КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ Університет

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Міхєєв Олександр Миколайович

УДК 581.1.03

Надклітинні механізми онтогенетичної

радіоадаптації у рослИн

03.00.01 - радіобіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України.

Науковий консультант:

доктор біологічних наук, професор, академік НАН України, Гродзинський Дмитро Михайлович,

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, завідувач відділу біофізики і радіобіології.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

Войціцький Володимир Михайлович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

професор кафедри біохімії;

доктор біологічних наук

Дружина Микола Олександрович,

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології

ім. Р.Є. Кавецького НАН України, завідувач відділу радіобіології;

доктор біологічних наук, професор

Кузьменко Михайло Ілліч,

Інститут гідробіології НАН України, провідний науковий співробітник відділу радіоекології.

Провідна установа: - Національний аграрний університет, м. Київ.

Захист відбудеться 25.06. 2007 р. о _14___ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м. Київ, просп. академіка Глушкова, 2, корп. 2, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий 18.05. 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Одним з головних напрямів сучасної біології є дослідження стійкості біологічних об'єктів до дії екстремальних чинників навколишнього середовища – екстремально низьких і високих температур, посухи, кисневого голодування, важких металів, іонізуючої радіації тощо (Кордюм Є.Л. та ін., 2003; Косаківська І.В., 2003). У біології стійкості рослин цей напрямок стимулюється практичною необхідністю отримання високих урожаїв сільськогосподарських культур в зонах ризикованого землеробства, на ґрунтах низької агрохімічної якості або в майбутніх умовах глобального потепління. Особливу актуальність в зв'язку з цим набувають дослідження способів управління радіостійкістю біологічних об'єктів після аварії на Чорнобильській АЕС. З цією метою, окрім застосування агротехнічних і хімічних засобів захисту рослин від різноманітних несприятливих чинників, селекційно-генетичних і генно-інженерних методів отримання стійких сортів рослин, можна використовувати фізіологічні (епігенетичні, фенотипічні) способи підвищення стійкості рослин до дії екстремальних факторів.

Практично вся проблематика теорії і практики стійкості біологічних об'єктів до екстремальних дій зосереджена навколо питання про суть і механізм стресу взагалі і радіаційного стресу зокрема. Найбільша складність при вирішенні цієї проблеми виникає відносно рослинних об'єктів, на що вказує наявність парадоксальної ситуації у галузі фізіології стійкості рослин. Суть її полягає у тому, що при широкому вживанні терміну "стрес", введеного в науковий ужиток Гансом Сельє, в літературі практично не звертається уваги на неможливість безпосереднього (практичного) використання традиційного визначення поняття "стрес" для опису феномена стресу у рослин. Це пояснюється дуже великим ступенем абстрактності запропонованого визначення і наявністю специфічних ознак реакцій рослин на екстремальні дії.

Достатньо проблем виникає також при інтерпретації даних, отриманих в експериментах, в яких не ставиться прямо завдання отримання ефекту загартовування рослин, тобто при спробах описати багатоетапні процеси реагування біологічних об'єктів на будь-які модифікуючі дії. Проте, незважаючи на вказані вище труднощі, дане Г. Сельє визначення стресу внаслідок достатньо високого ступеня його абстрактності обумовлює високий рівень його евристичності, що дозволяє виявляти універсальні елементи в механізмах реагування біологічних об'єктів на дію екстремальних чинників в будь-яких дозах, включаючи ті, що зумовлюють адаптацію. Зокрема, з'являється можливість і необхідність вивчити особливості багатоетапного процесу реагування рослинних об'єктів на весь спектр доз і потужностей можливих екстремальних впливів. Очевидним також є необхідність дослідження багаторівневих механізмів адаптації на противагу спробам зведення їх тільки до внутрішньоклітинних механізмів відновлення. Поза сумнівом, що в процесі адаптації беруть участь і інші системи відновлення – клітинно-репопуляційні, регенераційні, репопуляційні процеси на рівні популяцій та ін.

Все окреслене вище зумовило актуальність і необхідність вивчення особливостей прояву ефектів стимуляції (гормезису) у рослинних об'єктах на різних рівнях їх інтеграції. Важливим також було підтвердження прямого зв’язку стимуляційних процесів з адаптивними і, зокрема, радіоадаптивними процесами. Актуальним є також вивчення стимуляційних процесів за такими параметрами як здатність рослинних структур до поглинання радіонуклідів, що допомогло б суттєво підвищити ефективність технології фітодезактивації природних і техногенних середовищ від радіонуклідного забруднення, зокрема чорнобильського походження.

Необхідність створення несуперечливої концепції радіоадаптивної відповіді зумовила, в свою чергу, необхідність дослідження фазності реакцій (структури перехідних процесів), що індукуються екстремальними впливами, встановити їх зв'язок з типами адаптивної відповіді, а також показати роль надклітинних механізмів в адаптивній відповіді та з’ясувати можливість використання адаптуючих впливів як таких, що здатні зменшувати рівень радіаційного інгібування при застосуванні в післярадіаційному періоді.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відділі біофізики і радіобіології Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України відповідно до тем наукових досліджень, які проводилися в Інституті:

1. "Хронічне опромінювання рослин як чинник формування нестабільності геному" (1998-2002 рр., № д. р. 0101U0000349).

2. "Оцінка граничної радіоємності і екологічної стійкості типових екосистем України по відношенню до різних антропогенних навантажень" (1998-2002 рр., № д. р. 0103U005694).

