МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ РАДІОЕЛЕКТРОНІКИ

Музика КАТЕРИНА МИКОЛАЇВНА

УДК 543.545: 543.426: 621.373.826

ТЕХНОЛОГІЯ СТВОРЕННЯ ЕЛЕКТРОХЕМІЛЮМІНЕСЦЕНТНОГО МІКРОФЛЮЇДНОГО ПРИСТРОЮ БІОМЕДИЧНОГО ПРИЗНАЧЕННЯ

Спеціальність 05.27.06 – технологія, обладнання та виробництво

електронної техніки

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата технічних наук

Харків – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті
радіоелектроніки Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: доктор фізико-математичних наук, професор

Рожицький Микола Миколайович,

Харківський національний університет

радіоелектроніки Міністерства освіти і

науки України, професор кафедри

біомедичних електронних

пристроїв та систем.

Офіційні опоненти: доктор фізико-математичних наук, професор

Лепіх Ярослав Ілліч,

Національний університет ім. І.І. Мечникова

(м. Одеса) Міністерства освіти і науки України,

завідувач науково-дослідної лабораторії електронних,

іонних та молекулярних процесів у напівпровідниках;

доктор технічних наук, професор

Черенков Олександр Данилович,

Харківський національний технічний університет
сільського господарства ім. П.Василенка

Міністерства аграрної політики України,

професор кафедри загальної електротехніки

Захист відбудеться _________________ 2008 р. о ____ год. ____хв. на засіданні спеціалізованої вченої ради К 64.052.04 при Харківському національному університеті радіоелектроніки за адресою: 61166, м. Харків, пр. Леніна, 14.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Харківського національного університету радіоелектроніки за адресою: 61166, м. Харків, пр. Леніна, 14.

Автореферат розісланий 16 січня 2008 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради Б.Г. Бородін

(підпис) (ініціали, прізвище)

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми.

Розробка технологічної бази створення пристроїв селективного та чутливого визначення діагностичнозначущих речовин, зокрема, амінокислот, за кількісним складом яких можна судити про різні захворювання (нефротичний синдром, туберкульоз тощо) є важливим завданням біомедичного приладобудування.

З використанням мікросистемної технології стало можливим реалізовувати пристрої пробопідготовки та детектування в межах одного пристрою на новому технологічному рівні — у форматі “на чипі”, що дозволяє здійснювати високошвидкісний, високоселективний, високочутливий аналіз. У світовій науковій літературі даний напрямок фігурує під різними назвами: Micro Total Analytical Systems (TAS), Microfluidic Chip, Lab-on-a-chip. Окремим випадком TAS є мікроаналітичні електрохемілюмінесцентні (ЕХЛ) системи капілярного електрофорезу біомедичного призначення з проточно-інжекційним принципом аналізу (ПІА), які дають можливість достовірного визначення амінокислот. Однак, такі пристрої описані у небагатьох роботах, що зумовлено технологічними проблемами їх мініатюризації.

Можливість реалізації ЕХЛ-пристроїв у мікроформаті з’являється за рахунок використання методу Ленгмюр-Блоджетт (ЛБ) при виготовленні нових типів електродів-трансд’юсерів (перетворювачів), модифікованих нанорозмірними молекулярними плівками з інкорпорованими молекулами електрохемілюмінофорів. Однак цьому передує наявність низки невирішених проблем, пов’язаних як із розробкою технології створення ЕХЛ-трансд’юсера, так і технологією визначення з його допомогою амінокислот. Зокрема, одержання нанорозмірних сенсорних плівок гальмується нездатністю самостійного утворення електрохемілюмінофорами однорідних і стабільних ленгмюрівських моношарів на поверхні водної субфази.

Технологічною проблемою щодо адаптації капілярного електрофорезу “на чипі” є відсутність технічно й економічно обґрунтованих методів створення мікро-структур-капілярів у полімерних матеріалах, а також необхідність розробки конфігурації капілярної мережі для високоефективного розділення проби з амінокислотами.

Тому актуальним при створенні мікрофлюїдного ЕХЛ-пристрою є розробка технологій одержання: мікроструктур-каналів заданих розмірів і топології, адекватної для проведення розділення проби з амінокислотами; ЕХЛ-трансд’юсера на базі нанорозмірних функціональних плівок ЛБ (ПЛБ), а також дослідження результатів розроблених технологій та апробація пристрою щодо визначення амінокислот.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота за темою дисертації безпосередньо пов’язана з напрямками досліджень, що проводяться на кафедрі біомедичних електронних пристроїв та систем Харківського національного університету радіоелектроніки (ХНУРЕ), зокрема, за програмами держбюджетних науково-дослідних робіт №180-1 “Розробка аналітичних методик, програмного забезпечення та люменометра для дослідження метаболічної й індуційованої хемілюмінесценції рідин” (ДР № U004069), № 217-1 “Розробка й дослідження новітньої гібридно-інтегральної мікроаналітичної електрохемілюмінесцентної системи біомедичного призначення” (ДР№0107U003030) та міжнародних проектів Українського науково-технологічного центру №GE-77 “Розробка новітніх технологій і оптохемотронних сенсорів аналізу рідин на основі електрохемілюмі-несцентних молекулярних конденсованих плiвок Ленгмюра-Блоджетт із новими електрохемілюмінофорами”, а також №4180 “Розробка та дослідження тонкошарового електрохемілюмінесцентного сенсору типу "lab-on-a-chip" з діамантоподібними електродами для виявлення жовчних пігментів у біорідині”, виконавцем яких була і є здобувач.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є розробка технології створення мікрофлюїдного електрохемілюмінесцентного пристрою для визначення амінокислот. Для досягнення поставленої мети необхідно вирішити такі завдання:

- проаналізувати сучасний стан, науково-методологічні і технологічні основи створення та функціонування мікроаналітичних систем біомедичного призначення;

- обґрунтувати топологію мікрофлюїдного електрохемілюмінесцентного пристрою, необхідну для ефективного і високошвидкісного фракціонування проби з амінокислотами;

- запропонувати й обґрунтувати технологію створення функціональних мікроструктур-каналів у мікрофлюїдній полімерній платформі;

- розробити технологію створення електрохемілюмінесцентної сенсорної зони (трансд’юсера) мікрофлюїдного аналітичного пристрою на базі впорядкованих нанорозмірних структур Ленгмюра-Блоджетт з інкорпорованими електрохемілюмінофорами-реагентами;

- провести апробацію отриманого електрохемілюмінесцентного трансд’юсера мікрофлюїдного пристрою щодо визначення амінокислот.

