НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна

МАРЧЕНКО НАТАЛІЯ ЮРІЇВНА

УДК 577.112

АФІННО-ХРОМАТОГРАФІЧНИЙ АНАЛІЗ ШАПЕРОНІНІВ

У НОРМІ ТА ПІД ВПЛИВОМ ІОНІВ КАДМІЮ

03.00.04 біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті

ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України

та в Інституті білка Російської академії наук.

Науковий керівник доктор біологічних наук, професор

КАЛІМАН Павло Авксентійович,

професор кафедри біохімії

Харківського національного університету

ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України.

Офіційні опоненти:доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

ЛІТОШЕНКО Олександр Якович,

керівник лабораторії молекулярної генетики

Інституту геронтології АМН України;

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник

ВЕРЬОВКА Сергій Вікторович,

завідувач лабораторії біохімії

Інституту отоларингології ім. О.С. Коломійченка

АМН України.

Провідна установа Інститут молекулярної біології і генетики

Національної академії наук України, відділ білкової

інженерії та біоінформатики, м. Київ

Захист відбудеться 21 травня 2007 року о 14 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії

ім. О.В. Палладіна Національної академії наук України

(01601, Київ, вул. Леонтовича, 9)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна (Київ, вул. Леонтовича, 9)

Автореферат дисертації розісланий 12 квітня 2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук КІРСЕНКО О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Білок теплового шоку GroEL клітин Escherіchіa colі є представником молекулярних шаперонів – великої групи різноманітних білків, що забезпечують згортання білків (синтезованих de novo чи денатурованих внаслідок різних клітинних стресів), а також трансмембранний транспорт білків і деградацію короткоживучих білків цитозолю [Lindquist S., Craig E.A., 1988; Gething M.J., Sambrook J., 1992]. Термін “шапероніни” вживають по відношенню до шаперонів родини Hsp60 (60-kDa heat-shock proteins). Шапероніни є олігомерами, мають вигляд двох кілець, покладених одне на одне, здатні міцно зв'язувати різноманітні денатуровані білкові молекули і виявляють слабку АТФазну активність [Hemmingsen S.M. et al, 1988; Braig K. et al, 1994; Roseman A.M. et al, 1996]. Шапероніни виявлено в мітохондріях, хлоропластах і в еубактеріальному цитозолі [Hemmingsen S.M. et al, 1988; Cheng M.Y. et al, 1989]. Кількість шаперонінів значно зростає не тільки за теплового шоку, але й за інших стресів та захворювань [Lindquist S., Craig E.A., 1988; Schlesinger M.J., 1990; Ranford J.C., Henderson B., 2002]. Бактеріальні шапероніни є сильними імуногенами і можуть викликати різні патології тканин. Шапероніни (як бактеріальні, так і шапероніни ссавців) залучені в процеси, що відбуваються при інфекційних і автоімунних захворюваннях, при амілоїдозах, а також при багатофакторних захворюваннях, таких як артрити й атеросклероз, і захворюваннях неясного походження [Ranford J.C., Henderson B., 2002; Maguire M. et al, 2002]. Тому молекулярні шапероніни (і, зокрема, GroEL) належать до найважливіших об'єктів сучасних досліджень у галузі молекулярної біології, біотехнології та біомедицини.

При вивченні фізико-хімічних властивостей шаперонінів дослідники стикаються з низкою проблем, серед яких можна виділити такі:

1) проблема очищення від численних поліпептидних домішок, що міцно зв'язані з шаперонінами (існуючі методи очищення є ефективними, але складними) [Murai N. et al, 1996; Clark A.C. et al, 1998; Todd M.J., Lorimer G.H., 1998];

2) проблема вивчення взаємодії шаперонінів з денатурованими білками (такі білки або ренатурують у присутності шапероніну, або схильні до неспецифічної агрегації, що ускладнює дослідження їх взаємодії з шаперонінами) [Rozema D., Gellman S.H., 1996; Марченков В.В. и др, 2004];

3) проблема швидкого аналізу вмісту шаперонінів у клітинах різних організмів, у тому числі шаперонінів, що накопичуються при стресах і захворюваннях (приготування антитіл – складний і тривалий процес, а наявний у продажі набір антитіл обмежений) [Pauwels K. et al, 2005; Joyner-Matos J. et al, 2006].

У дисертаційній роботі розроблено метод афінної хроматографії GroEL на базі денатурованих білків, ковалентно іммобілізованих на нейтральному носії (агароза), що значно спрощує вирішення ряду задач в області досліджень GroEL та інших шаперонінів, а саме:

1) афінна хроматографія дозволяє в одну стадію з мінімальними втратами одержувати високоочищений GroEL із освітленого клітинного лізату;

2) ковалентно іммобілізовані на хроматографічному носії денатуровані білки не агрегують, що дає можливість у широких діапазонах зовнішніх умов (рН, іонної сили, концентрацій лігандів, тощо) досліджувати взаємодію шаперонінів з білками, які мають різні фізико-хімічні властивості;

3) міцна взаємодія шаперонінів з афінним сорбентом та їх мінімальні втрати на стадії очищення уможливлюють створення методів експрес-аналізу вмісту GroEL та інших шаперонінів у клітинах різних організмів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках науково-дослідної роботи кафедри біохімії Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна за темою “Клітинні та молекулярні механізми адаптації метаболізму при оксидативному стресі” (№ державної реєстрації 0197 И008188).