3 "Регуляторні і сигнальні механізми адаптивної відповіді" (2002 -2007 рр., № д. р. 0103U005729).

Мета і завдання дослідження. Головна мета дисертаційної роботи полягала у вивченні можливої ролі надклітинних механізмів у забезпеченні стану радіоадаптованості рослинних об’єктів. Принциповий аспект проблеми стресових станів біологічних об'єктів пов'язаний з багаторівневістю їх структурно-функціональній організації, що дозволяє припустити існування багаторівневої системи, що забезпечує багаторівневі механізми адаптивних реакцій. Доказу останнього присвячена основна частина дисертаційної роботи. Необхідність застосування такого підходу обумовлена численними і не завжди вдалими спробами звести все різноманіття механізмів адаптивних реакцій лише до механізмів, що функціонують на внутріклітинному рівні, наприклад, така тенденція простежується в спробах зведення механізмів стресових реакцій лише до механізму індукції синтезу білків теплового шоку. При цьому не враховується наявність і можливості ієрархічної організації біологічного об'єкта, кожен структурно-функціональний рівень якого (клітина, тканина, орган тощо.), мабуть, здатний у відповідних умовах забезпечити умови для адаптивної відповіді всієї системи за рахунок функціонування багаторівневих індуцибельних або стимульованих систем відновлення.

Дослідженням передбачалося вирішення таких задач:

вивчити особливості прояву ефектів стимуляції (гормезису) у рослинних об'єктів.

з’ясувати можливість стимулювати чинниками різної природи (фізичними, хімічними та радіаційними) накопичення рослинними тканинами радіонуклідів.

вивчити прояв радіоадаптивних реакцій на різних рівнях інтеграції рослинних об'єктів.

дослідити структуру перехідних процесів, індукованих/стимульованих екстремальними впливами і встановити їх зв'язок з типами адаптивної відповіді (власне адаптація або дезадаптація).

вивчити надклітинні механізми радіоадаптивної відповіді.

встановити можливості радіотерапевтичної дії іонізуючого випромінювання в дозах, що відповідають адаптуючим.

Об'єкт дослідження – особливості гормезисної і радіоадаптивної відповідей на різних рівнях інтеграції рослинного організму, їх часова залежність, ступінь специфічності адаптуючого впливу та роль послідовності дії адаптуючих і тестуючих доз.

Предмет дослідження – рослинні тест-системи різних рівнів інтеграції, динаміка формування дозових навантажень від інкорпорованих радіонуклідів.

Методи дослідження –

разове та хронічне опромінення (зовнішнє і внутрішнє) різними дозами іонізуючої радіації, обробка рослин розчинами важких металів, гіпертермічний і механічний впливи - способи забезпечення адаптуючих і тестуючих впливів;

фізіологічні, цито- і гістологічні методи;

для вивчення радіоадаптивної відповіді запропоновано принципово новий метод, що дозволив безконтактним (без пошкодження рослин) способом швидко отримувати інформацію про інтегральний стан рослини та її органів після дії адаптуючих і тестуючих доз - метод залишкової радіоактивності, що оснований на вимірюванні поточної радіоактивності культурального середовища в процесі інкубації на ньому рослинних об'єктів;

методи математичного планування експерименту для оптимального планування схем дослідів, а також для отримання кількісних оцінок окремої і поєднаної дії чинників;

сцинтиляційні і спектрометричні методи визначення радіонуклідів в компонентах рослинних систем і середовищах їх існування;

авторська розробка методу розрахунку доз внутрішнього опромінювання рослинних тканин від інкорпорованих радіонуклідів.

Наукова новизна одержаних результатів. На основі теоретичного положення щодо можливості визначального зв’язку стану адаптації біологічних систем зі станом їх стимульованості та існування багаторівневих механізмів радіоадаптивної відповіді вивчено ефекти гормезисної дії разового та хронічного опромінення з урахуванням характеру розподілу радіоактивності в критичних тканинах рослин. Виявлено відмінності ізоефективних питомих активностей 137Cs і 90Sr, що пояснюється різними значеннями коефіцієнтів накопичення цих радіонуклідів кореневою системою проростків і різними ділянками кореня, в яких відбувається переважне накопичення радіоізотопів. Виявлена вертикальна гетерогенність розподілу радіоцезію в головному корені проростків дозволила істотно підвищити точність розрахунків величини поглинених меристемою кореня доз від інкорпорованого радіоцезію. Встановлено подібний характер розподілу радіоцезію по зонах кореня проростків, що культивувались в умовах водної і ґрунтової культур. Показано, що коефіцієнт накопичення радіоцезію в меристематичній зоні головного кореня проростків досягав декількох десятків тисяч одиниць, що вказувало на формування своєрідних біологічних "гарячих частинок" в апікальних кореневих меристемах.

Встановлено, що стимуляцію (гормезис) слід розглядати як одну з фаз реакції біологічного об'єкта на пошкоджуючу дію чинника. Для стимуляції є характерним транзитивний характер і відносність за параметрами. Фазі стимуляції передує період інгібування функціональної (ростовою, проліферативної тощо) активності, що дає підставу розглядати її як результат надвідновлювального процесу.

