 metX-1 rib81-131 MAT+, SW6-18 hisX-17 rib83-6 MAT+, Rop--13 metX-1 rib83 MAT-, Rop--27 metX-1 rib83 MAT-; РА49 ade2 rib7 MAT+ - РФ-залежний мутант; D163 L26 Arg- rtr+ ( I ) MAT- - мутант, у якого порушений транспорт РФ; Д26/5-3С.6 rib7 rtr+ rib81 MAT- – надсинтетик 6,7-диметил-8-рибітиллюмазину (сконструйований у даній роботі). Всі штами були селекціоновані і підтримуються у відділі регуляторних систем клітини. Бактерійний штам E. coli DH5б lacZ?M15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(rk-, mk+), supE44, relA1, deoR, ?(lacZYA-argF)U169) використовувався для селекції та ампліфікації плазмід (з колекції відділу молекулярної генетики і біотехнології).

Дріжджі вирощували при 30 оС у модифікованому синтетичному середовищі Беркгольдера [Шавловский с соавт., 1978]. Використовували середовища з високим (0,2 мг/л –середовище з оптимальним для росту вмістом заліза) і низьким (0,01 мг/л – залізодефіцитне середовище) вмістом заліза, яке додавали у вигляді солі Мора. Від заліза середовище очищали за допомогою 8-гідроксихіноліну [Warring, Werkman, 1943]. При необхідності у середовище вносили аденін, метіонін, гістидин, цитозин – по 40 мг/л, лізин і РФ – по 200 мг/л. Агаризовані середовища містили 2 % агару.

Бактерії E. coli DH5б вирощували при 37 оС у середовищі LB (Ausubel et al., 1990). Для селекції клітин, які містили плазміди, використовували ампіцилін у концентрації 100 мг/л. Для трансформації штами дріжджів вирощували при 30 оС у багатому середовищі YPD.

Схрещування ауксотрофних мутантів і аналіз мейотичних сегрегантів проводили за [Сибирный с соавт., 1977], а гібридизацію дріжджів шляхом злиття протопластів - за [Сибирный с соавт., 1982].

Біомасу визначали турбідиметрично на фотоелектроколориметрі ФЕК-56М. Вміст флавінів у культуральній рідині і екстрактах клітин визначали флуорометрично на приладі ЕФ-3М, використовуючи для стандартного розчину РФ синтетичний вітамін В2 [Bessey et al., 1949].

Концентрацію негемінового заліза в клітинах визначали за Kurup and Brodie, 1967], загальний вміст заліза у клітинах – за [Ковалёв с соавт., 1984]. Визначення швидкості поглинання заліза клітинами проводили за допомогою циклотронного 55FeCl3 з питомою активністю 16 · 1011 Бк/г в 0,5 N HCl (Ленінградське відділення В/О “Изотоп”). Склад інкубаційної суміші та умови визначення описані в [Шавловский с соавт.. 1988]. Фериредуктазну активність клітин дріжджів визначали за [Lesuisse et al., 1987], використавши для зв’язування Fe(II) його хелатор ,’-дипіридил.

Активності ГТФ-циклогідролази II і РФ-синтази визначали у безклітинних екстрактах за [Логвиненко с соавт., 1982, 1973]. За одиницю активості фермента (Од.) приймали його кількість, яка забезпечує синтез 1 мкмоля продукту за 1 хв. Питому активність виражали числом одиниць на мг білку.

Виділення нуклеотидів з культуральної рідини здійснювали за [Шавловский с соавт.. 1970], а їх ідентифікацію і кількісне визначення за [Шавловский с соавт., 1969]. Мутагенез дріжджів проводили за допомогою УФ-променів [Логвиненко с соавт., 1972], виділення мутантів, резистентних до аналогів пуринів, - за [Pickering, Woods, 1973].