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи є розробка методу афінної хроматографії шаперонінів клітин різних організмів (на прикладі клітин Escherіchіa colі дикого типу і суперпродуценту GroEL, а також клітин печінки щурів у нормі та при оксидативному стресі).

Досягнення поставленої мети передбачало вирішення таких завдань:

1) дослідження фізико-хімічних властивостей (структури, заряду і гідрофобності) ряду денатурованих білків, що можуть бути використані для створення афінних сорбентів;

2) дослідження умов взаємодії GroEL з різними денатурованими білками в розчині;

3) виготовлення афінних сорбентів на основі різних денатурованих білків шляхом їх ковалентного приєднання до нейтрального хроматографічного носія;

4) дослідження умов взаємодії GroEL з афінними сорбентами на базі апоцитохрому с, в_казеїну, пепсину, б_лактальбуміну, лізоциму і рибонуклеази А;

5) розробка методики ефективного очищення GroEL на афінних сорбентах;

6) застосування розробленого методу на прикладі аналізу вмісту шаперонінів у клітинах печінки щурів у нормі та при оксидативному стресі.

Об'єкт дослідження – вміст і властивості шаперонінів.

Предмет дослідження – метод афінної хроматографії на основі іммобілізованих денатурованих білків для аналізу вмісту шаперонінів у печінці щурів при оксидативному стресі, для вивчення взаємодії GroEL з різноманітними денатурованими білками, а також для очищення GroEL.

Методи дослідження. Аналіз елюції шаперонінів з афінних сорбентів, а також перевірку чистоти та нативності білків проводили методами спектрофотометрії, електрофорезу, флуоресцентної спектроскопії та визначенням АТФазної активності; виділення та очищення білків виконували за допомогою методів гель-фільтрації, іонообмінної і зворотнофазової хроматографії; концентрацію білків та активність гемоксигенази визначали за допомогою методу спектрофотометрії; вимірювання гідрофобності денатурованих білків та вивчення взаємодії GroEL з денатурованими білками у розчині виконували методами флуоресцентної спектроскопії та гель-фільтрації; освітлення клітинного лізату, зразків білків та одержання субклітинних фракцій печінки виконували за допомогою диференційного центрифугування.

Наукова новизна дисертаційної роботи

Вперше запропоновано універсальний, простий і швидкий метод аналізу вмісту шаперонінів у різних організмах за допомогою афінної хроматографії на базі денатурованого лізоциму.

Вперше докладно досліджено умови взаємодії GroEL з різними денатурованими білками, які не здатні прийняти нативну конформацію.

Вперше застосовано метод афінної хроматографії на базі денатурованого пепсину для виділення та очищення GroEL із освітленого центрифугуванням клітинного лізату.

Показано:–

надійно з'єднується з денатурованими білками, що мають різний ступінь структурованості, гідрофобності та різний заряд;–

надійно зв'язується з афінними сорбентами на базі різних денатурованих білків, що дає можливість для його ефективного виділення та очищення;– 

при низьких і середніх іонних силах (до 100 мМ) і pН 7.5 присутність двовалентних катіонів (магнію чи кальцію) необхідна для зв'язування GroEL з негативно зарядженими денатурованими білковими мішенями, однак при високих іонних силах (~600 мМ) GroEL утворює міцний комплекс із негативно зарядженими денатурованими білками і за відсутності двовалентних катіонів; присутність двовалентних катіонів чи високої іонної сили не впливає на зв'язок молекулярного шаперону GroEL з позитивно зарядженими денатурованими білками;– 

ліганди GroEL (Mg-АДФ, Mg-АТФ і кошаперонін GroES) послаблюють зв'язок GroEL з денатурованими білковими мішенями, причому це ослаблення залежить як від природи ліганда в ряді Mg-АДФ < Mg-АТФ < GroES, так і від його концентрації (у випадку нуклеотидів);– 

через добу після введення хлориду кадмію щурам кількість шапероніну мітохондрій (Hsp60) печінки збільшується.

Практичне значення одержаних результатів. Простий та ефективний метод очищення в одну стадію GroEL та інших шаперонінів дозволяє одержати достатню кількість чистого білка для досліджень і можливого практичного застосування, а також надає можливість швидкого визначення вмісту шаперонінів у клітинах різних організмів у нормі, при стресах і при різних захворюваннях, що відкриває можливості для дослідження механізмів та перебігу ряду захворювань та їх діагностики.

