НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ФІЗИКО-ХІМІЧНИЙ ІНСТИТУТ ім. О.В. БОГАТСЬКОГО

МАЛОВІЧКО ОЛЬГА ЛЕОНТІЇВНА

УДК 577.32’17.012:543.422.25

СИНТЕЗ І ВЛАСТИВОСТІ RGD МІМЕТИКІВ НА ОСНОВІ АЗОТОВМІСНИХ ГЕТЕРОЦИКЛІВ

02.00.10 – біоорганічна хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Одеса – 2007

Дисертація є рукопис.

Робота виконана на кафедрі фармацевтичної хімії Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова МОН України та у відділі медичної хімії Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України

Науковий керівник: | академік НАН України, доктор хімічних

наук, професор

АНДРОНАТІ Сергій Андрійович,

Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, директор, завідувач відділом медичної хімії

Офіційні опоненти: | доктор хімічних наук, професор

ЗЕМЛЯКОВ Олександр Євгенович,

Таврійський національний університет

ім. В.І. Вернадського МОН України,

професор кафедри органічної і біологічної хімії.

доктор хімічних наук, доцент

КОМАРОВ Ігор Володимирович,

Київський національний університет

ім. Тараса Шевченка,

доцент кафедри органічної хімії

Провідна установа: | Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії

НАН України, м. Київ

Захист відбудеться “21” червня 2007 року о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.219.02 в Фізико-хімічному інституті
ім. О.В. Богатського НАН України (65080, м. Одеса, Люстдорфська дорога, 86).

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України (65080, м. Одеса, Люстдорфська дорога, 86).

Автореферат розісланий “18 ” травня 2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, кандидат хімічних наук Л.О. Литвинова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. На кінець XX століття було встановлено провідну роль агрегації тромбоцитів, що призводить до утворення тромбів, у розвитку таких небезпечних серцево-судинних захворювань як атеросклероз, стенокардія, інфаркт, інсульт та тромбоемболія. Процес агрегації здійснюється за допомогою фібриногену, що взаємодіє зі своїм рецептором – інтегрином IIb3, на поверхні активованих тромбоцитів. Одним з важливих завдань профілактики та лікування серцево-судинних захворювань, пов’язаних з тромбоутворенням, є створення лікарських засобів, які запобігають агрегації тромбоцитів, тобто антиагрегантів.

Відповідальним за зв’язування фібриногену з його рецептором – глікопротеїновим комплексом GP IIb/IIIa (інтегрином IIb3), є трипептидний фрагмент - RGD (Arg-Gly-Asp). Зв’язування фібриногену з IIb3 може блокуватися різними пептидами, що містять RGD послідовність. Таким чином, RGD послідовність є основою для дизайну нових антагоністів IIb3, інгібіторів агрегації тромбоцитів. Молекулярний дизайн потенційних антагоністів IIb3 включає моделювання структур, які містять RGD - фрагмент або його імітують. Природні пептиди, що містять RGD послідовність, виявляють низьку селективність, так як мають спорідненість і до інших рецепторів, що відносяться до сімейства інтегринів. Можливості їх медичного застосування обмежені через їх швидку метаболічну деградацію та низьку біодоступність.

У ряді провідних наукових центрів світу проводяться інтенсивні дослідження, спрямовані на створення ефективних та безпечних антиагрегантів. Одним з найбільш перспективних напрямків вважається створення антагоністів фібриногенових рецепторів. Отримано високоафінні антагоністи цих рецепторів - ефективні інгібітори агрегації тромбоцитів. Допущеними до застосування в медицині є чотири антагоністи фібриногенових рецепторів: моноклональне антитіло до GP IIb/IIIa абсиксімаб, циклічний RGD пептид ептіфібатид, лінійні RGD - пептидоміметики тірофібан та ламіфібан.

Результати робіт у сфері створення принципово нових антитромботичних засобів за останні 10 років свідчать про актуальність та перспективність проблеми. Розвиток досліджень у даній галузі дозволить розв’язати ряд важливих теоретичних та прикладних проблем: встановити зв'язок між структурою та властивостями RGD міметиків; обґрунтувати принципи біоізостерного та інших підходів до дизайну перспективних та безпечних антиагрегантів; з’ясувати молекулярні, біохімічні та фізіологічні основи селективності їх дії; створити перорально активні антиагреганти та інше.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконувалась у відповідності до тематики відділу медичної хімії Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України за наступними темами: “Синтез, структура, властивості та афінітет до фібриногенових рецепторів нових RGD пептидоміметиків на основі 4-оксо-(4-піперазин-1-іл)бутанової кислоти та її похідних” (№ держ. реєстрації 0102V000118, 2001-2003), “Синтез та структурно-функціональне вивчення лігандів рецепторів ЦНС, GP IIb/IIIa і нуклеїнових кислот” (№ держ. реєстрації 0102V001465, 2002-2004), “Дизайн, синтез та властивості RGD міметиків – інгібіторів агрегації тромбоцитів” (№ держ. реєстрації 0103V004728, 2003-2004).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи: Синтез, вивчення властивостей та молекулярного механізму дії потенційних антиагрегантів – RGD міметиків, що містять фрагменти 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової,
4-(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл-аміно)-4-оксо-бутанової, 1,2,3,4-тетрагід-роізохінолін-7-карбонової, 3-[(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл-аміно)карбо-ніл]бензойних кислот та в-арил-в-аланінів як біоізостерні замісники.

