НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАїНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ПІВДЕННИХ МОРІВ

ім. О.О. КОВАЛЕВСЬКОГО

МУХАНОВ

Володимир Сергійович

УДК 574.583 (262.5)

ТЕПЛОПРОДУКЦІЯ ПІКО- І ФЕМТОПЛАНКТОНУ

03.00.17 - гідробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Севастополь – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біології південних морів

ім. О.О. Ковалевського НАН України, м. Севастополь

Науковий керівник: кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник,

Полікарпов Ігор Геннадійович,

Інститут біології південних морів НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

провідний науковий співробітник

Олейник Галина Миколаївна,

Інститут гідробіології НАН України

доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник,

зав. відділом біологічного тестування

Рябушко Віталій Іванович,

Інститут біології південних морів НАН України

Захист дисертації відбудеться “12” грудня 2007 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 50.214.01 Інституту біології південних морів НАН України за адресою: 99011, м. Севастополь, пр. Нахімова, 2

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту біології південних морів НАН України за адресою: 99011, м. Севастополь, пр. Нахімова, 2

Автореферат розісланий “_04_” __листопада__ 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д50.214.01

доктор біологічних наук,

професор А.В. Гаєвська

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Застосування мікрокалоріметрії в екологічних дослідженнях, і, зокрема, у водній мікробіології, є виключно перспективним, оскільки цей метод дозволяє безпосередньо вимірювати потоки енергії в таких складних біологічних системах, як природні мікробні угруповання. Затребуваність методу продиктована новими стандартами й вимогами до оцінки й аналізу вуглецевого й енергетичного бюджетів морських екосистем. Від якості подібних оцінок, одержуваних для локальних акваторій, може залежати те, наскільки дбайливо використовуватимуться їхні ресурси і наскільки буде збережено їхню екосистему. Однак якість локальних оцінок, безсумнівно, визначає і якість глобальних апроксимацій (наприклад, глобального циклу вуглецю), які необхідні людству для вироблення правильної стратегії в збереженні біосфери, прогнозі й контролі глобальних кліматичних змін.

Мікробна компонента угруповання планктона, функціональні характеристики якої і є предметом цього дослідження, визначає як значну частину вторинної продукції, так і процеси мінералізації новоутвореної органічної речовини в морях і океанах. Утворюючи основу харчової піраміди, мікроорганізми, по суті, формують і ту продуктивність водних екосистем, яка безпосередньо експлуатується людством. Вони залучені в усі найважливіші біогеохімічні процеси у водному середовищі, а мікробний метаболізм опосередковує глобальні потоки вуглецю й енергії в біосфері. У зв'язку з цим, вдосконалення методологічної бази прямого вимірювання потоків енергії у водних мікробних угрупованнях і накопичення даних про величину потоків і механізми їх регуляції в різних екосистемах є актуальними завданнями гідробіології.

Мікробні угруповання поєднують у собі просторову компактність зі структурною і функціональною складністю, властивою всім надорганізменним системам, що дає можливість досліджувати їх в експерименті в ампулах малого об’єму. Мікрокалоріметрія мікробних угруповань – єдине на сьогоднішній день джерело експериментальних даних для розвитку нерівновагої термодинаміки складних, надорганізмених біологічних систем. Результати експериментів з піко- і фемтопланктоном, представлені в цій роботі, — один з перших кроків у цьому напрямі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано у відділі планктона ІнБПМ НАНУ в рамках бюджетних тем “Дослідження багаторічної мінливості структурно-функціональної організації угруповань планктона Чорного та Азовського морів” (державний реєстраційний номер 0196U022099), “Структурно-функціональні основи біорізноманіття морських угруповань” (державний реєстраційний номер 0199U001388), міжнародних проектів ІНТАС (INTAS) №№ 96-1961, 99-0139, 03-51-6196 і стипендії ІНТАС для молодих вчених YSF 2002-0361.

