МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ЛУГАНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

МАЛИШ ПАВЛО МИКОЛАЙОВИЧ

УДК 577.12+612.12]:615.387

БІОХІМІЧНІ, СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНІ

ТА МЕТАБОЛІЧНІ ЗМІНИ

КОНСЕРВОВАНОЇ КРОВІ ЛЮДИНИ

В ПРОЦЕСІ ЗБЕРІГАННЯ ПРИ ПОЗИТИВНІЙ ТЕМПЕРАТУРІ

14.01.32 – медична біохімія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття вченого ступеня

доктора медичних наук

Луганськ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Луганському державному медичному університеті МОЗ України.

Науковий консультант:

доктор медичних наук, професор Комарєвцева Ірина Олександрівна, завідуюча кафедри медичної хімії Луганського державного медичного університету МОЗ України.

Офіційні опоненти:

член-кореспондент АМН України, засл. діяч науки і техніки України, доктор медичних наук, професор Губський Юрій Іванович, завідувач кафедри біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця МОЗ України (Київ);

доктор медичних наук, професор Мечетний Юрій Миколайович, завідувач кафедри проблем людини та філософії здоров’я Східноукраїнського національного університету ім. В. Даля МОН України (Луганськ);

доктор медичних наук, професор Гоженко Анатолій Іванович, директор державної установи “Український науково-дослідний інститут медицини транспорту” МОЗ України (Одеса).

Захист дисертації відбудеться 24 січня 2008 р. о 13.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 29.600.03 при Луганському державному медичному університеті МОЗ України (м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони Луганська, 1Г).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Луганського державного медичного університету МОЗ України (м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони Луганська, 1Г).

Автореферат розісланий “___”__________2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради І.А. Вишницька

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Донорська кров – обмежений національний ресурс, і у зв'язку з цим проблема підвищення об'ємів заготівлі гемотрансфузійних засобів на цей час є актуальною. Гостро необхідним є приріст донорського контингенту [Перехрестенко П.М., Назарчук Л.В., Чугрієв А.М., 2003], що у силу соціально-економічних умов, які мають місце в останні роки, сформувати непросто. У зв'язку з цим служба крові країни стоїть перед необхідністю проведення науково-дослідних робіт в області конструювання нових вітчизняних гемоконсервантів, здатних продовжити термін зберігання нативних властивостей еритроцитів людини в умовах, що не вимагають складного й коштовного встаткування, а саме: при позитивній температурі, з використанням звичайних рефрижераторів, адже гемоконсерванти “Глюгіцир” (“ГГЦ”) (Росія) і “ЦФДА-1” (США), які найбільш широко застосовуються в службі крові України, не в змозі забезпечити функціональну й морфологічну повноцінність основної маси еритроцитів після 21-ї доби зберігання [Малиш П.М., Орлова О.А., Комарєвцева І.О., 2004]. У даному аспекті актуальність розробленої теми полягає в необхідності: а) детального вивчення метаболічних і біохімічних аспектів “старіння” і загибелі консервованих еритроцитів із застосуванням сучасних методів дослідження; б) визначення тригерів і ланок ланцюга альтерацій, на які можливо впливати підбором коригуючих/моделюючих додатків у рецептуру гемоконсервантів. Дисертаційна робота в кінцевому її підсумку спрямована на благо здоров'я нації: створення гемостабілізаторів з досконалішими властивостями щодо збереження морфофункціональної цілісності консервованих еритроцитів буде сприяти забезпеченню високої якості гемотрансфузійних середовищ, отже, ефективній трансфузіологічній допомозі хворим.

Мета дослідження. Визначити роль альтераційних і регуляторних систем у регламентуванні строку адекватного функціонування консервованих еритроцитів людини шляхом вивчення біохімічних, структурно-функціональних і метаболічних змін у процесі зберігання консервованої крові при позитивній температурі. Виявлення сигнальних шляхів ушкодження й загибелі еритроцитів консервованої крові.

Завдання дослідження:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

У завдання даної роботи входило не тільки одержання й обговорення конкретних лабораторних і клінічних матеріалів, але й розгляд окремих методичних підходів до оцінки морфофункціонального стану консервованого еритроцита, і, на основі цього, – до можливості вдосконалення консервуючих розчинів, вибору гемоконсерванта при заготівлі компонентів і препаратів з донорської крові, призначених для лікування тих або інших патологічних станів.

Наукова новизна отриманих результатів. Всі отримані нами дані не тільки сприяли розвитку розуміння теорії виникнення пошкоджень, що відбуваються в консервованому еритроциті в міру його “старіння”, але й надали можливості визначити етапи, на яких реальна корекція альтерацій.

Уперше ми одержали відомості про морфометричні показники консервованих еритроцитів, обмірювані методом проточної цитометрії.

Уперше встановлений зв'язок механізмів зміни клітинного об'єму зі змінами кількості протонів води, розрахованих з використанням показників ЯМР-релаксометрії.

Уперше екстерналізацію фосфатидилетаноламіну в мембрані консервованого еритроцита розцінено як ознаку апоптичних змін, так само як екстерналізацію фосфатидилсеріну, виявлену при флуоресцентній мікроскопії. Уперше показано кореляційний зв'язок визначеної методом тонкошарової хроматографії елюації фосфоліпідів мембрани еритроцита в плазму з гематокритом і питомою вагою необоротно змінених форм еритроцитів на етапах спостерігання.

Уперше встановлено, що ключова роль у формуванні реологічних властивостей консервованої крові належить еритроцитам. Уточнено архітектуру агрегатів еритроцитів, з'ясовано, що перехід асоціації еритроцитів в “монетні стовпчики” до структур більш високого порядку підвищує в'язкість консервованої крові.