У зв’язку з метою роботи були поставлені такі завдання:

- Синтез RGD міметиків, що містять залишки 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової та м-амінобензойної кислот.

- Синтез “проліку” - 3-[4-оксо-4-(4-етоксикарбонілпіперазин-1-іл)бутирил-аміно]бензоїл-D,L--(3,4-метилендіоксифеніл)--аланіну.

- Синтез та вивчення спектральних властивостей RGD міметиків, похідних 4-(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл-аміно)-4-оксобутанової кислоти.

- Одержання 1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-карбонової кислоти та синтез на її основі нових RGD міметиків.

- Синтез RGD міметиків, похідних 3-[(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл-аміно)карбоніл]бензойних кислот.

- Вивчення антиагрегаційних властивостей та молекулярного механізму дії ряду синтезованих RGD міметиків.

Об’єкт дослідження: RGD міметики, що містять фрагменти 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової, 4-(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл-аміно)-4-оксо-бутанової, 1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-карбонової, 3-[(1,2,3,4-тетрагідро-ізохінолін-7-іл-аміно)карбоніл]бензойних кислот та в-арил-в-аланінів як біоізостерні замісники.

Предмет дослідження: Структура, біологічні властивості синтезованих RGD міметиків.

Методи дослідження: Органічний синтез, спектроскопія ЯМР, масс-спектрометрія, біологічні дослідження in vitro та ex vivo.

Наукова новизна отриманих результатів. Синтезовано ряд нових високоактивних RGDF міметиків на основі залишку 1,2,3,4-тетрагідро-ізохіноліну. Уперше показано, що як Arg-Gly біоізостер для отримання RGDF міметиків – високоактивних антагоністів IIb3, можна використовувати залишки 4-(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл-аміно)-4-оксобутанової та
3-[(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл-аміно)карбоніл]бензойних кислот, а як сурогат аргініну можна використовувати фрагмент 1,2,3,4-тетрагідро-ізохінолін-7-карбонової кислоти. Отримані на їх основі сполуки мають високу антиагрегаційну активність у дослідах in vitro та проявляють високий афінітет до фібриногенових рецепторів.

Практичне значення отриманих результатів. Експериментальні результати свідчать про перспективність пошуку антагоністів фібриногенових рецепторів у рядах сполук, що містять залишок 1,2,3,4-тетрагідроізохіноліну як біоізостер аргінілу. Залишки 4-(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл-аміно)-4-оксобутанової, 1,2,3,4-тетрагідроізохінол-ін-7-карбонової, 3-[(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл-аміно)карбоніл]бензой-них кислот і в-арил-в-аланінів можуть бути використані при створенні нових RGDF міметиків - перспективних сполук з високою антиагрегаційною активністю, які можуть надалі знайти застосування у медицині для профілактики та лікування різних захворювань серцево-судинної системи.

Особистий внесок автора. Дисертантом самостійно синтезовані нові RGD міметики на основі 4-оксо-(4-піперазин-1-іл)бутанової, 4-(1,2,3,4-тетра-гідроізохінолін-7-іл-аміно)-4-оксобутанової та 1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-карбонової кислот, а також на основі 7-аміно-1,2,3,4-тетрагідроізохіноліну, ізофталевої та 5-нітро-ізофталевої кислот. Самостійно синтезовано “пролік” на основі залишку 4-оксо-(4-піперазин-1-іл)бутанової і м-амінобензойної кислот, інтерпретовано дані спектрів 1Н-ЯМР, мас-спектрів. Постановку мети та завдань досліджень, інтерпретацію отриманих результатів, формулювання основних положень та висновків дисертації здійснено разом з науковим керівником.

У співавторстві виконані 1Н-ЯМР дослідження (к.х.н., ст.н.с. В.В. Піроженко, Інститут органічної хімії НАН України, м. Київ); мас-спектральні дослідження (к.х.н., ст.н.с. О.В. Мазепа, аспірант І.М. Ракіпов, ФХІ ім. О.В. Богатського НАН України); (1Н,13С)-ЯМР дослідження (д.х.н., проф. О.С. Шашков та к.х.н. В.В. Качала, Інститут органічної хімії ім. М.Д. Зелінського РАН, м. Москва); інтерпретація даних (1Н,13С)-ЯМР дослідів (д.х.н., проф. В.І. Грішковець, Таврійський національний університет ім. В.І. Вернадського); 2D ЯМР дослідження (д.х.н., ст.н.с. О.В. Туров, Київський національний університет ім. Тараса Шевченко, м. Київ); вивчено вплив отриманих RGD міметиків на агрегацію тромбоцитів, зв’язування FITC-фібриногену з рецепторами на тромбоцитах (д.б.н., проф., провід.н.с. Т.Л. Карасьова, к.б.н., н.с. Т.А. Кабанова, ФХІ ім. О.В. Богатського НАН України).

