Українська Академія Аграрних наук

Нікітський ботанічний сад – Національний науковий центр

Митрофанова

Ірина Вячеславівна

УДК 504.73:57.085.2

соматичний ембріогенез та органогенез як основа біотехнології отримання і збереження багаторічних садових культур

03.00.20 - біотехнологія

Автореферат

дисертація на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Ялта – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі біотехнології і біохімії рослин Нікітського ботанічного саду - Національного наукового центру УААН

Науковий консультант:

доктор технічних наук,

професор, академік УААН

Єжов Валерій Микитович,

Нікітський ботанічний сад – Національний науковий центр УААН,

завідувач відділу біотехнології і біохімії рослин.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

Кучук Микола Вікторович,

Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України,

в.о. завідувача відділу генетичної інженерії;

доктор біологічних наук, професор

Бугара Олександр Михайлович,

Таврійській національний університет ім. В.І. Вернадського

Міністерства освіти і науки України,

завідувач кафедри фізіології рослин і біотехнології;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Ігнатова Світлана Олександрівна,

Південний біотехнологічний центр у рослинництві УААН і МОН України, завідувач лабораторії культури тканей.

Захист відбудеться “2” листопада 2007 р. о 10.00 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 53.369.01 при Нікітському ботанічному саді – Національному науковому центрі за адресою: 98648, Україна, АР Крим, м. Ялта, Нікітський ботанічний сад – Національний науковий центр

Факс: (38) 0654 33-65-50, Е-mail: ssadogurskij@yandex.ru

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Нікітського ботанічного саду – Національного наукового центру за адресою: 98648, Україна, АР Крим, м. Ялта, НБС-ННЦ

Автореферат розісланий “5” вересня 2007 року.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Садогурський С.Ю.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Біотехнологічні підходи, засновані на культивуванні органів і тканин багаторічних садових рослин поза організмом, на штучних живильних середовищах у регульованих асептичних умовах, відкривають принципово нові можливості для фундаментальних і прикладних досліджень. Рослинні системи in vitro є зручними моделями для дослідження складних механізмів, що лежать в основі проліферації, клітинної диференціації, гістогенезу, органогенезу, соматичного ембріогенезу та регенерації цілого організму з клітин, що культивую Также и бонитировка? – Кем предложена – не указано. ться і мають тотипотентність (Бутенко, 1964, 1999; Кунах, 1995, 2005; Deverno, 1995; Merkle, 1997; Thorpe, Harry, 1997; Батыгина, Васильева, 2002). У прикладному аспекті на основі знань про біологію клітини in vitro розробляються меристемні технології, ембріокультура, гаплоїдні технології, клітинна селекція, генна та клітинна інженерія (Здруйковская-Рихтер, 2003; Ігнатова, 2001; Мельничук та ін., 2003; Jain, Ishii, 2003). Теоретичну основу абсолютно всієї методології культури клітин, органів і тканин, у тому числі клонального мікророзмноження, становить морфогенез in vitro. Незважаючи на наявні експериментальні роботи в галузі вивчення процесів морфогенезу і регенерації рослин в умовах in vitro, досі залишаються не розробленими системи отримання та збереження рослин in vitro для більшості багаторічних садових культур. Це обумовлено відсутністю чітких, добре відтворюваних методик, їх трудомісткістю, а також нестачею знань про морфогенетичні потенції органів і тканин цих культур та способи управління морфогенезом.

Колекційний генофонд Нікітського ботанічного саду - Національного наукового центру містить у собі різноманітні види та сорти декоративних, субтропічних і кісточкових плодових, ефіроолійних рослин, що мають як естетичне, так і господарське значення. Разом з цим, складнощі, що виникають при традиційному розмноженні, у процесі селекції і збереження багаторічних садових культур, спонукають науковців звертатися до сучасних методів біотехнології рослин.

Отже, спрямовані на глибоке вивчення процесів соматичного ембріогенезу та органогенезу дослідження є вельми актуальними, бо не тільки дозволяють поповнити знання про морфогенез рослин у цілому, зробити істотний внесок у розробку його теоретичних основ, але й розробити біотехнологічну методологію розмноження та збереження цінних видів і сортів декоративних, субтропічних і кісточкових плодових культур та ефіроолійних рослин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. У дисертаційній роботі узагальнено результати науково-дослідної роботи, виконаної у відповідності до науково-тематичних планів відділу біотехнології і вірусології рослин у рамках науково-технічних програм УААН за темами “Інтродукувати і вивчити генофонд декоративних, плодових і технічних рослин, удосконалити методи селекції і біотехнології та на їх основі створити нові сорти інтенсивного типу” (№ ДР 0192U034076), “Поповнення і вивчення генофонду плодових, субтропічних, горіхоплідних, декоративних, ефіроолійних, лікарських, пряноароматичних і красильних рослин; створення їх продуктивних і стійких сортів з використанням сучасних методів фізіології, біохімії й біотехнології” (№ ДР 0197U004324), “Розробити теоретичні і практичні принципи збереження і збільшення біологічного різноманіття декоративних, плодових і нових технічних рослин шляхом інтродукції, акліматизації, біотехнології та спрямованої селекції” (№ ДР 0101U007189), згідно з тематичним планом державної науково-технічної програми 03.04-МВ/322-97 “Теоретичні основи селекції та насінництва сільськогосподарських культур” за завданням “Розробити методи інтенсифікації формоутворюючих процесів субтропічних, горіхоплідних і кісточкових плодових культур через отримання сома- і каліклонів”, планом науково-технічної програми УААН “Біотехнологія культурних рослин 2001-2005 рр. “Розробка і впровадження ДНК-технологій, культури тканин та органів in vitro для розвитку теорії і практики селекції рослин”, затвердженої постановою Президії УААН (протокол №17 від 21.12.2000 р.), у рамках Державної НТП 02.12 “Перспективні біотехнології” за договором №2/655-97 і проектом 02.12/07734 “Синтезувати поліплоїди лікарських рослин Hyssopus officinalis L. та Nepeta cataria var.citriodora Beck. з використанням антимікротрубочкових сполук в умовах in vitro” з Міністерством України у справах науки та технології (№ ДР 0198U002007), у рамках Державної НТП 3.2. “Біотехнологія рослин та біобезпека” за договором ДП/39-2003 і проектом 03.02.02/0000728 “Розробити раціональну систему збереження в умовах in vitro цінних генотипів декоративних рослин, субтропічних і кісточкових плодових культур” з Міністерством освіти і науки України (№ ДР 0103U005992). З 2006 р. робота продовжується за завданням відділу біотехнології і біохімії рослин НБС-ННЦ УААН 09.02/017 “Створити в умовах in vitro колекції цінного рослинного генофонду на основі вивчення біотичних і абіотичних факторів безпересадочного культивування регенерантів плодових, субтропічних і декоративних культур” (№ ДР 0106U006808).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - виявити закономірності процесів соматичного ембріогенезу та органогенезу декоративних, субтропічних, кісточкових плодових і ефіроолійних культур і на їх основі розробити системи розмноження та збереження in vitro досліджуваних видів і сортів.

