Львівська Національна академія ветеринарної медицини імені с.з. гжицького

лісова Наталія Едуардівна

Удк 619:616,98:578.835.1.616-084:636.3

Імунофізіологічний статус телят

за впливу антимікробних препаратів

та імуномодуляторів

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Львів -2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Державному науково-дослідному контрольному інституті ветеринарних препаратів та кормових добавок Міністерства аграрної політики України.

Науковий керівникдоктор ветеринарних наук, професор

Коцюмбас Ігор Ярославович,

Державний науково-дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів та кормових добавок, директор, завідувач відділу фармакології та імуноморфології.

Офіційні опоненти: | доктор сільськогосподарських наук, професор Параняк Роман Петрович,

Львівська національна академія ветеринарної медицини імені С.З. Гжицького,

завідувач кафедри екології;

кандидат ветеринарних наук, с.н.с.

Віщур Олег Іванович,

Інститут біології тварин УААН,

завідувач лабораторії імунології.

Провідна установа | Дніпропетровський державний аграрний університет,

кафедра фізіології і біохімії сільськогосподарських тварин Міністерства аграрної політики України. |

Захист відбудеться: ” 31 ” травня 2007 року о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.826.01 у Львівській національній академії ветеринарної медицини імені С.З.Гжицького за адресою: 79010, м. Львів-10, вул. Пекарська, 50, аудиторія №1.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Львівської національної академії ветеринарної медицини імені С.З. Гжицького за адресою: 79010, м. Львів-10, вул. Пекарська, 50.

Автореферат розісланий: ” 27 ” квітня 2007р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук, професор Головач П.І.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. При впровадженні у практику ветеринарних лікарських засобів особливу увагу звертають на комплексне вивчення препаратів та їх вплив на функціонування організму в цілому і його захисних систем зокрема. Застосування препаратів з імунотропними властивостями зобов’язує до ретельного контролю їх дії на стан організму тварин, а детальне вивчення цього питання є актуальним у прикладному і теоретичному аспектах. Для практичної ветеринарної медицини також залишається важливою проблема функціонування імунної системи тварин залежно від клінічного стану організму. Широке застосування різноманітних антимікробних препаратів, без проведення контролю стану організму, може викликати негативні зміни в системі імунного захисту (Smith J.T., Lewis C.S., 1988; Purswani M.U. et al., 2002; Березняков И.Г., 2004). Це проявляється змінами імунологічної реактивності, порушенням біосинтезу білків, балансу макро- та мікроелементів, і, в кінцевому наслідку, зниженням резистентності організму до захворювань та потенціалу продуктивності (Алехин?Е.К., 1993; Гаранович І.І., 1997; Forster C. et al, 1998; Boman H., 2003). Особливо актуальним залишається вивчення реакції організму молодняку сільськогосподарських тварин за умов одночасного застосування імуномодуляторів та антимікробних препаратів, особливо в критичні періоди вирощування телят (Кинина Е.С. та ін., 1991; Fujii T. et al, 1996; Гаранович І.І., 1997; Кириллов В.И., 1998; Зайцев А.Н., 2003; Пинегин Р.М., Хаитов Б.В., 2003), коли не тільки лікування тварин від захворювань, але, перш за все, підтримка захисних сил організму є складовою частиною процесу контролю здоров’я сільськогосподарських тварин.

Тому метою даної роботи було з’ясувати імунологічні параметри фізіологічного стану організму телят за умов застосування ветеринарних лікарських засобів та імуномодуляторів різного походження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є окремим самостійним фрагментом наукових п'ятирічних програм лабораторії імуноморфології Державного науково-дослідного контрольного інституту ветеринарних препаратів та кормових добавок за період 1998-2005 рр.: № держреєстрації 0196U003862 1996-2000 рр. "Розробити і впровадити систему імунологічного контролю ветпрепаратів та кормових добавок"; № держреєстрації 0101U006355 2001-2005 рр. "Удосконалити і впровадити науково-технічну систему токсикологічного контролю згідно міжнародних вимог", у яких автор досліджував імунофізіологічний статус телят за впливу антимікробних та імуномодулюючих препаратів.

Мета і завдання досліджень. Дослідити імунофізіологічний статус телят за умов дії антимікробних препаратів при їх роздільному та сумісному застосуванні з імуномодуляторами. Для досягнення мети необхідно:–

дослідити стан факторів природної резистентності та білкових компонентів сироватки крові організму телят за умов застосування антимікробних препаратів пеніциліну і стрептоміцину, гентаміцину, енроцину, окситетрацикліну, тілбіану;–

встановити залежність імунофізіологічного статусу телят від функціональної активності різних ланок імунної системи за умов застосування антимікробних препаратів;–

дослідити гематологічні, імунологічні та біохімічні показники організму телят за сумісного та роздільного застосування антимікробних препаратів та імуномодуляторів (регенеративний біостимулятор РБС та левамізол);–

провести порівняльний аналіз результатів застосування імуномодуляторів;–

визначити основні напрямки проведення імунокорекції організму телят за умов застосування антимікробних препаратів різних груп;–

на основі отриманих даних визначити основні критерії для контролю імунного статусу телят та можливість підвищення їх стійкості до захворювань.

Об'єкт дослідження: імунний статус телят 2-4 місячного віку за умов застосування антимікробних та імуномодулюючих препаратів.

Предмет дослідження: показники неспецифічної резистентності та клітинних механізмів захисту організму, білковий спектр сироватки крові телят.