Дослідний препарат кормового РФ готували шляхом кип’ятіння вирощеної культури сконструйованого штама-надсинтетика Agur-125 Appr-3. Препарат змішували з кормом курей за допомогою побутового розпилювача “Росинка”.

Молекулярно-генетичні методи, що були використані під час експериментів, описані у [Маниатис с соавт., 1984]. Електротрансформацію дріжджів P. guilliermondii проводили за [Sibirny, 1996], а бактерій E. сoli – за [Tsuji et al., 1990]. Виділення плазмідної ДНК з клітин P. guilliermondii проводили за [Boretsky et al., 1999], а з клітин E. сoli - за [Birnboim and Doly, 1979]. Геномну бібліотеку P. guilliermondii конструювали за схемою, описаною у [Voronovsky et al., 2002]. Статистичну обробку результатів проводили за [Деркач с соавт., 1977].

Результати досліджень та їх аналіз

1. Генетичний і біохімічний аналіз мутантів rib80. Попередні дослідження властивостей мутантів rib80 показали, що вони не тільки здійснюють надсинтез РФ у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза внаслідок дерепресії синтезу ферментів флавіногенезу, але і містять підвищені у 2-4 рази кількості заліза у клітинах і виявляють високу швидкість поглинання цього металу з різних комплексів [Шавловский с соавт., 1985, 1988]. Було висловлене припущення про поліфункціональність гена RIB80, але воно не було перевірене генетично.

Селекція мутантів rib80 була складною [Шавловский с соавт., 1982]. Вона складалася з кількох етапів мутагенізації клітин дріжджів, тому не можна було виключити, що фенотип мутантів rib80 обумовлений не однією, а кількома мутаціями у різних генах. Для перевірки цього припущення було проведено три реципрокні схрещування мутантів rib80 зі штамом дикого типу L2 (hisX-17 MAT-), використавши для першої гібридизації штам rib80-22 1018/9 (mеtX-1 МАТ+). Всі отримані диплоїди „rib80/RIB80” характеризувалися регуляцією флавіногенезу, що властива штамам дикого типу. З цих диплоїдів отримували ауксотрофні мейотичні сегреганти, які відрізнялись між собою за флавіногенною активністю.

Біосинтез РФ – ознака кількісна, на проявлення якої впливає велика кількість взаємодіючих генів (полігенів). Продуктивність флавіногенезу у регуляторних мутантів rib80 визначають як гени основної дії (вони визначають розвиток ознаки), так і гени-модифікатори – інтенсифікатори і супресори. Разом вони складають генетичне оточення мутантного алеля rib80-22, яке може дуже відрізнятися у різних мейотичних сегрегантів одного диплоїда внаслідок рекомбінації геному диплоїда „rib80/RIB80” під час мейозу. У результаті продуктивність флавіногенезу різних мейотичних сегрегантів rib80 може відрізнятися у декілька разів і у деяких з них наближатися до продуктивності флавіногенезу сегрегантів дикого типу.

Для того щоб уникнути помилки включення низькофлавіногенних сегрегантів генотипу rib80 у групу сегрегантів дикого типу, було проведено оцінку меж коливання продуктивності флавіногенезу мейотичних сегрегантів дикого типу. Для цього дослідили продуктивність флавіногенезу мейотичних сегрегантів диплоїда Д64/10, який був отриманий внаслідок схрещування штамів генетичної лінії L2 і L3. Продуктивність флавіногенезу цих сегрегантів коливалася у межах 0,2 – 0,5 мкг/мг, що стало критерієм при розділенні мейотичних сегрегантів диплоїдів генотипу „rib80/RIB80” на сегреганти дикого типу і rib80.