Відповідно до поставленої мети передбачалося вирішити такі завдачі:

1. Встановити морфогенетичні потенції органів і тканин ломиноса і розробити систему прямого і непрямого соматичного ембріогенезу.

2. Виявити особливості регенерації рослин каладіума і показати можливі шляхи морфогенезу in vitro цієї культури.

3. Визначити оптимальні умови культивування експлантів фікуса ліровидного, що індукують процес соматичного ембріогенезу.

4. Установити закономірності регенерації рослин субтропічних плодових культур (зизифус, ківі, фейхоа, хурма) в умовах in vitro.

5. Дослідити особливості прямої регенерації рослин in vitro з листкових дисків ефіроолійних рослин (м’ята котяча, гісоп).

6. На основі встановленого регенераційного потенціалу експлантів декоративних (ломиніс, троянда, орхідея, юка), субтропічних (ківі, фейхоа) і кісточкових плодових (алича, персик, слива) культур розробити систему in vitro для тривалого збереження рослин при низьких позитивних температурах.

7. Провести порівняльний аналіз особливостей морфогенезу in vitro культур, які вивчалися і виявити закономірності та шляхи регенерації рослин.

Об'єкт дослідження. Процеси соматичного ембріогенезу та органогенезу in vitro.

Предмет дослідження. Шляхи реалізації морфогенетичного потенціалу різних експлантів досліджуваних культур, особливості одержання та депонування рослин в умовах іn vіtro.

Методи дослідження. Методи культури органів і тканин, молекулярно-біологічний метод (полімеразно-ланцюгова реакція, ПЛР), гістологічні методи, метод світлової та флуоресцентної мікроскопії, методи статистичного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на основі проведеного глибокого дослідження процесів прямого і непрямого соматичного ембріогенезу in vitro ломиноса, каладіума, фікуса ліровидного встановлено морфогенетичні потенції їх органів і тканин та закономірності індукції формування і розвитку ембріоїдів. Виявлено основні фактори, що впливають на частоту соматичного ембріогенезу рослин і обумовлюють реалізацію морфогенетичних потенцій in vitro у досліджуваних культур (індуктор, генотип, тип експланта, концентрація цитокініну, температура та інтенсивність освітлення). Доведено висунуту гіпотезу про провідну роль індуктора (соматичний зародок або група соматичних зародків) у процесі соматичного ембріогенезу ломиноса. Показано можливість формування 7 морфологічних типів соматичних зародків ломиноса, з яких тільки 4 здатні до формування повноцінних рослин. Вперше в результаті вивчення молекулярно-генетичної гетерогенності рослин ломиноса, одержаних при різних способах регенерації in vitro, встановлено особливості мінливості геному. Визначено, що збільшення кількості пасажів підвищувало частоту вторинного соматичного ембріогенезу ломиноса, каладіума та фікуса ліровидного. Вперше показано різні шляхи реалізації морфогенетичного потенціалу вегетативних бруньок ломиноса та висічок листка каладіума і фікуса ліровидного.

Вперше установлено високу регенераційну здатність листкових експлантів ряду субтропічних плодових культур до адвентивного пагоноутворення, а сім'ядолей – до соматичного ембріогенезу і прямої регенерації мікропагонів.

Показано вплив розташування експланта на живильному середовищі, концентрації фітогормонів, інтенсивності освітлення і температури на процес прямої регенерації рослин м’яти котячої та гісопу. Доведено позитивний ефект оптимальної концентрації тідіазурону на процес прямої регенерації мікропагонів ефіроолійних культур.

Створено реципієнтні системи in vitro ківі, зизифуса, фейхоа, хурми, м’яти котячої та гісопу на основі прямої регенерації цих рослин з листкових експлантів, що свідчить про високу тотипотентність клітини.

Вперше розроблено основні принципи депонування in vitro декоративних, субтропічних і кісточкових плодових рослин. Основним підходом до збереження колекцій цінних генотипів є мінімізація росту експлантів і запобігання їх старінню за рахунок комплексного використання кількох ефекторів, таких як температура, інтенсивність освітлення, склад живильного середовища, концентрації осмотика та ретарданту.