Методи дослідження: фізіологічні (дослідження клінічних показників стану організму), гематологічні (кількість еритроцитів і лейкоцитів, вміст гемоглобіну), імунологічні (бактерицидна, лізоцимна, комплементарна активності сироватки крові, фагоцитарна активність нейтрофілів, кількість Т- та В-лімфоцитів), біохімічні (вміст білка, білковий спектр сироватки крові, активність ферментів - трансаміназ), біометричні (визначення достовірності отриманих результатів методами варіаційної статистики).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше наведено теоретичне обґрунтування підходів до імунокорекції на основі класифікації антибіотиків за ступенем проникнення до клітини. Проведено комплексні дослідження функціонування імунного захисту телят з урахуванням клінічного стану їх організму за умов застосування антимікробних препаратів різних груп і використання імуномодуляторів різного походження та встановлено варіативні зміни показників, що характеризують стан білкових і клітинних факторів резистентності телят 2-4 місячного віку. Вивчено можливість корекції імунного захисту телят за умов застосування антимікробних препаратів імуномодулятором тканинного походження РБС, що сприяє стабілізації імунофізіологічного профілю організму та фізіологічного стану тварин. Науково доведено позитивний вплив імуномодулятора тканинного походження РБС у гострий період захворювання телят 2-4 місячного віку.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати біологічної дії імуномодулятора РБС можуть бути використані у розробці рекомендацій для підвищення резистентності молодняку великої рогатої худоби за умов фармакологічного навантаження антибіотиками. Отримані дані щодо впливу антимікробних препаратів на стан імунної системи телят 2-4 місячного віку доцільно використати у навчальному процесі для підготовки фахівців ветеринарної медицини. Матеріали дисертаційної роботи використано у розробці методичних рекомендацій „Імунологічний контроль ветеринарних лікарських засобів”. Матеріали досліджень імуномодулятора тканинного походження використано для розробки нормативної документації (НД) на регенеративний біостимулятор РБС та схеми застосування його з антимікробними препаратами для корекції імунофізіологічного стану телят.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно здійснювала пошук і аналіз даних літератури, проводила експериментальні та лабораторні дослідження, статистичну обробку та обгрунтування одержаних результатів. Аналіз та інтерпретацію одержаних результатів проведено під керівництвом наукового керівника, доктора ветеринарних наук, професора Коцюмбаса І.Я.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались, обговорювались і були схвалені на річних звітах наукових співробітників Державного науково-дослідного контрольного інституту ветеринарних препаратів та кормових добавок, Другій міжнародній міжвузівській науково-практичній конференції аспірантів і співшукачів ”Предпосылки и эксперимент в науке” (Санкт-Петербург, 23-24 березня, 2004), Міжнародній науково-практичній конференції ”Ветеринарна медицина-2004: сучасні аспекти розробки, маркетингу і виробництва ветеринарних препаратів” (АР Крим, Феодосія, 24-31 травня 2004р.), Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів (м. Львів, 10-11 червня 2004р.) та Міжнародній науковій конференції „Ветеринарні препарати: розробка, контроль якості та застосування” (Львів, 4-7 жовтня 2005р.).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 11 праць, в тому числі 6 у фахових виданнях, перелік яких затверджено ВАК України, видано методичні рекомендації „Імунологічний контроль ветеринарних лікарських засобів”, затверджено ТУ У на препарат РБС.

Структура та об'єм дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 148 сторінках комп’ютерного тексту, вона включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів і методів досліджень, результати досліджень, їх аналіз і обговорення, висновки, практичні рекомендації, список використаної літератури (266 найменувань, в т.ч. 174 кирилицею, 92 іноземною мовою). Робота ілюстрована 21 таблицею та 2 додатками.

Вибір напрямів досліджень,

матеріал та методи виконання роботи

Дослідження проведені протягом 1998-2005рр. у лабораторії імунології (тепер імуноморфології) Державного науково-дослідного контрольного інституту ветеринарних препаратів та кормових добавок, у науково-експериментальному центрі "Великий Любінь" і спілці пайовиків села Долиняни, Городоцького району, Львівської області, ПСП “Світанок” та учгоспі "Дублянський", Жовківського району, Львівської області (тепер – навчально-науково-дослідний центр Львівського державного аграрного університету), на телятах української чорно-рябої молочної породи, 2-4 місячного віку. Господарства, в яких досліджувались тварини, були благополучними щодо основних інфекційних захворювань. Тварини перебували на стійлово-пасовищному утриманні в літній та прив'язно-стійловому в зимовий період. Раціони годівлі забезпечували тваринам потребу в основних елементах живлення згідно з існуючими нормами. Параметри мікроклімату в приміщеннях знаходилися в межах зоогігієнічних норм.

У досліди підбирали тварин з клінічними ознаками бронхопневмонії - кашлем, виділеннями з ніздрів, температурою тіла 39,5 - 39,7 оС. Незаразну етіологію хвороби встановлено на підставі анамнезу, клінічного обстеження поголів’я хворих телят, даних епізоотологічних досліджень держветслужби району.

Дослідження впливу пеніциліну, стрептоміцину та РБС на показники імунітету телят. Дослід з вивчення імуностимулюючих та лікувальних властивостей РБС (регенеративного біостимулятора, біологічно активного препарату тканинного походження, негормональної природи, що містить низькомолекулярні компоненти ембріональної тканини, виготовлений науково-виробничим підприємством “Ербіс”, м.Київ), за його сумісного та роздільного введення з антибіотиками пеніцилін та стрептоміцин було проведено на 20 телятах-аналогах старше 2 місяців. Було підібрано 4 групи по п’ять тварин у кожній. Тварини 1 групи, без ознак захворювання, були контролем, їм вводили фізіологічний розчин внутрішньом’язово. Тваринам 2 групи вводили РБС у дозі 1 мл на 20 кг маси тіла, через добу, 5 разів, внутрішньом’язово; тваринам 3 групи ?вводили антибіотики згідно з настановою по застосуванню, пеніцилін – 8000 Од/кг маси та стрептоміцин – 8 мг/кг маси тіла внутрішньом’язово; тваринам 4 групи вводили РБС (1мл на 20 кг маси тіла через добу, 5 разів), та антибіотики згідно з настановою по застосуванню, як зазначено вище. За тваринами протягом 21 доби велись клінічні спостереження. Матеріалом для досліджень (у цьому досліді та надалі) була кров, відібрана з яремної вени телят кожної групи до ранішньої годівлі. Забір крові проводився до введення препаратів та на 7-, 14- і 21 доби від їх першого введення.

