Національна академія наук України

Інститут фізіології рослин і генетики

КОЛУПАЄВ Юрій Євгенович

УДК 581.13: 581.1.036.2: 581.1.632.122.1

ФІЗІОЛОГО-БІОХІМІЧНІ МЕХАНІЗМИ ФОРМУВАННЯ АДАПТИВНИХ РЕАКЦІЙ РОСЛИН: РОЛЬ АКТИВНИХ ФОРМ КИСНЮ ТА ІОНІВ КАЛЬЦІЮ

03.00.12 – фізіологія рослин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ - 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Харківському національному аграрному університеті ім. В.В.Докучаєва

Науковий консультант доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Косаківська Ірина Василівна
Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, заступник директора з наукової роботи, головний науковий співробітник

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Яворська Вікторія Казимирівна
Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, завідувач відділу фізіології росту і розвитку рослин

член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор Кордюм Єлизавета Львівна

Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, завідувач відділу клітинної біології

доктор біологічних наук, професор Паршикова Тетяна Вікторівна

Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, завідувач кафедри фізіології і екології рослин

Захист відбудеться 26 березня 2008 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01 Інституту фізіології рослин і генетики НАН України (03022, Київ, вул. Васильківська, 31/17)

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України (03022, Київ, вул. Васильківська, 31/17)

Автореферат розіслано 22 лютого 2008 р.

Учений секретар спеціалізованої

ученої ради д.б.н. Є.Ю. Мордерер

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Пізнання механізмів стійкості рослин до несприятливих умов навколишнього середовища в останні десятиліття увійшло до числа найактуальніших проблем фітофізіології і загальної біології. Це зумовлено передусім глобальними кліматичними змінами і посиленням впливу на рослини чинників антропогенного походження (ксенобіотики, різні види випромінювання тощо) [Мокроносов, 2000]. Крім сільськогосподарського аспекту, проблема стійкості має велике природно-екологічне значення, адже здатність рослин адаптуватися до умов існування – один із факторів, що визначає ареали поширення видів на планеті і можливість їх інтродукції [Косаківська, 2003, Кордюм и др., 2003, Трунова, 2007].

Упродовж більшої частини 20 століття досліджувалася феноменологія загального адаптаційного синдрому і фізіологічних змін, що супроводжують пристосування рослин до конкретних несприятливих чинників. Було встановлено, що адаптаційний синдром є необхідним етапом формування пристосувальних реакцій, фактором збереження гомеостазу [Веселовский, 1993, Lichtanthaler, 1998, Таран, 2001]. На якісно новому рівні дослідження механізмів адаптації рослин почалися після з’ясування загальних принципів трансдукції стресових сигналів в їх клітинах, ідентифікації генів і кодованих ними специфічних білків, причетних до розвитку стійкості [Яворская, Драговоз, 1999, Тарчевский, 2002, Дмитриев, 2003, Kacperska, 2004, Bhattacharjee, 2005]. Разом з тим, гіпотези щодо сигнальної ролі окремих сполук (іонів), вміст і внутрішньоклітинна компартментація яких змінюється за умов стресу, потребували експериментального обґрунтування.

До ранніх реакцій організму на дію стресорів відносять посилення утворення активних форм кисню (АФК) і активацію пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ). В останні десятиліття досить активно досліджується роль АФК в стійкості рослин до дії патогенів. Проте майже не з’ясованим залишається фізіологічне значення зрушення тканинного балансу антиоксидантів та прооксидантів у бік останніх (окиснювальний стрес) за дії абіотичних стресорів. Так, одними авторами розглядається зв’язок між нагромадженням АФК, продуктів ПОЛ та ступенем пошкодження тканин рослин за дії екстремальних факторів [Scandalios, 2002]. Водночас іншими дослідниками висловлюється припущення про роль АФК і продуктів ПОЛ як медіаторів, необхідних для запуску захисних реакцій рослинного організму [Dat et al., 2000, Suzuki, Mittler, 2006], хоча дотепер практично відсутні прямі докази участі АФК в індукуванні стійкості рослин до абіотичних стресорів. Мало відомо про те, які саме захисні реакції, корисні для розвитку стійкості до несприятливих абіотичних чинників, індукуються за зміни окиснювально-відновного балансу.

Разом з цим останнім часом активно досліджується роль кальцію як вторинного месенджера, що бере участь у передачі сигналів в рослинних клітинах. Іони Са2+ прямо чи опосередковано задіяні у роботі більшості сигнальних систем рослинних клітин [Медведев, 2005, Kaur, Gupta, 2005]. Проте відомості щодо впливу екзогенного кальцію і внутрішньоклітинного його пулу на стійкість рослин залишаються вельми суперечливими. Так, є дані щодо підвищення іонами Са2+ чутливості рослинних клітин до абіотичних стресорів [Бияшева и др., 1993, Лукаткин и др., 1997], з другого боку, нагромаджено і досить чисельні відомості про зростання стійкості рослин до несприятливих чинників під впливом екзогенного кальцію [Gong et al., 1998, Nayyar, Kaushal, 2002]. Встановлене важливе значення кальцію для розвитку окиснювального стресу як складової реакції надчутливості за ураження рослин патогенами [Grant et al., 2000]. Водночас недостатньо доказів причетності іонів кальцію до регуляції процесу генерації АФК і окиснювально-відновного балансу (зокрема, активності про-/антиоксидантних ферментів) у рослинних тканинах за дії абіотичних стресорів, з іншого боку, неоднозначними залишаються і відомості стосовно впливу потенційних агентів окиснювального стресу на кальцієвий статус рослинних клітин [Sagi, Fluchr, 2006]. В цілому значення зв’язків Са2+ та АФК, як компонентів сигнальної мережі рослинних клітин, в адаптації рослин є маловивченим, особливо за дії абіотичних стресорів [Rentel, Knight, 2004].