Всім вищеназваним колегам автор висловлює велику подяку за неоціненну допомогу у виконанні необхідних дослідів із дисертаційної роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були представлені на Четвертій Всеукраїнській науковій конференції студентів та аспірантів “Сучасні проблеми хімії” (Київ, 2003); Міжнародній конференції студентів та аспірантів, присвяченій 75-річчю із дня народження академіка О.В. Богатського “Сучасні напрямки розвитку хімії” (Одеса, 2004); XX Українській конференції з органічної хімії (Одеса, 2004); Міжнародній конференції з хімії азотовмісних гетероциклів (Харків, 2006) та IX конференції молодих вчених і студентів-хіміків Південного регіону України (Одеса, 2006).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 4 статті та тези 8 доповідей на українських і міжнародних конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури (розд. 1), результатів експерименту (розд. 2), експериментальної частини (розд. 3), висновків і списку використаних джерел (166 найменувань). Робота представлена на 132 сторінках, містить 5 таблиць, 16 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Синтез RGDF міметика на основі 4-оксо-4-(піперазин-1-іл) бутанової та м-амінобензойної кислот

Раніше у відділі медичної хімії Фізико-хімічного інституту
ім. О.В. Богатського НАН України був синтезований ряд лінійних RGDF міметиків 1 на основі 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти та залишків
-заміщених -аланінів. Отримані сполуки мали високу антиагрегаційну активність та афінітет до бIIbв3 (IC50 в межах 10-6 – 10-8 М). З літератури відомо, що у молекулах високоактивних RGDF міметиків між їх центрами зв’язування – кінцевими основною групою (як така можуть бути використані гуанідино-, амідино, аміно- та ін.) та карбоксильною функцією, повинна бути певна відстань (10 – 15 ?). Цим умовам відповідає структура пептидоміметика 2. Введення залишку м-амінобензойної кислоти забезпечує додаткову жорсткість молекули міметика, що позитивно впливає на активність.

Даний розділ роботи присвячено синтезу нового RGDF пептидоміметика 3, що містить залишок 4-оксо-(4-піперазин-1-іл)бутанової кислоти як Arg-міметик, фрагмент м-амінобензойної кислоти та залишок
D,L--(3,4-метилендіоксифеніл)--аланіну. Наявність гідрофобного радикалу в С-кінцевій частині міметика необхідна для його ефективного зв’язування з рецептором. Введення ліпофільних амінокислотних залишків, таких як фрагмент м-амінобензойної кислоти, у молекули RGD пептидоміметиків має також позитивно впливати на пероральну активність сполук.

Як вихідну сполуку для отримання 3-[4-оксо-4-(4-Boc-піперазин-1-іл)бутириламіно]бензойної кислоти (4) використовували Boc-піперазин (5) (схема 1). Сполуку 5 ацилювали бурштиновим ангідридом, в результаті чого була отримана 4-оксо-4-(4-Вос-піперазин-1-іл)бутанова кислота (6). Конденсацію м-амінобензойної кислоти та Вос-похідного 6 проводили трьома методами. Перший полягав у використанні змішаного ангідриду 7, який отримували з триетиламонійної солі кислоти 6 та ізо-бутилхлорфор-міату.

Схема 1

Другий метод передбачав використання N-оксисукцинімідного естеру (Su-естеру) 8, який синтезували зі сполуки 6 та N-оксисукциніміду (SuOH) в присутності N,N’-дициклогексилкарбодііміду (DCC). У третьому методі використовували пентафторфеніловий естер 9. Естер 9 отримували з кислоти 6, пентафторфенолу (PfpOH) та DCC. Похідними 7, 8 и 9 ацилювали натрієву сіль м-амінобензойної кислоти. Найкращий результат було досягнуто при використанні пентафторфенілового естеру (Pfp-естеру) 9 (вихід сполуки 4 складає 80 %). Карбоксильну групу сполуки 4 активували дициклогексил-карбодіімідним методом з додаванням SuOH (схема 2). В результаті було отримано Su-естер 10, наступна взаємодія якого з натрієвою сіллю D,L--(3,4-метилен-діоксифеніл)--аланіну привела до утворення Вос-похідного 11. Видаленням Вос-групи останнього отримано цільову сполуку 3.

Схема 2

Антиагрегаційна активність синтезованого RGDF міметика 3 вивчалася на багатій на тромбоцити плазмі (БТП) крові людини за методом Born G.V. Сполука 3 інгібувала АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів з IC50 = 35 нM. RGDS пептид, який використовували як речовину порівняння, проявив активність у тому ж експерименті з IC50 = 31000 нM. Порівняння величин IC50 для RGDS та міметика 3 показало, що отриманий міметик 3 має дуже високу антиагрегаційну активність.

Синтез “подвійного проліку” на основі залишків 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової і м-амінобензойної кислоти

RGDF пептидоміметик 3 має високу антиагрегаційну активність in vitro і може бути потенційним антитромботичним засобом, проте висока полярність молекул таких антагонистів є фактором, що перешкоджає їх надходженню до крові при введенні через шлунково-кишковий тракт. Як відомо, з метою отримання перорально біодоступних лікарських засобів можна використовувати “проліки” – біологічно активні сполуки, що біотрансформуються в організмі. Найбільш простий підхід для отримання “проліків” заснований на “маскуванні” кінцевих функціональних груп молекули, які обмежують її біодоступність. Підвищення липофільності, за рахунок введення фрагменту м-амінобензойної кислоти, очевидно, буде сприяти проникненню молекул “проліку” 12 крізь біологічні мембрани, внаслідок чого буде збільшуватися біологічна доступність і біологічний ефект даної речовини в дослідах ex vivo.

Для отримання “подвійного проліку” - етилового естеру 3-[4-оксо-4-(4-етоксикарбонілпіперазин-1-іл)бутириламіно]бензоїл-D,L--(3,4-метилендіок-сифеніл)--аланіну (12), як вихідну сполуку використовували 1-етоксикарбо-нілпіперазин (13). Сполуку 13 ацилювали ангідридом бурштинової кислоти, в результаті чого була отримана 4-оксо-4-(4-етоксикарбонілпіперазин-1-іл)бутанова кислота (14). Для активації карбоксильної групи сполуки 14 використовували DCC и PfpOH (схема 3). В результаті був отриманий пентафторфеніловий естер 15. Сполука 15 є першим блоком для створення “подвійного проліку”.