Об’єкт дослідження. Процеси транспорту і розділення рідкої проби, а також електрохемілюмінесцентного детектування її компонентів (амінокислот) у мікрофлюїдному аналітичному пристрої.

Предмет дослідження. Технологія створення електрохемілюмінесцентного мікрофлюїдного пристрою капілярного електрофорезу для визначення амінокислот.

Методи дослідження. Під час виконання дисертаційної роботи використовувалися методи:

- аналізу і синтезу – при критичному огляді робіт за темою дослідження;

- чисельного моделювання (біжучого рахунку);

- комп’ютерного моделювання, реалізовані у прикладному пакеті MatLab;

- лазерної абляції – при створенні мікроканалів для капілярного електрофорезу у базовому полімерному матеріалі-матриці;

- електронної мікроскопії – при дослідженні результатів технології створення мікроструктур-каналів у полімерній платформі для капілярного електрофорезу;

- Ленгмюра-Блоджет – під час розробки технології створення ЕХЛ-трансд’юсера мікрофлюїдного пристрою на базі нанорозмірних структур з іммобілізованими молекулами електрохемілюмінофорів-реагентів;

- циклічної вольтамперометрії та обертового дискового електрода – для дослідження трансд’юсерів із нанорозмірними плівками;

- електрохемілюмінесценції – для дослідження сенсорних властивостей розробленого трансд’юсера.

Наукова новизна одержаних результатів. Теоретичні та експериментальні дослідження, наведені в дисертаційній роботі [1 - 20], дозволили вирішити важливу науково-прикладну задачу теоретичного та експериментального обґрунтування технології створення мікрофлюїдного ЕХЛ-пристрою біомедичного призначення для визначення діагностичнозначущих речовин.

Наукова новизна отриманих результатів.

1. Набуло подальшого розвитку теоретичне визначення дисперсії проби за її гідродинамічного руху в мікрофлюїдному пристрої, що базується на модифікації та чисельному розв’язку рівняння Нав’є-Стокса і дає можливість прогнозувати вплив конструктивно-технологічних параметрів на величину аналітичного сигналу [4].

2. Вперше розроблено математичну модель електрокінетичного руху проби (на базі модифікованої моделі конвективної дифузії), яка враховує складові аксіальної дифузії та електрокінетичного руху, що дає можливість визначити параметри процесу сепарації проби, необхідні для розробки технології створення платформи капілярного електрофорезу [5, 6].

3. Набув подальшого розвитку метод створення лазерною абляцією мікроструктур у матеріалі з полімеру, що полягає в дослідженні та аналізі вперше отриманих залежностей розмірів мікроструктур у пластині з поліметилметакрилату від пара-метрів випромінювання лазера, і відрізняється контрольованістю розмірів утворення мікроструктур, що дало можливість розробити технологію виготовлення мікро-флюїдної платформи капілярного електрофорезу [7].

4. Вперше досліджено електрохемілюмінесцентні властивості молекул електрохемілюмінофорів-реагентів, інкорпорованих у нанорозмірні плівки Легнмюра-Блоджет на поверхні електрода з індій-олов’яного оксиду, що дало можливість розробити технологію створення електрохемілюмінесцентного трансд’юсера для визначення амінокислоти пролін [8].

Практичне значення одержаних результатів. Дисертаційні дослідження дозволили розробити технологію створення мікрофлюїдного електрохемілюмінесцентного пристрою. Найважливіші практичні результати роботи:

1. Розроблено проточно-інжекційну систему з електрохемілюмінесцентним детектуванням біорідин (патент України G01N27/48 № 2004032235).

2. Розроблено технологію створення ЕХЛ-трансд’юсера, що дало можливість розширити діапазон електрохемілюмінофорів-реагентів у водних середовищах, використання яких дозволило визначати діагностично важливі сполуки, такі, як амінокислоти (міжнародний проект УНТЦ GE-77 “Розробка новітніх технологій і оптохемотронних сенсорів аналізу рідин на основі електрохемілюмінесцентних молекулярних конденсованих плiвок Ленгмюра-Блоджетт із новими електрохемілюмінофорами”).

3. Розроблено технологію контрольованого отримання мікроструктур-каналів капілярного електрофорезу (міжнародний проект УНТЦ №4180 “Розробка та дослідження тонкошарового електрохемілюмінесцентного сенсору типу "lab-on-a-chip" з діамантоподібними електродами для виявлення жовчних пігментів у біорідині”).

4. Розроблено прототип ЕХЛ-пристрою капілярного електрофорезу, який було представлено на міжнародній виставці у Ганновері “Hanover Messer 2007” та включено до каталогу розробок даної виставки.

5. Результати роботи впроваджені у навчальний процес ХНУРЕ під час викладання курсів “Основи біофізики та біомеханіки”, “Лабораторна та аналітична техніка”, “Основи біохімії” (акти впровадження).

Особистий внесок здобувача. Всі основні результати, які складають сутність роботи та відбиті у пунктах новизни та практичного значення, одержані автором самостійно [5, 7, 18, 20]. У роботах, опублікованих у співавторстві, здобувачу належить: обґрунтування застосування ПІА під час розробки ЕХЛ-систем [1-3]; розробка конструкції ЕХЛ-комірки [9-12]; розробка математичних моделей проточних процесів у каналах мікрофлюїдного пристрою [13-15]; моделювання фізичних процесів у ЕХЛ-системі ПІА [4, 16]; пропозиція спільної технологічної реалізації ЕХЛ та капілярного електрофорезу в мікроформаті [17, 19]; проведення комп’ютерного розра-хунку, що пов’язує параметри процесу фракціонування проби з технологією створення платформи капілярного електрофорезу [6]; розробка технології створення ЕХЛ-трансд’юсера та технології аналізу проліну з його допомогою [8].