Дослідження впливу гентаміцину та імуномодулятора РБС на показники імунітету телят. Дослід проведено на 20 двомісячних телятах-аналогах. Тварин розділили на 4 групи по 5 телят у кожній. Телята 1 групи були контролем, 2 групі внутрішньом'язово вводили РБС, як зазначено вище; 3 групі вводили внутрішньом’язово гентаміцин у дозі 2 мл/голову згідно з настановою по застосуванню, двічі на день протягом 5 діб; 4 групі – гентаміцин та РБС сумісно за вищезазначеною схемою. За тваринами протягом 14 діб велись клінічні спостереження. Забір крові для досліджень проводили до введення препаратів, та на 7 і 14 доби від початку їх введення.

Дослідження впливу енроцину-50 та імуномодулятора РБС на показники імунітету телят. Дослід проведено на 16 телятах старше 3 місяців. Було підібрано 4 групи тварин по 4 у кожній: 1 група - контроль, 2 групі застосовували препарат РБС, внутрішньом’язово, як зазначено вище; 3 групі вводили енроцин (5% енрофлоксацин L-обертаючий) підшкірно, в дозі 1 мл на 20 кг маси тіла один раз на добу, 5 діб; 4 групі вводили РБС та енроцин у дозах, зазначених вище. Кров для досліджень одержували до введення препаратів, та на 7 і 14 доби від першого введення.

Дослідження впливу окситетрацикліну при застосуванні з РБС і левамізолом на показники імунітету телят. Дослід проведено на 15 телятах, старше 3 місяців. Піддослідні тварини були розділені на 3 групи по 5 телят у кожній. Телята 1 групи отримували окситетрациклін, згідно з настановою по застосуванню, у дозі 5 мл внутрішньом’язово, 1 раз на добу, протягом 5 діб. 2 групі вводили окситетрациклін у тих же дозах, та імуномодулятор РБС внутрішньом’язово у дозі, вказаній у попередніх дослідах. Телят 3 групи лікували аналогічно, а також вводили альфамізол 10 % в імуномодулюючих дозах, 1 мл/голову (100 мг) підшкірно 1 раз на добу через кожні сім діб (3 введення левамізолу протягом досліду). Матеріал для досліджень одержували до введення препаратів, та на 7, 14 і 21 доби від початку досліду.

Дослідження впливу тілбіану та РБС на показники імунітету телят. Дослід проведено на 15 телятах, старше 2-місячного віку. Піддослідні тварини були розділені на 3 групи по 5 телят у кожній. 1 група телят була контролем, телятам 2 групи вводили препарат тілбіан 20%-ний (аналог тілозину) згідно з настановою по застосуванню – внутрішньом’язово, 2,5 мл/голову протягом 5 днів, 3 групи - вводили РБС та тілбіан, як вказано вище. Забір крові для досліджень проводили до введення препаратів, та на 7 і 14 доби від першого введення.

У цільній крові визначали: вміст гемоглобіну – нефелометрично гемоглобінціанідним методом, загальну кількість лейкоцитів та еритроцитів (у камері Горяєва), фагоцитарну активність нейтрофілів (Чумаченко В.Е та ін., 1990), відносну кількість Т- і В-лімфоцитів методом спонтанного розеткоутворення з еритроцитами вівці (Е-РУК і ЕАС-РУК) (Кондрахин И.П., 1985; Кравчук Г.П., Казимирчук В.Е., 1986; Боброва И.А., Муравская Л.В., 2000). Загальний вміст білка в сироватці крові (СК) визначали за допомогою рефрактометра ІРФ-22, білковий спектр СК – методом електрофорезу на ацетаті целюлози в автоматичному режимі на приладі АФ-1. У СК визначали також бактерицидну (БАСК), лізоцимну (ЛАСК) та комплементарну активності, за методиками, адаптованими в лабораторії імунології ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок (Імунологічний контроль ветеринарних лікарських засобів. Методичні рекомендації, 2002) та активність ферментів-трансаміназ (аланінамінотрансферази – АлАТ, та аспартатамінотрансферази – АсАТ) згідно з інструкціями, з використанням стандартного набору реактивів виробництва НВФ “Simko LTD.

Отримані результати оброблялись статистично із визначенням середніх величин за формулою Петерса з урахуванням константи Молденгауера, достовірного інтервалу при наявному рівні значимості p? 0,05 з урахуванням критерію Стьюдента (Мазур Т., 1998); графічні зображення виконано за допомогою пакету програм Microsoft Office.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Дослідження впливу пеніциліну, стрептоміцину та РБС на показники імунітету телят. При вивченні впливу на організм телят препаратів першої групи (препарати з низьким ступенем проникнення до клітини – Никитин А, 1990, 1997, 2000) – пеніциліну та стрептоміцину, встановлено зниження кількості еритроцитів на 14,6% на 7 добу досліду в телят 3 групи, що отримувала антимікробні препарати, в порівнянні з показником телят контрольної групи (р<0,05).

За показниками неспецифічної резистентності встановлено (табл.1), що БАСК у телят 3 групи на 14 добу досліду знижувалася як у порівнянні з показником контрольної групи, так і з попереднім дослідним періодом (р<0,05). Кількість активних фагоцитів змінювалася у тварин групи, що отримували антимікробні препарати – на 14 добу показник був нижчим, ніж у тварин контрольної групи, фагоцитарний індекс, що характеризував інтенсивність фагоцитозу, протягом періоду досліду незначно зменшувався.

Таблиця 1.