Практичне значення одержаних результатів. Уперше розроблено спосіб прямого соматичного ембріогенезу ломиноса, що дав змогу масово розмножити генетично однорідний посадковий матеріал. Підібрано склад живильних середовищ для прямого і непрямого соматичного ембріогенезу ломиноса. Розроблено способи соматичного ембріогенезу та органогенезу каладіума. В результаті непрямого соматичного ембріогенезу і регенерації мікропагонів з калюсу листків каладіума отримано нові форми, що відрізняються розміром і забарвленням листкової пластинки. Вдосконалено метод мікророзмноження фікуса ліровидного за рахунок розробки способу прямого соматичного ембріогенезу з листка.

На основі вивчення впливу гормональних, трофічних і фізичних факторів культивування на органи і тканини цінних субтропічних культур, таких як зизифус, ківі, хурма та фейхоа розроблено способи регенерації рослин in vitro з листкових дисків і подано реципієнтну систему для подальших маніпуляцій, що підвищують ефективність створення нових форм і сортів. Уперше розроблено і запатентовано в Україні спосіб прямої регенерації мікропагонів з листкових експлантів ківі. Форми хурми, одержані внаслідок прямої регенерації мікропагонів із сім'ядолей незрілих зиготичних зародків, вирощуються в дослідному господарстві “Новокаховське” (Херсонська обл.).

Уперше розроблено і запатентовано спосіб прямої регенерації адвентивних мікропагонів гісопу звичайного. Використання цього методу дозволило розмножити рослини м’яти котячої, які передано до відділу нових ароматичних і лікарських рослин НБС-ННЦ і які перебувають у колекційних посадках.

Уперше в Україні створено повільно зростаючу in vitro колекцію цінних декоративних, субтропічних, кісточкових плодових рослин на основі розробки біотехнологічної системи депонування рослин при низьких позитивних температурах, що представлена 27 сортами троянди, 3 видами орхідей, 1 видом юки, 9 сортами ломиноса, 4 сортами й 2 гібридами ківі, 2 формами фейхоа, 2 сортами аличі, 1 сортом абрикоса та 10 сортами сливи.

Результати дисертаційної роботи використовуються в навчальному процесі під час підготовки студентів, фахівців і магістрів на біологічному факультеті Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського (м. Сімферополь), на факультеті екології й біотехнології Навчально-наукового інституту охорони природи і біотехнології Національного аграрного університету (м. Київ), на біологічному факультеті Московського державного університету ім. М.В. Ломоносова (м. Москва, Росія), а також їх включено до лабораторних практикумів і лекційних матеріалів спецкурсів “Основи біотехнології”, “Культура клітин рослин з основами біотехнології”, “Клональне мікророзмноження рослин”, “Біологія”, “Мікробіологія і вірусологія” та “Загальна біотехнологія”.

Особистий внесок здобувача. Результати досліджень, які подані в дисертації, одержані здобувачем у відділі біотехнології і вірусології рослин та у відділі біотехнології і біохімії рослин Нікітського ботанічного саду – Національного наукового центру УААН. Дисертаційна робота спланована і виконана автором під керуванням наукового консультанта, д.т.н., професора, академіка УААН В.М. Єжова. Ідеї, гіпотези та теоретичні концепції належать здобувачеві. Безпосередньо дисертантом проведений інформаційний пошук і зроблений глибокий аналіз даних світової літератури, підготовлений огляд. Автором проведені всі лабораторні дослідження та роботи з адаптації рослин в закритому ґрунті. Написання дисертації та її оформлення здійснене здобувачем самостійно. Дослідження молекулярно-генетичної гетерогенності ломиноса проведено разом із співробітниками Південного біотехнологічного центру УААН і МОН, м. Одеса (д.б.н. Сиволап Ю.М., м.н.с. Галаєв А.В.). Онтогенетичні дослідження соматичного ембріогенезу ломиноса та каладіума проведено разом із співробітниками Інституту фізіології і біохімії рослин та мікроорганізмів РАН, м. Саратов, Росія (д.б.н. Соколов О.І). До дисертації включено дані експериментів, проведених разом з аспірантами, науковими співробітниками різних підрозділів НБС-ННЦ.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, які увійшли до дисертаційної роботи, одержали позитивну оцінку на розширених засіданнях відділу біотехнології й біохімії рослин НБС-ННЦ, а також їх було апробовано на II і ІІІ Міжнародних конференціях “Регуляторы роста и развития растений” (Москва, Росія, 1993, 1995), Міжнародній конференції молодих учених “Проблемы дендрологии, садоводства и цветоводства” (Ялта, 1995), Міжнародній науково-практичній конференції “Переработка лекарственного сырья и производство фитопрепаратов для медицины и сельского хозяйства” (Алмати, Казахстан, 1996), Міжнародній конференції “Пути решения проблем и перспективы развития биотехнологии в декоративном садоводстве и плодоводстве” (Ялта, 1997), VII Міжнародній конференції “Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда” (Москва, Росія, 1997), II Міжнародній конференції “Биоресурсы и вирусы” (Київ, 1998), II Intl. Symp. “Plant Biotechnology” (Kyiv, 1998); Intl. Symp. “Fruit Breeding and Genetics” (Dresden, Germany, 1999), 7 Intl. Conf. “International Meeting of Young Scientists in Horticulture” (Lednice, Czech Republic, 1999), Intl. Symp. “UK-Ukraine Workshop on Plant Biotechnology” (Norwich, Great Britain, 1999), 12th Congress of the FESPP “Plant Physiology and Biochemistry” (Budapest, Hungary, 2000), Всеукраїнській конференції “Садівництво на межі тисячоліть” (Київ, 2000), Intl. Sci. Conf. “Growth, Development and Productivity of Plants. Theoretical and practical Problems” (Babtai, Lithuania, 2000; 2004), 4 Intl. Conf. “Propagation of Ornamental Plants” (Sofia, Bulgary, 2000), X Intl. Conf. “Plant Embryology” (Nitra, Slovak Republic, 2001), Intl. Symposium “Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources” (Yalta, 2002), II Ukrainian-Bulgarian Workshop on Plant Biotechnology (Yalta, 2002), Всеукраїнській конференції молодих учених “Актуальные вопросы современного естествознания – 2003” (Сімферополь, 2003), II Міжнародній конференції молодих учених “Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений” (Харьків, 2003), IV Міжнародній конференції “Геном растений” (Одеса, 2003), 5th Intl. Symp. “Plant Biotechnology: Progress and Development” (Stara Lesna, Slovak Republic, 2003), VIII Міжнародній конференції “Биология клеток растений in vitro и биотехнология” (Саратов, Росія, 2003), Міжнародній конференції “Охрана и культивирование орхидей” (Харьків, 2003), Ukranian-U.K. Workshop on Plant Biotechnology “Biotech Approaches to Engineering plant growth” (Yalta, 2004), Intl. Conf. of Baltic States “Plant Tissue Culture: From Theory to Practice” (Salaspils, Latvia, 2004), Міжнародній конференції, присвяченій 60-річчю Головного ботанічного саду ім. М.В. Цицина РАН, “Ботанические сады как центры сохранения биоразнообразия и рационального использования растительных ресурсов” (Москва, Росія, 2005), науковій конференції “Сучасна біотехнологія в сільському господарстві та медицині” (Киев, 2005), V Міжнародній конференції “Цветоводство без границ” (Харьків, 2006), III Міжнародній конференції “Фактори експериментальної еволюції організмів” (Алушта, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 61 наукову працю у вітчизняних і зарубіжних виданнях, у їх числі 24 – у спеціалізованих виданнях, 2 патенти України на винахід, 2 статті у збірнику наукових праць, 33 – у збірниках матеріалів і тез міжнародних конгресів, симпозіумів і конференцій.