Особистий внесок автора. Результати, представлені в дисертаційній роботі, є підсумком досліджень, проведених автором у співробітництві з науковим керівником. Дисертантом особисто здійснено інформаційний пошук, аналіз літературної інформації, експериментальні дослідження, теоретичне обґрунтування й оформлення результатів. Дисертантові належить основна роль в інтерпретації отриманих результатів, написанні й оформленні наукових праць. Дисертаційна робота написана автором самостійно. Автор висловлює подяку Каліману П.А. та Семісотнову Г.В. за постановку завдань дисертаційної роботи, прочитання рукопису і корисні обговорення; Котовій Н.В. і Марченкову В.В. за навчання основним методикам і допомогу у виділенні GroEL; Кашпарову І.А. і Шехватовій Г.В. за допомогу в приготуванні афінних сорбентів; Буланкіній Н.І. та Марченковій С.Ю. за обговорення результатів роботи, Кайшевій А.Л. за участь у підготовці зразків.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені та доповідались на наступних наукових з'їздах та конференціях: наукова конференція, присвячена 100-річчю з дня народження акад. І. Н. Буланкіна “Научное наследие академика И. Н. Буланкина и его развитие в современной биохимии” (2001, Харків, Україна); VIII Український біохімічний з'їзд (2002, Чернівці, Україна); щорічні наукові конференції Інституту білка РАН (2003-2006, Пущино, Росія); конференція молодих науковців, аспірантів та студентів з молекулярної біології і генетики, присвячена золотому ювілею подвійної спіралі ДНК та 30-річчю заснування Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (2003, Київ, Україна); ІІІ з'їзд біофізиків Росії (2004, Воронеж, Росія); 9-а Міжнародна Пущинська школа-конференція молодих учених “Биология – наука XXI века” (2005, Пущино, Росія); 30-й конгрес FEBS і 9-та конференція IUBMB “The Protein World” (2005, Будапешт, Угорщина); XVІІІ зимова молодіжна наукова школа “Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии” (2006, Москва, Росія); наукова конференція “Современные проблемы молекулярной биофизики”, присвячена 40-річчю спеціалізації “молекулярная биофизика” на фізичному факультеті Санкт-Петербуржського державного університету і 95-річчю з дня народження проф. E. В. Фрисман (2006, Санкт-Петербург, Росія); конференція молодих вчених FEBS (2006, Стамбул, Туреччина); 31-й конгрес FEBS “Molecules in Health & Disease” (2006, Стамбул, Туреччина); ІX Український біохімічний з'їзд (2006, Харків, Україна).

Публікації. Основні результати дисертаційної роботи опубліковані в 16 друкованих працях, у тому числі в 6 статтях (4 статтях у вітчизняних наукових журналах) і в 10 тезах доповідей на національних та міжнародних конференціях.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, 7 розділів, висновків і списку використаної літератури (298 найменувань). Робота має обсяг 132 сторінок, у тому числі 17 малюнків, 6 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури складається з 6 підрозділів. У підрозділах 1 та 2 розглядаються концепції спонтанної та асистованої самоорганізації білка, розказано про відкриття та функції шаперонів, перераховано їх основні класи. Структуру та функцію шаперонінів (на прикладі GroEL) розглянуто в підрозділі 3, у цьому ж підрозділі узагальнено недоліки загальноприйнятої моделі функціонування шаперонінів і запропоновано альтернативну модель. Велику увагу в огляді літератури надано оксидативному стресові, впливу іонів важких металів (зокрема, іонів кадмію) на розвиток оксидативного стресу та опису одного з маркерів оксидативного стресу гемоксигенази (підрозділи 4-6).

Матеріали та методи досліджень

GroEL виділяли за відомою методикою [Lissin N.M. et al, 1990] після експресії в клітинах E. colі (штам HB101) мультикопійної плазміди pGroE4 (повний groE оперон E. coli, клонований в EcoR1 сайті вектора pACYC184). Після стандартного виділення GroEL додатково очищали від поліпептидних домішок [Murai N. et al, 1996].

В якості білкових мішеней GroEL було використано наступні білки: апоцитохром с, в_казеїн, пепсин, а також б_лактальбумін, лізоцим і рибонуклеаза А за присутності дитіотреітолу. Заряд та молекулярну масу білків розраховували за їх амінокислотною послідовністю. Ступінь експонованості гідрофобних кластерів білків оцінювали виходячи з їх спорідненості до гідрофобного зонду АНС (амонієва сіль 8-анілінонафталін-1-сульфонату) [Semisotnov G.V. et al, 1991]. Флуоресцеїн-мічені білки готували за типовою методикою [Hermanson G.T., 1996].

Афінні сорбенти синтезували на базі CNBr-активованої Sepharose 4B ("Pharmacіa Bіotech", Швеція) [Axen R. et al, 1967]. Отримані афінні сорбенти поміщали в хроматографічні колонки (5 Ч 25 мм). GroEL наносили на таку колонку в концентрації ~2 мг/мл в об'ємі 150 мкл. Афінно зв'язаний GroEL елюювали різними буферними системами. Профілі нанесення й елюції GroEL аналізували з накопиченням аліквот 0.5 мл, їх подальшим діалізом та вимірами інтенсивності поглинання (при довжині хвилі 220 і 280 нм), інтенсивності власної флуоресценції зразків (при збудженні на довжині хвилі 275 нм і реєстрації на 310 нм), АТФазної активності [Lanzetta P.A. et al, 1979] та електрофорезом у поліакриламідному гелі [Laemmli U.K., 1970]. Кількість GroEL, що зв'язалася з афінним сорбентом, оцінювали, виходячи з площ під піками елюції.

Вміст шаперонінів у клітинах різних організмів вивчали на прикладі клітин Escherіchіa colі дикого типу та суперпродуценту GroEL, а також клітин печінки щурів (Rattus norvegіcus) у нормі та при оксидативному стресі.

При вивченні вмісту шаперонінів в клітинах E. colі освітлений лізат клітин у кількості 2 мл наносили на афінний сорбент в 20 мМ Trіs-HCl pН 7.5, 5 мМ ЕДТА, 600 мМ NaCl буфері. GroEL, що зв'язався з афінним сорбентом, елюювали 20 мМ Trіs-HCl буфером, pН 7.5.