Схема 3

Побудова другого блоку починалась з конденсації гідрохлориду етилового естеру D,L--(3,4-метилендіоксифеніл)--аланіну (16) з м-Boc-амінобензойною кислотою (17). Карбодіімідним методом із додаванням оксибензотриазолу було отримано етиловий естер м-Boc-амінобензоїл-D,L--(3,4-метилендіоксифеніл)--аланіну (18) (схема 4). Видалення Boc-групи зі сполуки 18 та реакція з Pfp-естером 15 привели до утворення цільового “проліку” 12.

Схема 4

Сполука 12 проявила антиагрегаційну активність при пероральному введені на мишах з ID50 = 0.22 мг/кг.

Синтез нових RGDF-міметиків на основі

4-(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл-аміно)-4-оксобутанової кислоти

Раніш повідомлялось про отримання RGDF міметиків серії ABAS на основі (амінобензамідино)сукцинілу 20 як Arg-Gly міметика. Як новий Arg-Gly ізостер для синтезу RGDF міметиків раніш ми використовували фрагмент 4-(ізоіндолін-5-іл)аміно-4-оксобутанової кислоти 21, виходячи зі структурної подібності фрагментів 20 та 21. Отримані сполуки на основі залишку 21 проявили високу антиагрегаційну активність та афінітет до зв’язування з бIIbв3. Гомолог ізоіндоліну - 1,2,3,4-тетрагідроізохінолін при дизайні RGD пептидоміметиків раніше не використовувався. Тому обраний нами фрагмент 4-(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл)аміно-4-оксобутанової кислоти 22 запро-поновано як Arg-Gly міметик при дизайні нових антагоністів бIIbв3. Як вихідні блоки для побудови нових RGDF міметиків у цьому розділі роботи були використані -арил--аланіни.

Як вихідну сполуку для отримання 4-(2-Вос-1,2,3,4-тетрагідро-ізохінолін-7-іл-аміно)-4-оксобутанової кислоти (23) застосовували 7-нітро-1,2,3,4-тетрагідроізохінолін (24) (схема 5). Аміногрупу сполуки 24 блокували Вос-групою. Послідовне відновлення нітрогрупи та ацилювання отриманого аміну 26 бурштиновим ангідридом приводило до отримання 4-(2-Вос-1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл-аміно)-4-оксобутанової кислоти (23).

Схема 5

Наступна активація карбоксильної групи в 23 з використанням DCC і SuOH і взаємодія отриманого Su-естеру 27 (без виділення) з відповідними
-аланінами в присутності NaHCO3 давали Вос-похідні 28 – 31 (схема 6). Ацидолітичним видаленням Вос-захисту в 28 – 31 були отримані цільові RGDF міметики 32 – 35.

Схема 6

Вивчення 2D ЯМР спектрів 4-(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл)аміно-4-оксобутаноїл-D-в-феніл-в-аланіну

Для віднесення сигналів та з’ясування конформаційних особливостей RGDF міметика 34 нами були вивчені двовимірні спектри 1Н ЯМР. Віднесення сигналів у спектрах 1Н ЯМР міметика 34 проводили на основі даних літератури про спектри 1Н ЯМР похідних залишку 1,2,3,4-тетрагідроізохіноліну та RGDF міметиків, що містять фрагменти бурштинової кислоти та в-феніл-в-аланіну. Для перевірки правильності віднесення сигналів протонів сполуки 35 використовували метод двовимірної гомоядерної протон-протонної кореляційної спектроскопії (COSY) та методику спостереження повних кореляцій (TOCSY). Використаний нами двовимірний експеримент зі спостереження ядерного ефекту Оверхаузера (NOESY) дає якісну інформацію про наявність диполь-дипольних контактів між просторово зближеними протонами. На рис. 1 представлена структура RGDF міметика 34 із зазначенням просторово зближених протонів даної молекули, які взаємодіють, на підставі наявності в спектрі NOESY крос-піків. Наявність у спектрі NOESY крос-піків свідчить про те, що відстань між ядрами, що взаємодіють, менше або дорівнює 5 Е. Відсутність ядерного ефекту Оверхаузера між “дальніми” протонами дає можливість стверджувати, що даний RGDF міметик у розчині DМSО перебуває у “витягнутій” конформації.

Рис. 1 Диполь-дипольна взаємодія протонів RGDF міметика 34 (на підставі наявності у спектрі NOESY крос-піків)

Синтез нових RGDF міметиків на основі 1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-карбонової кислоти

Нами розроблена методика отримання 2-Вос-1,2,3,4-тетрагідро-ізохінолін-7-карбонової кислоти (36), виходячи з 2-ацетил-1,2,3,4-тетра-гідроізохіноліну (37) (схема 7). Похідне 37 ацилювали ацетил хлоридом в присутності хлориду алюмінію, отриманий таким чином 2,7-діацетил-1,2,3,4-тетрагідроізохінолін (38) окислювали до 2-ацетил-1,2,3,4-тетрагідро-ізохінолін-7-карбонової кислоти (39). В результаті видалення ацетильної групи сполуки 39 кислотним гідролізом отримували гідрохлорид 1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-карбонової кислоти (40). Ацилювання кислоти 40 Вос2О приводило до 2-Вос-1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-карбонової кислоти (36).