В одному з типових експериментів по аналізу ауксотрофних мейотичних сегрегантів третього покоління диплоїда Д65/1 генотипу „rib80/RIB80” було встановлено, що мейотичне розщеплення за ознакою”надсинтез РФ” було близьким до співвідношення 1:1 (ч2екс = 2,96; ч2р=0,05 = 3,84). На основі отриманих результатів було зроблено висновок про моногенність мутації rib80-22, а також про її рецесивність та ядерну локалізацію. Доведення моногенності мутації rib80-22 дозволило також встановити флавіногенний потенціал мутантного алеля rib80-22. При оптимальному генетичному оточенні мутантного алеля rib80-22 окремі флавіногенні мейотичні сегреганти мали продуктвність флавіногенезу до 4,7 мкг РФ/мг сухих клітин. Запропонований підхід був використаний при встановленні флавіногеного потенціалу мутантних алелів генів RIB81 і HIT1 та дослідженні типу взаємодії між регуляторними генами RIB80 і RIB81 та RIB81 і HIT1, коли необхідно було встановити максимально можливу продуктивність подвійних регуляторних мутантів rib80 rib81 і rib81 hit1.

Сегреганти rib80 характеризувалися високою швидкістю поглинання 55Fe, приблизно такою ж, як вихідний мутант rib80 1018/189 (табл. 1). Сегреганти з низькою продуктивністю флавіногенезу за швидкістю поглинання 55Fe не

Таблиця 1.

Біосинтез РФ, поглинання 55Fe клітинами сегрегантів P. guilliermondii, що були отримані з диплоїда „rib80 1018/189 х L2”

Штами |

Комплемен-

тація з шта-

мом rib80 |

РФ, мг/г

сухих клітин |

Радіоактивність клітин (55Fe),

тис. імп./(хв • мг

сухих клітин)

L2 | + | 0,12 | 5,48

rib80 1018/189 | - | 2,44 | 22,85

187 | - | 1,97 | 20,50

195 | - | 1,73 | 21,50

5 | - | 0,80 | 20,58

35 | + | 0,23 | 7,42

41 | + | 0,15 | 8,35

62 | + | 0,23 | 6,65

10 | + | 0,29 | 8,11

відрізнялись від вихідного штама L2. Між інтенсивністю біосинтезу РФ і швидкістю поглинання заліза існує сильна кореляція (r1 = + 0,90).

Диплоїд, отриманий внаслідок схрещування мутанта rib80 1018/183 зі штамом дикого типу, не відрізнявся від останнього за продуктивністю флавіногенезу, швидкістю поглинання заліза, а також його вмістом у клітинах.

За допомогою УФ-променів зі штаму rib80 1018/183 було отримано ревертанти, нездатні до надсинтезу РФ у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза, що характерно для штамів дикого типу. Майже всі ревертанти містили мутацію rib80, що було показано за допомогою комплементаційного аналізу. Тільки у диплоїда, отриманого схрещуванням ревертанта 1018/183-6 з мутантом rib80 1018/189, продуктивність флавіногенезу була такою ж, як у штаму дикого типу. Дослідження флавіногенезу 144 мейотичних сегрегантів, виділених з диплоїда, що був отриманий схрещуванням ревертанта 1018/183-6 з штамом дикого типу L2, показало, що вони були нездатні до надсинтезу РФ у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза, тобто мутантний алель rib80-22 у геномі ревертанта не був виявлений. Клітини ревертанта 1018/183-6 характеризувалися регуляцією флавіногенезу залізом, яка властива клітинам дикому типу, а також не відрізнялись від штаму дикого типу за швидкістю поглинання 55Fe і вмістом цього металу (табл. 2). У середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза активності ГТФ-циклогідролази ІІ (0,49 • 10-5 Од./мг білку) і РФ-синтази (4,22 • 10-5 Од./мг білку) у ревертанта були близькими до активностей цих ферментів у штаму дикого типу.

Таблиця 2.