Експеримент щодо експрес-аналізу вмісту шаперонінів у печінці щурів проводили на тваринах лінії Wistar, самцях віком 4 місяці, яких утримували в стандартних умовах віварію. Експерименти на тваринах здійснювали відповідно до правил “Європейської конвенції захисту хребетних тварин, використаних в експериментальних та інших наукових цілях”. Для індукції оксидативного стресу 5 щурам був уведений CdCl2 у кількості 0.5 мг на 100 г маси щура (контрольним 5 щурам було введено 0.9% розчин NaCl) за 24 години до експерименту. Печінку щурів було перфузовано, гомогенізовано в 10 мМ HEPES буфері рН 7.5 (що містив 0.25 М сахарози, 1 мМ ЕДТА, 0.5 мМ PMSF (фенілметилсульфонілфторид)) і фракціоновано центрифугуванням для отримання субклітинних фракцій (10 хвилин при 4500g, 25 хвилин при 16000g, 60 хвилин при 110000g). Мітохондрії руйнували ультразвуком. Отримані фракції інкубували 10 годин при 200С у буфері 20 мМ TrіspН 7.5, що містив 100 мМ KCl, 10 мМ MgCl2 і 20 мМ ДТТ, і освітлювали центрифугуванням. Отриманий супернатант наносили на афінну смолу. Білки, що зв'язалися з денатурованим лізоцимом, елюювали буферами з високим рН.

Активність гемоксигенази визначали в мікросомальній фракції клітин печінки щурів [Sardana M.K. et al, 1985]. Субстратом служив метгемальбумін. До реакційної суміші додавали постмікросомальну фракцію клітин печінки інтактних щурів як джерело білівердинредуктази. Активність ферменту розраховували за кількістю утвореного білірубіну з використанням коефіцієнту поглинання е = 4 Ч 104 М-1см-1 при 530 нм.

Статистичну обробку результатів дослідження проводили з використанням t-критерію Ст'юдента [Гланц С., 1998].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Фізико-хімічні властивості денатурованих білків,

що були використані для афінної хроматографії GroEL

Першим етапом створення афінних сорбентів для GroEL був вибір білків, що можуть бути денатуровані в нативних для GroEL умовах, і які нездатні згорнутися в цих умовах навіть у присутності GroEL. Було обрано наступні білки: а) негативно заряджені за рН 7.5 б_лактальбумін (у присутності дитіотреітолу), в_казеїн і пепсин; б) позитивно заряджені за рН 7.5 лізоцим і рибонуклеаза А (у присутності дитіотреітолу) та апоцитохром с. Відомо, що ці білки відрізняються між собою за ступенем структурованості та компактністю [Stellwagen E. et al, 1972; Fisher W.R. et al, 1973; Козлов Л.В. и др, 1979; Creamer L.K. et al, 1981; Ewbank J.J., Creighton T.E., 1993; Aoki K. et al, 1997; Gekko K. et al, 2003; Livney Y.D. et al, 2004]. Нам також було важливо одержати інформацію щодо їх гідрофобності, оскільки гідрофобні взаємодії вважають основними при формуванні комплексів GroEL з білковими мішенями в фізіологічних умовах [Fenton W.A. et al, 1994; Lin Z. et al, 1995]. Для оцінки гідрофобності денатурованих білків було використано їхню спорідненість до гідрофобного флуоресцентного зонду АНС (амонієва сіль 8-анілінонафталін-1-сульфонату), що часто використовується для оцінки ступеня експонованості гідрофобних кластерів білків [Semisotnov G.V. et al, 1991; Brazil B.T. et al, 1998].

На малюнку 1 представлено спектри флуоресценції АНС у присутності використаних білків у нативному і денатурованому станах.

Рис. . Спектри флуоресценції АНС (лзб. = 340 нм) у присутності: денатурованого б_лактальбуміну (1), денатурованого лізоциму (2), в_казеїну (3), апоцитохрому с (4), денатурованого пепсину (5), денатурованої рибонуклеази А (6), і нативних б_лактальбуміну, лізоциму, рибонуклеази А (7_). Буфер: Trіs-HCl (20 мМ, pН 7.5), що містив 30 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, а також, у випадку денатурованих б_лактальбуміну, лізоциму і рибонуклеази А, 20 мМ ДТТ. Кінцеві концентрації білків і АНС дорівнювали 0.0014 мМ і 0.028 мМ, відповідно.

Видно, що денатуровані лізоцим і б_лактальбумін у присутності ДТТ (дитіотреітол) мають підвищену спорідненість до гідрофобного зонду АНС в порівнянні з цими білками в нативному стані. Апоцитохром с і в_казеїн також мають підвищену спорідненість до АНС, хоча і меншу, ніж денатуровані лізоцим і б_лактальбумін (див. також табл. 1). Разом з тим, денатуровані пепсин і рибонуклеаза А практично не зв'язують АНС (можливо, внаслідок низького ступеня експонованості гідрофобних кластерів, здатних зв'язати АНС).

Таким чином, використані в роботі денатуровані білки відрізняються один від одного за розміром, зарядом при нейтральних значеннях рН і спорідненістю до гідрофобного зонду АНС – “гідрофобністю” (таблиця 1), а також за ступенем структурованості та компактності.

Таблиця 1.

Фізико-хімічні властивості білкових субстратів GroEL

Білок | Умови денатурації | Заряд

при рН 7.5 | Молекулярна маса (кДа)“ | Гідрофобність”,

(, від. од.)