Для експериментального вивчення явища радіоадаптації розроблено метод реєстрації стану біологічних об'єктів в умовах разової або хронічної дії стресорів - метод визначення залишкової радіоактивності, який базується на вимірюванні поточної радіоактивності культурального середовища в процесі інкубації на ньому рослинних об'єктів. Запропонований метод дозволив оцінити в динаміці інтегральний стан кореневої системи, що була опромінена в стимулюючих та інгібуючих дозах гамма-випромінювання.

Встановлено, що радіоадаптивна відповідь спостерігається в момент, коли під впливом адаптуючої дози біологічний об'єкт знаходиться в стані стимуляції (надвідновлення). Застосування тест-опромінення в момент стимуляції ростових параметрів (швидкості росту, утворення бічних коренів тощо) виявило їх суттєво підвищену радіорезистентність в порівнянні з радіорезистентністю проростків, які не зазнали стимулюючого впливу. Подібність динаміки реагування адаптованих і неадаптованих рослин на дію іонізуючої радіації підтвердила припущення про принципову незмінність механізмів реагування адаптованих рослин. У адаптивній відповіді задіяні ендогенні механізми, які під впливом екзогенних чинників підсилюють або послабляють свій вплив на кінцевий результат реагування.

Механізми адаптації, в основі яких лежать надвідновлювальні (гіперкомпенсаторні) процеси, є універсальними для будь-якого рівня інтеграції біологічних об’єктів. Онтогенетична адаптація - це процес досягнення стану і сам стан біологічного об'єкту, що є фазою надвідновлення реакції відповіді, яка індукується надпороговим рівнем дії будь-якого чинника. В цій фазі збільшується рівень початкової стійкості об'єкта до повторної дії того ж або іншого чинника (перехресна або множинна адаптація). Параметри онтогенетичної адаптації змінюються в просторово-часових координатах; тривалість онтогенетичної адаптації визначається тривалістю фази стимуляції (надвідновлення).

Показано існування багаторівневої системи відновлення, яка, при відповідних дозах стрес-фактора, реалізується у вигляді багаторівневої системи надвідновлення і яка, у свою чергу, є основою багаторівневих адаптаційних механізмів. Встановлено визначальну роль стимуляції клітинної проліферації в забезпеченні адаптивної відповіді рослин при дії хронічного опромінення та регенерації в забезпеченні адаптивної відповіді декапітованих проростків на дію гострого гамма-випромінювання.

В дослідах з декапітованими проростками встановлені факти незмінності розміру клітин меристеми, її вищий мітотичний індекс і більший об'єм, відсутність ефекту фракціонування дози гострого опромінення і збільшення плеча на дозовій кривій залежності ростових параметрів бічних коренів декапітованих проростків дали підстави зробити висновок щодо існування надклітинних механізмів радіоадаптації в умовах стимуляції клітинно-репопуляційних і регенераційних процесів, що забезпечують рослинний об'єкт додатковим числом реагуючих елементів.

Показано існування відносної часової симетричності сумісної дії двох чинників, один з яких є радіоадаптуючим. Це означає можливість застосування радіоадаптуючого впливу не тільки як профілактичного засобу, внаслідок чого підвищується вихідний рівень радіоадаптованості, але і можливість застосування радіоадаптуючих доз як терапевтичних, тобто таких, які знижують рівень радіаційного пригнічення при застосуванні у післярадіаційному періоді.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані експериментальні і концептуальні результати дозволять прогнозувати наслідки дії різних за своєю природою екстремальних для біологічних об'єктів чинників та розробляти методи і методики терапевтичного впливу адаптуючих доз чинників, на основі їх прямих (адаптуючих, профілактичних) ефектів.

Встановлені надклітинні механізми радіоадаптивної відповіді рослинних об’єктів дозволяють суттєво розширити діапазон радіоадаптуючих (і взагалі адаптуючих) доз, що, в свою чергу, означатиме створення можливостей для більш повної реалізації потенціалу онтогенетичної (епігенетичної) адаптації.

На основі даних про можливість керування (зокрема підсилення) процесом нагромадження радіонуклідів рослинними структурами запропоновано новий метод очищення водних середовищ, забруднених радіонуклідами, заснований на використанні значної поглинальної здатності кореневої системи наземних рослин в умовах водної культури. Запропонований спосіб був випробуваний у лабораторних умовах і в умовах натурного експерименту в 10-км зоні ЧАЕС. Метод виявився ефективним для очищення води від радіостронцію і радіоцезію. Показана ефективність відповідно адаптованого методу для деконтамінації радіонуклідних забруднень ґрунтів.

Розкриття механізмів стійкості біологічних об'єктів може бути основою при побудові загальної теорії їх онтогенезу, в створенні концептуальної або математичної моделі їх функціонування в нормальних і екстремальних умовах. Окрім цього, вирішення проблеми стійкості різних структурно-функціональних рівнів організації біосистем матиме і загальнобіологічне значення, оскільки в ній сконцентровані практично всі основні питання фізіології, біохімії, молекулярної біології та інших біологічних дисциплін – проблеми онтогенезу (морфо- і функціогенезу), старіння, канцерогенезу, регуляції генної і епігеномної активності тощо.