У зв’язку з викладеним з використанням чинників різної природи досліджувалися характер і механізми змін окиснювально-відновного балансу при індукуванні стійкості рослин до абіотичних стресорів, а також значення генерації АФК рослинними тканинами і роль кальцієвого статусу у запуску конкретних адаптивних реакцій.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася згідно з планом науково-дослідних робіт Харківського національного аграрного університету ім. В.В.Докучаєва в рамках міжкафедральної (кафедра ботаніки і фізіології рослин та кафедра загальної хімії) держбюджетної теми № 38.02 “Дослідження неспецифічних стресових реакцій рослин: біохімічні аспекти” (р/№ 0107U005809), керівником і виконавцем якої був дисертант.

Мета і завдання дослідження. Основною метою роботи було з’ясування ролі АФК та іонів кальцію як взаємопов’язаних інтермедіатів єдиної системи передачі стресових сигналів у рослинних клітинах у формуванні стійкості рослин до дії абіотичних стресорів. Відповідно було поставлено такі завдання:

- з’ясувати особливості впливу екзогенних пероксиду водню, саліцилової кислоти (СК), абсцизової кислоти (АБК) та іонів Са2+ як можливих агентів окиснювального стресу на стійкість рослинних тканин до гіпертермії і дії NaCl;

- дослідити часову динаміку вмісту АФК і продуктів ПОЛ за індукування стійкості рослин природними агентами окиснювального стресу та гіпертермії та після дії засолення середовища;

- встановити можливість супресії антиоксидантами фізіологічних ефектів агентів окиснювального стресу;

- оцінити значення змін активності гваяколпероксидази, супероксиддисмутази (СОД) і каталази в регуляції окиснювально-відновного балансу в рослинних тканинах за дії екзогенних індукторів окиснювального стресу та пошкоджуючих чинників;

- виявити можливу роль кальцію як сигнального інтермедіата в реалізації фізіологічних ефектів саліцилату та Н2О2;

- дослідити особливості сумісної дії іонів кальцію та пероксиду водню на показники окиснювального метаболізму рослинних об’єктів за умов гіпертермії та їх теплостійкість;

- визначити можливість індукування нагромадження низькомолекулярних поліфункціональних протекторів (пролін, розчинні вуглеводи) агентами окиснювального стресу і довести наявність зв’язку цих ефектів зі змінами вмісту АФК в рослинних тканинах;

- вивчити вплив штучних антиоксидантів на теплостійкість, показники окиснювально-відновного балансу та порівняти їх ефекти з дією агентів окиснювального стресу, здатних підвищувати стійкість рослин до абіотичних стресорів.

Об’єкт дослідження: процес формування адаптивних реакцій рослин за участю Н2О2, СК, АБК та іонів Са2+.

Предмет дослідження: маркери окиснювального метаболізму (динаміка генерації АФК, активності прооксидантних ферментів) та захисних реакцій (зміни вмісту низькомолекулярних поліфункціональних протекторів, активності компонентів антиоксидантної системи) рослин.

Методи дослідження. У роботі застосовувалися прийоми модифікації прооксидантно-антиоксидантного, кальцієвого і гормонального статусу рослинних об’єктів, а також методи інгібіторного (фармакологічного) аналізу. При проведенні біохімічних аналізів (визначення вмісту АФК і продуктів ПОЛ, активності про-/антиоксидантних ферментів, вмісту проліну та розчинних вуглеводів, вмісту білка) використовувалися переважно спектрофотометричні методи. Фізіологічний стан рослин та ізольованих органів після дії стрес-факторів оцінювався за кількісними показниками (виживання, інгібування росту, вихід електролітів з тканин). Для оцінки достовірності досліджуваних ефектів застосовувалися класичні методи статистичної обробки результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Сформульовано положення, відповідно до якого керований окиснювальний стрес розглядається як індуктор адаптивних реакцій рослинного організму, що призводять до підвищення стійкості до абіотичних стресорів (гіпертермія, дія солей тощо), а не як чинник пошкоджень. Запропоновано й експериментально обгрунтовано гіпотетичний механізм зв’язків між АФК та іонами кальцію як інтермедіатами запуску адаптивних реакцій рослин на абіотичні стресори. Згідно з ним індукування стійкості рослин відбувається за умови взаємопов’язаного зростання вмісту АФК і посилення надходження іонів Са2+ в цитозоль.

Вперше показано, що ефект індукування екзогенними СК, АБК та іонами кальцію стійкості рослин до нагрівання і дії NaCl реалізується з участю АФК.

Доведено, що у виникненні окиснювального стресу, індукованого дією на рослинні тканини екзогенною СК, задіяні кальцієві канали і кальмодулін. Отримано свідчення щодо ролі Са2+-каналів в розвитку в рослинах ПОЛ, спричиненого екзогенним пероксидом водню.

Вперше встановлено, що сумісна обробка рослинних тканин екзогенними сіллю кальцію та пероксидом водню в нетоксичних концентраціях може призводити до розвитку некерованого окиснювального стресу за умов нагрівання рослинних об’єктів. Комбінована обробка рослинних тканин екзогенними іонами кальцію та пероксидом водню з наступним ушкоджуючим нагріванням розглядається як модель синергічних порушень кальцієвого та окиснювального гомеостазу.

Показано, що тимчасове підвищення вмісту АФК в рослинних тканинах під впливом СК пов’язане не стільки з інгібуванням каталази, як вважалося раніше, скільки з одночасними різноспрямованими змінами активності кількох ферментів окиснювального метаболізму (гваяколпероксидази, СОД, каталази). На підставі одержаних експериментальних даних запропонований гіпотетичний механізм виникнення окиснювального стресу в рослинних клітинах під впливом СК.