Схема 7

Активацією карбоксильної групи сполуки 36 за допомогою DCC і SuOH було отримано Su-естер 41 (схема 8). Наступна взаємодія з натрієвими солями амінокислот (в-аланіну та г-аміномасляної кислоти) приводила до утворення дипептидів 42 і 43. Далі кислоти (дипептиди 42 і 43) перетворювали за допомогою DCC і SuOH у активовані естери 44 і 45. Реакція їх з в-амінокислотами давала Вос-похідні 46 - 50. Ацидолітичним видаленням Вос-захисту в 46 - 50 були отримані цільові RGDF міметики 51 - 55, що містили фрагмент 1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-карбонової кислоти як Arg-міметик.

Схема 8

Синтез нових RGDF міметиків на основі 3-[(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл-аміно)карбоніл]бензойної і 3-[(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл-аміно)карбоніл]-5-нітробензойної кислот

З літератури відомо, що введення “конформаційно жорсткого” фрагменту до структури RGD пептидоміметика приводить до збільшення антиагрегаційної активності та афінітету до бIIbв3. Фрагмент ізофталевої кислоти раніше використовувався як коформаційно обмежувальний лінкер для отримання RGD пептидоміметиків.

Метою даного етапу роботи є синтез раніш не описаних в літературі RGDF міметиків, що містять фрагменти ізофталевих кислот.

Як вихідна сполука для синтезу 3-[(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл-аміно)карбоніл]бензойної (56) і 3-[(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл-аміно)карбоніл]-5-нітробензойної (57) кислот використовували 7-аміно-2-Вос-1,2,3,4-тетрагідроізохінолін (26). Сполуку 26 ацилювали хлорангід-ридами монометилових естерів ізофталевих кислот, в результаті чого були отримані естери 58 і 59 (схема 9).

Схема 9

Омилення складноестерних груп сполук 58 і 59 приводило до відповідних кислот 56 і 57. Карбоксильні групи сполук 56 і 57 активували карбодіімідним методом з використанням DCC і SuOH, наступна реакція Su-естерів з різними в-заміщеними в-аланінами давала Вос-похідні 62 - 69. На останній стадії видаляли Вос-захист за допомогою трифтороцтової кислоти з утворенням цільових RGDF міметиків 70 – 77, що містили фрагменти
3-[(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл-аміно)карбоніл]бензойної кислоти як Arg-Gly міметик.

Індивідуальність всіх отриманих сполук в даній роботі контролювали методом ТШХ, структуру підтверджували даними спектроскопії 1Н-ЯМР і FAB-спектрометрії. У спектрах 1Н ЯМР отриманих сполук були присутні всі характерні сигнали протонів з відповідними інтегральними інтенсивностями.

Вивчення антиагрегаційної активності RGDF міметиків на основі залишку 1,2,3,4-тетрагідроізохіноліну

Отримані RGDF міметики 32 – 35, 51 – 55 і 70 – 77 є хімічно стабільними при нормальних умовах і добре розчинними у воді, що є важливим для тестування у дослідах in vitro. Синтезовані нами RGDF міметики проявили високу антиагрегаційну активність у дослідах in vitro на багатій на тромбоцити плазмі крові людини (табл. 1). Експерименти проводились за методом Born G.V. на зразках крові, отриманих не менш чим від трьох донорів. Аденозиндифосфорна кислота (АДФ) (кінцева концентрація 10 µМ) була використана як індуктор агрегації тромбоцитів.

З метою з’ясування молекулярного механізму антиагрегаційної дії RGDF міметиків 32 – 35, 51 – 55 і 70 – 77 проведено вивчення їх впливу на специфічний зв'язок міченого флуоресцеїном фібриногену (FITC-Fg) з його рецептором на суспензії відмитих тромбоцитів людини за методом Xia Z. FITC-Fg, отриманий за методом, описаним Hantgan R., специфічно зв’язується з рецепторами на тромбоцитах з константою дисоціації (Kd), що дорівнює 1.02 µМ. Експериментальні дані свідчать про високий афінітет сполук 32 – 35, 51 – 55 і 70 – 77 до IIb3 (табл. 1).

Введення фенільного замісника в в-положення залишку в-аланіну сполуки 32 практично не вплинуло на афінітет міметика 33 до бIIbв3, але при цьому його антиагрегаційна активність збільшилась майже у 2 рази відносно сполуки 32. Підвищення антиагрегаційної активності міметика 33 можна пояснити збільшенням його ліпофільності, порівнюючи з 32. Аналогічна тенденція просліджується також для пар міметиків 70 і 71, 74 та 75. Біологічна активність сполук, що містять фрагмент ізофталевої кислоти, (міметики 70 та 71) в цілому нижче, ніж активність їх аналогів 32 і 33. Наявність метокси-замісника у пара-положенні фенільного радикала
в-аланінової частини RGDF міметиків 72 та 76 приводить до незначного збільшення афінітету та антиагрегаційної активності цих сполук порівняно з їх аналогами 71 і 75, відповідно. Введення другої метокси-групи в мета-положення бензольного кільця значно збільшило ефективність зв’язування з бIIbв3 та інгібування агрегації тромбоцитів у дослідах in vitro для сполук 73 та 75, порівняно з 71 та 75. Наявність метокси-замісників позитивно впливає на антиагрегаційні властивості RGDF міметиків, припустимо, через утворення водородних зв’язків між рецептором та атомом кисню метокси-групи. Порівнюючи біологічні властивості міметиків 70 – 73, що не мають нітрогрупи у фрагменті ізофталевої кислоти, з їх аналогами 74 – 77, які містять нітрогрупу, можна помітити негативний вплив нітрогрупи на афінітет та антиагрегаційну активність.