апоцитохром с | рН 7.5 | +9 | 11.7 | 0.9

лізоцим | рН 7.5, 20 мМ ДТТ | +8 | 14.3 | 2.3

рибонуклеаза А | рН 7.5, 20 мМ ДТТ | +4 | 13.7 | 0.1

-лактальбумін | рН 7.5, 20 мМ ДТТ | -7 | 14.1 | 3.5

-казеїн | рН 7.5 | -8 | 23.6 | 0.9

пепсин | рН 7.5 | -32 | 34.6 | 0.1

Взаємодія GroEL з денатурованими білками в розчині

Для дослідження взаємодії денатурованих білків з GroEL у розчині було взято позитивно заряджений (при рН 7.5) лізоцим у присутності ДТТ і негативно заряджений пепсин.

Лізоцим з відновленими сульфгідрильними групами має високий ступінь експонованості гідрофобних кластерів (див. таблицю 1) і, за відсутності GroEL, агрегує в розчині при концентраціях вище за 0.005 мг/мл. Для полегшення реєстрації комплексу лізоциму з GroEL у розчині до лізоциму була ковалентно приєднана флуоресцентна мітка – флуоресцеїн-ізотіоціанат.

На малюнку 2А наведено кінетичні дані агрегації флуоресцеїн-міченого лізоциму в присутності ДТТ як за відсутності, так і в присутності дворазового молярного надлишку GroEL. Видно, що за відсутності GroEL лізоцим агрегує і через 100 хвилин майже весь білок знаходиться в осаді. Навпроти, у присутності GroEL швидкість агрегації лізоциму різко зменшена, що свідчить про міцну взаємодію білкової мішені з шапероніном. Гель-хроматографія супернатанту на Superose 12 (рис. 2Б) показує, що флуоресценція міченого лізоциму зосереджена в зоні піку елюції GroEL. Таким чином, денатурований лізоцим у супернатанті знаходиться в комплексі з GroEL, хоч і повільно дисоціює з нього й агрегує (див. рис. 2А). Процес агрегації денатурованого лізоциму в присутності GroEL трохи прискорюється при додаванні в розчин Mg-АДФ (рис. 2А). Додання GroES до суміші денатурованого лізоциму з GroEL і Mg-АДФ сильно прискорює агрегацію денатурованого лізоциму (рис. 2А), але навіть у цих умовах близько 20% денатурованого лізоциму залишається міцно зв'язаним з GroEL.

Рис. . А. Кінетика агрегації флуоресцеїн-міченого лізоциму (0.05 мг/мл) у буфері, що містив 20 мМ Trіs-HCl, 100 мМ KCl, 10 мМ MgCl2 і 50 мМ ДТТ (рН 7.5), при 45оС. 1 – за відсутності GroEL; 2 – у присутності двократного молярного надлишку GroEL; 3 – у присутності двократного молярного надлишку GroEL і 2 мМ АДФ; 4 – у присутності двократних молярних надлишків GroEL і GroES, і 2 мМ АДФ.

Б. Гель-фільтрація флуоресцеїн-міченого лізоциму, інкубованого протягом двох годин (у тому ж буфері, що і в А) у присутності двократного молярного надлишку GroEL. Стрілками зазначені об'єми елюції стандартів молекулярних мас: 1 – 800 кДа (молекулярна маса GroEL), 2 – 66 кДа, 3 – 45 кДа, 4 – 25.7 кДа, 5 – 12.4 кДа.

Пепсин при рН 7.5 має значно менший ступінь експонованості гідрофобних кластерів порівняно до відновленого лізоциму (див. рис. 1 і табл. 1), внаслідок чого агрегує слабкіше. Ця властивість денатурованого пепсину дає можливість досліджувати його взаємодію з молекулярним шапероном GroEL методом гель-фільтрації на Superose 6. Для полегшення реєстрації пепсин також було модифіковано флуоресцеїн-ізотіоціанатом. Отримані дані про взаємодію флуоресцеїн-міченого денатурованого пепсину з GroEL зведено в таблицю 2.

Таблиця 2.

пепсин:GroEL | Mg2+ | АДФ, мМ | АТФ, мМ | GroES | % зв'язаного пепсину

1:1 | + | 100

2:1 | + | 95

1:1 | 5

1:1 | + | 0.1 | 67

1:1 | + | 0.1 | + | 16

1:1 | + | 1 | 10

1:1 | + | 1 | + | 3

1:1 | + | 0.1 | 11

1:1 | + | 0.1 | + | 1

З таблиці 2 видно, що GroEL (M ~800 кДа) в присутності іонів Mg2+ утворює міцний комплекс із денатурованим пепсином. АТФ значно сильніше, ніж АДФ (при рівних концентраціях) дестабілізує комплекс шаперону з денатурованим білком, однак збільшення концентрації АДФ на порядок (з 0.1 мМ до 1 мМ) призводить до приблизно такого ж ослаблення комплексу GroEL-пепсин, як при 0.1 мМ АТФ. Додавання GroES підсилює дестабілізуючу дію аденілових нуклеотидів на комплекс GroEL-пепсин. Додатково слід зазначити, що GroEL утворює міцний комплекс із денатурованим пепсином тільки в присутності іонів Mg2+ (див. табл. 2). Цей результат узгоджується з літературними даними про вплив двовалентних катіонів на спорідненість GroEL до денатурованого пепсину [Pack C.G. et al, 1999].

Таким чином, у розчині за певних умов GroEL утворює міцний комплекс як з позитивно зарядженими, так і з негативно зарядженими денатурованими білками.