Доведено, що екзогенні індуктори окиснювального стресу (пероксид водню, СК, іони кальцію) здатні спричиняти нагромадження в рослинах поліфункціональних низькомолекулярних протекторів. Вперше показано, що антиоксиданти пригнічують захисні реакції нагромадження в рослинах проліну та розчинних вуглеводів, індуковані дією СК та іонів кальцію.

Теоретичне і практичне значення. Представлена робота є фундаментальним дослідженням, яке істотно доповнює сучасні уявлення про функціонування сигнальних систем рослинних клітин за стресових умов та створює теоретичні основи для керування адаптивними реакціями рослин.

Отримані результати є передумовою для обґрунтування нової парадигми захисту рослин від окиснювальних пошкоджень шляхом індукування їх власної антиоксидантної системи за допомогою передобробки агентами окиснювального стресу у помірних дозах. Ці підходи відрізняються від традиційних, що зводяться до застосування штучних антиоксидантів.

Результати дослідження можуть бути використані при розробці методів оцінки дії синтетичних препаратів як потенційних індукторів стійкості рослин, виборі критеріїв визначення стресового стану рослин.

Експериментальні дані й теоретичні узагальнення використовуються при читанні спецкурсу “Фізіологія стійкості рослин”, загального курсу “Фізіологія рослин” в Харківському національному аграрному університеті ім. В.В.Докучаєва. Вони можуть бути використані у навчальному процесі на біологічних факультетах класичних університетів та в інших аграрних і педагогічних вищих навчальних закладах, а також у наукових установах, які здійснюють дослідження в галузі фізіології стресу і адаптації рослин.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана автором особисто. Дисертантом самостійно здійснені інформаційний пошук та аналіз літературних джерел, визначено мету і завдання дослідження, розроблені робочі гіпотези та методологія постановки експериментів, інтерпретовано та узагальнено результати, підготовлено друковані праці. Експериментальні дослідження проводилися автором особисто та за участю здобувача кафедри ботаніки і фізіології рослин ХНАУ Карпця Ю.В. і магістрантки Акініної Г.Є. Частка особистої участі в основних колективних публікаціях становить 80-90 %.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційного дослідження були представлені на Міжнародному симпозіумі “Фізико-хімічні основи фізіології рослин” (Росія, 1996), ХI і ХII з’їздах Українського ботанічного товариства (Харків, 2001; Одеса, 2005), Третьому з’їзді Українського товариства фізіологів рослин (Тернопіль, 2002), Міжнародній конференції “Проблеми сучасної екології” (Запоріжжя, 2002), Другій і Третій Міжнародних конференціях “Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти” (Львів, 2004, 2007), Міжнародній науковій конференції “Актуальні питання ботаніки і фізіології рослин” (Росія, 2004), Міжнародній науковій конференції “Ріст і розвиток рослин: теоретичні і практичні проблеми” (Литва, 2004), 8-й Міжнародній науковій конференції “Актуальні проблеми збереження стійкості живих систем” (Росія, 2004), Першій і Другій Всеукраїнських наукових конференціях “Сучасні проблеми фізіології та інтродукції рослин” (Дніпропетровськ, 2005; 2007), XV Конгресі Федерації європейських товариств біологів рослин (Франція, 2006), IX Українському біохімічному з’їзді (Харків, 2006), Міжнародній конференції “Сучасні проблеми біології, екології та хімії” (Запоріжжя, 2007), VI з’їзді Товариства фізіологів рослин Росії: Міжнародна конференція “Сучасна фізіологія рослин: від молекул до екосистем” (Росія, 2007), ІІ З’їзді Українського товариства клітинної біології (Київ, 2007) та інших конференціях.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 52 наукові праці, у тому числі 27 статей у провідних фахових виданнях та одна монографія.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, 6 розділів (огляд літератури, опис об’єктів і методів досліджень, чотири експериментальні розділи), узагальнення результатів досліджень, висновків. Список цитованої літератури містить 508 джерел. Дисертація викладена на 340 сторінках, ілюстрована 74 рисунками, містить 15 таблиць і 7 схем.

ОБ’ЄКТИ, УМОВИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єкти досліджень. Основними об’єктами досліджень були відрізки колеоптилів та етіольовані проростки озимої м’якої пшениці (Triticum aestivum L.) сорту Донецька 48. Окремі експерименти проводили на сортах пшениці Донецька 46, Харківська 81, Харківська 96. Вибір етіольованих проростків або їх частин як об’єктів досліджень зумовлений складністю регуляції про-/антиоксидантної рівноваги в зелених частинах рослин. Водночас незелені органи рослин - корені та колеоптилі, а також інтактні етіольовані проростки - можуть бути чутливими моделями для створення експериментального окиснювального стресу [Минибаева и др., 1997]. Для попередження можливого розвитку явищ апоптозу в колеоптилях під час досліджень насіння пшениці пророщували 4 доби за температури 18-20°С, а експерименти з ізольованими колеоптилями закінчували на 6-7добу. При цьому в контрольних колеоптилях, що не зазнавали стресу, не спостерігалося змін, які б могли свідчити про початок апоптозних явищ (вміст білка і показники окиснювального метаболізму залишалися стабільними). Частину досліджень проводили також на етіольованих проростках ярого ячменю (Hordeum vulgare L. – сорт Козак) та ізольованих сім’ядолях огірка (Cucumis sativum L. – сорт Джерело).