Особистий внесок здобувача. Особистим внеском здобувача є розробка концепції проведення наукових досліджень, формулювання мети роботи, аналіз літературних даних з цього питання, збір експериментального матеріалу, його обробка і узагальнення отриманих результатів формулювання висновків, написання наукових публікацій за темою дисертаційної роботи. Впродовж 1987-2006 рр. здобувач здійснив низку польових експериментів на експериментальних радіоекологічних полігонах в Зоні відчуження ЧАЕС. У наукових працях, опублікованих у співавторстві, дисертантом представлені експериментальні результати власних досліджень, їх математичне опрацювання, за участю співавторів зроблено теоретичний аналіз.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи були представлені на:

Всесоюзной конференции "Культура клеток растений, III Всесоюзная конференция" (Абовян, 1979); Первой Всесоюзной конференции по с.-х. радиологии (Обнинск, 1979); Всесоюзной конференции "Биологические аспекты изучения рационального использования животного и растительного мира" (Рига, 1981); Второй Всесоюзной конференции по прикладной радиобиологии (Киев, 1985); Первом Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва, 1989); Annual Meeting of International Union of Radioecology and Workshop on "Microbial Aspects in Radioecological Research" (Udine, Italy, 1993); 3-м съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 1997); Науково-практичній конференції з радіаційної гігієни (радіаційна гігієна, радіоекологія, радіобіологія, радіаційна медицина) (Київ, 2000); International Conference "Modern Problems of Radiobiology, Radioecology and Eevolution", dedicated to centurary of N. W. Timofeeff-Ressovsky (Dubna, Russia, 2000); 4-м съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2001); NATO Advanced Research Workshop "Ecological standardization and equidosimetry for radioecology and environmental ecology" (Kiev, 2002); 3-му з'їзді з радіаційних досліджень (радіобіологія, радіоекологія) (Київ, 2003); Міжнародній науково-практичній конференції "Екологічна безпека об'єктів господарської діяльності" (Миколаїв, 2004); 33rd Annual Meeting of European Society for Radiation Biology – European Radiation Research 2004 (Budapest, Hungary, 2004); Науково-практичній конференції "Парадигми сучасної радіобіології. Радіаційний захист персоналу об'єктів атомної енергетики" (Київ – Чорнобиль, 2004); Міжнародній конференції "Радіобіологічні ефекти: ризики, мінімізація, прогноз" (Київ, 2005); Междкнародной конференции "Радиоактивность после ядерних взрывов и аварий" (Москва, 2005); 5-м съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2006); Міжнародній науково-практична конференції "Ольвійській форум 2006: Пріоритети України в геополітичному просторі" (Ялта, 2006); 35-ій щорічній конференції Європейського суспільства з радіаційних досліджень та 4-ій конференції радіобіологічного товариства України (Київ, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 47 роботи, з яких 23 роботи у виданнях, що визнані ВАК України як фахові.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 337 сторінках друкованого тексту, складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, 4 розділів власних досліджень з обговоренням і узагальненням отриманих результатів, висновків і списку використаної літератури. Текст ілюстровано 72 рисунками і 8 таблицями. Список використаних літературних джерел включає 428 найменувань.

ОСНОВНІЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методИ досліджень

Визначення ростових характеристик проростків, що піддавалися різноманітним стресуючим впливам. Основні дослідження здійснювали на проростках і насінні різноманітних сортів гороху посівного. Крім того, досліди проводили на деяких злакових культурах (зокрема, проростках і насінні кукурудзи і пшениці).

Замочування, пророщування насіння і культивування проростків проводили на воді з водогону при температурі 22   С. До 3-добового віку проростки знаходились в темряві в кюветах, після чого їх переносили в умови водної культури і продовжували культивування в кліматичній камері при освітленості 2286  і темносвітловому циклі: 16 год світла + 8 год темряви. Експерименти проводилися на проростках, що були синхронізовані за частотою появи пагонів і коренів певної довжини.

Найчастіше вживаним методом впливу на досліджувані об’єкти було гостре гамма-опромінення проростків з допомогою гамма-установки “ИССЛЕДОВАТЕЛЬ” при потужності від 2,0 до 20 сГр/с. Для дослідів з високими рівнями доз використовували гамма-установку “УК-250000” з потужністю випромінювання до 10 Гр/с. Для створення умов дії хронічного опромінення застосовували або штучно забруднені розчином 137CsCl ґрунти, або використовували спеціально сконструйоване міні-гамма-поле з радіусом 30 см, у центрі якого розташовували пробірку з водним розчином 137CsCl. Ще одним методом створення умов хронічного опромінення було вирощування проростків на водних розчинах 137CsCl. Поглинуті дози розраховували на підставі даних щодо поглинальної активності різних частин проростків. Вимірювання питомої активності рослинного матеріалу здійснювали з допомогою сцинтіляційного лічильника “1211 RAKBETA”.

Методи роботи з одноклітинними організмами. Дослідження радіобіологічних реакцій одноклітинних об’єктів проводили на культурі кишкової палички Escherichia coli JM 101 та культурі синьо-зеленої водорості Anabaena cylindrica. Бактерії вирощували на середовищі LB. Для оцінки дії гострого гамма-випромінювання на бактерії водну суспензію 24-год культури бактерій опромінювали на установці "ИССЛЕДОВАТЕЛЬ " в діапазоні доз від 0,63 до 100 Гр при потужності дози 4,0 сГр/с. Виживаність опромінених бактерій оцінювали методом макроколоній.

Культуру Anabaena cylindrica, вирощену на середовищі Дрью, опромінювали в дозах 4000 Гр при потужності 0,08 Гр/с і висівали на непоживний агар. Через добу після опромінення під мікроскопом проглядали препарати, фіксуючи в них інтерфазно (метаболічно) загиблі клітини.