Уперше простежено динаміку дихальних газів на етапах зберігання консервованій крові, що надало можливості уточнити механізм розвитку оксидативного стресу й припустити, що однією з основних причин ушкодження структур еритроцитів (зокрема, ліпідного шару мембрани, гемоглобіну) є генерація й дія активних форм кисню (АФК).

Уперше для консервованого еритроцита показаний біфункціональний характер впливу оксиду азоту (NO), низькі концентрації якого грають компенсаторну антиоксидантну роль, а його гіперпродукція при “старінні” консервованої крові справляє на еритроцити токсичний вплив, що підтверджено констатацією виникнення й накопичення тілець Гейнца-Эрліха.

Уперше для консервованого еритроцита встановлена активація метаболічного шляху монооксиду вуглецю (СО), що дозволило судити про активність системи гемоксигеназа-СО й зробити висновок про антиоксидантну дію ферменту гемоксигеназа-1 (ГО-1). Виявлено використання консервованим еритроцитом і інших природних антиоксидантів, як ферментів (супероксиддисмутаза (СОД), глутатіонредуктаза (ГР), каталаза), так і неферментної природи (відновлений глутатіон (ВГ), білірубін (Bi), сечовина, СО).

Уперше простежено сигнальні шляхи загибелі консервованого еритроцита, що включають зміни, типові для апоптозу ядерних клітин – оксидативний і осмотичний стрес (знайдено окремі причини розвитку останнього в консервованому еритроциті, – залежне від часу накопичення глюкози, катіонів натрію (Na+) й кальцію (Ca2+)), експресія на поверхні мембрани фосфоліпідів (ФЛ) внутрішнього моношару, зменшення об'єму клітини.

Практичне значення отриманих результатів. У роботі показані переваги вміщуючих у рецептурі аденін і неорганічний фосфат гемоконсервантів, у тому числі нового гемоконсерванту “Адглюфоцит” (“АГЦ”), створеного вченими України. Результати досліджень дозволили стверджувати, що “АГЦ”, маючи необхідні стабілізуючі й консервуючі властивості, протягом установленого строку зберігання гемотрансфузійного середовища більш успішно, ніж “ГГЦ”, і в не меншому ступені, ніж “ЦФДА-1”, зберігає морфофункціональні характеристики еритроцитів. Тому, застосовуючи в практичній діяльності “АГЦ”, служба крові країни могла б забезпечити лікувальну мережу високоякісними й ефективними компонентами донорської крові. Після проведення клінічних випробувань і впровадження вітчизняного гемоконсерванту очікуються ефекти: а) науково-технічний, якому сприяють оптимальна збалансованість рецептури, високий рівень якості й сучасна технологія виробництва; б) економічний, завдяки якому можливі імпортозаміщення, можливість експорту. Менша технологічна собівартість нового гемоконсерванту дозволить закладам служби крові заощаджувати близько 40% коштів, призначених для придбання видаткових матеріалів; в) соціальний: використання “АГЦ” буде сприяти забезпеченню високої якості трансфузіологічної допомоги хворим, і в остаточному підсумку - оздоровленню нації.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Дисертант особисто сформулював мету й завдання дослідження, здійснив інформаційний пошук і аналіз літературних джерел. Автор самостійно зробив відбір зразків донорської крові для досліджень, постановку біохімічних тестів, їхній аналіз. Інтерпретація отриманих результатів, основні положення й висновки, представлені на захист, належать авторові. Здобувач особисто провів статистичну обробку результатів досліджень, підготував до публікації матеріали дисертаційної роботи, сформулював практичні рекомендації. Опубліковано самостійні, а також створені в співавторстві роботи.

Апробація результатів досліджень. Результати досліджень, що ввійшли в дисертацію, апробовані на науково-практичній конференції “Сучасні проблеми трансфузіології” (Харків, 2004), науковому симпозіумі “Актуальні й невирішені питання гематології й трансфузіології” (Київ, 2006), семінарі з міжнародною участю “Державна реєстрація, технологія виробництва, контроль якості й клінічне застосування препаратів крові” (Луганськ, 2006), II-му міжнародному симпозіумі “Гемостаз – проблеми та перспективи” (Київ, 2006).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковані в 34 наукових працях, у тому числі 30 статтях, з них 8 без співавторів. Публікації основного змісту дисертації здійснені в наукових виданнях, затверджених ВАК України.

Структура дисертації. Дисертація складається із вступу, 5 розділів, 30 підрозділів, висновків, списку літератури. Викладена на 300 сторінках, містить 72 таблиці, ілюстрована 50 малюнками. Список літератури включає 530 найменувань.

Робота виконана на кафедрі медичної хімії Луганського державного медичного університету (зав. кафедри д.мед.н., проф. І.О. Комарєвцева).

ЗМІСТ РОБОТИ

Об'єкт дослідження. Дози консервованої крові здорових донорів однієї статі (чоловіки), вікової категорії (20-36 років), групи крові (0(I)), у контейнерах з полівінілхлориду з гемостабілізаторами “ЦФДА-1” (Польща), “АГЦ” (Україна), і “ГГЦ” (Росія), що зберігалися при температурі (+4 - +8)0С.

Таблиця 1.

Рецептура гемоконсервантів

Компонент | Кількість, г

ГГЦ | ЦФДА-1 | АГЦ

Натрію цитрату дігидрат | 20,0 | 26,3 | 16,0

Лимонної кислоти моногідрат | 3,27

Глюкози моногідрат | 30,0 | 31,9 | 30,0

Натрію фосфат одноосновний | 2,22 | 5,0

Аденін | 0,275 | 0,3

Вода для ін’єкцій | до 1000 мл | до 1000 мл | до 1000 мл

Вибір статі донорів, віку й групи крові (з найменшим вмістом еритроцитарних групових антигенів) здійснювали з метою максимальної стандартизації випробуваних зразків консервованих еритроцитів. Спостерігання здійснювали з першого по сорок другий день, з часовими проміжками в 7 діб.