Біосинтез РФ, вміст негемінового заліза в клітинах, поглинання 55Fe та комплементаційний тест у ревертанта 1018/183-6

Штами | Компле-ментація з штамом rib80 | РФ, мг/г сухих клітин при вмісті заліза у середовищі | Радіоактивність клітин (55Fe),

тис. імп./(хв • мг сухих клітин) | Вміст неге-мінового заліза, мкг/г сухих клітин

0,2 мг/л | 0,01 мг/л

L2 | + | 0,10 | 8,64 | 4,16 | 53,04

rib80 1018/183 | - | 1,95 | 20,42 | 36,57 | 119,90

1018/183-6 | + | 0,23 | 17,50 | 7,43 | 49,20

Очевидно, у штаму 1018/183-6 відбулася реверсія у мутантному алелі rib80-22, яка привела до того, що швидкість поглинання 55Fe і вміст цього металу в клітинах, а також регуляція флавіногенезу і активності ферментів цього процесу залізом повернулися до рівнів, що характерні для штамів дикого типу. Отримані результати однозначно доводять, що мутація rib80-22 є моногенною, рецесивною і має плейотропну дію.

2. Генетичний аналіз мутантів rib81. Дослідженями диплоїдів генотипу „rib81/RIB81” і їх сегрегантів було показано, що мутація rib81-131 рецесивна, ядерна і моногенна [Бабяк с соавт., 1993]. У проведених дисертантом додаткових дослідах по аналізу мейотичних сегрегантів з диплоїдів, отриманих після схрещування штамів rib81 (вони містили мутацію rib81-131) з штамами генетичної лінії L1, L2, L3, було виявлено не дві, а три групи сегрегантів: 1) сегреганти, які у рідкому середовищі Беркгольдера, що містило 0,2 мг Fe/л, мали продуктивність флавіногенезу 5,3 – 22 мкг/мг, і штрихи яких на агаризованому середовищі світилися під УФ; їх фенотип було позначено Rop+ (riboflavin overproduction); 2) сегреганти, які у рідкому середовищі мали продуктивність флавіногенезу 0,86 - 3,7 мкг/мг, і штрихи яких на агаризованому середовищі не світились під УФ; їх фенотип було позначено Olm+ (overproduction only in liquid medium); 3) сегреганти дикого типу з продуктивністю флавіногенезу 0,15 – 0,5 мкг/мг. В одному з типових дослідів було проаналізовано 120 мейотичних сегреганти диплоїда Д64/5 генотипу „rib81/RIB81”. З них 24 сегреганти мали фенотип Rop+ (20 %), 38 – фенотип Olm+ (31,7 %), 58 – фенотип дикого типу (48,3 %). Важливо відмітити, що фенотипи Rop+ і Olm+ разом складають 51,7 % сегрегантів.

Для встановлення природи сегрегантів Olm+, їх схрестили з штамами rib81, дикого типу і Olm+ протилежного типу спарювання. Диплоїди „Olm+/rib81” мали продуктивність флавіногенезу як сегреганти Olm+ (0,5 – 3,5 мкг/мг), диплоїди „Olm+/дикий тип” – як штами дикого типу, диплоїди „Olm+/Olm+” – більшу від штамів дикого типу (0,5 – 2,0 мкг/мг). Аналіз мейотичних сегрегантів диплоїдів „Olm+/дикий тип” і „Olm+/Olm+” не виявив у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза сегрегантів фенотипу Rop+.

На основі цих результатів можна зробити припущення, що фенотип Olm+ обумовлений супресією мутації rib81-131 супресорною(-ними) мутацією(-іями), які присутні у штамах генетичної лінії. Природа їх невідома. Вони могли виникнути у штамах генетичної лінії під час селекції. Отримані результати є важливими для молекулярно-генетичних досліджень та конструювання штамів-надсинтетиків РФ дріжджів Р. guilliermondii, тому що при цьому використовуються мутанти, що є похідними штамів генетичної лінії.