Апробація результатів дисертації. Результати роботи доповідались (і опубліковані у відповідних матеріалах) на: Міжнародній конференції “Техніка прийому, передачі і обробки інформації” (Туапсе, 2004, 2005), VII - XІ Міжнародних молодіжних форумах “Радіоелектроніка і молодь у ХХІ сторіччі” (Харків, 2004 – 2007); II Міжнародній науково-технічній конференції “Сенсорна електроніка і мікросистемні технології (СЕМСТ-2)” (Одеса, 2006), Міжнародній конференції “Analytical Chemistry and Chemical Analysis (AC&CA05)” (Київ, 2005), “Ukrainian-German Symposium on Nanobiotechnology. Current State and Future Prospects for Cooperation” (Київ, 2006), Сесії Наукової Ради НАН України з проблеми “Аналітична хімія” (Харків, 2007), Міжнародній конференції “Глобальні інформаційні системи. Проблеми та тенденції розвитку”. – Харків – Туапсе (2006, 2007).

Публікації. За результатами досліджень опубліковано 20 робіт (з них 8 статей у науково-технічних виданнях, що входять до переліку ВАК та 1 патент України).

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, чотирьох розділів, висновків, переліку посилань, 5 додатків. Робота викладена на 121 сторінці, ілюстрована 9 таблицями та 46 рисунками. Перелік посилань містить 151 найменування, що викладено на 15 сторінках. Обсяг роботи з додатками – 154 сторінки.

ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми роботи, показано зв’язок із науковими програмами, планами, темами, визначено мету і завдання дослідження, наукову новизну та практичне значення отриманих результатів, наведено відомості про особистий внесок автора, апробації та публікації.

У першому розділі проведено аналітичний огляд сучасного стану та науково-технологічних основ розвитку систем біохімічного аналізу, виконаних на новому технологічному рівні — у форматі “лабораторія на чипі”. Відзначено, що до сьогодні вже намітилися тенденції в класифікації аналітичних мікросистем: матричні гібридизаційні та капілярні (мікрофлюїдні) чипи. Зазначено, що технології матричних гібридизаційних чипів (ланцюгових молекул-мішеней, фотоініціювання реакцій, гібридизації (розпізнавання на молекулярному рівні)) досягли комерційного рівня, а капілярних (або мікрофлюїдних) чипів (електрокінетичний транспорт, фракціонування, детектування) перетворюються в споживчі продукти повільніше й є більш наукоємними, що показує необхідність розробки оригінальних технічних рішень. Основна увага у розділі зосереджена на науково-практичній інформації щодо технології розробки капілярних аналітичних мікросистем, які є чип-реалізацією засобів фракціонування (капілярного електрофорезу) і пристроїв детектування (трансд’юсерів). При виборі ЕХЛ-принципу розпізнавання (для адаптації в мікрофлюїдному чипі капілярного електрофорезу) оцінено переваги й недоліки відомих принципів визначення діагностично-важливих речовин, зокрема, амінокислот.

Розглянуто технології, які можна використати при мініатюризації основних функціональних елементів аналітичних систем. Зазначено, що традиційні (запозичені з мікроелектроніки) технології створення мікроструктур дуже дорогі, для них потрібне специфічне устаткування, а також чистота середовища в зоні виробництва. Крім того, дотепер у цих технологіях можна застосовувати тільки кремній і метали. Зазначено, що застосування полімерних матеріалів як базового матеріалу-матриці через їх низьку собівартість дозволяє розробляти швидкі й дешеві технології (зокрема, на базі методу лазерної абляції) серійного виробництва мікрофлюїдних пристроїв. Однак при цьому проблемою залишається вибір режимів лазерного видалення матеріалу, які, визначаючи геометричні характеристики капілярної мережі, істотно впливатимуть на ефективність фракціонування біопроб.

Докладно розглянуті питання технології створення сенсорних елементів трансд’юсерів. Зосереджено увагу на виборі функціональних сполук, які, будучи вбудованими у відповідну матрицю, надаватимуть трансд’юсеру ЕХЛ-сенсорні властивості, а також на методі іммобілізації цих сполук. Зазначено перспективність використання методу ЛБ під час розробки технології реалізації ЕХЛ-трансд’юсера на базі нанорозмірних впорядкованих плівок. Відмічено, що при цьому основними причинами значного відставання є: обмежений вибір сполук, які можуть надавати сенсорні властивості; проблема утворення ними стабільних моношарів, а отже, і плівок ЛБ.

Таким чином, низка невирішених науково-технологічних задач гальмує роз-робку аналітичних ЕХЛ-мікрофлюїдних пристроїв біомедичного призначення, зокрема, для визначення амінокислот. Це зумовлено, з одного боку, відсутністю доступних і оперативних технологій створення мікроструктур-каналів капілярного електрофорезу та розробок топології чипу, специфічних для обраного об’єкту аналізу. З іншого боку, — складністю розробки технології створення ЕХЛ-трансд’юсера та його адаптації “на чипі” для визначення (у водних середовищах) діагностично важливих речовин, зокрема, амінокислот. Враховуючи вищенаведене, сформовано мету та задачі дослідження, спрямовані на подолання теоретичних та експериментальних труднощів розробки технології створення пристроїв такого формату та призначення.