Таблиця 1

Біологічна активність RGDF міметиків на основі залишку

1,2,3,4-тетрагідроізохіноліну та RGDS пептиду

№ сполуки | Антиагрегаційна активність у дослідах in vitro на БТП крові людини, IC50, нмоль/л | Інгібування зв’язування FITC-Fg з бIIbв3 на поверхні активованих тромбоцитів людини, IC50, нмоль/л

32 | 30.0 ± 1.6 | 1.20 ± 0.14

33 | 13.0 ± 1.0 | 1.00 ± 0.12

34 | 7.9 ± 0.9 | 0.30 ± 0.05

35 | 8.9 ± 1.1 | 1.00 ± 0.15

51 | 1100.0 ± 100.0 | 22.00 ± 2.00

52 | 14.0 ± 2.0 | 10.50 ± 1.40

53 | 7.8 ± 1.4 | 0.85 ± 1.10

54 | 15.0 ± 1.8 | 9.50 ± 1.50

55 | 6.4 ± 1.1 | 0.80 ± 0.12

70 | 78.0 ± 6.5 | 9.00 ± 0.56

71 | 25.0 ± 1.7 | 1.00 ± 0.41

72 | 17.0 ± 1.6 | 0.80 ± 0.07

73 | 11.6 ± 1.3 | 0.70 ± 0.07

74 | 2300.0 ± 160.0 | 32.00 ± 2.20

75 | 710.0 ± 39.0 | 8.00 ± 0.60

76 | 450.0 ± 41.0 | 5.00 ± 0.40

77 | 340.0 ± 23.0 | 3.70 ± 0.40

RGDS | 31000.0 ± 2000.0 | 13000.00 ± 1600.00

Отримані експериментальні дані з антиагрегаційної активності та інгібування зв’язування FITC-Fg з фібриногеновими рецепторами дозволяють розглядати нові RGDF міметики на основі залишку 1,2,3,4-тетрагідроізохіноліну та в-заміщених в-аланінів як високоактивні інгібітори агрегації тромбоцитів і як антагоністи бIIbв3 рецепторів.

RGDF міметики 34, 55 і 73 проявили максимальний афінітет до бIIbв3 рецепторів на поверхні відмитих тромбоцитів людини та можуть бути запропоновані для подальшого поглибленого вивчення їх біологічних властивостей.

ВИСНОВКИ

1. Вперше показано, що залишки 4-(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл)аміно-4-оксобутанової та 3-[(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл-аміно)карбо-ніл]бензойної кислот є замінниками Arg-Gly-ділянки RGD пептиду, а залишок 1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-карбонової кислоти є біоізос-тером аргінілу. Всі ці залишки можуть бути використані для молекулярного дизайну і є придатними для побудови RGD міметиків – ефективних інгібіторів агрегації тромбоцитів і антагоністів бIIbв3.

2. Встановлено, що введення до молекул RGDF міметиків – похідних
4-оксо-(4-піперазин-1-іл)бутанової кислоти, залишку м-амінобензойної кислоти замість фрагменту Gly приводить до отримання високоактивних інгібіторів агрегації тромбоцитів, що проявляють активність як у дослідах in vitro, так і у дослідах ex vivo.

3. Показано, що молекулярною мішенню RGD міметиків – похідних
4-(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл)аміно-4-оксобутанової, 1,2,3,4-тетра-гідроізохінолін-7-карбонової і 3-[(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл-амі-но)карбоніл]бензойних кислот, є глікопротеїновий комплекс GP IIb/IIIa (бIIbв3).

4. RGD міметики (34, 55 і 73), що проявили максимальний афінітет до бIIbв3 та антиагрегаційну активність, являються перспективними як потенційні антиагреганти.

5. На підставі даних двовимірної спектроскопії ЯМР встановлено, що у розчині DМSО RGDF міметик (4-(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл)аміно-4-оксо-бутаноїл-D-в-феніл-в-аланін) знаходиться переважно у “витягнутій” конформації.

СПИСОК РОБІТ, ЩО ОПУБЛІКОВАНІ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Крысько А.А., Маловичко О.Л., Кабанова Т.А., Мазепа А.В. Синтез и антиагрегационная активность нового RGDF-миметика // Биоорганическая химия. – 2004. – Т. 30, № 6. – С. 594 – 598. (Синтез сполук, участь в обговоренні результатів).

2. Крысько А.А., Андронати С.А., Маловичко О.Л., Кабанова Т.А., Ракипов Э.М. Синтез этилового эфира м-[4-оксо-4-(4-этоксикарбонил-пиперазин-1-ил)бутириламино]бензоил-D,L--(3,4-метилендиоксифенил)--аланина и его антиагрегационная активность при пероральном введении // Доповіді НАН України. – 2005. – № 1. – С. 167 – 170. (Виконання хімічного експерименту, аналіз, трактовка отриманих результатів).

3. Malovichko O.L., Petrus A.S., Krysko A.A., Kabanova T.A., Andronati S.A., Karaseva T.L., Kiriyak A.V. Derivatives of 7-amino-1,2,3,4-tetrahydro-isoquinoline and isophthalic acids as novel fibrinogen receptor antagonists // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. – 2006. – Vol. 16, № 20. – P. 5294 – 5297. (Синтез сполук, участь в обговоренні результатів).