3. Генетичний і біохімічний аналіз мутантів rib83. Мутанти rib83, на відміну від штамів дикого типу, у залізодефіцитному середовищі не здатні до надсинтезу РФ. За цих умов у них не відбувається дерепресія синтезу ферментів флавіногенезу, що, очевидно, і є причиною відсутності надсинтезу вітаміну [Шавловский с соавт., 1989]. Для того щоб вияснити, чи ця властивість мутантів rib83 визначається однією мутацією, було отримано диплоїд Д88/37 генотипу „rib83/RIB83” і проаналізовано характер мейотичного розщеплення у його сегрегантів за ознакою „надсинтез РФ” у залізодефіцитних умовах. У випадковій вибірці з 75 мейотичних сегрегантів 39 з них (52 %) синтезували РФ в межах 0,4 – 0,8 мкг/мл, тобто були нездатні до його надсинтезу. У інших 36 сегрегантів (48 %), як і у диплоїда Д88/37, спостерігали надсинтез РФ (15 – 76 мкг/мл). Таким чином, співвідношення між двома групами мейотичних сегрегантів (39:36) диплоїда Д88/37 є близьким до теоретично очікуваного 1:1. Отримані результати свідчать про моногенність, рецесивність мутації rib83-6 та її ядерну локалізацію.

Регуляторні гени RIB80, RIB81 і HIT1 у P. guilliermondii беруть участь у контролі не тільки біосинтезу РФ, але і транспорту заліза [Шавловский с соавт., 1988, 1993]. З метою встановлення, чи ген RIB83 володіє такою ж поліфункціональністю, було досліджено вплив мутації rib83-6 на швидкість поглинання заліза, фериредуктазну активність та вміст заліза у клітинах мутантів rib83, що були вирощені у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза і залізодефіцитному середовищі. З представлених у табл. 3 результатів видно, що у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза клітини штамів дикого типу і мутантів rib83 не відрізнялись суттєво за інтенсивністю поглинання 55Fe. Дефіцит заліза у середовищі посилює його поглинання клітинами, але рівень цього

Таблиця 3.

Поглинання 55Fe клітинами штамів дикого типу і регуляторних мутантів rib83 P. guilliermondii, що були вирощені у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза (+Fe) і залізодефіцитному (-Fe) середовищах.

Генотип

штаму | Кількість

досліджених

штамів | Радіоактивність клітин (55Fe),

тис. імп./(хв • мг сухих клітин) |

-Fe/+Fe

+ Fe | - Fe

дикий тип | 3 | 14,4±0,7 | 164,7±9,0 | 11,4

rib83 | 3 | 11,5±0,9 | 45,8±2,7 | 4,0

посилення (співвідношення радіоактивності клітин у залізодефіцитному середовищі до радіоактивності клітин у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза) у мутантів rib83 майже втричі менший, ніж у штамів дикого типу. Очевидно, мутація rib83-6 послаблює швидкість транспорту заліза у клітини за умови його дефіциту у середовищі.

Зниження швидкості поглинання заліза у клітинах мутантів rib83 могло бути викликане негативною дією мутації rib83-6 на фериредуктазну активність клітин, яка є необхідною для відновлення Fe(ІІІ) до Fe(ІІ) (відновлення заліза є одним з етапів високоафінного транспорту цього металу). Тому досліджували вплив мутації rib83-6 на ріст, флавіногенез, а також на фериредуктазну активність і вміст заліза в клітинах штамів 43-Д88/37 (дикий тип) і 60-Д88/37 (мутант rib83). У середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза не було виявлено суттєвих відмінностей між двома штамами за згаданими властивостями, тоді як у залізодефіцитних умовах мутація rib83-6 викликає зниження інтенсивності росту штама 60-Д88/37 і блокує у нього надсинтез РФ (Рис. 1). Крім того, у штама дикого типу, на відміну від мутанта, після стаціонарної фази спостерігали другу логарифмічну фазу, в кінці якої його біомаса досягала більше 3 мг/мл, тоді як у мутанта rib83 вона залишалась на рівні 0,7 мг/мл.