Взаємодія GroEL з афінними сорбентами на основі денатурованих білків

Афінні сорбенти було створено на основі CNBr-активованого гранульованого агарозного гелю. Білки ковалентно приєднували до хроматографічної смоли. На афінну колонку наносили GroEL у різних умовах (див. таблицю 3). Афінно зв'язаний GroEL елюювали різними буферними системами як у нативному (олігомерному), так і в денатурованому станах (табл. 3). Взаємодію GroEL з афінним сорбентом реєстрували за поглинанням світла, а також за даними АТФазної активності (рис. 3А), електрофорезу (рис. 3Б) і власної флуоресценції (рис. 3А).

Рис. . Типові профілі елюції GroEL з афінного сорбенту, зареєстровані: А – за АТФазною активністю (0) і тирозиновою флуоресценцією (^) при довжині хвилі 310 нм (довжина хвилі збуджуючого світла – 270 нм); Б – методом SDS-електрофорезу (стандарти молекулярних мас: 1 – 60 кДа, 2 – 45 кДа, 3 – 29 кДа, 4 – 23 кДа, 5 – 12.5 кДа, 6 – 6.5 кДа).

Для з'ясування ролі гідрофобних і електростатичних взаємодій у формуванні комплексу GroEL з денатурованими білками, афінну хроматографію GroEL проводили з використанням різних денатурованих білків (див. таблицю 1) у широких інтервалах концентрацій двовалентних катіонів і значень іонної сили розчину при нейтральних рН. У таблиці 3 зведені результати цих експериментів.

Таблиця 3.

Вплив зовнішніх умов і лігандів на взаємодію GroEL з афінними сорбентами

на базі денатурованих білків

Денатуро-ваний білок | Заряд при рН 7.5 | Умови нанесення | Умови елюції | Наяв-ність* комп-лексу

апоцито-хром с | +9 | А + 5 мМ ЕДТА | А + 20 мМ Mg-АДФ | +

А + 10 мМ MgCl2 (CaCl2) | А + 20 мМ Mg-АДФ | +

А + 600 мМ NaCl (KCl, NH4Cl) | А + 20 мМ Mg-АДФ | +

лізоцим | +8 | Б + 5 мМ ЕДТА | Б + 6 М сечовини | +

Б + 10 мМ MgCl2 (CaCl2) | Б + 6 М сечовини | +

Б + 600 мМ NaCl (KCl, NH4Cl) | Б + 6 М сечовини | +

рибо-нуклеаза А | +4 | Б + 5 мМ ЕДТА | Б + 20 мМ Mg-АДФ | +

Б + 10 мМ MgCl2 (CaCl2) | Б + 20 мМ Mg-АДФ | +

Б + 600 мМ NaCl (KCl, NH4Cl) | Б + 20 мМ Mg-АДФ | +

-лакталь-бумін | -7 | Б + 5 мМ ЕДТА | (GroEL у вільному об'ємі)

Б + 10 мМ MgCl2 (CaCl2) | Б + 5 мМ ЕДТА | +

Б + 5 мМ ЕДТА, 600 мМ NaCl (KCl, NH4Cl) | Б + 5 мМ ЕДТА | +

-казеїн | -8 | А + 5 мМ ЕДТА | (GroEL у вільному об'ємі)

А + 10 мМ MgCl2 (CaCl2) | А + 5 мМ ЕДТА | +

А + 5 мМ ЕДТА, 600 мМ NaCl (KCl, NH4Cl) | А + 5 мМ ЕДТА | +

пепсин | -32 | А + 5 мМ ЕДТА | (GroEL у вільному об'ємі)

А + 10 мМ MgCl2 (CaCl2) | А + 5 мМ ЕДТА | +

А + 5 мМ ЕДТА, 600 мМ NaCl (KCl, NH4Cl) | А + 5 мМ ЕДТА | +

*Якщо більш ніж 90% шаперону, що було нанесено на афінний сорбент, зв'язувалося з сорбентом, вважали, що комплекс GroEL з ненативним білком наявний; якщо менш ніж 10% шаперону, що було нанесено на афінний сорбент, зв'язувалось, комплекс вважали відсутнім.

А 20 мМ Tris-HCl, рН 7.5; Б 20 мМ Tris-HCl, 20 мМ ДТТ, рН 7.5.

Видно, що при низькій іонній силі розчину (20 мМ Trіs-HCl, рН 7.5) і за відсутності двовалентних катіонів (іонів Mg2+ і Ca2+) GroEL не зв'язується з негативно зарядженими при рН 7.5 денатурованими білками (пепсин, в_казеїн і б_лактальбумін), але зв'язується з позитивно зарядженими денатурованими білками (апоцитохром с, рибонуклеаза і лізоцим). Таким чином, при низьких іонних силах наявного ступеня денатурованості негативно заряджених білкових мішеней недостатньо для утворення міцного комплексу з GroEL. Загальний заряд GroEL при рН 7.5 (розрахований з його амінокислотній послідовності) негативний (-266). Можна припустити, що гідрофобне притягнення GroEL і денатурованого білка при низькій іонній силі розчину цілком компенсується електростатичним відштовхуванням їх негативно заряджених молекул. На користь цього свідчить той факт, що підвищення іонної сили розчину до 600 мМ NaCl забезпечує утворення міцного комплексу GroEL з негативно зарядженими денатурованими білками навіть за відсутності двовалентних катіонів (таблиця 3).