Обробка рослинного матеріалу ефекторами. Як агенти окиснювального стресу використовували пероксид водню або сполуки, здатні посилювати генерацію АФК тканинами (СК, іони кальцію, АБК).

У дослідах з вивчення ефектів блокаторів кальцієвих каналів використовували блокатор потенціалзалежних кальцієвих каналів верапаміл, а також хлориди лантану та кобальту (LaCl3 i CoCl2), що блокують різні типи кальцієвих каналів [Дячок и др., 1997]. Крім того, досліджували ефекти антагоніста кальмодуліну хлорпромазину.

Для оцінки внеску білоксинтезуючої системи в реалізацію дії досліджуваних ефекторів використовували інгібітор синтезу білка на 80S рибосомах циклогексимід (ЦГ).

З метою з’ясування ролі АФК в реалізації ефектів екзогенних СК, кальцію і АБК на рослинні об’єкти використовували антиоксиданти іонол та глутатіон. Дослідження включали також оцінку впливу диметилсульфоксиду (ДМСО) на теплостійкість проростків і відокремлених колеоптилів пшениці та показники окиснювально-відновного балансу. В окремій серії експериментів вивчалася дія екзогенного цитокініну (кінетин) на теплостійкість сім’ядолей огірка та вміст в них пероксидів [Колупаєв та ін., 2006].

В експериментах з колеоптилями пшениці досліджувані речовини додавали в основне середовище їх інкубації (2%-ний розчин сахарози). Сім’ядолі огірка інкубували на дистильованій воді (контроль), у дослідні варіанти додавали відповідні ефектори. В інтактні проростки пшениці та ячменю досліджувані сполуки вводили шляхом інкубації кореневої системи у відповідних розчинах.

Дія стрес-факторів на досліджувані об’єкти. У роботі вивчали вплив жорстких (потенційно летальних) “доз” стрес-факторів [Мелехов, 1985] і оцінювали їх ефекти за рівнем виживання об’єктів досліджень.

Як основний абіотичний стресор використовували ушкоджуюче нагрівання. Нагрівання здійснювали, занурюючи досліджувані об’єкти (етіольовані проростки пшениці або ячменю, відрізки колеоптилів пшениці, сім’ядолі огірка) у ванну водного ультратермостату на 10 хв. Температуру прогріву вибирали на підставі результатів попередніх дослідів. Для колеоптилів пшениці в різних серіях дослідів вона становила 43-45 єС, для інтактних проростків пшениці та ячменю - 44,5-45,0 єС, для сім’ядолей огірка – 46-47 єС.

Досліджували також дію осмотичного і сольового стрес-факторів на рослинні об’єкти. Вплив зневоднення вивчали на прикладі колеоптилів пшениці, які занурювали на 3 год у 25%-ний ПЕГ-4000. Ефекти засолення середовища досліджували на колеоптилях та інтактних проростках пшениці. Відрізки колеоптилів експонували 48 год у вологій камері на фільтрувальному папері, зволоженому 2%-ним розчином сахарози з додаванням 0,4 М NaCl. У випадку з проростками пшениці їх кореневу систему занурювали в 4% (0,68 М) NaCl на 5 год, далі відмивали від солі і переносили зразки на воду.

Біохімічні аналізи. Для характеристики окиснювально-відновного балансу оцінювали генерацію рослинними об’єктами супероксидного радикала (за відновленням нітротетразолію синього) [Шоринг и др., 2000], вміст пероксидів в тканинах [Sagisaka, 1976] та кінцевих продуктів ПОЛ – тіобарбітурат-активних (ТБК-активних) сполук [Мерзляк и др., 1978].

Активність розчинної пероксидази та іоннозв’язаної пероксидази клітинних стінок (КФ 1.11.1.7) визначали за методом Ріджа і Осборна [Ridge, Osborne, 1970] з деякими модифікаціями [Колупаев и др., 2005], як відновник використовували гваякол. Активність СОД (КФ 1.15.1.1) визначали за методом, описаним Чеварі та співавт. [Чевари и др., 1985]. Активність каталази (КФ 1.11.1.6) визначали за кількістю розкладеного Н2О2 [Королюк и др., 1988].

Вміст білка в рослинному матеріалі визначали за [Bradford, 1976], проліну - за методом Бейтса [Bates, 1973], вміст відновних цукрів та суму розчинних вуглеводів - ферроціанідним методом [Арасимович, 1987].

Виживання рослинних об’єктів оцінювали візуально. Стан колеоптилів пшениці визначали через 48 год після дії стресора. Ушкоджені колеоптилі набували специфічного відтінку і втрачали тургор [Мелехов и др., 1983]. Виживання проростків пшениці та ячменю оцінювали за їх здатністю до росту після дії несприятливого фактора. Оцінку проводили через 3-4 доби після дії стресора, при цьому 2-3 останні доби проростки інкубувалися на світлі (2 клк, фотоперіод 14 год). Виживання сім’ядолей огірка визначали через 4 доби після ушкоджуючого нагрівання [Анев и др., 1987].

Статистичну обробку результатів проводили за загальноприйнятими методами [Лакин, 1990]. Крім випадків, відзначених окремо, обговорюються результати, достовірні при Р ? 0,05.

ОКИСНЮВАЛЬНИЙ СТРЕС І СТІЙКІСТЬ РОСЛИН ДО НЕСПРИЯТЛИВИХ АБІОТИЧНИХ ЧИННИКІВ

Одним із досить простих і водночас інформативних методичних підходів з’ясування ролі АФК в індукуванні стійкості рослин є штучна зміна окиснювально-відновного балансу в тканинах. З такою метою може бути використана як обробка рослинних об’єктів стабільними екзогенними АФК, наприклад, пероксидом водню, так і сполуками – індукторами утворення ендогенних АФК в рослинних тканинах. Ми досліджували вплив екзогенних пероксиду водню, СК і хлориду кальцію на тепло- і солестійкість ізольованих органів рослин (колеоптилі пшениці, сім’ядолі огірка) та інтактних проростків пшениці. В окремих експериментах вивчалася дія СК на теплостійкість проростків ячменю.