Що стосується фериредуктазної активності клітин, що були вирощені у залізодефіцитних умовах, то у процесі росту штамів їх здатність до відновлення Fe(ІІІ) знижувалась, але після 45 год. культивування у штама дикого типу вона поступово зростала, а у мутанта rib83 залишалась на низькому рівні (Рис. 2). Вірогідно, зростання фериредуктазної активності штама дикого типу у залізодефіцитних умовах сприяє кращому забезпеченню його залізом і є причиною диауксії росту у нього. Вміст заліза у його клітинах, як і у клітинах мутанта rib83, при цьому не змінювався і на протязі досліду становив 20 – 25 мкг/г сухих клітин. Таким чином, ген RIB83 дріжджів Р. guilliermondii проявляє плейотропну дію, здійснюючи позитивний контроль не тільки біосинтезу РФ, але і поглинання заліза.

4. Властивості подвійних мутантів rib80 rib81. Як було показано вище, регуляторні гени RIB80 і RIB83 є поліфункціональними: вони контролюють як біосинтез РФ, так і транспорт заліза. Таку ж поліфункціональність проявляють гени RIB81 і HIT1 [Шавловский с соавт., 1985, 1993; Стенчук с соавт., 1991]. Можна було припустити, що продукти цих генів якимось чином взаємодіють між собою. З метою вивчення можливої взаємодії регуляторних генів RIB80 і RIB81 було отримано штами, що містили їх мутантні алелі в одному гаплоїдному геномі. Для цього схрестили між собою мутанти 9-Д52/71 rib80 та 4-Д77/3 rib81 і з отриманого диплоїда виділили гаплоїдні мейотичні сегреганти. Наявність мутацій rib80-22 та rib81-131 у кожного з відібраних сегрегантів визначали шляхом його гібридизації з мутантами rib80 та rib81. Висока флавіногенна активність диплоїдів обох типів свідчила про те, що сегрегант має генотип rib80 rib81.

Для того, щоб встановити характер взаємодії регуляторних генів RIB80 і RIB81, порівнювали продуктивності флавіногенезу найбільш флавіногенних сегрегантів генотипу rib80 rib81 з продуктивністю флавіногенезу не вихідних штамів rib80 та rib81, а найбільш флавіногенних сегрегантів диплоїдів „rib80/RIB80” та „rib81/RIB81”. Вірогідно, таким способом можна обійти негативний вплив супресорних мутацій і порівнювати флавіногенні потенціали мутантних алелів регуляторних генів, коли вони знаходяться в оптимальному генетичному оточенні. Найпродуктивніші сегреганти генотипу rib81 диплоїда „rib81/RIB81” синтезували до 20 - 22 мкг РФ/мг сухих клітин, а генотипу rib80 диплоїда „rib80/RIB80” – до 3,5 – 4,5 мкг РФ/мг сухих клітин. Очевидно, що максимальна продуктивність флавіногенезу сегрегантів генотипу rib80 rib81 (40 – 45 мкг/мг) є значно вищою, ніж це могло б бути у випадку простого сумування максимальних ефектів мутацій rib80-22 і rib81-131 (рис. 3). Отже, мутації rib80-22 та rib81-131, що знаходяться в одному гаплоїдному геномі, стимулюють біосинтез РФ у Р. guilliermondii за типом синергізму.

Виявилось, що синергідна взаємодія мутацій rib80 та rib81 проявляється також на рівні дерепресії синтезу ГТФ-циклогідролази ІІ. У штаму 9-Д78/2 активність ГТФ-циклогідролази ІІ була у 3,5 раза вищою від максимальних значень активностей цього фермента у мутантів rib81, відомих з літератури [Шавловский с соавт., 1990, 1993; Бабяк с соавт., 1993]. Рівні активності РФ-синтази сегрегантів rib80 rib81 і мутантів rib81 суттєво не відрізнялися.