Показники неспецифічної резистентності телят за застосування препаратів РБС, пеніциліну та стрептоміцину (М ± m, n=5)

Показник | Групи тварин | До введення | Доби після введення | 7 | 14 | 21 | Бактерицидна активність сироватки крові, % | 1

2

3

4 | 45,6±3,3

47,4±1,6

43,2±1,8

46,9±1,3 | 44,8±3,6

48,8±2,3

40,0±0,6

44,8±2,1 | 44,2±1,3

49,3±0,8

34,0±1,5*оо

45,9±1,4 | 45,8±2,4

48,0±1,1

39,7±1,5

43,9±1,3 | Лізоцимна активність сироватки крові,% | 1

2

3

4 | 28,9±2,5

27,9±1,6

30,5±1,6

31,1±1,0 | 29,5±1,6

28,6±1,3

29,8±0,6

31,1±0,7 | 28,6±1,6

31,9±2,7

27,4±1,4

32,6±2,6 | 27,5±1,8

30,4±1,7

26,9±2,2

31,3±1,8 | Фагоцитарна

активність

нейтрофілів, % | 1

2

3

4 | 44,4±4,1

42,5±2,0

43,8±1,4

42,3±4,5 | 41,7±2,3

44,2±3,2

40,2±0,9

36,8±3,9 | 39,1±4,2

50,2±1,2*оо

34,9±2,2*

37,9±2,1 | 40,2±2,0

48,6±2,0

37,2±1,0

39,6±1,5 | Фагоцитарний

індекс | 1

2

3

4 | 4,1±0,2

4,4±0,2

4,2±0,1

4,1±0,4 | 3,9±0,1

5,1±0,2

3,9±0,1

4,3±0,2 | 4,1±0,2

5,2±0,2*оо

3,7±0,2

4,2±0,2 | 4,0±0,3

4,9±0,3

3,8±0,4

4,2±0,3 | Комплементарна

активність, од. | 1

2

3

4 | 0,19±0,01

0,18±0,01

0,19±0,01

0,18±0,01 | 0,19±0,02

0,20±0,01

0,18±0,01

0,21±0,01 | 0,18±0,01

0,23±0,01*оо

0,18±0,01

0,20±0,01 | 0,19±0,01

0,22±0,01

0,19±0,01

0,21±0,01

Примітка. Тут і надалі в таблицях:

*- показник статистичної достовірності у порівнянні з попереднім дослідним періодом;

оо- у порівнянні до контрольної групи на час відбору матеріалу, р<0,05

Зниження відсотка активних фагоцитів відбувалося, можливо, за рахунок зменшення здатності нейтрофілів до хемотаксису. Останнє може спостерігатися, якщо під впливом антимікробних препаратів відбувається зменшення синтезу низькомолекулярних пептидних хемоаттрактантів клітинами мікроорганізму, а відповідно, зменшується стимулювання направленого руху фагоцитів (Ныс П. С., Курочкина В.Б, Скляренко А.В., 2000). Очевидно, у даному випадку може мати місце часткова зміна активності фагоцитарної системи – зменшення хемотаксису нейтрофілів без порушення їх опсонізуючих та кілерних функцій. Отже, виявлені зміни у функціонуванні фагоцитарної системи при застосуванні комбінації препаратів з низькою здатністю проникати до клітини, скоріше за все, пов’язані з дією препаратів на клітини мікроорганізму, ніж безпосередньо на фагоцитуючі механізми гранулоцитів. Одночасно слід зауважити, що застосування РБС як монотерапії викликало підвищення активності фагоцитарної системи.

При дослідженні фракційного складу СК спостерігалася тенденція до зниження вмісту альбуміну СК у тварин, які отримували тільки антибіотики. У показниках клітинного імунітету та ферментативної активності СК телят 3 групи змін не встановлено. У телят 2 групи відзначалося виражене зростання активності АлАТ (р< 0,05). Життєздатність лімфоцитів була вищою у тварин 2 дослідної групи (р< 0,05), а у тварин 4 групи проявлялася тенденція до її підвищення, що, ймовірно, є проявом мембранопротекторних функцій препарату.

Загалом, за нашими даними, за умов застосування препаратів пеніциліну та стрептоміцину встановлено зміни показників природного імунітету: активності клітинного фактора неспецифічної резистентності (зниження відсотка активних фагоцитів на 14 добу досліду без суттєвих змін інтенсивності фагоцитозу); та бактерицидної активності СК у цей же проміжок часу. Застосування РБС разом з пеніциліном та стрептоміцином призводило до стабілізації факторів неспецифічної резистентності. За умов застосування РБС також встановлено підвищення життєздатності лімфоцитів, що може бути проявом активації ліпідного та вуглеводного обміну клітинних систем організму.

Дослідження впливу гентаміцину, енроцину, окситетрацикліну та імуномодулятора РБС на показники імунітету телят. Аналіз результатів впливу препаратів другої групи (препарати з середнім ступенем проникнення до клітини) на досліджувані показники резистентності організму телят свідчить, що при застосуванні телятам гентаміцину спостерігалося зменшення кількості лейкоцитів на 7 добу від початку введення препаратів у тварин 3 групи. Різниця зі значеннями цього ж показника тварин 1, 2 та 4 дослідних груп становила 20,9 %, 15,8 % та 23,2%. Також встановлено зростання відносної та абсолютної кількості Т-лімфоцитів у телят цієї ж групи на 7 добу зі збереженням підвищених значень показника до 14 доби досліду (р<0,05). За нашими даними, не встановлено вираженого впливу гентаміцину на показники природної резистентності.

При застосуванні телятам 2 і 4 дослідних груп РБС та гентаміцину з РБС виявлено підвищення ЛАСК і комплементарної активності СК (табл 2). Зокрема, вказані показники зростали у тварин 2 та 4 дослідних груп починаючи з 7 доби і залишалися достовірно вищими також і на 14 добу. Встановлено також вищий рівень фагоцитарної активності нейтрофілів та фагоцитарного індексу у телят 2 і 4 груп протягом досліду, р<0,05.

При дослідженні активності ферментів переамінування виявлено підвищення рівня АлАТ на 48,4% та АсАТ на 32,6% у телят 2 групи порівняно до зазначених показників телят контрольної групи (р<0,05), що, очевидно, пов’язане з гепатотропними властивостями імуномодулятора.