Метод визначення залишкової радіоактивності. Розроблена оригінальна методика, що дозволила визначати поточний стан рослин та їх окремих органів в нормі і при дії різноманітних стресорів. Ідея методу полягає в тому, щоб використовувати ізотоп 137Cs для визначення сорбційної активності рослинних об'єктів за часткою (відсотком) радіоактивності, яка залишається в культуральному середовищі після інкубації в ньому проростків. Експериментальною підставою цього методу були встановлені факти прямого зв'язку стану рослинного об'єкту з його поглинальною здатністю (Костюк, Міхєєв, Гродзинський, Кутлахмедов, 1993).

Проростки розміщували в 0,5 л судинах з радіоактивним культуральним середовищем, питома активність якого по 137Cs складала 400 кБк/л. Періодично відбирали проби води. Активність визначали на сцинтиляційному лічильнику “1211 RACKBETA”.

Вивчали також вертикальний розподіл 137Cs i 90Sr по довжині головного коріння. З цією метою після 5 діб інкубації проростків гороху у водному розчині солей радіоцезію (137CsCl) і радіостронцію (90SrNО3) з питомою активністю відповідно 296 і 1700 кБк/л, головне коріння розрізали по всій довжині на 5-мм сегменти, зважували і вимірювали сумарну активність кожного сегменту. Одержані оцінки поглинальної активності далі використовували для побудови дозових і часових залежностей. Обчислення поглинених доз здійснювали за формулою, запропонованою О.О. Моїсєєвим і В.І. Івановим (1990).

Зразки радіоактивних ґрунтів і рослин аналізували на гамма-спектрометрі АМА-ОЗФ з детектором ДГДК-100 В-3.

Методи визначення характеристик апікальних меристем коріння проростків. Відбирали зразки кореневих апексів, в яких за стандартною методикою визначали мітотичну активність меристематичних клітин (Паушева,1988). В кожному препараті підраховували 500–600 клітин і визначали відсоток клітин, що діляться – мітотичний індекс (МІ).

У експериментах з дослідження радіомодифікуючої ролі декапітації головного коріння, по-перше, визначали МІ клітин апікальних меристем бічного коріння (АМБК) і, по-друге. визначали розмір клітин АМБК та їх геометричний об'єм. Тимчасові препарати, одержані за описаною вище методикою, після підрахунку МІ фотографували під мікроскопом за допомогою цифрової фотокамери. Застосувавши програму для кількісного аналізу комп'ютерних зображень, визначали лінійні розміри клітин. Об'єм АМБК визначали з допомогою фарбування метиленовим синім і вимірювання за допомогою окуляр-мікрометра довжини меристематичної зони, її мінімальний і максимальний радіуси. Далі, використовували формулу для розрахунку об'єму зрізаного конуса: V = h * р (R2 + Rr + r2) /3, де: h – висота конуса, R – великий радіус, r – малий радіус.

Методи математичного планування експерименту. Окрім комплексу стандартних методів графічної, математичної і статистичної обробки отриманих даних, застосували один з методів математичного планування експерименту, а саме метод повного факторного експерименту (ПФЕ).

Реалізація процедури ПФЕ зводиться до знаходження числових значень регресійного рівняння, що описує зв'язок параметрів відгуку системи з діючими чинниками. У загальному вигляді це рівняння можна записати так:

n n

Y = B0 +УBiXi, + УBijXij + …

i=1 i,j=1

де Xi,Xj, - змінні (чинники, фактори), Bi,Bj – коефіцієнти регресії при відповідних змінних. Коефіцієнти регресії дозволяють кількісно оцінити як незалежний внесок кожного чинника, так і ефекти їх сумісної дії. Експеримент, в якому реалізуються всі можливі поєднання рівнів чинників, називається повним факторним експериментом.

Експериментальні схеми вивчення радіоадаптивної відповіді. В більшості випадків вивчення радіоадативної відповіді використано загальноприйняту методику, коли об'єкт підпадає під модифікуючий вплив в певній дозі діючого чинника і через певний часовий інтервал (Дt) застосовується тест-опромінення (дест-доза) з метою визначення спрямованості і ступеня зміни вихідного стану радіорезистентності об'єкта, що вивчається. У наших дослідах Дt варіював від декількох годин до декількох діб, що було обумовлено необхідністю індукції різних типів механізмів радіоадаптивної відповіді. Зокрема, передбачалось, що при годинних інтервалах між адаптуючою дозою (АД) і тестуючою дозою (ТД) будуть індукуватись сублітинні (наприклад, репараційні) механізми радіоадаптації, а при добових – надклітинні. Ще однією особливістю наших експериментів було те, що при застосуванні адаптуючої дози на сухе насіння, вона перевищувала тестуючу дозу, яка застосовувалася по відношенню до проростків.

Результати досліджень та їх обговорення

Стимуляція як основа адаптуючої дії факторів.

Феноменологія стимулюючої дії гострого гамма-опромінювання. Розглянемо спочатку прояви стимулюючої (гормезисної) дії іонізуючого випромінювання, звертаючи більш детально увагу на явище радіаційного гормезису. Логічно було почати дослідження радіаційних гормезисних ефектів на простих біологічних об'єктах. Ми вибрали для цього E. coli як одноклітинний організм, добре вивчений в радіобіологічному відношенні. Ефект радіостимуляції спостерігали для дози опромінювання 0,6 Гр (рис. 1). Видно, що ефект стимуляції був тимчасовим (транзитивним) і починався з деякого інгібування проліферативної активності, що дає підставу розглядати його як результат гіперкомпенсаторного

Рис. 1. Динаміка числа клітин E. coli, які були опромінені в дозі 0,6 Гр

процесу, тобто процесу, якому передують певні радіаційно-стимульовані інгібувальні (в окремому випадку деградаційні) процеси.