У клінічній частині роботи групу спостерігання склали 48 хворих гематологічного відділення Луганської обласної клінічної лікарні, у віці 60±7 років, з дифузно-осередковою формою множинної мієломи. У всіх пацієнтів, крім основного захворювання, був анемічний синдром з рівнем гемоглобіну 70-89г/л, що проявлявся як змінами в загальному аналізі крові, так і клінічно. З метою корекції анемії здійснювалися гемотрансфузії: 50% хворих одержали еритроцитну масу (ЕМ), виділену з крові, консервованої “ЦФДА-1”; 50% - ЕМ із крові, консервованої “ГГЦ”. Строк зберігання ЕМ з моменту ексфузії донорської крові не перевищував 3 доби. Переливання ЕМ здійснювалися трикратно: на 2, 4 і 6 добу після надходження пацієнтів. Сумарна доза перелитої ЕМ склала 750±50 мл на 1 хворого.

Предмет дослідження. Ознаки дезінтеграції й загибелі консервованих еритроцитів протягом строку зберігання консервованої крові; використання консервованим еритроцитом резервів, як природних (вихідні інгредієнти крові донора, зокрема, антиоксиданти), так і штучних (хімічні складові гемостабілізатора) для підтримки власної морфофункціональної стабільності протягом строку зберігання. Зазначені процеси, що породжують проблемну ситуацію (необхідність конструювання вдосконалених вітчизняних розчинів, які мають максимальні стабілізуючі та консервуючі властивості щодо забезпечення тривалої життєздатності клітин крові, їхньої приживлюваності і успішного виконання специфічних функцій у кровоносному руслі реципієнта), обумовили вибір предмета дослідження.

Методи досліджень. Для вивчення морфології й оцінки морфометричних змін еритроцитів консервованої крові на етапах зберігання застосовували автоматичний гематологічний аналізатор АВХ Micros 60 OT 18.

Для визначення кількості живих еритроцитів й тих, що дезінтегрували, використовували біохімічний набір “Apoptosis Detection Kit, Annexin V-CY3” (“Sigma-Aldrich”, США). Загиблі еритроцити вивчали за допомогою люмінесцентного мікроскопа Olympus AX70. Фарбування відмитих тричі еритроцитів у нативному препараті виконували барвником люмінесцентним Fits Lucifer yellow (“US Biological”, США), застосовували світлофільтр із діапазоном довжини хвилі 460-490 нм.

Визначення осмотичної резистентності еритроцитів (ОРКЕ) проводили методом Яновського Д. Н. (1957), а також за уніфікованою методикою в модифікації Ідельсона Л. І. (1974). Механічну резистентність вивчали за методом Ham T.H., Shen S.C., Fleming E.M. and Castle W.B. (1948), кислотну – за методом Терськова І.А. і Гітельзона І.І. (1959) у модифікації Воробйова А.І. (1960) з використанням фотоелектроколориметра ФЕК-56М (Росія).

Парціальну напругу газів (рО2, рСО2) і концентрацію Н+ у консервованій крові визначали з використанням газоаналізатора Medica EasyBloodGas (США).

Зміст глікозильованого гемоглобіну (Hb1c) в консервованих еритроцитах визначали з використанням набору реактивів “Гликозилированный гемоглобин (GHB 100)” (“Біо-Ла-Тест”, Чехія).

Концентрацію фосфоліпідів у плазмі визначали методом тонкошарової хроматографії з використанням хроматографа рідинного мікроколонкового “Міліхром-А 02” (“Эконова”, Росія); колонок нормальнофазових із силікагелем “Silasorb 600” (“Медикант”, Росія), діаметр пор 5 мкм, 80х2мм.

Динаміку внутрішньоклітинного й позаклітинного об'єму води в концентраті еритроцитів вивчали методом ЯМР-релаксометрії на ядрах 1Н за допомогою ЯМР-релаксометра “Minispec” (“Bruker”, Німеччина) з робочою частотою 25 Мгц.

Концентрацію неорганічного фосфору, аденозинтрифосфату (АТФ) і 2,3-діфосфогліцерату (2,3-ДФГ) визначали колориметричним методом Виноградової І.Л., Багрянцева С.Ю., Дервіз Г.В. (1980) у модифікації Камишнікова В.С. (2003).

Рівень лужних (натрій, калій) металів в еритроцитах і плазмі визначали фотометрією полум'яною емісійною з використанням ПАЖ-3 (Україна).

Концентрацію СО визначали по Chalmers (1991) за допомогою спектрофотометра СФ-46 (Росія) при довжині хвилі 541 і 555 нм.

Зміст NO визначали по його стабільних метаболітах – нітрит- та нітрат- аніонах (NO2-, NO3-), методом Green L.C., Wagner D.A., Glogowski, J. еt al. (1985) у модифікації Орлової О.А., Комарєвцевої І.О., Комарєвцева В.М. (2002).

Активність лактатдегідрогенази (ЛДГ) визначали в плазмі крові в ході зворотної реакції відновлення пірувата в лактат за Артюховим В.Г., Наквасиній М.А. (2000).

Визначення активності глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г-6-ДФГ) у плазмі й еритроцитах консервованої крові проводили спектрофотометричним методом із використанням “Набору для визначення глюкозо-6-фосфатдегідрогенази” (“Sentinel”, Італія).

Активність каталази в плазмі визначали за Карпищенко А. І. (1999).

Рівень активності СОД в еритроцитах  визначали за допомогою набору “SOD Assay Kit-WST” (“Fluka”, Німеччина).