Передобробка колеоптилів 1 і 10 мМ розчином Н2О2 підвищувала їх виживання після ушкоджуючого нагрівання на 16-20% (рис. 1, А). Дія Н2О2 у 20 мМ концентрації виявляла ознаки токсичного ефекту (торцеві некрози), хоча й незначною мірою підвищувала їх виживання після нагрівання. Низькі концентрації пероксиду водню були неефективними, ймовірно, через швидке розщеплення Н2О2 позаклітинними формами антиоксидантних ферментів

Під впливом Н2О2 підвищувалася стійкість колеоптилів до дії тривалого сольового стресу (рис. 1, Б). При цьому діапазон ефективних концентрацій пероксиду водню не відрізнявся від встановлених у дослідах з тепловим стресом і складав 1-10 мМ.

Рис. 1. Вплив екзогенного Н2О2 на виживання (%) колеоптилів пшениці після ушкоджуючого нагрівання (43°С, 10 хв) (А) та сольового стресу (0,4 М NaCl, 48 год) (Б).

Підвищення стійкості рослин до абіотичних стресорів спостерігалося і за дії СК. У певному (відносно вузькому) концентраційному діапазоні вона підвищувала теплостійкість усіх досліджуваних об’єктів (табл. 1). Необхідно наголосити, що підвищені концентрації СК, які не виявляли токсичних ефектів, тобто не впливали на життєздатність рослинних об'єктів за фізіологічно нормальних умов, знижували їх теплостійкість. Такі ефекти спостерігалися за двогодинної дії на колеоптилі 250 мкМ СК, 24 год впливу на інтактні проростки пшениці 100 мкМ СК або добового впливу 100 мкМ саліцилату на сім’ядолі огірка. Як показали спеціальні експерименти з визначення вмісту продуктів ПОЛ, при цьому підвищені концентрації СК спричиняли надмірний (некерований) окиснювальний стрес у досліджуваних об’єктів (див. нижче).

Таблиця 1

Вплив саліцилової кислоти на виживання проростків та ізольованих органів різних видів рослин після потенційно летального нагрівання

Об’єкт дослідження | Температ. прогріву, 0С | Концентрація СК (М) та виживання (%)

0 (контроль) | 10-710-610-510-42,5·10-4

Cucumis sativus L. (сім’ядолі) | 460,2 | 46,12,7 | 48,72,1 | 67,03,0 | 59,92,6 | 40,22,9 | -

Triticum aestivum L. (проростки) | 440,1 | 51,73,2 | 74,84,5 | 81,13,7 | 56,73,3 | 43,63,3 | -

Triticum aestivum L. (колеоптилі) | 430,1 | 47,83,4 | - | 50,14,1 | 68,94,2 | 55,24,7 | 21,36

Hordeum vulgare L. (проростки) | 440,1 | 67,02,9 | - | 78,33,6 | 85,82,9 | 68,73,4 | -

Підвищення стійкості рослинних об’єктів викликав й екзогенний кальцій. 16-20-годинна інкубація колеоптилів пшениці на розчинах СаCl2 призводила до підвищення їх виживання після дії теплового і осмотичного стресів (рис. 2). Ефективними виявилися досить високі концентрації іонів кальцію – 5-50 мМ. Однак такі ефекти не пов’язані з осмотичною дією кальцію, адже обробка колеоптилів індиферентним (метаболічно неактивним) вуглеводом маннітом не призводила до підвищення їх стійкості [Колупаев и др., 2002]. Ідентичні результати отримані на інтактних проростках пшениці [Колупаев, Карпец, 2006].

З метою оцінки ролі АФК у формуванні адаптивних реакцій з’ясовували, чи супроводжувалося описане вище підвищення стійкості рослин до дії абіотичних стресорів під впливом екзогенних пероксиду водню, СК та хлориду кальцію, змінами показників про-/антиоксидантної рівноваги.

Рис. 2. Вплив СаCl2 на виживання (%) колеоптилів пшениці після теплового (а) (440С, 10 хв) і осмотичного (б) (25% ПЕГ-4000, 3 год) стресів.

Обробка колеоптилів екзогенним пероксидом водню (1-10 мМ) призводила до збільшення вмісту пероксидів приблизно в 3 рази, але він був на 5 порядків нижчим від концентрації Н2О2 в інкубаційному середовищі і знаходився в межах фізіологічних концентрацій [Колупаєв, Карпець, 2007]. Під впливом 1 та 10 мМ Н2О2 вміст ТБК-активних продуктів зростав відповідно в 1,4-1,5 раза. Проте після ушкоджуючого нагрівання у зразках, оброблених перед стресом пероксидом водню, вміст пероксидів і ТБК-активних продуктів був значно меншим від контролю, в якому відзначалося зростання цих показників [Колупаєв, Карпець, 2007, Kolupaev, 2007].