Щоб проілюструвати думку про різноманіття форм прояву гормезисного ефекту у рослинних об'єктів і для демонстрації складної картини розвитку цього процесу в часі були проведені експерименти щодо дослідження радіоадаптивної відповіді при опромінюванні насіння гороху. Результати цих досліджень представлені на рис. 2.

Рис. 2. Динаміка довжини головного кореня проростків при дії гострого гамма-опромінення насіння гороху в дозі 10 Гр на

Зрозуміло, ефект опромінювання значною мірою залежить від стану опромінюваного об'єкту, про що свідчать результати, представлені на рис. 3.

Для ілюстрації різноманіття радіогормезисних ефектів наводимо дані рис. 4 з яких видно, що можлива одночасна різноспрямованість дії опромінювання, коли суттєва радіаційна стимуляція (радіогормезис) спостерігається лише за деякими параметрами.

Рис. 3. Залежність довжини головного кореня тридобових проростків гороху від дози гострого гамма-опромінення насіння після різних термінів їх намочування | Рис. 4. Вплив опромінення проростків гороху у віці 7 діб на утворення коренів у ізольованих відразу після опромінення стебел

Вплив випромінювання від інкорпорованих радіонуклідів на ростові характеристики проростків гороху. Прояв гормезисної дії іонізуючого випромінювання можливий не тільки при зовнішньому, але і при внутрішньому випромінюванні від інкорпорованих в біологічні тканини радіоізотопів. Дане явище було вивчене нами в дослідах з солями 90Sr і 137Cs, вибір яких був зумовлений тим, що вони є основними дозоутворюючими радіонуклідами у післячорнобильському періоді.

Дію інкорпорованих радіонуклідів на ростову активність органів рослин вивчали в умовах водної культури проростків гороху і кукурудзи. Динаміка цього процесу представлена на рис. 5-7. Видно чіткі ефекти стимуляції росту коріння і стебел. Для відносно малих питомих активностей піки стимуляції виявлялися пізніше, ніж для більш високих активностей.

Рис. 5. Вплив 137CsCl на швидкість росту коренів проростків гороху в умовах водної культури | Рис. 6. Вплив 137CsCl на швидкість росту стебел проростків гороху в умовах водної культури

При високих питомих радіоактивностях 137Cs (1,5Ч106 та 2,1Ч106 Бк/л) криві швидкості росту коріння втрачали коливальний характер і набували форму, характерну для кривих, що отримують при гострому зовнішньому гамма-опромінюванні в інгібуючих дозах. Проте криві, одержані в експериментах з радіонуклідами, характеризуються значним піком стимуляції в перші дні інкубації проростків в присутності радіонуклідів. Лише на 4-5 добу швидкість росту в досліді різко знижувалася, практично досягаючи нульових значень на 8-10 добу і далі не відновлювалася. Ймовірно, що в ході інкубації проростків формування поглиненої дози, що призводить до загибелі меристематичних клітин, розтягнуте в часі і залежить від початкової питомої активності розчину. Проростки, фактично, поступово по мірі накопичення радіонуклідів проходять весь діючий дозовий діапазон, починаючи від нейтральних доз, через, ті, що стимулюють (гормезисні), і закінчуючи дозами, що інгібують і нарешті - летальними.

Рис. 7. Вплив 90SrNO3 на швидкість росту коріння гороху в умовах водної культури

Результати вивчення накопичення 137Cs в корінні і стеблах проростків, свідчать, що з підвищенням питомої активності розчину зростає питома активність коріння і стебел проростків (див. табл. 1), і, отже, зростає дозове навантаження на них.

Слід також відзначити достатньо високі коефіцієнти накопичення 137Cs стеблами і особливо корінням проростків.

Істотна відмінність в реакції коренів і стебел, мабуть, була обумовлена тим, що ці органи характеризуються різними значеннями коефіцієнтів накопичення (КН) 137Cs. В табл. 1 можна бачити, що КН 137Cs коренями коливається від 400 до 1000, а стеблами – від 50 до 90, тобто на порядок менше.

Таблиця 1

Питома активність коріння і стебел проростків гороху залежно від початкової питомої активності водного розчину 137CsCl

Питома активність радіонукліда в середовищі, Бк/л | Питома активність стебел, Бк/кг | Коефіцієнт накопичення в стеблах | Питома активність, коріння, Бк/кг | Коефіцієнт накопичення в корінні

3,8 Ч102 | 5,7 Ч104 | 150 | 3,2 Ч105 | 842

1,6 Ч103 | 1,1 Ч105 | 69 | 1,2 Ч106 | 750

3,2 Ч103 | 2,5 Ч105 | 78 | 1,8 Ч106 | 563

1,5 Ч104 | 1,0 Ч106 | 69 | 9,2 Ч106 | 613

3,1 Ч104 | 2,2 Ч106 | 71 | 1,7 Ч107 | 548

1,6 Ч105 | 1,2 Ч107 | 75 | 9,7 Ч107 | 606

3,9 Ч105 | 2,5 Ч107 | 64 | 1,6 Ч108 | 410

1,5 Ч106 | 9,0 Ч107 | 60 | 1,0 Ч109 | 667

2,1 Ч106 | 2,0 Ч108 | 95 | 2,2 Ч109 | 1048

При таких відмінностях цілком зрозуміло, чому корені ушкоджуються значно більше, ніж стебла. Динаміка накопичення 137Cs для коренями і стеблами представлена на рис. 8 і 9.