Активність ГР вивчали з використанням набору “Glutathione Reductase Colorimetric Assay Kit” (“Sigma-Aldrich”, США), шляхом колориметричної детекції при довжині хвилі 412 нм.

Активність глутатіонпероксидази (ГП) оцінювали за допомогою кольорової реакції з 5',5'-дітіо-біс-2 (нітробензойної) кислотою (ДТНБ) (Карпищенко А. И., 1999).

Концентрацію загального, зв'язаного й вільного Bi визначали в плазмі фотометрично за допомогою “Набору реактивів для визначення загального, прямого білірубіна в сироватці крові (за методикою Єндрашика)” (“Філісіт-Діагностика”, Україна).

Концентрацію ВГ визначали спектрофотометричним методом, заснованим на здатності низькомолекулярних тіолів при взаємодії з ДТНБ утворювати пофарбовану сполуку – тіо-2-нітробензойну кислоту (Карпищенко А.И., 1999).

Визначення малонового діальдегіда (МДА) виконували спектрофотометричним методом, заснованим на взаємодії тіобарбітурової кислоти з низькомолекулярними діальдегідами з утворенням пофарбованого комплексу, що має максимум світлопоглинання при довжині хвилі 535 нм (Карпищенко А.И., 1999).

Статистичний аналіз даних проводили з використанням пакета програми Statistica v.6. Вірогідність розходжень середніх оцінювали з використанням t-критерію Стьюдента-Фішера.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Морфологічні й морфометричні характеристики консервованих еритроцитів на етапах зберігання. Результати досліджень показали, що кількість еритроцитів у консервованій крові поетапно зменшувалась, змінювалася форма від дискоцитів через оборотні (ехіноцити, стоматоцити) варіанти в необоротні (акантоцити, сфероцити) з наступною дезінтеграцією. У першу добу спостерігання в крові, заготовленій на всіх випробуваних гемоконсервантах, дискоїдні форми еритроцитів становили 92%, змінені – 8%. У структурі останніх основна частина становила оборотні форми еритроцитів – стоматоцити й ехіноцити. Сфероцити, клітини в термінальній стадії життя, становили 0,8% (“АГЦ”); 1% (“ГГЦ”); 1,2% (“ЦФДА-1”) від усієї кількості клітин. Дисксферотрансформація еритроцитів в “ГГЦ”- крові протікала з поетапним зменшенням об'єму клітин. У крові, консервованій “ЦФДА-1” і “АГЦ”, накопиченню сфероцитів передував етап збільшення діаметра клітин на 14 – 21-шу добу спостерігання, про що свідчить другий пік кривих Прайс-Джонса (рис.1).

Рис. 1. Еритроцитометрична крива Прайс-Джонса на 14-ту добу спостерігання

Виявили, що гемоконсерванти “ГГЦ” з 14-ї доби, а “ЦФДА-1” – з 21-ї доби не зберігали нормальний морфологічний статус основної маси еритроцитів. На 35-ту добу в крові, консервованій “ГГЦ”, були відзначені дегенеративні форми, “осколки” клітин, сфероцити, одиночні акантоцити, які в сумі становили 49,8% всіх клітин; дискоцити були відсутні. В цей час “ЦФДА-1”-крові в наявності 51,8% дискоцитів і оборотно змінених форм клітин, в “АГЦ”- крові їх 57,8%.

Гемоконсервант “АГЦ” ефективніше виявляв консервуючі якості, що знайшло відображення у пізніших необоротних змінах в популяції донорських еритроцитів. Так, на 28-му добу питома вага акантоцитів, сфероцитів і клітин, що дезінтегрували, у крові, консервованій “ГГЦ”, становила 45,6%, в “ЦФДА-1”- крові - 39,0%, у той час як в “АГЦ”- крові - 34,0%; на 35 добу питома вага необоротно змінених форм складала 49,8, 49,0 і 42,2% відповідно.

Реологічний статус консервованої крові. Відомо, що в'язкість цільної крові людини визначається різними факторами: пружними й орієнтаційними властивостями еритроцитів, гематокритом, в'язкістю плазми. Окремі показники реологічного статусу крові донора властиві й консервованій крові, однак остання має особливості, створені умовами її існування [Терехов Н.Т., Петров М.М., 1983; Шафранова Е.И., Снегирева Е.И., 2000; Гуменюк Н.И., Лишневская В.Ю., 2003; Цветков В.Д., 2004]. Дослідили в'язкість консервованої крові та її залежність від в'язкості плазми, гематокрита, морфології еритроцитів, наявності білково-клітинних і еритроцитарних мікроагрегатів. Виявили немонотонність змін даного показника: підвищення до 21-ї доби й подальше зниження до кінця строку спостерігання. Установили, що в'язкість консервованої крові не мала достовірного причинно-наслідкового зв'язку з поетапним збільшенням кількості білково-клітинних мікроагрегатів, що виникають під час “старіння” крові, а також зі змінами в'язкості плазми. Визначили, що ключова роль у формуванні реологічних властивостей консервованої крові належить еритроцитам. Перехід асоціації еритроцитів в “монетні стовпчики” до структур більш високого порядку вірогідно підвищував в'язкість консервованої крові в період з 1-ї по 21-гу добу після заготівлі. Зниження в'язкості консервованої крові на етапі 21 – 42-га доба зберігання було обумовлено а) накопиченням еритроцитів зі зменшеним діаметром; б) зниженням гематокриту.