Мета і завдання дослідження. Мета дослідження полягає у вимірюванні сумарного й питомих потоків енергії в планктонній мікробній "петлі" мікрокалоріметричним методом. Поставлена мета визначила такі завдання дослідження:

1. Розробити й оптимізувати метод приготування проб піко- і фемтопланктона для прямого вимірювання їхньої теплопродукції мікрокалоріметричним методом.

2. З'ясувати, чи існує зв'язок між розмірною структурою угруповання гетеротрофного пікопланктона і питомими потоками енергії в ньому, визначити внесок ультрамікробактерій та епібактерій, що населяють планктонні агрегати, у сумарний бюджет угруповання.

3. Дослідити природу теплопродукційних процесів у фемтопланктоні, а саме, диференціювати внутрішньоклітинні (метаболізм) і позаклітинні джерела теплової енергії, визначивши їхній внесок у сумарну теплопродукцію фракції.

4. Провести вимірювання теплопродукції гетеротрофного пікопланктона в різних водних екосистемах з подальшою оцінкою потоків енергії через мікробне угруповання й ефективності мікробної “петлі”.

Об'єкт дослідження — гетеротрофний пікопланктон, фемтофракція планктонів.

Предмет дослідження — інтенсивність теплопродукції планктонних бактерій і потік енергії в мікробній “петлі”.

Метод дослідження. Теплопродукцію мікробного угруповання вимірювали за допомогою мікрокалоріметричного методу. Чисельність, біооб’єм (біомасу) і біоповерхню угруповання визначали мікроскопічними методами. Матеріальний потік через мікробний харчовий ланцюг (виїдання бактерій найпростішими) вимірювали за допомогою методу розбавлень (Tremaine, Mills, 1987).

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше визначено і детально описано (у тому числі й засобами імітаційного моделювання) мікробні процеси, що відбуваються після концентрування угруповання пікопланктона на нітроцелюлозну мембрану. На основі цих даних оптимізовано протокол фракціонування й концентрування проб піко- і фемтопланктону для подальшого вимірювання їхньої теплопродукції за допомогою мікрокалоріметрії.

Вперше отримано дані про інтенсивність теплопродукції гетеротрофного пікопланктона в морських екосистемах і гіперсолоній водоймі, досліджено залежність питомої теплопродукції угруповання (на клітину, одиницю біооб’єму і біоповерхні) від його розмірної структури, визначено термодинамічні параметри угруповання (добова продукція ентропії і питома дисипативна функція), оцінено ефективність мікробної “петлі” у мінералізації новоутвореної у стовпі води органічної речовини.

Запропоновано оригінальну модифікацію методу розбавлень, що дозволяє вимірювати питому продукцію і швидкість виїдання бактерій гетеротрофним нано- і мікропланктоном в планктонних агрегатах. Її успішна апробація в польовому дослідженні дозволила одержати перші дані для бактеріпланктона Севастопольської бухти (Чорне море).

Вперше встановлено, що питома (в одиниці об'єму біотопу) теплопродукція фемтопланктона порівнювана з теплопродукцією пікопланктона. У серії експериментів показано, що головне джерело теплової енергії у фемтофракції – позаклітинні процеси (можливо, гідроліз РОВ), а не бактеріальний метаболізм.

Науково-практична значимість отриманих результатів. Результати дисертаційної роботи показують, як процедури фільтрації й концентрування впливають на активність мікроорганізмів, швидкість їх росту і смертність. Ця інформація може бути використана у прикладних дослідженнях і біотехнологічних розробках, якщо в таких для фракціонування і/або концентрування бактеріальних клітин застосовується мікрофільтрація. Пропонований здобувачем протокол приготування проб пікопланктона і вимірювання їхньої теплопродукції може бути використаний як експрес-метод оцінки функціонального стану мікробного угруповання в досліджуваних акваторіях. Модифікація методу розбавлень, запропонована в цій роботі, розширює можливості дослідження детритного харчового ланцюга, а метод повторних циклічних фільтрацій пікопланктона при його поєднанні з мікрокалоріметрією може служити інструментом дослідження потоку енергії у вірусній “петлі”.