Структура і обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 354 сторінках комп'ютерного тексту. Вона складається зі вступу, 8 розділів, висновків, практичних рекомендацій, списку використаної літератури, що включає 552 найменування, у їх числі 453 – іноземними мовами, і додатків. Дисертація містить 38 таблиць і 106 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРНИХ ДАНИХ

У літературному огляді наведено детальний опис шляхів реалізації морфогенетичного потенціалу органів і тканин вищих рослин в умовах in vitro за допомогою соматичного ембріогенезу, як найважливішого біологічного механізму розвитку і регенерації рослин. На численних прикладах різних видів розглянуто його різні типи, генезис і фактори, необхідні для ефективного функціонування цього унікального способу розмноження рослин у різних системах in vitro, спрямованих на поліпшення поданих культур та їх широкомасштабну репродукцію. Відзначено переваги і недоліки кожного з досліджених різними авторами шляхів соматичного ембріогенезу. Особливу увагу приділено складу живильних середовищ у взаємозв'язку з вмістом трофічних компонентів і регуляторів росту. Розглянуто роль останніх як індукторів, інгібіторів і тригерів етапів соматичного ембріогенезу. Показано вплив фізичних факторів (інтенсивність освітлення, спектральний склад світла, фотоперіод, температура) на ефективність проходження окремих етапів цього процесу. Відображено питання прояву сомаклональної мінливості при культивуванні органів і тканин рослин в умовах in vitro. Представлено галузі застосування соматичного ембріогенезу в біотехнології для цілей розмноження, селекції і кріозбереження цінного рослинного матеріалу. Показано сучасний стан питань прямої і непрямої регенерації вищих рослин з різних експлантів і показано результати, одержані різними авторами в процесі досліджень.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для проведення досліджень було використано модельні рослини, представлені видами, сортами та формами родин: Ranunculaceae, Rosaceae, Ebenaceae, Myrtaceae, Moraceae, Agavaceae, Actinidiaceae, Araceae, Orchidacea, Lamiaceae з колекційного генофонду НБС-ННЦ. В експерименти з соматичного ембріогенезу та орагногенезу було включено експланти ломиноса (Clematis L.), каладіума (Caladium hortulanum Birdsey.) і фікуса ліровидного (Ficus lyrata Warb.). Для розроблення реципієнтних систем in vitro як вихідний рослинний матеріал використано вегетативні бруньки, листя, мікропагони і зародки хурми (Diospyros kaki Thunb.), фейхоа (Feijoa sellowiana Berg.), зизифуса (Ziziphus jujuba Mill.), ківі (Actinidia deliciosa (Chev.) Liang, Ferguson), м’яти котячої (Nepeta cataria L.) та гісопу (Hyssopus officinalis L.). У дослідженнях з депонування рослин і створення повільно зростаючих колекцій в умовах in vitro використовувалися такі культури, як троянда (Rosa L.), ломиніс (Clematis), цимбідіум (Cymbidium hybridum, C. minima), досинія (Dossinia sp.), юка (Yucca aloifolia L., Y. torrey Shafer.), ківі (A. deliciosa), фейхоа (F. sellowiana), абрикос (Prunus armeniaca L.), алича (Prunus cerasifera Ehrh.), слива (Prunus domestica L.).

Умови стерилізації рослинного матеріалу підбиралися під кожну з досліджуваних культур. Залежно від походження експланта, що вводився, опрацьовувалися експозиція і концентрація стерилізуючого агента. Як антисептики було використано комерційний препарат Domestos (Unilever Madyarorszбg Kft., Угорщина), що містить 5% розчин гіпохлориту Na, 70% етиловий спирт (Медасепт, Україна), 0,08% розчин AgNO3 (Merсk, Німеччина), 1% розчин Thimerosal (Merсk, Німеччина), які звільняли експланти, що вводяться, від бактеріальної та грибної інфекції. Результати цих експериментів викладено в розділах 3, 4, 5 дисертації.