Вуглеводний обмін консервованих еритроцитів. Вивчили рівень глюкози в еритроцитах і плазмі консервованої крові, ефективність її використання клітинами на етапах зберігання. Установили, що в першу добу після заготівлі рівень глюкози в еритроцитах і плазмі крові, консервованої “ЦФДА-1”, найнижчий, і зберігається таким до кінця спостерігання, що може бути пов'язане з меншою кількістю глюкози в гемоконсерванті, яка припадає на 1мл заготовленої цільної крові (в “ЦФДА-1”- крові – 0,004 г/мл, в “ГГЦ” і “АГЦ”- крові – 0,008 г/мл), а також з гліколізом, що протікає ефективно. Виявили більш високий ступінь убування глюкози з плазми крові, консервованої “ЦФДА-1”, ніж “АГЦ”- і “ГГЦ” (до 14-ї доби - на 65,5% проти 20,1% і 31,7% відповідно), що можна пояснити ефективним залученням глюкози до метаболізму еритроцитів. В клітинах “ГГЦ”- крові відзначене лінійне підвищення рівня глюкози, що свідчить про менш інтенсивне здійснення гліколізу, а також про дестабілізацію мембранних структур, яка сприяє надходженню глюкози в еритроцит із плазми за градієнтом концентрації. Оскільки підвищення внутрішньоеритроцитарної концентрації глюкози пов’язане з розвитком осмотичного стресу, можна вважати середовище, створене гемоконсервантом “ГГЦ”, менш сприятливим для клітин. В еритроцитах “АГЦ”- крові відзначено тенденцію до поетапного зменшення концентрації глюкози, що поряд із адекватним зниженням даного показника в плазмі свідчить про стабільність катаболізму глюкози. Вказане підтверджується динамікою концентрації лактату. Так, до 21-ї доби спостерігання рівень лактату в плазмі “ГГЦ”- крові перевищив первісний показник в 2,1 рази; в “ЦФДА-1”- і “АГЦ”- крові - в 3,1 і 3,4 рази відповідно. До кінця строку спостерігання рівень лактату в плазмі “АГЦ”- крові був вищим, ніж в “ЦФДА-1”, на 4,5%, і на 6,3% вищим, ніж у плазмі “ГГЦ”- крові.

Відомо, що глюкоза у високій концентрації викликає глікозилювання гемоглобіну (Hb). Hb1c, як хімічно стійка сполука, втрачає здатність транспортувати гази крові, відповідно, знижує трансфузіологічну цінність донорських еритроцитів. Нами було встановлено, що концентрація Hb1c в еритроцитах на всіх етапах перевищує референтні цифри, особливо в крові, консервованій “ГГЦ” і “АГЦ”, які містять більшу кількість глюкози, що обумовлено рецептурою даних гемостабілізаторів. У зв'язку з цим можна стверджувати, що висока концентрація глюкози в складі консерванту, поряд з позитивним (резерв субстрату для гліколізу) має й негативний бік - глікозилювання Hb, яке погіршує якість гемотрансфузійних еритроцитних середовищ відносно транспорту газів крові.

Енергетичний статус консервованих еритроцитів. Виявили поетапне зниження рівня АТФ і 2,3-ДФГ в еритроцитах крові, заготовленої з використанням всіх зазначених гемоконсервантів, однак у крові, стабілізованій “ЦФДА-1” і “АГЦ”, що містять у рецептурі аденін і неорганічний фосфат, – у меншому ступені. Відзначили, що до 14-ї доби – у період найбільшого використання еритроцитвміщуючих середовищ для переливання хворим – дані гемоконсерванти підтримували більш високу концентрацію макроергічних сполук (не менше 90% АТФ і 60% 2,3-ДФГ) отже, віддаляли в часі дисксферотрансформацію еритроцитів. На цьому етапі використання “ГГЦ” сприяло збереженню лише 81,4% АТФ і 53,1% 2,3-ДФГ. Показники збереження АТФ еритроцитів виявили придатність останніх як переносників газів крові (концентрація  АТФ  не нижче 50% від вихідного рівня) [Технічне керівництво Американської асоціації банків крові, 2000], в “ГГЦ”-крові – до 21-ї, “ЦФДА-1” і “АГЦ” - до 35-ї доби, що відповідає вимогам. Перевагу “ЦФДА-1” і “АГЦ” перед “ГГЦ” відносно збереження морфофункціональних властивостей донорських еритроцитів обумовлено, зокрема, наявністю в складі аденіну, який має здатність швидкого проникнення в еритроцит з утворенням додаткової кількості АТФ. Ми встановили, що в крові, заготовленій з використанням “ГГЦ”, в 1-шу добу спостерігання рівень аденіну істотно не відрізняється від такого в крові, заготовленій на “ЦФДА-1” і “АГЦ”. Парадоксальний, на перший погляд, результат дослідження можна пояснити високим ступенем пошкодження еритроцитів донора в момент їхнього переміщення в штучне середовище консерванту “ГГЦ”. Дезінтеграція структур клітин, що мають у складі пуринові сполуки, є причиною накопичення аденіну в плазмі. Можна припустити, що момент “зустрічі” крові з “ЦФДА-1” і “АГЦ” протікає м'якіше, у противному випадку рівень аденіну істотно перевищував би такий у плазмі “ГГЦ”- крові. Досліджуючи споживання аденіну консервованим еритроцитом, установили поетапне зниження його рівня в плазмі крові, консервованої “ГГЦ”, на 7-му добу спостерігання, а в плазмі крові, консервованій “АГЦ” і “ЦФДА-1”, які містять цю пуринову основу, – на 14-ту. Раннє зниження даного показника в “ГГЦ”- крові можна пояснити більшою потребою клітин в аденіні – наслідком більш вираженого збитку макроергічних сполук у порівнянні з “ЦФДА-1”- і “АГЦ”- кров'ю.

Відомо, що дії АТФ і 2,3-ДФГ адитивні відносно збереження стабільності мембрани еритроцита [Зинчук В. В., 2001; Дедов И.И., Александров А.А., 2004].