Отже, при дослідженні впливу гентаміцину на гематологічний профіль крові телят нами встановлено: зниження загальної кількості лейкоцитів, підвищення кількості Т-лімфоцитів на 7 добу досліду. При цьому не спостерігалося суттєвого впливу препарату на показники природної резистентності.

Таблиця 2

Показники неспецифічної резистентності телят за введення препаратів РБС та гентаміцину ( M±m, n=5)

Досліджувані

показники | Групи тварин | До введення | Доби після введення | 7 | 14 | Бактерицидна активність

сироватки крові, % | 1

2

3

4 | 48,5±5,9

43,7±4,4

45,2±6,7

49,3±7,1 | 41,8±2,2

43,5±2,7

37,3±3,0

42,0±5,1 | 43,6±3,3

48,8±2,4

47,5±4,4

47,6±2,4 | Лізоцимна активність сироватки крові, % | 1

2

3

4 | 28,8±1,9

26,8±1,4

30,6±1,5

24,2±2,4 | 31,1±1,1

25,6±3,5

32,1±2,7

23,1±2,9 | 32,3±1,3

32,4±4,5*

30,0±2,5

32,2±2,5* | Фагоцитарна

активність нейтрофілів, % | 1

2

3

4 | 50,4±3,0

50,0±2,3

47,2±2,5

51,6±2,8 | 49,4±1,3

58,0±1,3*оо

45,4±1,9

49,0±1,6 | 50,3±1,9

54,4±1,9

49,4±1,4

50,1±1,2 | Фагоцитарний

індекс | 1

2

3

4 | 4,3±0,7

4,7±0,2

4,5±0,2

5,0±0,3 | 3,8±0,2

5,8±0,3*оо

4,3±0,1

4,8±0,3оо4,1±0,4

5,8±0,2*оо

4,6±0,2

5,2±0,2оо | Комплементарна активність, од. | 1

2

3

4 | 0,19±0,01

0,18±0,01

0,18±0,01

0,18±0,01 | 0,19±0,01

0,21±0,01

0,20±0,01

0,21±0,01 | 0,18±0,01

0,22±0,01*оо

0,20±0,02

0,22±0,01*оо | При одночасному застосуванні гентаміцину та РБС спостерігалося підвищення інтенсивності фагоцитозу, починаючи з 7 доби досліду. При застосуванні лише РБС відзначено активацію показників природної резистентності – фагоцитарної активності нейтрофілів, лізоцимної і комплементарної активності СК, а також підвищення активності ферментів-трансаміназ.

При дослідженні впливу енроцину на показники природної резистентності телят 3 групи встановлено зниження рівня ЛАСК на 7 добу досліду, БАСК на 14 добу, та незначне зростання показника комплементарної активності СК на 14 добу після введення препарату (табл.3). Виявлено зміни фагоцитарного індексу (інтенсивності фагоцитозу), що зростав на 7 добу, а на 14 добу достовірно знижувався у телят 3 групи. Посилення фагоцитуючих функцій клітинного фактора неспецифічної резистентності виявлялося короткотривалим і не супроводжувалося підсиленням опсонізуючої здатності нейтрофілів. Відзначено стабільність показників природної резистентності протягом дослідного періоду за одночасного застосування антимікробного та імуномодулюючого препаратів. При аналізі впливу енроцину та РБС на функціонування нейтрофілів слід враховувати дію двох факторів. Одним з них є стимулювання ”дихального вибуху” нейтрофілів (так званого праймінгу) енроцином. Перебіг цього процесу залежить від ступеня проникнення препарату до клітини, а сам процес супроводжується транслокацією білків у мембрані нейтрофілів (Зайцев А.Н., 2003). При цьому сам препарат не впливає на рецепторозв’язуючі властивості нейтрофілів. Очевидно, тому зростання інтенсивності фагоцитозу було нетривалим. Проте застосування РБС, що має мембраностабілізуючі властивості, дозволяло стабілізувати даний процес протягом досліджуваного періоду.

Таблиця 3

Показники неспецифічної резистентності телят за застосування препаратів РБС та енроцину ( M±m, n=4)

Досліджувані

показники | Групи тварин | До введення | Доби після введення | 7 | 14 | Бактерицидна активність

сироватки крові, % | 1

2

3

4 | 45,8±1,5

43,3±1,2

44,1±1,7

43,1±1,5 | 43,8±1,1

42,5±0,3

43,2±0,7

42,5±1,5 | 44,2±2,0

46,9±0,9*

38,4±1,0*оо

47,4±1,1* | Лізоцимна активність сироватки крові, % | 1

2

3

4 | 32,1±3,7

27,7±2,6

33,4±2,7

29,7±3,7 | 27,7±1,5

26,2±2,7

23,8±2,8*

28,4±1,2 | 28,4±2,7

25,5±2,7

34,8±4,0оо

33,6±4,8 | Фагоцитарна активність нейтрофілів, % | 1

2

3

4 | 42,2±1,2

44,5±2,3

46,0±1,8

42,4±1,1 | 43,9±1,9

46,7±1,8

47,2±2,0

45,1±1,3 | 42,6±1,4

51,2±1,6*оо

44,8±0,7

48,7±1,4*оо | Фагоцитарний

індекс | 1

2

3

4 | 4,1±0,1

4,0±0,2

5,0±0,1

4,7±0,5 | 4,3±0,9

4,9±0,2*

5,7±0,1*оо

4,9±0,4 | 4,6±0,4

5,5±0,2*оо

4,6±0,2*

5,1±0,1 | Комплементарна активність, од. | 1

2

3

4 | 0,17±0,01

0,18±0,02

0,17±0,01

0,17±0,01 | 0,18±0,01

0,21±0,01

0,22±0,01*оо

0,19±0,01 | 0,18±0,01

0,23±0,01*оо

0,20±0,01*

0,21±0,01*

У білковому спектрі СК встановлено зниження вмісту ?1-глобулінів та збільшення вмісту ?2- глобулінів у телят 3 групи протягом досліду. Спостерігалися зміни активності ферменту переамінування – АлАТ, що поступово зростала у телят 2 групи протягом дослідного періоду, до 14 доби суттєво відрізняючись від вказаного показника телят контрольної групи (р<0,05); у телят 4 групи зазначений показник поступово зростав до 14 доби досліду.