4. Krysko A.A., Malovichko O.L., Andronati S.A., Kabanova T.A., Karaseva T.L., Petrus A.S. Novel fibrinogen receptor antagonists – RGDF mimetics, 4-(1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-7-yl)amino-4-oxobutyric acid derivatives // Medicinal Chemistry. – 2006. – Vol. 2, № 3. – P. 295 – 298. (Синтез сполук, обробка спектральних даних, участь в обговоренні результатів).

5. Крысько А.А., Маловичко О.Л., Петрусь А.С. Синтез нового RGDF-пептидомиметика на основе 4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)бутановой кислоты и остатка м-аминобензойной кислоты // Четверта всеукраїнська наукова конф. студентів і аспірантів “Сучасні проблеми хімії”. – Київ, 2003. – С. 113.

6. Маловичко О.Л., Петрусь А.С., Ракипов Э.М. Синтез новых антагонистов фибриногеновых рецепторов – RGDF-миметиков, производных
4-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино-4-оксо-бутановой кислоты // Міжнародна конф. студентів та аспірантів, присвячена 75-річчю із дня народження академіка О.В. Богатського “Сучасні напрямки розвитку хімії”. – Одеса, 2004. – С. 64.

7. Маловичко О.Л., Петрусь А.С., Ракипов Э.М. Синтез и свойства RGDF миметиков, содержащих остаток м-аминобензойной кислоты // Міжнародна конф. студентів та аспірантів, присвячена 75-річчю із дня народження академіка О.В. Богатського “Сучасні напрямки розвитку хімії”. – Одеса, 2004. – С. 65.

8. Крысько А.А., Маловичко О.Л., Петрусь А.С., Карасёва Т.Л., Кабанова Т.А., Андронати С.А. Синтез и свойства “пролекарств” – производных RGDF миметиков // XX Українська конф. з органічної хімії. – Одеса, 2004. – С. 58.

9. Крысько А.А., Маловичко О.Л., Петрусь А.С., Карасёва Т.Л., Кабанова Т.А., Андронати С.А. Новые антагонисты фибриногеновых рецепторов - RGDF миметики, производные 1,2,3,4-тетрагидроизохинолина // XX Українська конф. з органічної хімії. – Одеса, 2004. – С. 543.

10. Malovichko O.L., Petrus A.S., Krysko A.A., Grishkovets V.I., Andronati S.A., Kabanova T.A. Novel fibrinogen receptor antagonists based on 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-7-carboxylic acid // International conf. chemistry of nitrogen containing heterocycles (CNCH – 2006). – Kharkiv, 2006. – P. 30.

11. Malovichko O.L., Petrus A.S., Krysko A.A., Kabanova T.A., Andronati S.A. Derivatives of 7-amino-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline and isophtalic acid – novel fibrinogen receptor antagonists // International conf. chemistry of nitrogen containing heterocycles (CNCH – 2006). – Kharkiv, 2006. – P. 238.

12. Маловичко О.Л., Петрусь А.С., Ракипов И.М., Крысько А.А. Производные 7-амино-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина и изофталевых кислот – новые антагонисты фибриногеновых рецепторов // ІХ конф. молодих вчених та студентів-хіміків Південного регіону України. – Одеса, 2006. – С. 20.

АНОТАЦІЯ

Маловічко О.Л. Синтез та властивості RGD міметиків на основі азотовмісних гетероциклів. Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.10 – біоорганічна хімія. Фізико-хімічний інститут
ім. О.В. Богатського НАН України, Одеса, 2007.

Робота присвячена синтезу та вивченню властивостей RGDF міметиків, які містять фрагменти 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової, 4-(1,2,3,4-тетра-гідроізохінолін-7-іл-аміно)-4-оксобутанової, 1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-карбонової, 3-[(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл-аміно)карбоніл]бензойних кислот і в-арил-в-аланінів.

Синтезовано новий RGDF пептидоміметик - 3-[4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутириламіно]бензоїл-D,L--(3,4-метилендіоксифеніл)--аланін, який має високу антиагрегаційну активність in vitro (IC50 = 3.5.10-8 М). На його основі отримано “подвійний пролік” (ex vivo антиагрегаційна активність, ID50 = 0.22 мг/кг).

Вперше запропоновано для молекулярного дизайну RGDF міметиків залишки 4-(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл-аміно)-4-оксобутанової і
3-[(1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-7-іл-аміно)карбоніл]бензойної кислот як замінники Arg-Gly-ділянки RGD пептиду, та залишок 1,2,3,4-тетрагідроізо-хінолін-7-карбонової кислоти, як біоізостер аргінілу. Синтезовані на їх основі RGDF міметики є ефективними антагоністами бIIbв3 (IC50 ~ 10-8 – 10-10 М).

Встановлено, що молекулярною мішенню синтезованих RGDF міметиків є глікопротеїновий комплекс GP IIb/IIIa (бIIbв3).

Вищенаведені показники антиагрегаційної активності і афінітету дозволяють розглядати нові RGDF міметики, похідні 1,2,3,4-тетрагідро-ізохіноліну, як потенційні сильнодіючі антиагрегаційні препарати.

Ключові слова: RGDF міметики, 1,2,3,4-тетрагідроізохінолін, піперазин, агрегація тромбоцитів, бIIbв3.

АННОТАЦИЯ

Маловичко О.Л. Синтез и свойства RGD миметиков на основе азотсодержащих гетероциклов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.10 – биоорганическая химия. Физико-химический институт им. А.В. Богатского НАН Украины, Одесса, 2007.