Видно, по-перше, що рівень накопичення радіоцезію в стебловій частині майже на два порядки нижчий, ніж в кореневій , по-друге, рівень питомої активності в стеблах з часом подібно кореневій системі також зменшується, і, нарешті, по-третє, ймовірно, (і це надалі підтвердилося) апікальна меристема коріння насправді піддається ще більш високим дозовим навантаженням внаслідок високого рівня гетерогенності накопичення радіоцезію в його тканинах з переважною локалізацією 137Cs в меристематичній зоні.

Рис. 8. Динаміка питомої радіоактивності коренів проростків гороху, що ростуть на водному розчині 137CsСl | Рис. 9. Динаміка питомої радіоактивності стебел проростків гороху, що ростуть на водному розчині 137CsСl

Криві швидкості росту органів проростків гороху при вирощуванні їх на розчинах 90SrNO3 (рис. 8) в цілому подібні до кривих, що описують реакцію органів проростків при вирощуванні їх на розчинах 137CsСl. Проте присутність 90Sr позначається на рості коріння при значно вищих (на два порядки) питомих радіоактивностях, ніж 137Cs. Найвірогідніше причина відмінності ізоефективних питомих активностей цих радіонуклідів полягає у тому, що КН 137Cs і 90Sr суттєво відрізняються. Для 137Cs вони мають значення, як ми вже вказували, від 400 до 800, а для 90Sr – від 5 до 6. Інакше кажучи, різниця в радіобіологічній ефективності (по стимуляції та по інгібуванню) 137Cs і 90Sr повністю співпадає з різницею в рівнях їх накопичення відповідними рослинними тканинами.

Вертикальний розподіл 137Cs і 90Sr в головному корені проростків у водній і ґрунтовій культурах. При питомій активності розчинів від 1480 до 2220 кБк/л через тиждень інкубації рослин спостерігали повну зупинку росту коріння. Розрахунок поглинених доз від зовнішнього опромінення і опромінення від інкорпорованих радіонуклідів, базувався на припущенні про рівномірний розподіл 137Cs в зонах головного кореня. Проте розраховане значення сумарної поглиненої дози, накопиченої за час інкубації рослин (7 діб) склало близько 1 Гр, що ніяк не відповідало інгібуючій дії на меристему. В кращому разі це могло викликати стимуляцію росту (яку ми, втім, спостерігали), але яка не могла при такій дозі завершитися загибеллю апекса головного кореня. Порівнюючи дані цих експериментів з результатами вивчення дії гострого опромінення, ми припустили наявність гетерогенності вертикального розподілу 137Cs в головному корені з переважною його концентрацією в меристематичній зоні.

Результати даної серії експериментів представлені на рис. 10. Видно різку нерівномірність розподілу 137Cs по довжині головного кореня. Найбільшу питому активність має перший сегмент, в якому розташована меристематична зона.

Рис. 10. Питома активність 137Cs в 5-мм сегментах головного кореня проростків кукурудзи і гороху. Примітка: наведені типові результати

Встановлено, що апікальна частина кореня завдовжки 5 мм, маса сирої речовини якої складає приблизно 3 % від маси всього кореня (на 5-6-у добу вирощування) містила до 30 % сумарної активності сорбованого 137Cs. При середньому коефіцієнті накопичення для всього кореня 800-1000, КН в апексі, таким чином, досягав десятків тисяч (27000), тобто концентрація 137Cs в апікальній частині і, особливо, в меристематичній зоні (КН 39000) більш ніж на порядок вища середньої концентрації радіонукліда в корені, а значить і поглинені дози випромінювання від інкорпорованого 137Cs більше передбачуваного рівня, як мінімум, в 10 разів. Така доза є вже достатньо високою, щоб викликати необернене припинення ростових процесів. На рис. 11. представлена динаміка поглиненої дози від зовнішнього і внутрішнього опромінення, що підтверджує наше припущення.

Таким чином, встановлена гетерогенність розподілу 137Cs дозволила пояснити летальну дію інкорпорованих в тканині коріння радіонуклідів.

Окрім експериментів з 137Cs дослідження були проведені і з 90Sr. Ефект необерненого пригнічення ростової активності кореня був одержаний при питомих радіоактивностях 90Sr, які більш ніж на два порядки перевищували відповідні активності для 137Cs. Пояснення цьому факту ми знайшли, проаналізувавши розподіл 90Sr уздовж головного кореня. На рис. 12. видно, що 90Sr концентрується переважно в зонах розтягування і диференціації клітин, що і зумовлює, зрештою, істотно менші дозові навантаження на меристематичну зону апікальної частини кореня.