У другому розділі перед етапом технологічних робіт зі створення мікрофлюїдного пристрою визначено вплив низки факторів (топологія та матеріал стінок мікроканалу, величина напруги, що задає аксіальний рух проби, рН буферного розчину) на величину дисперсії проби, а, отже, і на отримання високоефективного швидкісного розділення суміші амінокислот. Для цього проведено огляд основних теоретичних положень різних режимів ПІА (гідродинамічного та електрокінетичного) та підходів до математичного моделювання останніх у мікрофлюїдиці. Так, на основі чисельного розв’язку наведеної нижче системи модифікованих рівнянь Нав’є-Стокса у стаціо-нарному випадку, були отримані графічні зображення швидкісного профілю потоку, індукованого тиском (рис. )

де u, v, – повздовжня і поперечна компонента швидкості точки потоку;

p – тиск;

x, y, – координати точки потоку;

Re – число Рейнольдcа.

Оскільки координати точки потоку, які визначаються довжиною транспортно-сепараційного каналу мікрофлюїдного пристрою, є складовими моделі, то, задаючи конкретні дані, можна виявляти їх вплив на характер швидкісного профілю (дисперсії), визначаючи, тим самим, відповідні конструктивно-технологічні параметри.

Рис.1. Графічна інтерпретація дисперсії проби за різних значень числа Re

Зауважимо, що основними недоліками індукованого тиском потоку є: неодно-рідність швидкісного профілю, яка збільшується при варіації параметрів потоку (зокрема, зі збільшенням числа Re (рис.1)); необхідність додаткового обладнання (дозаторів, насосів) для дозованого вводу проби та ініціювання руху рідкої фази; низька селективність аналізу, оскільки швидкість руху кожного компоненту практично однакова, і визначається, загалом, швидкістю буферного розчину. Тому особливо перспективним, на наш погляд, є створення систем, які дають можливість підвищити селективність аналізу за рахунок кінетичної дискримінації, що досягається при використанні електрокінетичного (капілярний електрофорез) способу доставки проби до зони детектування. При цьому окрім транспорту забезпечується ще одна додаткова функція – сепарація проби.

Для вибору технологічних параметрів реалізації мікроструктур капілярного електрофорезу було розроблено модель електрокінетичного руху проби, що мігрує у буферному розчині в прямому сепараційному каналі мікрофлюїдної платформи. Модель, що наведена нижче, базується на рівнянні конвективної дифузії з додатковим урахуванням електрокінетичної складової швидкості

,

де с = c (х, t) – координатно-часовий розподіл концентрації речовини;

D – коефіцієнт молекулярної дифузії речовини у буферному розчині;

x – аксіальна координата;

uек – швидкість електрокінетичного руху речовини у буферному розчині;

u =µ E=L2/t; µ – електрокінетична рухливість; Е – напруженість електричного поля; L – довжина капіляра від місця введення проби до детектора);

t — час переміщення.

При розробці моделі враховано особливості суцільного середовища руху рідини у тонкому капілярі з електрично ізольованимистінками, а саме: а) однорідність дзета-потенціалу на стінках мікроканалу; б) ламінарність потоку; в) однорідність характеристик потоку; г) паралельність вхідного і вихідного потоків.

Модель реалізовувалась методом кінцевих різниць із застосуванням апарату матричних обчислень у пакеті MatLab. Процедура дискретизації рівняння (за явною схемою “біжучого рахунку”) полягала в наступному. На просторі час-відстань вводилась сітка з відповідними кроками: за часом t і відстанню x. Тоді значення шуканої функції у вузлі з координатами (i, j), де i — номер вузла сітки за часом, j — за відстанню, запишеться як ui,j. Похідні, що входять до складу рівняння, були отримані з розкладення в ряд Тейлора:

Аналогічно може бути отримано вираз для другої похідної за координатою:

.

Таким чином, після дискретизації рівняння набуло такого вигляду:

,

.

Співвідношення між кроками за часом t і за відстанню x обиралось таким, щоб задовольнити умову стійкості чисельної схеми: conv   1.

Оскільки проба вводиться в канал у режимі проточної інжекції, то на вході каналу значення концентрації прийнято рівним c0i = 0, тобто гранична умова являє собою умову Діріхле. На виході каналу концентрація проби задовольняє умові Неймана і може бути записана у вигляді ciN+1= ciN (N – номер кроку).

На базі розробленої моделі електрокінетичного руху проби проведено обчислювальний експеримент сепарації суміші амінокислот (рис. – 4): 1 – пролін (Pro); 2 – метіонін (Met); 3 – тирозин (Туr); 4 – триптофан (Trp) вздовж зони проби у буферному розчині за різних значень рН буферного розчину, падіння напруги на кінцях каналу (U), довжин каналу (L).

При виборі рН буферного розчину для оптимізації розділення вищезазначених амінокислот ми керувались значеннями ізоелектричної точки рІ: Phe – 5,48; Trp – 5,89; Туr – 5,66; Pro – 6,30; Met – 5,74; Cys – 5,02. Тобто підбирали таке значення рН, яке відрізняється від значення рІ, що необхідно для ефективного фракціонування, оскільки в ізоелектричній точці не мають місця електрокінетичні явища, бо в цьому випадку амінокислоти існують у нейтральній формі і не рухаються в електричному полі. Зауважимо, що оскільки зміна рН буферу впливає на зміну електроосмотичної мобільності, то саме ця особливість враховувалась нами під час розрахунків із варіюванням рН.