СК в концентраціях, що підвищували теплостійкість рослинних об’єктів, як і екзогенний пероксид водню, викликала тимчасове зростання вмісту пероксидів в тканинах [Колупаев, Карпец, 2005, Колупаєв та ін., 2006]. Посилення генерації рослинами АФК, як правило, призводить до підвищення інтенсивності ПОЛ [Меньшикова, Зенков, 1993]. Такий ефект спостерігався нами і у разі обробки колеоптилів СК [Колупаєв, Акініна, 2005]. Ми порівняли вплив на інтенсивність ПОЛ СК в концентрації, що чинила захисний ефект (10 мкМ) і посилювала пошкодження (250 мкМ, див. табл. 1). Після двогодинної обробки 10 мкМ СК вміст ТБК-активних продуктів в тканинах зростав приблизно на 25%, дія 250 мкМ СК призводила до дворазового збільшення вмісту ТБК-активних продуктів. Тепловий стрес спричиняв додаткове підвищення вмісту продуктів ПОЛ у колеоптилях, оброблених СК, що спостерігалося через 1 год після нагрівання (рис. 3). У разі обробки 10 мкМ СК це явище не пов’язане з пошкодженням колеоптилів, оскільки вже через 3 год після теплового стресу (5 год від початку експерименту) вміст ТБК-активних продуктів у зразках, оброблених СК, був набагато нижчим порівняно з контролем і меншим за передстресовий. Через 24 год після нагрівання вміст продуктів ПОЛ дещо збільшувався як у контролі, так і у варіанті з 10 мкМ СК, водночас вміст ТБК-активних продуктів у дослідному варіанті був значно меншим від контролю (рис. 3). Зовсім іншою була динаміка ПОЛ в колеоптилях, оброблених 250 мкМ СК. Відбувалося незворотне підвищення інтенсивності ПОЛ після нагрівання, тобто мав місце розвиток некерованого окиснювального стресу. Вміст ТБК-активних продуктів досягав високих значень і не зменшувався в ході післястресової інкубації колеоптилів (рис. 3). Отже, захисний ефект (підвищення виживання колеоптилів після нагрівання) СК викликала лише в концентрації, яка спричинювала керований (оборотний) окиснювальний стрес. Висока концентрація СК, яка призводила до незворотного посилення ПОЛ, знижувала показники виживання колеоптилів.

Рис. 3. Вплив СК на вміст ТБК-активних продуктів (нмоль/г сух. речовини) в колеоптилях пшениці до і після нагрівання (43 єС, 10 хв). 1 - контроль (2% сахароза), 2 - 2% сахароза + 10 мкМ СК, 3 - 2% сахароза + 250 мкМ СК. Фігурною дужкою позначено час обробки колеоптилів СК, після чого їх відразу прогрівали.

Іони кальцію, які ми розглядаємо як потенційний агент окиснювального стресу, також призводили до підвищення вмісту АФК в рослинних тканинах. Так, інкубація колеоптилів на середовищі з СаСl2 спричинювала достовірне підвищення (на 35%) вмісту пероксидів (рис. 4). Іншою була картина після теплового стресу. Через 1 год після ушкоджуючого нагрівання вміст пероксидів в колеоптилях контрольного варіанта достовірно не змінювався. Водночас у відрізках, оброблених іонами кальцію, цей показник зменшувався. Через 24 год після стресового впливу в контролі виявлялася тенденція до збільшення вмісту пероксидів, у варіанті з СаСl2 відбувалося подальше зниження вмісту пероксидів (рис. 4). Схожа картина відзначалася і при визначенні генерації зразками супероксидного радикала [Колупаев, Карпец, 2005] та оцінці вмісту в них ТБК-активних продуктів [Колупаев и др., 2005]: “попередній” окиснювальний стрес, спричинений обробкою рослинних тканин екзогенним кальцієм, зменшував його прояви після наступного ушкоджуючого нагрівання колеоптилів або інтактних проростків пшениці.

Рис. 4. Вміст пероксидів (нмоль Н2О2 /г сухої речовини) в колеоптилях пшениці за дії іонів кальцію (5 мМ) і ушкоджуючого нагрівання (430С, 10 хв). 1 – контроль (2% сахароза), 2 - 2% сахароза + 5 мМ CaCl2.

Значення окиснювального сплеску, спричинюваного екзогенними пероксидом водню, СК та іонами кальцію в реалізації захисних ефектів було доведено в експериментах з усуванням нагромадження АФК антиоксидантами. Є відомості, що обробка рослин антиоксидантами може пригнічувати індукований СК синтез PR-білків, необхідний для формування стійкості рослин до патогенів [Wendehene et al., 1998]. Водночас такий методичний підхід за умов дії абіотичних стресорів не використовувався. У зв’язку з цим дію СК на теплостійкість колеоптилів та інтактних етіольованих проростків пшениці, а також сім’ядолей огірка досліджували у поєднанні з антиоксидантами – глутатіоном та іонолом. На прикладі колеоптилів та інтактних проростків пшениці вивчали також сумісну дію іонів кальцію та іонолу на теплостійкість та показники окиснювально-відновного балансу.

Рис. 5. Генерація супероксидного радикала інтактними проростками пшениці (% до контролю без нагрівання та обробки модифікаторами окиснювального метаболізму). а – через 4 год від початку обробки СК або через 6 год від початку обробки іонолом; б - через 24 год від початку обробки СК або через 26 год від початку обробки іонолом; в, г – відповідно через 1 і 24 год після нагрівання проростків при 440С; д – через 24 год після перенесення проростків, що не зазнавали нагрівання, з розчинів модифікаторів окиснювального метаболізму на дистильовану воду. 1 – контроль (дистильована вода), 2 – СК (1 мкМ), 3 – іонол (90 мкМ), 4 – СК (1 мкМ) + іонол (90 мкМ).