Для всіх досліджених сегрегантів генотипу rib80 rib81 характерна дуже висока швидкість поглинання 55Fe - на порядок вища, ніж у батьківських штамів. Таким чином, і в цьому випадку спостерігається синергідна дія мутацій rib80-22 і rib81-131. Визначення вмісту заліза в клітинах сегрегантів rib80 rib81 показало, що за його вмістом вони не відрізнялися суттєво від мутанта rib80. Тобто у цьому випадку синергідна взаємодія мутацій rib80-22 та rib81-131 не відбувається.

5. Властивості подвійних мутантів rib81 hit1. Для вивчення флавіногенного потенціалу мутації hit1-1 схрестили мутант 30-Д84/1 hit1 з штамом генетичної лінії L1. З отриманого диплоїда Д87/8 виділили мейотичні сегреганти, у яких визначили продуктивність флавіногенезу. Як і у випадку сегрегантів rib80 та rib81, для сегрегантів hit1 була характерна висока флавіногенна мінливість, очевидно, внаслідок різного генетичного оточення мутації hit1-1 у кожного окремо взятого сегреганта. Найбільш флавіногенні мейотичні сегреганти hit1 мали продуктивність флавіногенезу 4,5 – 5,5 мкг/мг.

Для того щоб отримати штами генотипу rib81 hit1, схрестили між собою мутанти 18-Д84/1 hit1-1 та 4-Д77/3 rib81-131 і з отриманого диплоїда Д85/122 виділили гаплоїдні мейотичні сегреганти. Наявність мутантних алелів обох регуляторних генів у окремих флавіногенних сегрегантів перевіряли за допомогою комплементаційного аналізу, схрещуючи їх з мутантами rib81 та hit1 протилежного типу спарювання. Висока флавіногенна активність диплоїдів обох типів, що були вирощені у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза, свідчила про те, що сегрегант має генотип rib81 hit1. Продуктивність флавіногенезу у частини подвійних сегрегантів досягала 70 – 80 мкг РФ/мг біомаси. Ці сегреганти росли у синтетичному середовищі значно гірше, ніж інші сегреганти диплоїда Д85/122, і швидко (протягом 2 - 3 тижнів) ревертували за ознакою „надсинтез РФ” до рівня сегрегантів rib81.

Враховуючи те, що у найбільш флавіногенних сегрегантів генотипу rib81 диплоїда „rib81/RIB81” продуктивність флавіногенезу становила 20 - 22 мкг/мг, а у сегрегантів hit1 диплоїда „hit1/HIT1” – лише 4,5 – 5,6 мкг/мг, можна зробити висновок, що мутації rib81-131 та hit1-1 взаємодіють між собою за типом синергізму у процесі біосинтезу РФ

6. Властивості потрійних мутантів rib80 rib81 rib83. Про те, що мутація rib83-6 епістатує над мутаціями rib80-75 та rib81-131 повідомлялося у 1989 році [Шавловский с соавт., 1989]. Такий висновок було зроблено на основі того, що подвійні мутанти rib80 rib83 і rib81 rib83 були нездатні до надсинтезу РФ у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза. Однак моногенність згаданих мутацій не була досліджена, а активності ферментів флавіногенезу у таких подвійних мутантів не визначались. Для того, щоб встановити тип взаємодії між мутацією rib83-6 і мутаціями rib80-22 та rib81-131, моногенність яких була доведена, сконструювали гаплоїдні штами генотипу rib80 rib83, rib81 rib83 та rib80 rib81 rib83. Представлені на рис. 4 результати свідчать про те, що мутація rib83-6 блокує надсинтез РФ не тільки у подвійних мутантів rib80 rib83 і rib81 rib83, але і у потрійного мутанта rib80 rib81 rib83 як у залізодефіцитному середовищі, так і у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза, незважючи на те, що мутації rib80-22 і rib81-131 при сумісній дії посилюють біосинтез РФ за типом синергізму, а у залізодефіцитному середовищі у мутантів rib80, rib81 та rib80 rib81 відбувається ще й додаткове зростання надсинтезу РФ.