а б

Рис. 2. Результати комп’ютерних розрахунків електрофореграм амінокислот:

а – рН = 4, U = 2 кВ, L = 2 cм;

б – рН = 4, U = 2 кВ, L = 5 cм

а б

Рис. 3. Результати комп’ютерних розрахунків електрофореграм амінокислот:

а – рН = 7, U = 1 кВ, L = 2 cм;

б – рН = 7, U = 1 кВ, L = 5 cм

а б

Рис. 4. Результати комп’ютерних розрахунків електрофореграм амінокислот:

а – рН = 7, U = 2 кВ, L = 2 cм;

б – рН = 7, U = 2 кВ, L = 5 cм

Зауважимо, що повна електрокінетична рухливість кожної з амінокислот дорівнює сумі її електрофоретичної (µЕФ) та електроосмотичної (µЕОС) рухливостей у буферному розчині в мікроканалі пристрою з поліметилметакрилату (ПММА). Електроосмотичні рухливості молекул буферного розчину (µЕОС , 10-4 см2/Вс) становлять: за рН – 2,18; за рН – 2,3. Приймалось, що амінокислоти не утворюють між собою іонні пари, тим самим не змінюючи свої електрофоретичні рухливості (µЕФ, 10?9см2/Вс): Phe – 22.6±0.3; Trp –20.8± 0.3; Туr – 21.5 ± 0.2; Pro – 30.7 ± 0.9; Met – 24.4 ± 0.2; Cys – 28.8 ± 0.3. Значення коефіцієнта молекулярної дифузії амінокислот у буферному розчині бралось усередненим (79,410-7cм2/с) для всіх аміно-кислот, оскільки його внесок у переміщення зневажливо малий і на практиці ним часто нехтують. Оскільки на рис. 2 – 4 наведений розподіл піків інтенсивності аналітичного ЕХЛ-сигналу в часі, то їх можна назвати електрофореграмами.

Аналізуючи електрофореграми за однакових значеннь L та рН, зазначимо вплив на час розділення (t) різних U:

- за рН = 7, U = 1 кВ, L = 2 см t = 9 с, що в 6 разів менше, ніж за 5 см (рис. 2, а і 2, б);

- за рН = 7, U = 2 кВ, L = 2 см t = 4 с, що в 8 разів менше, ніж за 5 см (рис. 3, а і 3, б).

Розглядаючи випадок рівності U, рН, але різних L видно:

- зі зростанням U вдвічі при L = 2 см t скорочується з 9 с до 4 с (рис. 3, а і 4, а);

- зі зростанням U вдвічі при L = 5 см t скорочується з 60 с до 30 с (рис. 3, б і 4, б).

Отже, на основі результатів обчислювального експерименту фракціонування проби з амінокислотами та враховуючи, що архітектура пристрою визначається функціями, які він має виконувати у мікроформаті, під час розробки технології створення каналів-мікроструктур нами обрано топологію капілярної мережі — так званий “простий хрест”, яка забезпечує стадії дозування, капілярного електрофорезу та ЕХЛ-детектування (рис. 5), а також розраховано довжину (2 см) розділового каналу №2 (рис. 5), яка достатня та необхідна для високошвидкісного і селективного визна- |

чення амінокислоти пролін (за результатами обчислювального експерименту пролін розділився найкраще). При цьому рН = 7, а значення напруги, прикладеної до резервуарів 1 і 2 (рис.5), складає 2 кВ.

Після розробки топології чипу, реалізованої з використанням пакету CorelDRAW11 (рис.5), необхідно вирішити наступне завдання — розробити технології отримання мікроструктур чипа (канал №1, 2, резервуари: 1, 2, 3, 4) при реалізації заданої топології та ЕХЛ-трансд’юсера сенсорної зони 5.

Рис. 5. Ескіз топології мікрофлюїдної ПММА-платформи (резервуари: 1 – буферного розчину, 2, 4 – зливу відходів зразка, 3 – зразка і 5 – сенсорна зона)

Третій розділ присвячений розробці мікротехнології створення платформи з отворами і капілярною мережею та нанотехнології отримання ЕХЛ-трансд’юсера.

Технологія створення мікроструктур. Оперативне формування каналів і отворів (для проведення капілярного електрофорезу) у пластинах (товщиною 4 мм) марки Acryma 72 (ПММА) здійснювалось із використанням методу лазерної абляції (ЛА), що реалізовувався в ЗАТ “НДІ лазерних технологій” (Харків) на гравері фірми Trotec  з лазером довжиною випромінювання 10,6 мкм, потуж-ністю  Вт та номінальною швидкістю руху лазерного пучка 2000 мм/c. Зауважимо, що вибір методу лазерної абляції обґрунтовано його точністю, відносною доступністю, оперативністю обробки полімерних матеріалів.

Для відпрацювання технології лазерного видалення матеріалу (яка, зрештою, визначає ефективність фракціонування проби з амінокислотами) у пластинах ПММА за різних режимів ЛА були сформовані ділянки, розміри яких вивчались з використанням растрового електронного мікроскопа РЕМ-106 лабораторії “Нанотехнології” ХНУРЕ. Залежності розмірів прорізу від параметрів випромінювання лазеру наведені на рис.6. З графіків видно, що за швидкості руху лазера, рівної 15% від номінальної (криві 1 і 2) в діапазоні потужностей 60-65% від номінальної співвідношення глибини і ширини каналу приблизно становить . Це проглядається як для частоти 2500 Гц (рис. 6, а), так і 5000 Гц (рис.6, б). При цьому за частоти 2500 Гц залежність розмірів каналу від номінальної потужності лазера має більш прямолінійний характер, що свідчить про кращу відтворюваність результатів. За швидкості руху лазерного пучка, рівної 20% від номінальної, глибина прорізу на кілька десятків мікрометрів менша, ніж за 15%-ї (від номінального значення) швидкості (криві 2, 4 рис.6, а і 6, б).

Промінь, який переміщується повільніше, утворить глибший канал, ніж той, що переміщується швидше (рис. ), тобто глибина каналу лінійно залежить від потужності випромінювання й обернено пропорційна швидкості руху світлового потоку.

а б

Рис. 6. Залежність глибини і ширини прорізу у пластині з ПММА від потужності випромінювання за різних швидкостей руху променя і частоти імпульсів за фокусної відстані 2,5 дюйма (6,35 см): а – 2500 Гц; б – 5000 Гц

На основі отриманих експериментальних залежностей нами знайдено їх лінії тренда та вирази апроксимації (поліноми четвертого степеня), що може використовуватися для обчислення глибини і ширини каналів у залежності від параметрів лазерного випромінювання. Крім того, отримані експериментальні дані дозволяють оцінити деякі енергетичні параметри ЛА в припущенні ідеального розподілу інтенсивності й безперервності випромінювання, для одержуваної в експерименті ширини каналу в ПММА до повного випалювання покриття.