Інкубація проростків пшениці у розчині СК спричинювала посилення генерації ними супероксидного радикала (рис. 5, а). Необхідно зауважити, що через 4 год від початку експерименту підвищувалася і генерація „зовнішнього” супероксиду контрольними проростками. Такий ефект може бути пов’язаний з перенесенням проростків на початку експерименту у свіжу дистильовану воду, що спричинювало механічний стресовий вплив на корені [Часов и др., 2005]. Надалі (через 24 год інкубації) генерація супероксиду проростками як в контролі, так і у варіанті з СК зменшувалася. Проте і в цьому випадку виділення О2.- проростками, обробленими СК, приблизно на 30% перевищувало величину контролю (рис. 5, б). Іонол знижував генерацію супероксиду проростками і повністю знімав ефект СК (див. рис. 5, а, б).

Через 1 год після нагрівання посилювалася генерація О2.- проростками усіх варіантів, при цьому відмінності між варіантами досліду нівелювалися. Через 24 год після нагрівання утворення супероксиду зменшувалося, а вірогідної різниці між варіантами не було (рис. 5, в, г). Необхідно зауважити, що у проростках, які не нагрівали, генерація О2.- через добу після перенесення на дистильовану воду дещо зменшувалася у варіанті з СК і зростала у варіантах з іонолом та іонолом + СК (рис. 5, д).

Зміни сумарного вмісту пероксидів в коренях і пагонах корелювали зі змінами генерації супероксиду в період обробки проростків досліджуваними речовинами [Колупаєв, Карпець, 2007]. Отже, обробка проростків СК перед нагріванням спричиняла ефект окиснювального стресу, що усувався антиоксидантом іонолом.

В концентрації, яка посилювала генерацію АФК перед нагріванням, СК підвищувала теплостійкість проростків, про що свідчить збільшення відсотка їх виживання через 4 доби після теплового стресу (рис. 6). Захисний вплив на проростки за умов нагрівання чинила і обробка їх іонолом, хоча ефекти антиоксиданту були меншими порівняно з СК. Проте комбінована обробка проростків СК та іонолом призводила до повного нівелювання ефекту СК (рис. 6). Таким чином, антиоксидант, пригнічуючи генерацію АФК, індуковану обробкою СК, знімав водночас і позитивний вплив СК на теплостійкість проростків. Ідентичні результати ми отримали і на прикладі відокремлених колеоптилів пшениці та сім’ядолей огірка [Колупаев и др., 2004, 2006].

Рис. 6. Виживання проростків пшениці, оброблених СК, іонолом та їх комбінацією (%) після ушкоджуючого нагрівання (450С, 10 хв). 1 – контроль (дистильована вода), 2 – СК (1 мкМ), 3 – іонол (90 мкМ),

4 – СК (1 мкМ) + іонол (90 мкМ).

Подібну картину спостерігали при дослідженні дії екзогенного кальцію у поєднанні з іонолом на проростки пшениці: антиоксидант усував прояви окиснювального стресу, спричинюваного екзогенним кальцієм і водночас значно зменшував позитивний вплив обробки сіллю кальцію на виживання проростків після ушкоджуючого нагрівання [Колупаев, Карпец, 2006].

Отже, одержані результати свідчать про участь АФК в індукуванні стійкості рослин до абіотичних стресорів. Підвищення тепло- і солестійкості інтактних рослин та їх ізольованих органів вдавалося досягти, змінюючи про-/антиоксидантний статус різними способами – прямою обробкою АФК (екзогенним пероксидом водню) або дією екзогенних індукторів утворення АФК – СК, іонами кальцію, а також АБК [Колупаєв та ін., 2006]. Всі види таких обробок призводили до тимчасового підвищення вмісту пероксидів в рослинних тканинах та короткочасної активації процесів ПОЛ.

Зміна про-/антиоксидантної рівноваги, ймовірно, пов’язана з модуляцією активності ферментів, що беруть участь в генерації і руйнуванні АФК. Так, індукування окиснювального стресу СК включало в себе тимчасове зниження активності каталази, підвищення активності гваяколпероксидази (потенційний продуцент АФК, зокрема, супероксиду) і зростання активності СОД, яке може бути причиною нагромадження пероксиду водню [Колупаєв, Акініна, 2005, Колупаєв, 2007]. В посилення генерації АФК рослинними тканинами під впливом екзогенного кальцію певний внесок робить підвищення активності гваяколпероксидази, передусім її іоннозв’язаної форми [Колупаев и др., 2005].

Після тимчасового (оборотного) зрушення про-/антиоксидантної рівноваги у прооксидантний бік відбувалося підвищення стійкості рослинних тканин. При цьому рослинні об’єкти, попередньо „загартовані” (передадаптовані) обробкою названими індукторами окиснювального стресу, після потенційно летальних впливів високої температури або засолення краще зберігали про-/антиоксидантну рівновагу і мали менші пошкодження. Про пряму причетність АФК до індукування стійкості свідчить супресія антиоксидантами позитивних ефектів СК, АБК та іонів кальцію на стійкість рослинних тканин.

РОЛЬ КАЛЬЦІЄВОГО СТАТУСУ У РОЗВИТКУ ОКИСНЮВАЛЬНОГО СТРЕСУ ТА АДАПТИВНИХ РЕАКЦІЙ РОСЛИННИХ КЛІТИН

Залежність впливу пероксиду водню та СК на теплостійкість рослинних клітин від їх кальцієвого статусу. Між вмістом іонів кальцію, їх розподілом в рослинних клітинах і тканинах, з одного боку, та утворенням і елімінацією АФК з іншого, існують досить складні і далеко не повністю з’ясовані зв’язки. Є відомості як про індукування генерації АФК за збільшення внутрішньоклітинної концентрації кальцію, так і про здатність АФК спричиняти вихід Са2+ в цитозоль [Bolwer, Fluhr, 2000, Kaur, Gupta, 2005].