При вивченні морфогенетичних потенцій органів і тканин в умовах in vitro досліджуваних культур було використано ряд базових живильних середовищ, таких як Моньє (Monnier, 1973), Кнудсона С (Knudson, 1925), МС (Murashige, Skoog, 1962), В5 (Gamborg, Eveleigh, 1968), КЛ (Quoirin, Lepoivre, 1977), які при виконанні експериментів було модифіковано. Для регулювання процесів соматичного ембріогенезу та органогенезу рослин in vitro до складу живильного середовища вводили фітогормони цитокінінового (0,44-44,00 мкМ БАП, 0,46-46,00 мкМ кінетину, 0,46-45,62 мкМ зеатину, 1,0-9,0 мкМ ТДЗ) і ауксинового типу дії (0,29-11,47 мкМ ІОцК, 0,25-9,8 мкМ ІОлК, 0,27-10,74 мкМ НОК, 4,52-13,56 мкМ 2,4-Д. Як основний вуглевод для культивування органів і тканин застосовували сахарозу в концентрації 20-40 г/л. Експланти вирощували в культуральній кімнаті, де залежно від об'єкта дослідження, що культивується, та експерименту підтримувалася температура 20-30С, 16-годинний фотоперіод, інтенсивність освітлення 0-62,5 мкМ м-2 с-1 і 70% відносна вологість повітря. Частину експлантів поміщали до термостату з температурою 25С. Субкультивування тканин і органів проводили через 15-30 діб.

Приготування та забарвлення препаратів проводили відповідно до методик, викладених у роботах У.Дженсена (1965), Є. Пірса (1962) і М.Н. Прозіної (1960). Зрізи забарвлювали 0,1% водяним розчином акридинового жовтогарячого, 0,5% водяним розчином толуїдинового синього та водяним розчином DAPI (10 мкг/мол). На постійних препаратах досліджували особливості формування первинних і вторинних соматичних зародків, а також утворення адвентивних бруньок ломиноса, каладіума та фікуса ліровидного. Зрізи (5 і 10 мкм) одержували з використанням мікротома МС-2 (Росія). Всі препарати аналізували та фотографували під флуоресцентним мікроскопом Leica DMLB (Німеччина). Розвиток соматичних зародків і утворення адвентивних бруньок досліджували під стереомікроскопом МБС-9 (Росія).

Молекулярно-біологічний аналіз рослин ломиноса, одержаних у результаті органогенезу, прямого та непрямого соматичного ембріогенезу in vitro, проводили за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. ДНК виділяли за допомогою СТАВ-буфера (Сиволап, 1998). Для ампліфікації використовували прилад “Терцік” (ДНК-технологія, Росія). Реакційна суміш для проведення ISSR – ПЛР обсягом 20 мкл містила: 50 мМ КСl, 20 мМ трис-НСl (рН 8,4 при Т 25С), 2-5 мМ MgCl2, 0,01% Tween 20, з 0,2 мМ кожного нуклеотиду, 0,2 мкМ праймера, 20 нг ДНК й 1 од. Taq-полімерази. Ампліфікацію з сімома ISSR-праймерами проводили в режимі: перша денатурація - 93С – 1 хв. 30 с, 35 циклів - 60С – 40 с, 70С – 1 хв., 93С – 30 с, остання елонгація - 70С – 1 хв. 30 с. Електрофорез продуктів ампліфікації ДНК проводили в однократному буфері (0,045 М Трис-борат і 10 мМ ЕДТА, рН 8,0) в 2%-ному агарозному гелі довжиною 12 см при 100-130 В протягом 2,5 год. Гелі, попередньо забарвлені бромистим етидієм, після електрофоретичного поділу продуктів ампліфікації фотографували в ультрафіолетовому світлі на плівку “Мікрат-300”. Результати ISSR-аналізу обраховували згідно з M. Nei і W. Li (1979).

При проведенні експериментів зі створення зростаючих in vitro колекцій декоративних, субтропічних і кісточкових плодових культур для характеристики регенераційної здатності експлантів використовували ряд показників: ростовий індекс, частота регенерації, органогенетичний індекс, ефективність мікророзмноження, викладених у методиках оцінки рослинних об'єктів (Калинин и др., 1980; Dudits, Hesky, 1990). Уповільнення ростових процесів досліджуваних культур проводилося за допомогою введення до складу живильного середовища таких інгібіторів росту: 15, 20, 30, 60, 90 г/л сахарози, 40, 50, 60 мг/л маніту, 40, 50, 60 мг/л сорбіту, 20, 30 г/л глюкози, 0,9, 1,8 мг/л -аспарагіну, 5-10 мг/л АБК і 0,2-1,2 мг/л хлор холін хлориду (ССС). Методика введення інгібіторів опрацьовувалася нами в процесі проведення експериментів. Пробірки, колби та банки з експлантами поміщали до холодильних камер з регульованою низькою позитивною температурою (5 1С) та інтенсивністю освітлення 1,25-3,75 мкМ м-2 с-1. Рослинний матеріал фіксували через 3, 6, 12, 24, 36 місяців культивування. Оцінювали якісні (бонітування за допомогою 4-бальної шкали) та кількісні характеристики депонованих експлантів (життєздатність, довжина мікропагона, кількість міжвузль, кількість коренів).