Крім того, при низькій іонній силі розчину високу спорідненість GroEL до негативно заряджених денатурованих білків можуть забезпечити порівняно невеликі концентрації (~10 мМ) двовалентних катіонів (іонів Mg2+ і Ca2+, таблиця 3) (див. також [Pack C.G. et al, 1999]). Відомо, що іони Mg2+ значно підвищують стійкість GroEL до дії температури [Surin A.K. et al, 1997] і сечовини [Azem A. et al, 1994]. Можливо, це підвищення стабільності забезпечується зв'язуванням іонів Mg2+ з ділянками, розташованими на поверхні GroEL. Таке зв'язування може також приводити до значного зменшення локального негативного заряду на частині його поверхні, можливо, в зоні безпосереднього контакту з денатурованим білком, зменшуючи електростатичне відштовхування.

Таким чином, у формуванні міцного комплексу GroEL з негативно зарядженими денатурованими білками велике значення відіграє пригнічення їх електростатичного відштовхування, що і здійснюється у фізіологічних умовах підвищеною іонною силою (~150 мМ NaCl) і присутністю іонів Mg2+ чи Са2+. На наявність взаємодії GroEL з позитивно зарядженими денатурованими білками не впливає ні присутність двовалентних катіонів, ні підвищення іонної сили до 600 мМ (таблиця 3).

Слід зазначити, що представлені результати узгоджуються з літературними даними про вплив двовалентних катіонів на спорідненість GroEL до денатурованих пепсину, б_лактальбуміну й апоцитохрому c [Pack C.G. et al, 1999], а також з даними, що були отримані нами щодо взаємодії GroEL з флуоресцентно-міченими пепсином, лізоцимом і б_лактальбуміном у розчині. В той же час, використання обраного нами методу (афінної хроматографії на базі агарозного гелю з ковалентно приєднаними білками-мішенями) дозволило розширити спектр білкових мішеней у порівнянні з відомими роботами [Aoki K. et al, 1997; Pack C.G. et al, 1999], завдяки чому можна стверджувати, що двовалентні катіони необхідні для взаємодії GroEL саме з негативно зарядженими денатурованими білковими мішенями при низьких іонних силах.

Виділення та очищення GroEL методом афінної хроматографії

Внаслідок неослабного інтересу до дослідження структури і функціонування молекулярних шаперонінів, вже давно постало питання про їх швидке та ефективне очищення. Існує ряд відомих методик виділення й очищення, що базуються на гель-фільтрації, іонообмінній і зворотнофазовій хроматографії і т.д. Ці методики досить трудомісткі і складаються з кількох послідовних стадій [Lissin N.M. et al, 1990; Clark A.C. et al, 1998; Motojima F. et al, 2000]. Істотною проблемою є також доочищення GroEL від домішок, що практично не виявляються методами електрофорезу, однак чітко визначаються методом флуоресцентної спектроскопії (амінокислотна послідовність GroEL не містить залишків триптофану [Hemmingsen S.M. et al, 1988], однак очищені зразки шаперону часто мають значну триптофанову флуоресценцію [Price N.C. et al, 1991]). Використання афінної хроматографії на базі денатурованого пепсину дозволяє досить просто звільнитися від такої домішки. На малюнку 4 представлені дані SDS-електрофорезу і флуоресцентної спектроскопії шапероніну GroEL, виділеного стандартним методом, до і після його додаткового очищення за допомогою афінної хроматографії.

Рис. . SDS-електрофорез (А) і спектри флуоресценції (Б) зразків GroEL після стандартного очищення до нанесення на афінну колонку (1); домішка, що виходить у вільному об'ємі при нанесенні GroEL на афінний сорбент у 600 мМ NaCl (2); GroEL, елюйований з афінного сорбенту буфером 20 мМ Trіs-HCl, pН 7.5 (3). Спектри флуоресценції заміряно при довжинах хвиль збуджуючого світла 270 нм (––––) і 293 нм (– – –).

Видно, що, незважаючи на те, що очищений стандартним способом [Lissinet al, 1990] GroEL виглядає електрофоретично як добре очищений (рис. А, слот 1), спектр його флуоресценції містить великий внесок триптофанової складової (лмакс ~350 нм (рис. 4Б, 1)). Нанесення цього препарату GroEL на афінний сорбент з негативно зарядженим денатурованим пепсином в умовах високої іонної сили (600 мМ) при відсутності двовалентних катіонів приводить до того, що GroEL зв'язується з сорбентом (рис. 4А, слот 2; див. також табл. 3), а домішка, що містить триптофан, виходить у вільному об'ємі (рис. 4Б, 2). Елюйований з афінного сорбенту GroEL (рис. 4А, слот 3) практично не має домішки, що містить триптофан, і його спектр флуоресценції має тільки тирозинову складову (рис. 4Б, 3), як і випливає з його амінокислотної послідовності. Вірогідно, при високій іонній силі взаємодія GroEL із домішкою, що містить триптофан, послаблюється і вона не може утриматись на міцно зв'язаному з афінним сорбентом шапероні.

Афінна хроматографія на базі денатурованих білків видається одним з перспективних підходів до розробки методів швидкого і високоефективного очищення GroEL і подібних йому шаперонінів безпосередньо з клітинного лізату [Evers M.E. et al, 1993]. Це, в свою чергу, становить інтерес як для біотехнологічних цілей (наприклад, для одержання шаперонінів з різних організмів з метою їх використання для реактивації рекомбінантних білків з “тілець включення”), так і для експрес-аналізу вмісту шаперонінів у клітинах різних організмів, що може бути корисним у біомедицині для розробки нових діагностичних систем.