Стан фосфоліпідної складової мембрани консервованого еритроцита. Виявили елюацію в плазму по мірі “старіння” консервованої крові структурних ФЛ внутрішнього моношару мембрани – фосфатидилсеріну (ФС) і фосфатидилетаноламіну (ФЕ). Рівень ФС у плазмі “ГГЦ”- і “ЦФДА-1”- крові в період 1 – 14-та доба мав тенденцію до підвищення, і вірогідно перевищив вихідний на 21-шу добу; в плазмі “АГЦ”- крові – на 28-му добу. Динаміка рівня ФС у плазмі “ГГЦ”- і “АГЦ”- крові була аналогічній динаміці ФЕ; у плазмі “ЦФДА1”- крові рівень ФС перевищив первісний на 7-му добу (табл.2).

Таблиця 2.

Фосфоліпіди в плазмі консервованої крові на етапах зберігання, мг/мл

Доба | Фосфатидилетаноламін | Фосфатидилсерін

ГГЦ | ЦФДА-1 | АГЦ | ГГЦ | ЦФДА-1 | АГЦ

1 | 0,253±0,048 | 0,214±0,036 | 0,167±0,034 | 0,035±0,020 | 0,014±0,003 | 0,015±0,083

7 | 0,315±0,149 | 0,267±0,060 | 0,190±0,044 | 0,026±0,013 | 0,038±0,010* | 0,027±0,008

14 | 0,321±0,065 | 0,254±0,035 | 0,239±0,084 | 0,077±0,027 | 0,040±0,010* | 0,058±0,024

21 | 0,557±0,106* | 0,367±0,061* | 0,323±0,086 | 0,233±0,063* | 0,126±0,027* | 0,126±0,044

28 | 0,598±0,172* | 0,418±0,076* | 0,346±0,059* | 0,325±0,108* | 0,188±0,037* | 0,151±0,027*

35 | 0,543±0,113* | 0,484±0,059* | 0,379±0,094* | 0,307±0,086* | 0,296±0,041* | 0,171±0,048*

42 | 0,657±0,182* | 0,641±0,144* | 0,499±0,187* | 0,490±0,154* | 0,349±0,115* | 0,281±0,083*

*р<0,05 у порівнянні з показником 1-ї доби зберігання

Отримані дані ми розцінили як наслідок порушення фізіологічної транслокації ФЛ. Втрата ФЕ й ФС мембраною приводить до сферуляції та зменшення діаметра консервованих еритроцитів, знижується їх фізіологічна здатність до деформації, отже, і здатність до адекватної циркуляції в кровоносному руслі реципієнта.

Для того щоб підтвердити факт присутності ФС на поверхні консервованого еритроцита, ми використали метод фарбування флуоресцентним комплексом біохімічного набору для детекції апоптичних змін. Установили, що в першу добу після вилучення крові від донора спостерігається світіння клітин тільки в зеленій області спектра, що є сигналом життєздатності еритроцитів. Уперше флуоресценцію в червоній області спектра відзначили на 21-шу добу в крові, консервованій “ГГЦ” і “ЦФДА-1”, і на 28-му – у крові, консервованій “АГЦ”. До 42-ї доби кількість еритроцитів, що флуоресціює у червоній області спектра, збільшилося в порівнянні з 21-28-ю добою в 3 рази, у зеленій – зменшилося в 5 разів.

Це свідчило про наростання в клітинних структурах деструктивних процесів і “просування” значного числа еритроцитів по шляху суїцидної загибелі – ериптозу [Lang K.S., Lang P.A., Bauer C. et al., 2005]. З огляду на викладене, ми припустили, що лінійне, статистично достовірне підвищення ступеня елюації ФС в плазму консервованої крові можна вважати маркером такої ланки сигнального шляху запрограмованої загибелі еритроцита, як транслокація даного ФЛ у зовнішній моношар мембрани. На нашу думку, аналогічний перехід ФЕ також може вважатися етапом на шляху консервованого еритроцита до власної загибелі (стверджується вперше).

Ми встановили, що в першу добу дослідження зміст фосфатидилхоліну (ФХ) у плазмі перевищував референтні значення (1-2 мг/мл) в 3,8-7,7 разів. Тому може спричинитися ушкодження зовнішнього шару клітинної мембрани еритроцитів у момент переміщення із кровоносного русла донора в штучне середовище. Даний показник у крові, консервованій “ГГЦ”, перевищує такий в “ЦФДА-1”- крові на 13,0%, в “АГЦ”- крові - на 26,2%, із чого можна зробити висновок про найбільший ступінь травматизації еритроцитів гемоконсервантом “ГГЦ”, і найменший – “АГЦ”. Відзначили тенденцію до поетапного зниження рівня ФХ у плазмі крові, консервованій “ЦФДА-1” і “АГЦ”, і статистично достовірне зниження до 35-ї доби даного показника в плазмі крові, консервованої “ГГЦ”. Відомо, що ФХ використовується еритроцитом як для “будівництва” мембрани, так і для корекції її ушкоджень, а також як джерело біологічно активних речовин, що беруть участь у механізмі ліпідного й вуглеводного обміну клітини, і що метаболізм ФЛ включає їхнє взаємоперетворення [Кольман Я., Рем К.-Г., Вирт Ю., 2000]. Так, ФС при декарбоксилюванні утворює ФЕ, що є попередником ФХ. Тому не виключено, що забезпеченню стабільності ФХ- складової мембрани сприяла висока концентрація в плазмі (особливо з 21-ї доби спостерігання) ФЕ й ФС, яка створювала можливість використання консервованими еритроцитами зазначених ФЛ для побудови ФХ, тобто консервований еритроцит здатний до реконструювання власної мембрани за рахунок наявних ФЛ- ресурсів.