Для вкорінення мікропагонів використовували 0,49-9,80 мкМ ІОлК і 1,07-5,37 мкМ НОК. Експланти поміщали на живильне середовище, що містить Ѕ норми солей з МС, 1-1,5% сахарози, 25 мг/л мезоінозиту, 0,6-0,8% агару (Sigma-Aldrich, США). Укорінені мікропагони та рослини, одержані із соматичних зародків, висаджували до стерильного субстрату (торф: пісок – 2:1, торф: пісок: лісова земля – 2:1:1, торф: пісок: лісова земля – 1:1:2). Адаптовані до умов in vivo рослини вирощували в теплиці.

Математичну обробку даних проводили, використовуючи комп'ютерну програму STATISTICA for Windows, 6/0 (StatSoft, Inc/ 1984-2001) за допомогою методів статистичного аналізу, викладених у посібнику Г.Ф. Лакіна (1990).

МОРФОГЕНЕТИЧні ПОТЕНЦІї ОРГАНІВ І ТКАНИН ЛОМИНОСА (CLEMATІs L.) В УМОВАХ ІN VІTRO І РОЗРОБлення СИСТЕМИ СОМАТИЧнОГО еМБРіОГЕНЕЗу

Для розроблення біотехнологічної системи розмноження рослин ломиноса вперше вивчено особливості регенерації рослин через соматичний ембріогенез і органогенез іn vіtro і виявлено основні фактори, що впливають на морфогенетичний потенціал органів і тканин досліджуваних сортів.

У процесі досліджень визначено оптимальні строки введення в умови іn vіtro вегетативних бруньок сортів ломиноса Серенада Крима, Юность, Нєвєста, Crіmson Star, Космічєская мєлодія, Вєчний зов, Ай-Нор, Лєсная Опєра. Так, у період з лютого по квітень кількість бруньок, що утворюють мікропагони або соматичні зародки, досягала 90-100%. Поряд із тим, визначено ефективний спосіб стерилізації рослинного матеріалу (спосіб послідовного застосування 70% етилового спирту – 1 хв. і 4%-ного розчину гіпохлориту Na – 15 хв.), при якому кількість експлантів, вільних від контамінації, досягала 98%.

Проведено вивчення компонентного складу індукційного живильного середовища як фактора, що не тільки виявляє, але й підтримує якісні характеристики морфогенетичних подій, які відбуваються у вегетативних бруньках ломиноса, що розвиваються в процесі культивування іn vіtro. Для експлантів ломиноса експериментально підібрано сольову основу середовища МС і визначено необхідність присутності в ньому для індукції процесу непрямого соматичного ембріогенезу в якості дедиференціатора зеатину в концентрації 1,8 мкМ. Установлено, що протягом 30 діб культивування ембріогенного калюсу з'являлися ембріогенні зони, меристематичні бугорці та ембріоїди (рис. 1, 2). Гістологічний аналіз показав, що в ембріогенній масі є як ембріогенні, так і неембріогенні клітини. Виявлено, що на 3 добу культивування активізувалися процеси мітотичної та меристематичної активності в ембріогенній масі клітин. Проембріо починав формуватися внаслідок асиметричних поділів найчастіше безпосередньо всередині калюсу. Соматичні зародки з'являлися на поверхні калюсу тільки на 35-40 добу культивування.

Рис. 1. Формування меристематичних бугорців на поверхні калюсу ломиноса сорту Серенада КримаРис. 2. Соматичний зародок, що утворився в калюсу ломиноса сорту Серенада КримаПоказано, що присутність у середовищі зеатину індукувала утворення біполярних структур на поверхні та всередині калюсу. Так, максимальну кількість ембріоїдів на експлант (25 2,6 шт.) було одержано на середовищі МС, доповненому 1,8 мкМ зеатину через 4 тижні культивування. На стадії дозрівання в умовах іn vіtro відзначали утворення глобулярних, сердечковидних і торпедовидних ембріоїдів ломиноса, подібно до розвитку зиготичних зародків.

Уперше встановлено, що розвиток соматичних зародків ломиноса в умовах іn vіtro залежав від його морфологічного типу. З виявлених 7 морфологічних типів соматичних зародків, тільки 4-и мали регенераційний потенціал: 1 – односім'ядольний, 2 – двосім'ядольний, 3 – полісім'ядольний, 4 - трубчастий. Проростання таких соматичних зародків відбувалося протягом 30-40 діб культивування.

Наступне субкультивування соматичних зародків на середовище, що містить 1,8 мкМ зеатину і різні концентрації ІОлК, приводило до утворення вторинних ембріоїдів на поверхні вже сформованих зародків, що розвиваються. При цьому встановлено, що частота вторинного ембріогенезу залежала від концентрації ІОлК у живильному середовищі. Оптимальною виявилася концентрація 0,9 мкМ ІОлК, при якій середня кількість ембріоїдів склала 30 5,2 штук на експлант.

Використання фізичних факторів як ефекторів соматичного ембріогенезу дало змогу встановити оптимальні значення температури (26С) і інтенсивності освітлення (40 мкМ м-2 с-1), при яких кількість розвинених ембріоїдів досягала 25-30 штук на експлант (рис. 3, 4).

Рис. 3. Залежність частоти утворення соматичних зародків ломиноса від впливу температури в процесі культивування іn vіtroРис. 4. Залежність частоти соматичного ембріогенезу від впливу інтенсивності освітлення в процесі культивування калюсу ломиноса

Поряд із тим, вивчено особливості утворення мікропагонів із калюсу ломиноса. Показано, що калюс листкового походження діаметром 7-10 мм є компетентним експлантом, здатним формувати максимальну кількість адвентивних бруньок на живильному середовищі МС, що містить 2,3 мкМ зеатину.