Работа посвящена синтезу и изучению свойств RGDF миметиков, содержащих фрагменты 4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)бутановой, 4-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил-амино)-4-оксобутановой, 1,2,3,4-тетрагидроизо-хинолин-7-карбоновой, 3-[(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил-амино)кар-бонил]бензойных кислот и в-арил-в-аланинов.

Синтезирован новый RGDF пептидомиметик, содержащий в качестве биоизостера фрагмента Arg остаток 4-оксо-(4-пиперазин-1-ил)бутановой кислоты, а также фрагмент м-аминобензойной кислоты и остаток D,L--(3,4-метилендиоксифенил)--аланина. Синтезированный RGDF миметик –
3-[4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)бутириламино]бензоил-D,L--(3,4-метилендиок-сифенил)--аланин обладал способностью ингибировать агрегацию тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме крови человека, вызванную AДФ, с IC50 = 3.5.10-8 М. С целью получения соединения, обладающего повышенной биодоступностью при пероральном введении, синтезировано “двойное пролекарство” - 3-[4-оксо-4-(4-этоксикарбонилпиперазин-1-ил)бутириламино]бензоил-D,L--(3,4-метилендиоксифенил)--аланин, кото-рое в опытах ex vivo проявило высокую антиагрегационную активность с показателем ID50 = 0.22 мг/кг.

Впервые предложены для молекулярного дизайна RGDF миметиков остатки 4-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил-амино)-4-оксобутановой и
3-[(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил-амино)карбонил]бензойной кислот как заменители Arg-Gly-участка RGD пептида. Синтезированные RGDF миметики, производные 4-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил-амино)-4-оксобутановой или 3-[(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил-амино)карбо-нил]бензойных кислот, проявили высокую антиагрегационную активность в опытах in vitro на богатой тромбоцитами плазме крови человека с IC50 в пределах 10-7 – 10-9 М.

Предложена новая методика синтеза 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-карбоновой кислоты и впервые на ее основе получен ряд RGDF миметиков, которые обладают высокими антиагрегационными свойствами (IC50 в пределах 10-8 – 10-10 М).

Установлено, что молекулярной мишенью RGDF миметиков – производных 4-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино-4-оксобутановой, 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-карбоновой и 3-[(1,2,3,4-тетрагидроизохи-нолин-7-ил-амино)карбонил]бензойных кислот, является гликопротеиновый комплекс GP IIb/IIIa (бIIbв3), расположенный на поверхности активированных тромбоцитов человека. Полученные RGDF миметики ингибировали специфическое связывание флуоресцеин-меченого фибриногена с его рецеп-тором бIIbв3 со значениями IC50, находящимися в пределах 10-8 – 10-10 М.

Изучены двумерные спектры ПМР (COSY, TOCSY и NOESY) высоко-активного RGDF миметика - 4-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)амино-4-оксобутаноил-D-в-фенил-в-аланина. На основании данных спектроскопии NOESY можно предположить, что данный RGDF миметик в растворе DMSО пребывает в “вытянутой” конформации.

Данные эксперимента по изучению антиагрегационной активности и ингибированию связывания FITC-Fg с фибриногеновыми рецепторами позволяют рассматривать новые RGDF миметики, производные 1,2,3,4-тетрагидроизохинолина, как потенциальные сильнодействующие антиагрегационные препараты.

Ключевые слова: RGDF миметики, 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин, пиперазин, агрегация тромбоцитов, бIIbв3.

SUMMARY

Malovichko O.L. Synthesis and properties of RGD mimetics based on nitrogen containing heterocycles. – The manuscript

Thesis for a candidate’s degree in Chemical Sciences on speciality 02.00.10 – bioorganic chemistry. A.V. Bogatsky Physico-Chemical Institute of National Academy of Sciences of Ukraine, Odessa, 2007.

The work concerns synthesis and study of properties of RGDF mimetics containing the fragments of 4-oxo-4-(piperazine-1-yl)butyric, 4-(1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-7-yl-amino)-4-oxobutyric, 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-7-carboxylic, 3-[(1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-7-yl-amino)carbonyl]benzoic acids and в-aryl-в-alanines.

It has been synthesized the novel RGDF peptidomimetic, 3-[4-oxo-4-(piperazine-1-yl)butyrylamino]benzoyl-D,L-в-(3,4-methylenedioxyphenyl)-в-alanine, which has demonstrated a high in vitro antiaggregative activity
(IC50 = 3.5.10-8 M). On the base of this mimetic, it has been synthesized the “double prodrug” (ex vivo antiaggregative activity, ID50 = 0.22 mg/kg).

For the first time, the residues of 4-(1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-7-yl-amino)-4-oxobutyric and 3-[(1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-7-yl-amino)carbo-nyl]benzoic acids have been proposed for molecular design of RGDF mimetics as surrogates of RGD peptide Arg-Gly moiety, and 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-7-carboxylic acid residue – as arginyl bioisostere. RGDF mimetics synthesized on their base are potent бIIbв3 antagonists (10-8– 10-10 M).

It has been established that glycoprotein complex GP IIb/IIIa (бIIbв3) is a molecular target for the synthesized mimetics.

Above mentioned indexes for the antiaggregative activity and affinity allow to consider the novel RGDF mimetics, 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline derivatives, as prospective potent antiaggregative agents.

Key words: RGDF mimetics, 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline, piperazine, platelets aggregation, бIIbв3.