Таким чином, на базі аналізу отриманих методами лазерної абляції експери-ментальних залежностей розмірів мікроструктур у пластині з ПММА від параметрів лазерного випромінювання вдалось розробити підхід до створення мікроструктур-каналів капілярного електрофорезу з контрольованими розмірами в діапазоні глибини і ширини прорізу від 160 до 300 мкм.

а | б

Рис. 7. Зображення профілю мікроструктур, одержаних у полімерах

методом ЛА за частоти імпульсів 5000 Гц:

а – швидкість переміщення променя 20% від номінальної;

б – швидкість переміщення променя 15% від номінальної

Герметизація мікроструктур. Обравши (з використанням експериментальних залежностей розмірів мікроструктур від параметрів випромінювання лазера) опти-мальне значення параметрів для отримання величин глибини й ширини каналу, рівних 240 і 244 мкм відповідно, проведено герметизацію прорізу шляхом спікання пластини з мікроструктурами й захисною пластиною з того ж матеріалу (ПММА). Обробка поверхонь каналізованої і захисної пластин із ПММА включала стадії протирання спиртом, промивання в проточній воді і сушіння в термошафі за 6070С. Спікання проводилось у вакуумній сушильній шафі потужністю 2кВт за температури 150С (що визначалась температурою формовки ПММА). Було встановлено, що на міцність з’єднання двох пластин при спіканні, а, отже, і на герметичність каналу насамперед впливають: обробка поверхні; температура і час спікання; питомий тиск.

Технологія створення сенсорної зони (ЕХЛ-трансд’юсера) мікрофлюїдного пристрою базувалась на двох основних етапах: використання методу ЛБ для створення нанорозмірних плівок з інкорпорованими електрохемілюмінофорами-реагентами, а також електрохімічних та електрохемілюмінесцентних дослідженнях якості отриманих структур на поверхні робочого електрода та оптимізації технології їх створення. Останній етап описано у четвертому розділі.

Використання методу ЛБ полягало у багаторазовому перенесенні мономолекулярних шарів (з інкорпорованими електрохемілюмінофорами) з поверхні рідкої субфази на тверду прозору підкладку з індій-олов’яного оксиду (ІТО). Процес реалізовувався у приладі LT-102 фірми Microtestmachines Co (Білорусія). Як електрохемілюмінофори було відібрано біпіридильний комплекс рутенію (Ru(bpy)32+) та рубрен, що обумовлено високою інтенсивністю ЕХЛ цих сполук у розчинах та відносно невеликою енергію електрон-збудженого стану (спектр люмінесценції в жовто-червоному діапазоні). Останнє збільшує вірогідність їх ЕХЛ при відносно низьких значеннях електродних потенціалів в умовах водних розчинів. Однак технологічною проблемою створення плівок на базі даних електрохемілюмінофорів було те, що вони не амфіфільні і не утворюють власного моношару на поверхні води. Тому ми використовували амфіфільну речовину-матрицю для утримання таких молекул на межі поділу фаз вода / газ. Вибір матриці був визначальним, оскільки вона повинна забезпечувати, з одного боку, утворення стабільного ленгмюрівського моношару для формування високоорганізованих молекулярних плівок на електродах; з другого — інтегрувати якнайбільше молекул електрохемілюмінофору.

ПЛБ водорозчинних комплексів Ru(bpy)32+ були створені за рахунок адсорбції цих молекул на моношар протилежно заряджених амфіфільних молекул стеаринової кислоти (СтК). Водонерозчинний рубрен інкорпоровувався у матрицю ПММА. Вибір оптимальних параметрів нанесення ПЛБ здійснювали за допомогою ? – А ізотерми — діаграми стану мономолекулярного шару в координатах поверхневий тиск (?) та площа (А), що припадає на одну адсорбовану молекулу (рис.8), які демонстрували послідовність фазових переходів у моношарі при його стисненні. За значень ?, рівних для систем: СтК / Ru(bpy)32+– 30 мН м2 та рубрен / ПММА 20 мН/м2, формувались максимально конденсовані і стабільні моношари на субфазі, а також структурно впорядковані ПЛБ.

Перед етапом утворення ПЛБ проведено розрахунки необхідного об’єму матриці так, щоб після його нанесення на поверхню субфази він розтікся з утворенням мономолекулярного шару. При цьому враховувалось, що площа молекули СтК, орієнтованої горизонтально поверхні субфази, дорівнює А|| 1,22 нм2, а після конденсації, з розташуванням за нормаллю до поверхні, – А = 0,24 нм2. Вихідна ефективна площа, що припадає на одну молекулу, може бути прийнята рівною 50% від А|| - Аі = = 0,5А||. Співвідношення для шуканого об’єму V вихідного розчину має вигляд:

V = m/c = (nM)/(cAi) = (SM)/(AicNa),

де m – маса моношару;

с – концентрація СтК;

n – кількість молекул у моношарі (газоподібній плівці) площею S;

М = 284,48 – відносна молекулярна маса СтК;

Na = 6,021023 моль-1— число Авогадро;

S – робоча площа поверхні, (S = bl, де b = 13,5 см – ширина ЛБ-ванни LT-102;

l = 26,5 см – довжина ЛБ-ванни за винятком ширини бар’єру).

Отримання ізотерми стиску для моношару СтК. Розрахований об’єм вихідного розчину наносився на робочу поверхню субфази у ЛБ-ванні за допомогою мікропі-петки. Величина поверхневого тиску, що реєструвалась при цьому за допомогою ваг Вільгельмі, складала значення близьке до нульового. Для випаровування розчинника нанесений моношар витримували протягом 2030 хвилин. Відповідно до інструкції з експлуатації приладу, в автоматичному режимі підтискаючи моношар рухливим бар’єром (при швидкості зміни робочої площі бар’єру = 10 cм2/хв) отримували -А залежність (ізотерму стиску). При цьому поверхневий тиск визначається як різниця між поверхневим натягом сф чистої субфази (в цьому випадку води) і поверхневим натягом субфази , вкритої моношаром: сф - ) [мН/м]. Ефективна площа А, що припадає на молекулу в моно шарі, обчислювалась зі співвідношення:

А = (2 h b/n) [нм2], де h – робочий хід бар’єра.