Рис. 11. Динаміка поглинутої дози в 5-мм апексі головного кореня проростків гороху, вирощуваних на водному розчині 137CsСl з початковою питомою радіоактивністю 1,7 МБк/л | Рис. 12. Питома радіоактивність 90Sr в 5-мм відрізках головного кореня проростків гороху, % від питомої активності апікального 5-мм відрізка

Для того щоб переконатися чи поширюються встановлені закономірності розподілу радіонуклідів і на інші умови культивування рослин, була проведена серія дослідів щодо вирощування проростків гороху на ґрунті, що був привезен з 30-км зони ЧАЕС та мав рівень забруднення цезієм-137 15 кБк/кг.

Рис. 13. Питома радіоактивність 137Cs в кореневих сегментах проростків, вирощених на водному розчині 137CsCl і на ґрунті, забрудненого радіонуклідами, % від активності 1-го апікального сегменту. Примітка: наведені типові результати

Результати цього досліду представлені на рис. 13. Спостерігався схожий характер розподілу радіонуклідів уздовж довжини головного кореня, як у водній культурі, так і в ґрунтовій. В апікальній частині кореня КН 137Cs за 72 год інкубації в даних умовах склав 200, а питома активність - 3,5 МБк/кг. За цей же період (відносно короткий порівняно з максимально можливою тривалістю вегетаційного періоду) доза, накопичена апікальною частиною в умовах ґрунтової культури склала 0,02 Гр (у розчині за цей же період - 9,2 Гр). Дана обставина ще раз вказує на важливу роль гетерогенності накопичення радіонуклідів різними біологічними структурами і на необхідність врахування її при оцінці поглинених доз, які можуть виявитися досить далекими від “малих доз”.

Популяційно-організменний рівень гормезисних ефектів. Модифікація здатності рослин накопичувати радіонукліди за допомогою модифікації густини вирощування рослин і передпосівного гострого гамма-опромінення насіння виявилася ще одним ефективним способом отримання гормезисних і радіогормезисних ефектів. Вибір цих чинників був не випадковим, оскільки крім того, що їх ефекти представляли самостійний інтерес з погляду вивчення явища гормезису і заснованої на ній адаптації, вони могли бути засобом управління накопичення радіонуклідів та/або важких металів при вирішенні задачі очищення ґрунтів, що забруднені радіонуклідами та/або важкими металами з допомогою рослин – задачі фіторемедіації.

Насіння озимого жита і озимої пшениці опромінювали в дозах від 5 до 150 Гр і висівали на ділянках радіоекологічного полігону-стаціонару в 10-км зоні відчуження ЧАЕС. Аналіз зразків, відібраних через місяць вегетації рослин, дозволив встановити збільшення сумарного виносу 137Cs рослинами (майже в півтора рази) після опромінення насіння жита в дозі 5 Гр, що корелювало з приблизно таким же збільшенням надземної маси рослин (рис. 14.). При великих дозах збільшення сумарного виносу 137Cs обумовлене переважно підвищенням питомої активності стеблової частини рослин. Аналогічні результати одержані в дослідах з пшеницею.

Рис. 14. Вплив передпосівного гострого гамма-опромінення насіння озимого жита на питому радіоактивність 137Cs, сумарну радіоактивність 137Cs і масу надземної частини рослин | Рис. 15. Вплив щільності вирощування рослин гороху на їх ростові характеристики і параметри накопичення 137Cs

У вегетаційних дослідах з горохом вивчали вплив щільності висіву насіння і відповідно щільності розміщення рослин під час вегетації на поглинання радіонуклідів з ґрунту. У дослідах використовували грунт з 10-км зони відчуження ЧАЕС. Визначали середню масу однієї рослини в судині, загальну масу рослин в судині, сумарну і питому активність 137Cs.

Одержані дані представлені на рис. 15. Чітко виявляється прямо пропорційна залежність сумарної маси рослин від щільності їх вирощування, а середньої маси однієї рослини – обернено пропорційна. Сумарна радіоактивність рослин, починаючи з густини 5 рослин на судину, зростала аж до максимальної густини, перевищивши контрольне значення майже в 5,5 рази. Залежність питомої активності рослин від густини мала складніший характер, але все ж таки при великій густині перевищувала контрольний рівень в 1,5 - 2 рази.

Таким чином, показано, що модифікація (в даному випадку стимуляція) ростової активності рослин істотно впливає на їх накопичувальну здатність по відношенню до радіонуклідів. Даний результат представляє ще і той інтерес, що стимуляція, фактично, одержана завдяки модифікації біологічного фактора – щільності вирощування рослин.

На основі отриманих даних щодо можливості модифікувати нагромаджувальну здатність росин було розроблено технологію фітодезактивації грунтів та водоймищ, що забруднені радіонуклідами.

2. Радіоадаптивна відповідь та її зв’язок з фазами перехідного процесу.

Дослідження стану радіоадаптованості рослин за допомогою методу визначення залишкової радіоактивності. Наведемо деякі експериментальні докази існування явища радіоаптованості у рослин, звертаючи увагу на його фазність і скороминущий (транзитивний) характер.

Тридобові проростки гороху були розділені на 4 групи і опромінені в дозах 0 Гр (контроль) 0,5 Гр, 5 Гр і 0,5 Гр (адаптуюча доза) + 5 Гр (тестуюча доза) з двогодинним інтервалом. У всіх варіантах досліду вимірювали довжину головного кореня і стебла. Паралельно ставили досліди за аналогічною схемою, але про реакцію рослин судили за поглинальною здатністю проростків, яку виявляли за допомогою запропонованого нами методу залишкової радіоактивності. Якщо криві, які відображають модифікуючий вплив