Водно-електролітний обмін у консервованій крові. Оскільки в дійсному дослідженні виявлені ознаки дестабілізації ФЛ- сполук мембрани клітини, розподілу ФЛ у бішарі й зниження концентрації АТФ, було очікуваним порушення транспорту катіонів і води.

Виявили поетапний підйом концентрації Са2+, більше виражений в еритроцитах крові, консервованої “ГГЦ”. Визначили, що найзначніший приріст концентрації Са2+ відбувається в період з 7-ї по 14-ту добу, що відповідає накопиченню води в еритроцитах та їх морфометричним змінам, які настають на 14-ту добу. Очевидно, гідратовані Са2+, входячи в клітину, несуть з собою певну кількість води. Однак залежність накопичення води й, відповідно, діаметра еритроцитів від внутрішньоклітинної концентрації Са2+, не настільки велика, як залежність від входу в клітину гідратованих Na+, концентрація яких на три порядки вище.

Ми встановили, що в крові, заготовленій на всіх узятих для порівняння гемоконсервантах, внутрішньоеритроцитарна концентрація Na+, починаючи з 7-ї доби зберігання, була вищою за вихідний рівень. До кінцевого етапу дослідження в “ГГЦ”- крові даний показник перевищував базовий на 85,7%, в “ЦФДА-1”- і “АГЦ”- крові – на 99,2% і 96,6% відповідно. У період 14 – 21-ша доба концентрація Na+ в еритроцитах крові, заготовленої з використанням “ЦФДА-1” і “АГЦ”, була вище, ніж у крові, консервованій “ГГЦ”, і це відповідало виявленому накопиченню кількості еритроцитів збільшеного діаметра. В плазмі “ГГЦ”- крові до кінця строку зберігання рівень Na+ зростав, у той час як у плазмі крові, консервованої “ЦФДА-1” і “АГЦ”, знижувався. Це свідчило про меншу здатність гемоконсерванта “ГГЦ” до збереження цілісності структур еритроцитів і про вихід значних кількостей Na+ у позаклітинне середовище.

Підвищення внутрішньоеритроцитарної концентрації Na+ супроводжувалося втратою калію, вірогідність якої визначили в крові, консервованій “ГГЦ” і “ЦФДА-1”, на 14 добу, а в крові, консервованій “АГЦ”, – на 21-шу.

Зі змінами транспорту катіонів пов’язаний перерозподіл клітинної води. Ми вивчили поетапні зміни ЯМР-релаксації протонів води в еритроконцентраті, заготовленому з консервованої крові. Нами встановлене подовження Т1 та Т2- складових часу ЯМР-релаксації в зразках еритроконцентрата крові, консервованої “ГГЦ” і “АГЦ”, до 14-ї доби спостерігання, а крові, консервованій “ЦФДА-1”, – до 21-ї. Одночасне подовження Т1 і Т2 свідчило про вповільнення протонного обміну між вільною й зв'язаною фракціями води в еритроцитах, а також про ущільнення шару гідратної води.

В еритроцитах крові, консервованої “ГГЦ” і “АГЦ”, з 21-ї, а в “ЦФДА-1”- еритроцитах з 28-ї доби спостерігання відзначене зниження параметрів Т1 і Т2, що дозволило судити про зменшення рухливості молекул води в міру “старіння” консервованої крові й припустити можливість її структуризації за рахунок підвищення рівня осмотично активних іонів Na+ (рис. 2).

Т1 |

Т2

Рис. 2. Зміни складових часу ЯМР-релаксації Т1 і Т2 (мсек) в еритроконцентраті

*p<0,05 у порівнянні із групами “ГГЦ” і “АГЦ”

В еритроцитах крові, консервованої “ГГЦ”, динаміка Т1 і Т2 була подібна такій у крові, консервованій “ЦФДА-1”. Максимум часу ЯМР-релаксації доводився на 14-ту добу: ріст Т1 – на 126,8% , Т2 – на 134,2% щодо вихідних показників. Однак в “ЦФДА-1”- еритроцитах показник Т1 у період з 7-ї по 35-ту добу, Т2 на 21-28-му добу вірогідно перевищував аналогічний в еритроцитах “ГГЦ”- крові, що корелювало з морфометричними параметрами, які вказували на накопичення в “ЦФДА-1”- крові еритроцитів зі збільшеним діаметром, а також з підвищеним внутрішньоклітинним вмістом катіонів Na+. У зразках еритроконцентрата групи “АГЦ” складові часу релаксації на етапах спостерігання змінювалися набагато плавніше. Максимальний підйом Т1 і Т2 відзначений на 14-ту добу (на 5,8 і 3,0% відповідно).

На підставі отриманих даних можна стверджувати, що встановлені нами показники ЯМР-релаксації протонів води й трансмембранного переносу катіонів характеризують гемостабілізатор “АГЦ” як той, що забезпечує в порівнянні з “ГГЦ” і “ЦФДА-1” більшу стабільність гідроосмотичних механізмів у життєзабезпеченні консервованих еритроцитів.

Маркери пошкодження мембрани консервованого еритроцита.