Перенесення впорядкованого мономолекулярного шару на поверхню підкладки здійснювалось при значенні поверхневого тиску ( = 30 мН/м), що відповідає суцільному моношару з площею, що припадає на одну молекулу А.

Взагалі технологія утворення ПЛБ включала такі операції: а) попереднє очищення поверхні водної субфази; б) підготовка поверхні струмопровідних ІТО-підкладок; в) розрахунок необхідного об’єму розчину СтК, щоб після його нанесення на поверхню субфази він розтікся з утворенням мономолекулярного шару; г) приготування вихідного розчину СтК, що наноситься на поверхню субфази;

д) приготування розчину Ru(bpy)32+;
е) нанесення розчину СтК на поверхню водного розчину Ru(bpy)32+ у ЛБ-ванні; є) формування конденсованого ленгмюрівського моношару на межі розподілу вода повітря; ж) послі-довне перенесення моношарів на підкладки з ІТО методом вертикального ліфту;
з) просушування отриманих структур у камері без доступу світла за температури повітря 50  60С.

У четвертому розділі наведено результати експериментальних досліджень технології створення трансд’юсера на базі ПЛБ з інкорпорованими електрохемілюмінофорами-реагентами та його випробувань при визначенні амінокислоти пролін.

Для вивчення електрохімічних та ЕХЛ-властивостей створених нами експериментальних зразків ЕХЛ-трансд’юсерів їх піддавали електролізу в комірці методом циклічної вольтамперометрії (ЦВАМ), реалізованої на комплексі ЕЛАН-2М (розробленому в лабораторії “Аналітична оптохемотроніка” ХНУРЕ). Модельні водні розчини складались із бідистильованої води та сореагенту трипропіламіну (ТПА) (Fluke), фонового електроліту LiClO4 (Fluke) і попередньо перевірялись на відсутність ЕХЛ на немодифікованих ITO-електродах.

Дослідження стабільності властивостей ПЛБ. Дуже важливою характеристикою модифікованих ПЛБ електродів є стабільність їх властивостей як під час зберігання, так і під час електролізу. Експериментальні зразки (рубрену в матриці з ПММА та Ru(bpy)32+ в матриці зі СтК), що пролежали в темряві два місяці за 8-10С, демонстрували ЕХЛ-характеристики практично ідентичні щойно виготовленим. ІТО електроди, модифіковані ПЛБ з інкорпорованим рубреном у матриці з ПММА (10 шарів), практично не деградували під час експериментальних досліджень, а з інкорпорованим Ru(bpy)32+ у матриці зі СтК (10 шарів) – значно змінювали свої властивості. Це може бути пов’язано з видаленням з шарів у розчин водорозчинних іонів Ru(bpy)32+ та іон-радикалів Ru(bpy)33+, яке виникає під час електролізу. Тому були проведені додаткові дослідження технології створення ПЛБ з іншою матрицею для Ru(bpy)32+ — поліамідною кислотою (ПАК). На відміну від аналогічних експериментів із СтК / Ru(bpy)32+, при ЦВАМ ПАК/Ru(bpy)32+ жодних слідів Ru(bpy)32+ у розчині знайдено не було, що свідчить про краще утримання електрохемілюмінофору в новій матриці та перспективність її застосування в ЕХЛ-трансд’юсері.

Дослідження оптимального числа шарів. Ще однією важливою характеристикою адекватності розробки технології трансд’юсера є залежність ЕХЛ-сигналу від числа ЛБ-шарів. Виходячи з необхідності збільшити вміст електрохемілюмінофору та зробити покриття малодефектним, ми визначили початкову кількість у десять ЛБ-шарів. Але, як засвідчили наші подальші дослідження, це число не є оптимальним. Деградація ЕХЛ-сигналу від трансд’юсерів з ІТО-електродами, модифікованими ПЛБ з інкорпорованими електрохемілюмінофорами, виявилась значно меншою за прогнози, а властивості самих ПЛБ – досить стабільними. Збільшення кількості електрохемілюмінофору на електродній поверхні за рахунок більшого числа шарів не компенсувало відповідне зниження електропровідності модифікованого електрода, що й призводило до зниження як фарадеївського струму, так і (у ще більших масштабах) інтенсивності ЕХЛ. Зазначено що, крім відповідного зменшення струму та фотоструму, суттєве збільшення кількості шарів впливає на кінетику ЕХЛ. Таким чином, отримано, що оптимальна кількість шарів для досліджених структур, яка забезпечує максимальну емісію ЕХЛ, становить 13.

Апробація ЕХЛ-трансд’юсера проводилась за такою схемою.

1. Вибір електрохемілюмінофору-реагенту. (Ru(bpy)32+ у матриці СтК був обраний як елемент композиції ПЛБ з урахуванням факту його досить широкого застосування в аналітичній практиці. Слід зауважити, що даний люмінофор раніше використовувався в об’ємі комірки, а не в інкорпорованому на електроді вигляді, як це запропоновано у роботі.

2. Проведення контрольних електрохімічних та ЕХЛ-досліджень модельного розчину (0,1 М фосфатного буферу з рН=7,5) за відсутності проліну в трансд’юсері з робочим ІТО-електродом (S=75мм2), модифікованим ПЛБ СтК / Ru(bpy)32+, рис. 9.