Загалом, отримані результати свідчать, що за умов використання енроцину спостерігалися нестабільні зміни фагоцитарної активності нейтрофілів – стимуляція з наступним зниженням функцій фагоцитів. За застосування енроцину у комбінації з препаратом РБС спостерігався синергізм дії досліджуваних засобів, що проявлялося у підвищенні показників неспецифічної резистентності організму та стабільності фагоцитозу і дозволяло уникнути різнонаправлених змін процесу. При застосуванні РБС також відмічено активацію системи трансаміназ, що, ймовірно, свідчить про активацію обмінних процесів організму.

Щодо застосування РБС у вигляді монотерапії згідно з рекомендаціями розробника, слід зауважити, що за його дії спостерігалося підвищення активності фагоцитарної системи, що проявлялося як збільшенням числа активних нейтрофілів, так і їх здатності до фагоцитування мікроорганізмів – можливо, препарат стимулює утворення супероксид-аніону всередині нейтрофілів (Ніколаенко О.М., 1999, Jones S.L., Lindberg F.P., Brown E.J, 1999).

При вивченні впливу окситетрацикліну встановлено відсутність вірогідних різниць у гематологічних показниках телят 1 і 2 груп. При цьому у телят 3 дослідної групи виявлено вірогідне зростання показників вмісту гемоглобіну, кількості еритроцитів, починаючи з 7 доби після початку досліду, та зростання кількості лейкоцитів на 21 добу дослідного періоду. Останній показник у тварин 3 групи на 25,4% відрізнявся від такого у телят 1 та 2 груп (р<0,05). Встановлено зниження ЛАСК у тварин усіх дослідних груп, починаючи з 7 доби (р<0,05). Відзначено пригнічення активності фагоцитарної ланки імунітету телят за умов впливу лише окситетрацикліну, що виявлялося у зменшенні відсотка активних фагоцитів (р<0,05), однак не було виявлено вірогідного зниження фагоцитарного індексу, що свідчить про збереження фагоцитуючих функцій клітин. Вміст лізоциму в СК обумовлений функціонуванням поліморфно-ядерних лейкоцитів, до яких відносяться також і нейтрофільні гранулоцити, тому названі фактори в організмі взаємопов’язані (Петров Р.В., 1990). При застосуванні РБС сумісно з окситетрацикліном не вдавалося запобігти зниженню ЛАСК на 7 добу досліду, проте показник бактерицидної активності СК зберігався на задовільному рівні. Можливо, підтримка загальної активності СК здійснювалася, зокрема, завдяки активації іншого фактора захисту – системи комплементу, що підтверджується зростанням показника комплементарної активності СК вже починаючи з 7 доби досліду.

Проведеними дослідженнями встановлено вірогідне збільшення кількості Т-лімфоцитів на 14 і 21 доби у телят 2 і 3 дослідних груп (при застосуванні РБС з антимікробним препаратом та при введенні окситетрацикліну з левамізолом, р<0,05 (рис.1).

Рис.1. Динаміка змін відносної кількості Т-лімфоцитів за застосування окситетрацикліну, левамізолу та РБС.

Виявлено, що левамізол при використанні з окситетрацикліном більш виражено, ніж РБС, стимулює клітинний імунітет (р<0,05). Проте встановлено, що життєздатність лімфоцитів була вищою у телят 2 дослідної групи, яким вводили РБС, р<0,05. Оскільки сам окситетрациклін не спонукав змін кількості лімфоцитів, зростання цього показника віднесено до дії левамізолу. В організмі Т-лімфоцити відповідають не тільки за антивірусний імунітет, а й за аутоімунні процеси (Фримель Х., Брок Й., 1986; Ройт А., 2000; Шевырев Н., 2000). Тому надмірна стимуляція лімфоцитарної ланки може призвести до підсилення можливих імунних реакцій, пов’язаних з наявністю в організмі модифікованих фармакологічною субстанцією білків, наслідком чого можуть бути негативні процеси на тканинному рівні, тому застосування левамізолу у даному випадку викликає певні застереження.

Проведеними дослідженнями встановлено, що при застосуванні левамізолу з окситетрацикліном спостерігалося підвищення значень переважної більшості показників неспецифічної резистентності та клітинного імунітету, за виключенням показника лізоцимної активності СК, зниження якого виявилося стійким і відмічалося протягом усього дослідного періоду; зокрема, у телят 3 групи на 14 добу досдіду показник становив 30,3±3,1 проти 44,3±1,9 %, встановленого на початку досліду

Дослідженням фракційного складу СК встановлено, що при застосуванні окситетрацикліну з левамізолом протягом досліду спостерігалося виражене зниження рівня a1-a2-глобулінів, а РБС – поступове. Спостерігався вищий вміст b- глобулінів на 14 і 21 добу у СК телят 3 групи. Також відзначено вищий вміст ?-глобулінів у СК телят за умов застосування окситетрацикліну з левамізолом (р<0,05).

У цілому отримані результати досліджень свідчать про інгібуючий вплив окситетрацикліну на показники імунітету телят, що виявлялося у зменшенні кількості активних фагоцитів та зниженні лізоцимної активності СК. При цьому спостерігалося підвищення рівня ?-глобулінів у СК телят 3 групи на 38%, що не виключає можливого загострення перебігу імунних реакцій. Протягом досліду відмічено більш виражену, ніж при застосуванні РБС, стимуляцію більшості факторів імунітету за умов застосування левамізолу, та зміни активності ферментів-трансаміназ. На основі отриманих даних можна зазначити, що застосування левамізолу в середніх імуностимулюючих дозах у даному випадку викликає певні застереження.