Виникає запитання, наскільки залежать ефекти індукторів окиснювального стресу, які використовувалися в наших експериментах – екзогенних пероксиду водню та СК – від кальцієвого статусу клітин? Для з’ясування цього питання проводили обробку рослинних тканин названими сполуками разом з модифікаторами кальцієвого статусу клітин – блокаторами кальцієвих каналів та антагоністом кальмодуліну.

В одній із серій експериментів оцінювали вплив екзогенного пероксиду водню в поєднанні з модифікаторами кальцієвого статусу - блокатором кальцієвих каналів LaCl3 та антагоністом кальмодуліну хлорпромазином - на стійкість колеоптилів пшениці до ушкоджуючого нагрівання. Як показали результати наших досліджень, блокатор кальцієвих каналів LaCl3 повністю, анатогоніст кальмодуліну хлорпромазин значною мірою знімали позитивний вплив пероксиду водню на теплостійкість колеоптилів пшениці [Kolupaev, 2007].

Ми досліджували також вплив блокаторів кальцієвих каналів (верапаміл, хлориди лантану і кобальту) та антагоніста кальмодуліну (хлорпромазин) на генерацію АФК, інтенсивність ПОЛ і активність ферментів, причетних до утворення АФК, в колеоптилях пшениці, які обробляли екзогенною СК. Всі антагоністи кальцію пригнічували прояви окиснювального стресу, спричинюваного дією СК. Так, у колеоптилях пшениці, оброблених СК у поєднанні з верапамілом або хлорпромазином, на відміну від зразків, оброблених лише СК, не відбувалося активації утворення О2.- (рис. 7). Водночас нагрівання колеоптилів викликало тенденцію до посилення генерації супероксидного радикала в усіх варіантах досліду за винятком варіанта з СК.

Рис. 7. Генерація супероксиду (% до контролю без нагрівання) колеоптилями пшениці за обробки СК, верапамілом, хлорпромазином та їх комбінацією.

1 – контроль (2%-на сахароза), 2 - 2%-на сахароза + 10 мкМ СК, 3 - 2%-на сахароза + 250 мкМ верапаміл, 4 - 2%-на сахароза + 10 мкМ СК + 250 мкМ верапаміл, 5 - 2%-на сахароза + 20 мкМ хлорпромазин, 6 - 2%-на сахароза + 10 мкМ СК + 20 мкМ хлорпромазин.

Верапаміл пригнічував спричинюване СК підвищення активності гваяколпероксидази в рослинних тканинах [Колупаев и др., 2004]. Гваяколпероксидаза розглядається як фермент, причетний до генерації АФК, зокрема, супероксидного радикала [Shannon, 1986]. Знімаючи прояви окиснювального стресу, індукованого обробкою колеоптилів пшениці екзогенною СК, модифікатори кальцієвого статусу водночас нівелювали і позитивний вплив СК на теплостійкість рослинних клітин. Обробка колеоптилів верапамілом у досліджуваних концентраціях сама по собі дещо зменшувала їх виживання після ушкоджуючого нагрівання. Хлорид лантану і хлорпромазин істотно не впливали на теплостійкість відрізків колеоптилів. Водночас обидва блокатори кальцієвих каналів (верапаміл і LaCl3), а також антагоніст кальмодуліну хлорпромазин повністю нівелювали підвищення теплостійкості колеоптилів, індуковане СК (рис. 8).

Рис. 8. Вплив СК, верапамілу, хлориду лантану і хлорпромазину та їх комбінації на виживання колеоптилів пшениці після ушкоджуючого нагрівання (43,5єС, 10 хв).

1 – контроль (2%-на сахароза), 2 - 2%-на сахароза + 10 мкМ СК, 3 - 2%-на сахароза + 250 мкМ верапаміл, 4 - 2%-на сахароза + 10 мкМ СК + 250 мкМ верапаміл, 5 - 2%-на сахароза +1 мМ LaCl3, 6 - 2%-на сахароза + 10 мкМ СК +1 мМ LaCl3, 7 - 2%-на сахароза + 20 мкМ хлорпромазин, 8 - 2%-на сахароза + 10 мкМ СК + 20 мкМ хлорпромазин.

Отже, одержані результати свідчать про участь іонів кальцію і кальмодуліну у розвитку окиснювального спалаху, індукованого СК. Гіпотетичний механізм індукування саліцилатом окиснювального стресу представлений на рис. 9. Одним із шляхів впливу СК на про-/антиоксидантний статус клітин може бути безпосереднє інгібування каталази [Chen et al., 1993, 1997]. На прикладі колеоптилів пшениці нами показано, що концентрація СК 10 мкМ цілком достатня для інгібування каталази in vitro [Колупаєв та ін., 2006]. Інгібування каталази призводить до підвищення концентрації пероксиду водню. Транзиторне збільшення вмісту внутрішньоклітинного Са2+ під впливом нагромаджуваного пероксиду водню може бути важливою складовою окиснювального стресу. Інший шлях індукування саліцилатом окиснювального стресу і захисних реакцій, ймовірно, полягає в активації (посиленні синтезу) супероксид-генеруючих ферментів, таких як фенолпероксидази [Shannon, 1986] і НАДФН-оксидаза [Тарчевский, 2002]. Прикметно, що як пероксидаза [Кутузова, Угарова, 1981], так і НАДФН-оксидаза [Keller et al., 1998] мають Са2+-зв’язуючі ділянки. Підвищення активності НАДФН-оксидази і фенолпероксидаз може посилювати генерацію супероксиду. Останній, як відомо, під впливом СОД перетворюється на стабільну АФК – пероксид водню. Важливо, що екзогенна СК здатна підвищувати активність цього ферменту. Нами встановлено, що за обробки колеоптилів СК