Раніше було показано, що у мутантів rib83 у залізодефіцитному середовищі дерепресія синтезу ферментів флавіногенезу не відбувається [Шавловский с соавт., 1989] і це, очевидно, є причиною їх нездатності до надсинтезу РФ порівняно з штамами дикого типу. Відсутність дерепресії синтезу ГТФ-циклогідролази ІІ і РФ-синтази було виявлено не тільки у подвійних мутантів rib80 rib83 і rib81 rib83, але і у потрійного мутанта rib80 rib81 rib83 як у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза, так і у залізодефіцитному середовищі. Це, вірогідно, і є причиною нездатності цих мутантів до надсинтезу РФ. Очевидно, ген RIB83 відіграє центральну роль у регуляції біосинтезу РФ. Пошкодження цього гена приводить до блокування дії всіх відомих факторів, що викликають надсинтез РФ.

7. Розробка підходів та конструювання штаму-реципієнта для клонування гена RIB83 з банку генів дріжджів P. guilliermondii методом функціональної комплементації. Властивість мутації rib83-6 епістатувати над мутацією rib81-131 була використана при конструюванні штама реципієнта, за допомогою якого була створена система для клонування гена RIB83. У 1991 році було описано мутант rib1-86, який за своїм фенотипом нагадував мутанти rib1 (фенотип Rib-), але, на відміну від них, втрачав свою РФ-залежність після пошкодження у нього гена RIB81 [Шавловский с соавт., 1991]. Пізніше було показано, що виділений мутант rib1-86 є брадітрофним (leaky) мутантом по гену RIB1, а також виявлено значне підвищення експресії гена RIB1 у мутанта rib81, що був вирощений у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза [Boretsky et al., 2005]. Вірогідно, мутація rib81-131 викликає надсинтез мутованого білка ГТФ-циклогідролази II. Це приводить до синтезу невеликої кількості РФ, достатньої для росту подвійного мутанта rib1-86 rib81 (фенотип Rib+).

Введення мутації rib83-6 у геном мутанта rib1-86 rib81 приводило до РФ-ауксотрофності (фенотип Rib-) потрійного мутанта rib1-86 rib81 rib83 – реципієнта. Очевидно, мутація rib83-6 повністю виключає дію мутації rib81-131, тому введення гена RIB83 у складі плазмід у клітини такого потрійного мутанта буде приводити до відновлення дії мутації rib81-131 і, як наслідок, до появи клонів з фенотипом Rib+, які можна було б відбирати на синтетичному середовищі без РФ. Це спостереження стало основою для розробки системи клонування гена RIB83 Р. guilliermondii з бібліотеки генів цих дріжджів методом функціональної комплементації.

Для того, щоб провести таке клонування, було відібрано стабільний штам rib1-86, сконструювано стабільний потрійний мутант rib1-86 rib81 rib83 (реципієнт), підібрано метод трансформації і оптимальні параметри електропорації, сконструйовано бібліотеку генів дріжджів Р. guilliermondii, проведено трансформацію реципієнта банком генів, перевірено відібрані трансформанти на наявність плазмід, здійснено ретрансформацію реципієнта виділеними плазмідами. В одному з дослідів по трансформації штама E. coli DH5б плазмідним препаратом з дріжджового трансформанта №21 було отримано 6 колоній, з яких була виділена плазміда, що мала більший розмір, ніж вихідний вектор рUC-ARS. Ця плазміда (позначена pN1) з низькою ефективністю (10 трансф./мкг ДНК) трансформувала штам-реципієнт до прототрофності за РФ. Виділена з дріжджових трансформантів плазміда pN1 за молекулярною масою не відрізнялась від плазміди, що була виявлена у трансформантах E.