Дослідження впливу антимікробного препарату тілбіан на показники імунітету телят. На відміну від інших використаних нами антимікробних препаратів, тілбіан не викликав зниження показників неспецифічної резистентності (табл.4). Зокрема, спостерігалося підвищення БАСК з 7 доби досліду на 62% порівняно з рівнем показника тварин 3 групи, та на 49 % – порівняно з періодом до введення препарату. Протягом досліду, однак, не відзначено суттєвих змін лізоцимної та комплементарної активностей СК.

Спостерігалася активація системи нейтрофільних гранулоцитів: зміни фагоцитарної активності нейтрофілів, виражені зростанням кількості активних нейтрофілів і підвищенням інтенсивності фагоцитозу (р? 0,05). Зміни зазначених показників встановлено на 7 добу після введення тілбіану. Оскільки активації системи комплементу протягом досліду встановлено не було, вплив препарату, ймовірно, проявлявся лише на рівні функціонування нейтрофільних гранулоцитів.

Таблиця 4

Показники неспецифічної резистентності телят за застосування препаратів тілбіану та РБС (M±m, n=5)

Досліджувані

показники | Групи тварин | До введення | Доби після введення | 7 | 14 | Бактерицидна активність сироватки крові, % | 1

2

3 | 55,7±3,0

49,5±3,0

48,2±3,1 | 68,5±5,8

74,2±3,0*

45,9±2,4 | 41,9±3 ,6

51,3±4,2*

51,8±3,7*Лізоцимна активність сироватки крові, % | 1

2

3 | 28,3±0,8

29,1±0,9

28,9±1,2 | 27,2±0,6

30,1±0,9

31,4±1,0 | 28,6±0,8

30,3±1,3

34,2±1,1ооФагоцитарна активність нейтрофілів, % | 1

2

3 | 27,6±1,2

32,7±1,3

29,2±0,9 | 27,4±2,8

39,8±1,6*оо

37,8±1,0*оо29,2±4,0

44,5±3,6*оо

41,4±2,5*ооФагоцитарний індекс | 1

2

3 | 8,3±0,8

9,1±1,1

8,2±0,5 | 7,2±0,6

10,0±1,2оо

9,9±0,9*8,5±0,7

10,2±0,3оо

10,0±0,6 | Комплементарна активність, од. | 1

2

3 | 0,20±0,02

0,21±0,05

0,21±0,01 | 0,21±0,02

0,23±0,01

0,22±0,01 | 0,21±0,03

0,22±0,01

0,23±0,01 | Препарат третьої групи (тілбіан) – єдиний серед досліджуваних нами препаратів, за дії якого спостерігалися суттєві зміни кількості В-лімфоцитів. Зокрема, зростання їх відносної кількості на 7 добу характеризувалося у телят 2 групи різницею у порівнянні до попередніх значень, а у тварин 3 групи – також і до контролю, а на 14 добу достовірна різниця за цим показником спостерігалася у тварин 2 і 3 груп як до вихідного, так і до контрольного рівня, р? 0, (рис.2).

Рис. 2. Динаміка змін відносної кількості В-лімфоцитів за застосування тілбіану та РБС.

Водночас, потрібно відзначити зростання загальної кількості лейкоцитів у середньому на 43% у крові тварин 2 і 3 групи, що отримували тілбіан, у порівнянні до попереднього періоду, та на 69% і 71% відповідно – до контролю.

Зміни кількості того чи іншого виду лімфоцитів можуть свідчити як про активацію імунних процесів, так і про можливі негативні наслідки впливу препарату, а відхилення кількості лейкоцитів на 20-25 % у той чи інший бік від норми може свідчити про ймовірний імунотоксичний вплив препарату (Арзамасцев Е., Любимов Б., 1995; Утешев Б, 1996). Окрім цього, активація клітинної ланки імунітету на початкових стадіях захворювань не завжди носить позитивний характер, оскільки може спричинити загострення хвороби і посилення запальних процесів (Borel I, et al., 1999). Зростання кількості Т-лімфоцитів не супроводжувалося, однак, підвищеним вмістом g-глобулінової фракції білкового спектру, тому можна зробити висновок про відсутність імунотоксичних властивостей препарату.

Отже, загалом слід відмітити, що застосування препаратів з високим ступенем проникнення до клітин потребує обов’язкового імунологічного моніторингу, оскільки вплив таких препаратів на стан імунітету може виявитися досить значним і характеризуватися підвищеними значеннями показників природного та специфічного імунітету. Інтенсивність метаболічних модифікацій клітинних мембран, здатність до швидкого реагування при можливих змінах у організмі в значній мірі визначає морфофункціональний стан імунних органів і систем захисту тварин. Отже, застосування препаратів, що впливають на стан клітинної мембрани, потребує одночасного застосування препаратів мембраностабілізуючої дії. РБС містить велику кількість активних груп, що дозволяє йому впливати на проникність клітинних мембран, ймовірно, за рахунок підвищення рівня внутрішньоклітинного кальцію – одного з головних медіаторів активації клітин, що у кінцевому результаті може проявлятися стабілізацією ліпідного та вуглеводного обміну клітинних систем організму. У цілому препарат, ймовірно, може підвищувати регенеративно - репаративний потенціал організму, що проявляється у стимулюючій його дії. Ймовірним наслідком застосування даного препарату є регуляція проліферативної активності фібробластів, а за рахунок цього відбуваються регенеративні процеси в організмі (Ніколаєнко О.М., 1999).