Проведено молекулярно-генетичний аналіз донорної рослини та сомаклонів ломиноса сорту Серенада Крима, одержаних шляхом органогенезу та соматичного ембріогенезу. Встановлено особливості мінливості геному при різних способах регенерації іn vіtro. За допомогою ІSSR праймерів виявлено 105 ампліконів, з яких поліморфними виявилися 6. Середній показник гетерогенності рослин ломиноса склав 5,7%. На дендрограмі (рис. 5) видно, що найбільш генетично диференційованим від інших є контроль (материнська рослина, що не ввійшла до жодного з двох кластерів). Разом з тим, всі рослини, одержані з соматичних зародків і доведені до цвітіння, не відрізнялися за фенотипом від вихідної.

Рис. 5. Дендрограма, що відображує взаємини між 13 рослинами ломиноса, побудована на основі ІSSR-аналізу за допомогою UPGMA, відповідно до генетичних дистанцій, визначених за Нєм і Лі. По вертикалі вказано номери рослин, одержаних шляхом *: органогенезу з калюсу (рослини 1, 2 і 3); непрямого соматичного ембріогенезу (рослини 4, 5 і 6); прямого соматичного ембріогенезу з листкових дисків (рослини 7, 8 і 9); прямого соматичного ембріогенезу із сегментів мікропагонів (рослини 10, 11 і 12); контроль (доросла рослина 13)

На основі порівняльного вивчення морфогенетичних потенцій вегетативних бруньок 8 сортів ломиноса (Серенада Крима, Юность, Нєвєста, Crіmson Star, Космічєская мєлодія, Вєчний зов, Ай-Нор, Лєсная Опєра) розроблено систему прямого соматичного ембріогенезу. Встановлено залежність формування соматичних зародків від генотипу та концентрації БАП у живильному середовищі МС. Оптимальною виявилася концентрація БАП, що дорівнювала 2,22 мкМ, присутність якої в середовищі індукувала соматичний ембріогенез та утворення максимальної кількості зародків у всіх сортів ломиноса. В усіх досліджуваних сортів утворення соматичних зародків відбувалося безпосередньо на поверхні вегетативних бруньок, найчастіше в зоні апекса, де клітини активно діляться. На 20 добу культивування експлантів відзначено появу маси глобулярних структур. Поряд із тим, характерною рисою цих сортів була здатність первинних соматичних зародків до вторинного ембріогенезу. Досліджувані сорти розрізнялися між собою за частотою вторинного ембріогенезу. Так, високу частоту ембріогенезу, що досягала 65-100%, було відзначено у сортів Нєвєста, Crіmson Star, Серенада Крима, Юность, Ай-Нор при культивуванні на середовищі, що містило 2,2 мкМ БАП. Таким чином, як у випадку первинного, так і вторинного ембріогенезу, вищий ембріогенний потенціал мали бруньки сортів ломиноса, що відносилися до груп Ланугіноза і Жакмана.

У процесі досліджень уперше виявлено існування зони активізації утворення соматичних зародків ломиноса – тобто існували ембріоїд або група ембріоїдів, які були здатні індукувати як первинний, так і вторинний соматичний ембріогенез. Такий експлант був названий нами "індуктором". Вплив "індуктора" на соматичний ембріогенез виявлявся в активному утворенні додаткових зародків на експлантах, поміщених на живильне середовище. Це було нами відзначено в усіх сортів ломиноса, за винятком сорту Космічєская мелодія. Наша гіпотеза щодо впливу "індуктора" на сусідні експланти ломиноса через живильне середовище, до якого виділялися індукуючи речовини (метаболіти, гормони тощо) не підтвердилася. Поряд із тим, було встановлено, що "індуктор" міг діяти досить тривалий відрізок часу (до 2-3 років). Позитивною стороною призупинення процесу соматичного ембріогенезу за рахунок видалення "індуктора" була можливість поділу соматичних зародків на окремі фракції, шляхом їх згрупування за розміром і стадією розвитку.

На основі проведених досліджень визначено основні фактори, що впливають на процес прямого соматичного ембріогенезу ломиноса. Такими факторами є концентрація екзогенного цитокініну БАП, температура, інтенсивність освітлення, "індуктор" соматичного ембріогенезу та генотип. Встановлено, що при концентрації БАП 2,22 мкМ, температурі 24С та інтенсивності освітлення 40 мкМ·м-2·с-1 активізація процесів первинного і вторинного соматичного ембріогенезу відбувається тільки в присутності "індуктора". Частка його впливу складала 50%.

Всі одержані в умовах іn vіtro рослини адаптовано іn vіvo і висаджено іn sіtu. Адаптація соматичних зародків і рослин, одержаних з них, до умов іn vіvo проходила протягом 20-30 діб. Висадження до відкритого ґрунту сформованих рослин з потужною мочкуватою кореневою системою та дерев'янистими або напівдерев'янистими стеблами здійснювали через 9-12 місяців після адаптації до умов закритого ґрунту.

Таким чином, нами вперше створені оптимальні умови регенерації рослин через непрямий і прямий соматичний ембріогенез ломиноса та запропонована біотехнологічна система одержання рослин іn vіtro через прямий соматичний ембріогенез (рис. 6).

Рис. 6. Біотехнологічна система отримання рослин ломиноса через прямий соматичний ембріогенез (середовище МС, доповнене 2,22 мкМ БАП)

соматичний ембріогенез І РЕГЕНЕРАЦІЯ РОСЛИН каладіума (Caladium hortulanum Birdsey.) І ФІКУСА ліровидного (Ficus lyrata warb.) в умовах in vitro

На відміну від ломиноса, у каладіума та фікуса ліровидного саме листя виявилося компетентним експлантом, здатним до утворення як соматичних зародків, так і мікропагонів.