а б

Рис. 9. Вихідні аналітичні сигнали трансд’юсера (ІТО-електрод, S=75мм2, з ПЛБ системи СтК / Ru(bpy)32+ в 0,1 М фосфатного буфера з рН=7,5) в залежності від прикладеного потенціалу за швидкості розгортки V=100мВ/с та UФЕП = 1400В:

а – емісія ЕХЛ (фотострум);

б – струм поляризації трансд’юсера

За найнижчої чутливості фотоелектронного помножувача (ФЕП) спостерігалась відсутність помітного випромінювання (рис.9, а), що підтверджувало відсутність впливу на результати ЕХЛ-досліджень залишкових концентрацій електрохемілюмінофорів та сореагентів у модельному розчині.

3. Додавання в об’єм розчину проліну до концентрації 1,2 мМ. При цьому інтен-сивність ЕХЛ зросла практично втричі (рис. 9, а). Це пояснюється тим, що пролін, вступаючи у хімічну реакцію з електрогенерованими на модифікованому електроді трикатіон-радикалами рутенію, виконуючи функцію сореагенту, призводив до випромінювання ЕХЛ реагентом.

Зазначимо, що введення у модельний розчин проліну не вплинуло на величину струму поляризації ІТО-електрода, модифікованого ПЛБ. Це показує, що визначення електрохімічними методами проліну за даних умов неможливе, оскільки ця аміно-кислота неелектроактивна. Однак, як видно з рисунків, розроблений ЕХЛ-трансд’юсер демонструє свої сенсорні властивості.

Узагальнюючи, технологія створення ЕХЛ-мікрофлюїдного пристрою включає процеси мікротехнології та нанотехнології. Загальна схема технологічного процесу (ТП) створення мікрофлюїдного ЕХЛ-пристрою наведена на рис. 10.

Рис. 10. Загальна схема технологічного процесу створення мікрофлюїдного

ЕХЛ-пристрою

Таким чином, прототип мікрофлюїдного аналітичного пристрою, створений на основі розробленої технології, являє собою планарний чип, що складається з двох полімерних (ПММА) — каналізованої і захисної — пластин, герметично з’єднаних шляхом спікання. Канали (рис. 11) (в перерізі: основа трапеції — 240 мкм, глибина — 50 мкм) та наскрізні отвори для утворення мікрорезервуарів отримані лазерною абляцією. В останні мікродозатором вводиться проба і буфер, а по мережі капілярів здійснюється дозування, транспорт і сепарація проби. Топологія “простий хрест” дає можливість дозувати пробу, що відбувається під дією електричних потенціалів (напруг), прикладених до електродів, розміщених у мікрорезервуарах. Електроди, представлені прямокутними паралелепіпедами зі скловуглецю (2 см 2 мм 2 мм), розміщуються в центрі мікрорезервуарів, а за допомогою затискачів приєднуються до електричної мережі. У резервуарі 5 (рис. 5, рис. 11) розміщується вставний елемент |

сенсорної зони (виготовлений за допомогою розробленої технології на основі методу ЛБ) — ЕХЛ-трансд’юсер на базі ІТО-електрода (з висотою, довжиною і шириною відповідно 6 мм 2 мм 2 мм) з нанорозмірними структурами з інкорпорованими у матрицю зі СтК молекулами Ru(bpy)32+.

Електроліз під час ЕХЛ-аналізу результатів розділення здійснюється подачею потенціалів до трансд’юсера (зона 5, рис. 5) та графітового електрода (резервуар 2, рис.5).

Рис. 11. Фотографія прототипу мікрофлюїдного пристрою

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі вирішене актуальне науково-практичне завдання – розроблено технологію створення мікрофлюїдного електрохемілюмінесцентного пристрою аналізу амінокислот, яка представлена сукупністю методів і операцій, що забезпечили можливість створення та інтеграцію в один повноцінно функціонуючий пристрій платформи капілярного електрофорезу з мікроструктурами-каналами та ЕХЛ-трансд’юсера на базі нанорозмірних (в одному вимірі) ансамблів молекул-електрохемілюмінофорів у амфіфільній матриці, а також сукупністю методів досліджень кожного з функціональних елементів пристрою.

Основні результати дисертаційної роботи.

1. На основі огляду літератури щодо сучасного стану та науково-методологічних і технологічних основ виробництва електронної техніки біомедичного призначення зазначено, що одним із перспективних напрямків розвитку аналітичного приладобудування є мікросистемні технології для реалізації методів пробопідготовки та детектування в межах одного пристрою на новому технологічному рівні – у форматі “на чипі”, що дає можливість високошвидкісного, високоселективного, високочутливого аналізу. При цьому особлива увага приділяється розробці технологій швидкого виготовлення мікрофлюїдних пристроїв (на основі мікро- і нанороз-мірних структур), які визначаються тими матеріалами і методами аналізу, які реалізовуються у мікроформаті. До найперспективніших методів фракціонування належить капілярний електрофорез, а детектування – електрохемілюмінесценція. Відзначено, що технології отримання мікророзмірних структур для капілярного електрофорезу у склі й кварці трудомісткі, а успіхи в області створення сенсорних нано-розмірних структур зумовлені використанням методу Ленгмюра-Блоджетт.

Таким чином, на основі зробленого аналітичного огляду обрано напрямок досліджень: розробка технології мікрофлюїдного пристрою для електрохемілюмінесцентного аналізу амінокислот, Відзначено, що для створення мікрофлюїдної платформи доцільно використовувати полімерні матеріали; для оперативного формування мікроструктур і отворів – метод лазерної абляції; нанорозмірних структур ЕХЛ-трансд’юсера – метод ЛБ. Однак при цьому невирішеними проблемами є: вибір топології капілярної мережі, режимів капілярного електрофорезу та лазерного видалення матеріалу, які, зрештою, істотно впливатимуть на ефективність фракціонування біопроб; проблема утворення електрохемілюмінофорами-реагентами стабільних моношарів, а отже, і плівок ЛБ. Сформульовано мету та задачі дослідження.

2. Вирішено наукову задачу вибору топології мікрофлюїдного електрохемілюмінесцентного пристрою з