Загалом, за даними наших досліджень, препарат РБС проявляє найбільш виражений вплив на фагоцитарну ланку природної резистентності. Це, скоріше за все, призводить до помірної активації синтезу цитокінів, що продукуються даними клітинами та, в кінцевому результаті, загальної корекції як клітинної, так і гуморальної відповіді. Імунокоригуюча дія препарату, що проявляється при порушеннях імунного стану організму, може полягати, окрім того, в помірній активації Т-лімфоцитів. Це, ймовірно, може проявлятися у балансуванні роботи як Т-хелперів і Т-кілерів, так і у нормалізації роботи Т-супресорів, що інгібують активність В-лімфоцитів. Така дія сприяє відновленню балансу між клітинною та гуморальною ланками імунітету у разі його порушення. Оскільки препарати офлоксацинового ряду також здатні посилювати первинну цитокінову відповідь при введенні в організм, то у випадку застосування РБС разом з енроцином спостерігається активація імунітету за принципом синергідної дії. РБС до деякої міри потенціює дію антибіотиків і, разом із тим, зменшує їх можливу імунотоксичну дію. У залежності від вихідного стану імунітету, препарат коригує співвідношення та активність його клітинних та гуморальних складових.

Висновки:

У дисертації наведено теоретичне обґрунтування і нове вирішення наукової проблеми збереження резистентності організму телят 2-4-місячного віку за впливу препаратів антимікробної дії. У проведених нами дослідженнях встановлено, що показники імунітету тварин зазнають змін протягом 7-14 діб після початку застосування антимікробних препаратів (пеніциліну та стрептоміцину, гентаміцину, енронцину, окситетрацикліну, тілбіану) з різним ступенем проникнення до клітини, та піддаються корекції препаратом тканинного походження РБС. У результаті проведених досліджень встановлено:

1. Загальні показники імунофізіологічного стану телят 2-4 місячного віку з респіраторними захворюваннями (бронхопневмонія) є нестабільними і можуть зазнавати суттєвих відхилень внаслідок застосування антимікробних препаратів (пеніциліну, стрептоміцину, гентаміцину, окситетрацикліну, енроцину, тілбіану);–

при вивченні дії гентаміцину – препарату 2 групи – встановлено зменшення кількості лейкоцитів у крові телят на 7 добу від початку досліду на 15,8 - 23,2 % у порівнянні з іншими групами телят; –

при вивченні впливу тілбіану – препарату 3 групи – встановлено зростання загальної кількості лейкоцитів у крові дослідних тварин на 43 % у порівнянні з попереднім періодом та кількості В-лімфоцитів у середньому на 24,3 % (р? 0,05).

2. Зміни параметрів імунного захисту при застосуванні препаратів з низьким (пеніцилін, стрептоміцин) і середнім (гентаміцин, енроцин, окситетрациклін) ступенем проникнення до клітини проявлялися у зниженні активності факторів неспецифічної резистентності – як клітинних, так і гуморальних: фагоцитарної активності нейтрофілів та бактерицидної і лізоцимної активності сироватки крові.

3. При застосуванні препарату з високим ступенем проникнення до клітини (тілбіан) встановлено зміни показників природного імунітету – підвищення фагоцитарної активності нейтрофілів у 1,52 рази порівняно з контролем (р? 0,05), бактерицидної активності сироватки крові у 1,5 рази у порівнянні з періодом до введення (р? 0,05).

4. Внаслідок вікових особливостей формування імунної системи у телят 3-місячного віку спостерігалося зниження лізоцимної активності сироватки крові у середньому на 13-32 %, по відношенню до загального рівня показника інших груп телят, за умов застосування антимікробних препаратів з низьким та середнім ступенем проникнення до клітини.

5. При застосуванні левамізолу встановлено підвищення активності як клітинних, так і гуморальних факторів захисту організму телят. Виявлене підвищення рівня ?-глобулінів у білковому спектрі сироватки крові на 38 % у порівнянні з контролем (р? 0,05) та підвищення кількості Т-лімфоцитів на 12,8 %. За умов нестабільного фізіологічного стану організму застосування імуностимулюючих доз препарату може викликати певні застереження.

6. Вплив препарату РБС на імунну систему реалізувався, перш за все, шляхом впливу на стан компонентів неспецифічної резистентності та її клітинного фактора – фагоцитарної системи нейтрофілів. При одночасному застосуванні РБС з антибіотиками, за умов нестабільного імунофізіологічного стану організму телят, не спостерігалося негативних змін показників імунітету; у більшості випадків використання імуномодулятора дозволяло уникнути можливого негативного впливу препаратів антимікробної дії.

7. За умов використання антимікробних препаратів або одночасного їх застосування з імуномодуляторами телятам 2-4-місячного віку обов’язкове проведення імунологічного моніторингу, незважаючи на наявність чи відсутність початкових змін у показниках імунітету.

практичні рекомендації

1. При використанні антимікробних препаратів 1 і 2 групи (з середнім та низьким ступенем проникнення до клітини) телятам 2-4 місячного віку, для стабілізації імунного захисту організму, рекомендуємо застосовувати препарат РБС протягом всього періоду введення антибіотиків.

2. При використанні антимікробних препаратів з високим ступенем проникнення до клітини слід проводити імунологічний моніторинг протягом всього періоду використання антимікробного препарату.

3. Для стабілізації функцій імунної системи, при наявності стану фізіологічної нестабільності систем захисту організму телят, рекомендуємо застосування препарату РБС внутрішньом'язово в дозі 1 мл на 20 кг маси тіла, через добу, 5 разів.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Дія левамізолу на окремі показники імунітету у хворих телят і телиць/ Клос Ю.С., Михалусь Г.М., Кружель Н.П., Дацьків О.М., Лісова Н.Е., Шкодяк Н.В., Бассараб В.П., Левків Г.Ю., Кішко А.С. // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини імені С.З.Гжицького. – Львів, 1999. –Т.1, № 4. – С. 84-91. (Дисертант брав участь у проведенні досліду, визначенні гематологічних та імунологічних показників телят, проводив науковий та статистичний аналіз отриманих результатів та описав їх у статті).

2. Вплив аерозолів декаметоксину на імунологічні та інші показники телят, уражених респіраторними хворобами / Клос Ю.С., Михалусь Г.М., Кружель Н.П., Дацьків О.М., Лісова Н.Е., Шкодяк Н.В., Бассараб В.П. Левків Г.Ю., Кішко А.С. // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини імені С.З.Гжицького. – Львів, 1999. – Вип.2. – С. 70-75. (Дисертант брав участь у