Установлено строки введення первинних експлантів каладіума і фікуса. Так, листя каладіума, відібране в період із травня по липень, було найбільш морфогенним, при цьому частота утворення соматичних зародків досягала 86-100%. Бруньки фікуса ліровидного вводили протягом усього року, а експланти листка відбирали з регенерантів, які культивувались в умовах in vitro. Визначено оптимальні способи стерилізації рослинного матеріалу обох видів, що дали змогу одержувати до 100% експлантів, вільних від контамінації: каладіум – 1,8%-ний розчин гіпохлориту натрію (5 хв.) 70%-ний етанол (1 хв.) дистильована H2O; фікус ліровидний – 70%-ний етанол (1 хв.) 4%-ний розчин гіпохлориту натрію (15 хв.) дистильована H2O.

У процесі дослідження було модифіковано склад живильного середовища МС (С1) та підібрано оптимальні концентрації цитокініну для індукції морфогенетичних процесів у тканинах листків двох сортів каладіума, що приводять до соматичного ембріогенезу. Серед випробуваних концентрацій кінетину оптимальною виявилася 2,32 мкМ, при якій формувалися соматичні зародки на 66,67% та 70,78% листкових дисків у сортів Pink Gem і Triumphe de Compte відповідно. Поряд із тим, удалося визначити найбільш морфогенні зони, здатні до прямого і непрямого соматичного ембріогенезу. Такими зонами виявилися – зона з'єднання листової пластинки з черешком і край висічки листка. Період розвитку від уведення первинних експлантів каладіума в культуру до появи глобулярних структур по краю висічки листка без етапу калюсоутворення склав 30 діб.

У процесі досліджень також установлено, що шляхи реалізації морфогенетичного потенціалу експлантів залежали від умов культивування. У разі відсутності освітлення формувалися тільки соматичні зародки. На світлі відбувалося три морфогенетичних процеси: органогенез у морфогенному калюсі, непрямий і прямий соматичний ембріогенез. У зоні з'єднання листкової пластинки з черешком ембріогенні структури з'являлися безпосередньо в епідермальній і субепідермальній зоні висічки листка. Протягом наступних 30 діб спостерігали розвиток повноцінних соматичних зародків. Наступні пасажі соматичних зародків на живильне середовище С1 індукували вторинний ембріогенез (рис. 7). Весь процес від уведення експлантів до регенерації рослин склав 3 місяці (рис. 8).

Рис. 7. Вторинний ембріогенез каладіума на живильному середовищі С1 | Рис. 8. Регенеранти каладіума, одержані з соматичних зародків через прямий ембріогенез

Непрямий соматичний ембріогенез і пряму регенерацію мікропагонів з висічок листка каладіума спостерігали на середовищах С2 з БАП і НОК. Установлено оптимальні концентрації фітогормонів (2,22 мкМ БАП і 2,69 мкМ НОК), які індукували утворення максимальної кількості мікропагонів і ембріоїдів.

У результаті непрямого соматичного ембріогенезу у сорту Triumphe de Compte, непрямої регенерації мікропагонів і непрямого соматичного ембріогенезу у сорту Pink Gem отримано нові форми з різними соматичними мутаціями. У виділених рослин соматичні мутації виявлялися у вигляді різних форм листкової пластинки, її забарвленні та жилкуванні.

Вивчення регенераційної здатності зон листка фікуса ліровидного показало, що всі вони мали високий морфогенетичний потенціал, який реалізувався через соматичний ембріогенез і пряму регенерацію мікропагонів. Відзначено, що край листкової пластинки виявився найбільш компетентним до утворення соматичних ембріоїдів. У зоні уздовж основної жилки і у черешка найчастіше індукувався процес прямої регенерації мікропагонів.

Ефективність індукції соматичного ембріогенезу фікуса ліровидного залежала від концентрації БАП у живильному середовищі Куорін і Лепойвре. Максимальна кількість ембріоїдів формувалася на живильному середовищі КЛ, доповненому 0,89-1,33 мкМ БАП. Кількість соматичних зародків досягала в середньому 7,5 0,2 штук на експлант. Соматичні зародки проходили всі стадії розвитку, які було чітко видно вже на 30 добу культивування. Повноцінні рослини з ембріоїдів фікуса формувалися на 40-60 добу від початку індукції формування соматичних зародків.

Як і у випадку з культурами ломиноса та каладіума, вторинний соматичний ембріогенез фікуса ліровидного відбувався на індукційному живильному середовищі. Збільшення кількості субкультивувань значно підвищувало частоту вторинного соматичного ембріогенезу. Безперервний процес соматичного ембріогенезу фікуса ліровидного відбувався протягом 2 років, при цьому частота ембріогенезу залишалася на одному рівні і досягала 95-100%.

Підвищення концентрації БАП до 1,78 мкМ індукувало процес прямої регенерації адвентивних мікропагонів з листкових експлантів фікуса ліровидного. Поряд із тим, показано, що максимальна кількість коренів (5,8 0,1 штук на мікропагін) утворилася на Ѕ норми середовища МС, доповненого 0,98 мкМ ІОлК.

У процесі досліджень вивчено умови адаптації in vivo регенерантів каладіума та фікуса.

Таким чином, розроблено біотехнологічні системи одержання рослин каладіума та фікуса ліровидного через соматичний ембріогенез і органогенез (рис. 9, 10). Розроблені біотехнологічні системи розмноження рослин дають можливість одержувати до 40.000000 регенерантів каладіума та 4.000000 регенерантів фікуса ліровідного на рік.

Рис. 9. Біотехнологічна система регенерації рослин каладіума в умовах in vitro

Рис. 10. Біотехнологічна система мікророзмноження фікуса ліровидного (температура 241С, інтенсивність освітлення 40 мкМ м-2 с-1,