На малюнку 5 наведено результати афінної хроматографії (на сорбенті з денатурованим пепсином) клітинного лізату, освітленого центрифугуванням, після експресії в клітинах E. colі оперону groЕ.

Рис. . Афінне очищення GroEL із освітленого центрифугуванням лізату клітин E. colі після експресії в них groE-оперону (А) та клітин E. colі дикого типу (Б). А, Б – SDS-електрофорез клітинного лізату до нанесення на афінну колонку (1) і фракцій GroEL з афінного сорбенту в області піка елюції (2-4); В – типовий профіль елюції GroEL з афінного сорбенту, зареєстрований за АТФазною активністю. На врізці наведено спектри флуоресценції GroEL після афінного очищення при довжині хвилі збудження 270 нм (––––) і 293 нм (– – –).

Як видно з малюнка 5, очищений у такий спосіб GroEL не тільки електрофоретично чистий (рис. 5А) і нативний (тобто має АТФазну активність, див. рис. 5В), але й не має триптофанової складової власної флуоресценції (рис. 5В, врізка).

Як випливає з малюнка 5Б, афінна хроматографія на базі денатурованого пепсину дозволяє одержати очищений GroEL на тільки з клітин E. colі, що є суперпродуцентом GroE, але й із клітин E. colі дикого типу, де кількість шапероніну значно менша. Отримані результати вказують на високу ефективність очищення GroEL на афінному сорбенті з ковалентно іммобілізованим денатурованим пепсином. Такий підхід дозволяє очищати GroEL із клітинного лізату практично в одну стадію, забезпечуючи високий ступінь чистоти GroEL, і не вимагає додаткових етапів діалізу і концентрування, що підвищує вихід GroEL, дозволяючи уникнути його втрат у порівнянні з багатоетапним очищенням. Міцна взаємодія GroEL з афінним сорбентом в описаних нами умовах і мінімальні втрати шаперону на стадії очищення надають можливість експрес-аналізу вмісту GroEL та інших шаперонінів у клітинах, тканинах і органах різних організмів як у нормі, так і в патології, у тому числі при впливі різних стресів.

Експрес-аналіз вмісту шаперонінів печінки щурів

при оксидативному стресі

Для експрес-аналізу шаперонінів печінки щурів було обрано агарозний гель з ковалентно приєднаним лізоцимом. GroEL міцно взаємодіє з денатурованим (у присутності ДТТ) лізоцимом при будь-якій іонній силі розчину (див. таблицю 3). Для індукції оксидативного стресу щурам був уведений хлорид кадмію.

Для оцінки розвитку оксидативного стресу в групи щурів, що були під впливом хлориду кадмію, визначали активність гемоксигенази у мікросомальній фракції клітин печінки щурів, оскільки підвищення гемоксигеназної активності належить до класичних ознак оксидативного стресу. Було отримано наступні дані: в групі контрольних щурів значення гемоксигеназної активності склали 2.7±0.3 нмоль білірубіну/год на 1 мг білка, а в групі стресованих щурів – 15.7±0.8 нмоль білірубіну/год на 1 мг білка. Середні значення достовірно різняться: p < 0.05. Таким чином, показано розвиток оксидативного стресу.

На малюнку 6А наведено дані афінної хроматографії мітохондріальної фракції печінки щурів. При елюції буфером з високим рН білків, що міцно зв'язалися з денатурованим лізоцимом, видно мажорну смугу – білки з молекулярною масою близько 60 кДа (рис. 6А, слоти 3 і 4). Ця смуга спостерігається як у контрольних щурів (рис. 6А, слот 3), так і в стресованих (рис. 6А, слот 4), причому у стресованих щурів кількість елюйованого білка з даною молекулярною масою (оцінено за допомогою програми TotalLab) в три рази більше, ніж у контрольних, що свідчить про підвищення вмісту даного білка в мітохондріях клітин печінки щурів при стресі. Ця різниця є статистично достовірною: p < 0.05.

Відомо, що GroEL добре ренатурує з буферу з рН 11 при діалізі проти стандартного буферу, що містить 20 мМ Mg-АТФ. Нами проведено подібний діаліз фракції піка елюції білків, що зв'язалися з лізоцим-агарозою, з буфера з рН 11. Отриманий після діалізу зразок було відцентрифуговано і досліджено методом електрофорезу в нативних умовах (рис. 6Б). На малюнку 6Б видно, що після ренатурації білок є олігомером, однак проходить в електрофоретичному гелі меншу відстань, ніж олігомер GroEL. Цей результат опосередковано свідчить на користь того, що ренатурований білок є GroEL-подібним шапероном мітохондрій щура (Hsp60), тому що загальний заряд Hsp60 щура (розрахований з амінокислотної послідовності) складає -126 на олігомер (у GroEL – -266 на олігомер), тож олігомер Hsp60 щура і повинний у нативних умовах йти повільніше, ніж олігомер GroEL. Зразки елюйованого білку з молекулярною масою 60 кДа також було досліджено методом мас-спектрометрії, проведеної Котовою Н. В. та Суріним О. К. Отримані при цьому дані однозначно свідчать про те, що досліджений білок є Hsp60 щура.

Рис. . Експрес-аналіз GroEL-подібного шаперону мітохондрій клітин печінки щурів за оксидативного стресу. А – SDS-електрофорез мітохондріальних фракцій клітин печінки щурів до