Цитозольні ферменти в плазмі. Було встановлено, що в плазмі крові, заготовленої як на “ГГЦ”, так і на гемостабілізаторах, що містять аденін та фосфат натрію, у першу добу після заготівлі рівень активності ЛДГ і Г-6-ФДГ був вище референтних меж, що пояснюється травматизацією клітин крові в момент консервування. Далі активність ЛДГ у плазмі поетапно зростала, і до 14-ї доби зберігання крові, заготовленої на “ГГЦ” і “ЦФДА-1”, перевищувала верхню межу норми в 2,0 і в 1,9 рази відповідно; у плазмі крові, консервованої “АГЦ”, - в 1,6 разів, що свідчило про присутність в останній більшої кількості інтактних клітин. До 21-ї доби зберігання крові, заготовленої на “ГГЦ”, активність ЛДГ перевищувала фонову на 109,8%. У плазмі крові, заготовленої на “ЦФДА-1” і “АГЦ”, цей показник дорівнював 97,3% і 95,2% відповідно. Активність Г-6-ФДГ у першу добу в плазмі “ГГЦ”- крові була вище в 2,1 рази, ніж в “ЦФДА-1”-, і в 2,2 рази – ніж в “АГЦ”- плазмі, і це підтверджувало більшу травматичність середовища “ГГЦ”. Починаючи з 21-ї доби, рівень Г-6-ФДГ у плазмі зріс, що свідчило про прогресуюче руйнування структур еритроцитів, особливо помітне в період з 35-ї по 42-гу добу спостерігання. У плазмі крові, консервованої “ЦФДА-1” і “АГЦ”, активність Г-6-ДФГ до 28-ї доби лише мала тенденцію до підвищення, отже, ступінь вивільнення даного ферменту із клітинних структур і його виходу в плазму був нижчим.

Резистентність консервованих еритроцитів. Визначили зниження осмотичної резистентності еритроцитів крові, заготовленої на всіх узятих в дослідження гемоконсервантах, уже в першу добу після вилучення в донора, навіть в ізоосмотичному середовищі, яким є 0,85% розчин натрію хлориду, і це підтверджує виникнення стресової ситуації для клітин у момент їхньої зустрічі зі штучним середовищем гемоконсерванта. Повний гемоліз еритроцитів крові, заготовленої на гемоконсервантах, що містять аденін і фосфат натрію, відбувався в більш гіпоосмотичних розчинах натрію хлориду, ніж еритроцитів крові, консервованої “ГГЦ”. Нижня границя ОРКЕ в “ГГЦ”- крові в усі строки зберігання перевищувала таку в крові, стабілізованій “ЦФДА-1” і “АГЦ”, що свідчило про меншу стійкість “ГГЦ”- еритроцитів до гіпоосмотичного впливу. Руйнування клітин крові, консервованої “ГГЦ”, відбувалося на більш ранніх етапах зберігання, ніж крові, консервованої “ЦФДА-1” і “АГЦ”. Гемоконсерванти, що містять аденін і неорганічний фосфат, ефективніше зберігали стійкість донорських еритроцитів до осмотичного гемолізу порівняно з “ГГЦ”, отже, дестабілізація мембранних структур еритроцитів на етапах зберігання “ЦФДА-1”- і “АГЦ”- крові була виражена в меншому ступені й відбувалася в пізніший термін.

При дослідженні механічної резистентності консервованих еритроцитів установили, що в крові, заготовленій з використанням всіх узятих для порівняльного дослідження гемоконсервантах, концентрація позаеритроцитарного Hb до й після механічного впливу вже на 7-му добу зберігання зросла щодо вихідного показника. Далі в крові, консервованій “ГГЦ”, рівень позаеритроцитарного Hb на всіх етапах дослідження перевищував аналогічний показник у зразках крові, консервованої “ЦФДА-1” і “АГЦ”. До 14-ї доби близько 50% еритроцитів руйнувалися центрифугуванням в “ГГЦ”-крові, і близько 25% - у крові, консервованій “ЦФДА-1” і “АГЦ”. На 21-шу добу в крові, консервованій “ГГЦ”, спостерігалися одиничні еритроцити, стійкі до механічного впливу, у той час як в “ЦФДА-1”- і “АГЦ”- крові близько 60% еритроцитів витримували центрифугування. До 28-ї доби після механічного впливу “ГГЦ”- кров неушкоджених еритроцитів не містила; в “ЦФДА-1”- і “АГЦ”- крові близько 50% еритроцитів залишалися стійкими до механічної дії. На 35-ту добу спостерігання тільки кров, заготовлена на “ЦФДА-1” і “АГЦ”, містила поодинокі еритроцити, резистентні до механічного впливу.

Результати вивченої нами кислотної резистентності еритроцитів консервованої донорської крові показала, що жодна з узятих для порівняння рецептур гемоконсервантів не забезпечує достатнього захисту від гемолізуючої дії кислоти. Установили, що рівень пониженостійких і середньостійких до впливу кислоти еритроцитів у першу добу зберігання вище в крові, консервованій “ГГЦ”; підвищеностійких – нижче, що свідчить про менший ступінь резистентності “ГГЦ”- еритроцитів до кислотного впливу. У міру “старіння” консервованої крові, до кінця встановленого строку зберігання для компонентів крові - переносників газів, що становить 21 добу для “ГГЦ”- еритроцитів і 35 діб для “ЦФДА-1”- і “АГЦ”- еритроцитів, мало місце збільшення питомої ваги еритроцитів зі зниженою стійкістю до руйнуючого впливу кислоти.

Для того щоб підтвердити отримані дані про прогресуючу дестабілізацію клітинних структур під час зберігання консервованої крові, вивчили здатність еритроцитів до фарбування люмінесцентним барвником Lucifer yellow. Результати дослідження показали зростання числа пофарбованих клітин на етапах зберігання консервованої крові. Відомо, що великі молекули люмінесцентного барвника здатні проникати в клітину тільки при наявності дефектів плазматичної мембрани діаметром не менше 3,5 мкм, зокрема, обумовлених апоптичними змінами [Sauer H., Pratsch L., Fritzsch G. еt al., 1991; Satchell D., 2000]. Якщо в першу добу після заготівлі крові, консервованої “ГГЦ”, люмінесценція еритроцитів була відсутня, то на 7-му добу число пофарбованих Lucifer yellow клітин склало 1-2 у полі зору, і до 21-ї доби їхнє число зросло в 3