Особистий внесок здобувача. Планування експериментів, обслуговування (включаючи калібровку) і частина операторської роботи на мікрокалоріметрі BAM 2277, лічба мікроорганізмів за допомогою епіфлуоресцентної мікроскопії (фарбування DAPI), математичне моделювання, статистична обробка, аналіз і узагальнення результатів виконані самостійно. Інші роботи проводилися разом з О. Найдановою і О. Рильковою (лічба і вимірювання мікроорганізмів, накопичувальні культури гетеротрофного пікопланктона), О. Лопухіною (мікрофільтрація, операторська робота на ВАМ), М. Кіріним (метод розбавлень), Александре Анесіо (радіоізотопний метод).

Апробація роботи. Матеріали дисертації доповідалися автором на вітчизняних і міжнародних конференціях: III Міждисциплінарному симпозіумі ІНТАС (INTAS) “Physical General Biochemistry, Biotechnology and Environment”, Московський державний університет (Москва, 14—17 грудня 2000 р.); IV Міждисциплінарному симпозіумі ІНТАС (INTAS) “Physical and Chemical Methods in Biology, Medicine and Environment”, Московський державний університет (Москва, 30 травня — 3 червня 2001 р.); конференції молодих вчених “Понт Евксинський II”: “Проблеми екології Азово-чорноморського басейну: сучасний стан і прогноз (Севастополь, 18—20 вересня 2001 р.); VIII міжнародній конференції по гіперсолоних озерах (Жемчужний, Республіка Хакасія, 23—26 липня 2002 р.); конференції молодих учених з проблем Чорного й Азовського морів “Понт Евксинський III” (Севастополь, 27—30 травня 2003 р.); XIII конференції міжнародного товариства біологічної калоріметрії (International Society for Biological Calorimetry, ISBC) “Energetics of Adaptation and Development. From Molecular Mechanisms to Clinical Practice” (Вюрцбург, Німеччина, 27 вересня — 1 жовтня 2003 р.); XIV конференції ISBC “Energetics of Adaptation and Development” (Гданьск, Польща, 2—7 червня 2006 р.).

Публікації. По темі дисертації опубликованo 20 наукових праць, з яких 8 статей (з них 4 статті у виданнях, рекомендованих ВАК України) і 12 тез доповідей у матеріалах міжнародних і регіональних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 163 сторінках друкованого тексту; складається зі вступу, 8 розділів, висновків і списку використаних джерел, що включає 171 найменування, містить 12 таблиць і 35 малюнків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ.

Вимірювання потоків енергії в планктонних мікробних угрупованнях (літературний огляд, розділ 1). Розглянуто шляхи інтерпретації результатів респірометрії в рамках існуючих концепцій енергетичного балансу водних екосистем. Наводиться огляд робіт, у яких проводилася кількісна оцінка потоків енергії в планктонних мікробних угрупованнях і мікробній “петлі”. Серед недоліків респірометричного підходу виділено такі: а) помилково розглядати аеробне дихання як єдиний катаболічний процес у стовпі води і, таким чином, ототожнювати результати прямої і непрямої калоріметрії; б) у водному середовищі можуть відбуватися інші окислювальні процеси, що споживають кисень. Виникаючих у зв'язку з цим погрішностей можна уникнути, комбінуючи респірометрію з мікрокалоріметрією, що дозволяє безпосередньо вимірювати тепловий потік, продуцований біологічною системою (тобто потік енергії). Дається пояснення повільної “експансії” мікрокалоріметрії в дослідженнях планктона.

Матеріал і методи дослідження (розділ 2). Проби морської води відбирали з поверхневого шару на 4-х станціях у Севастопольській бухті (Чорне море, південно-західний Крим; станції 1 і 2 на виході з бухти, 3 і 4 — у її кутовій частини) у різні сезони з 1998 по 2004 р. і в узбережжі м. Аберістуїта (затока Кардиган, Уельс, Великобританія) у липні-серпні 1999 р. У мілководному гіперсолоному озері на мисі Херсонес (південно-західний Крим, 44о35'09' N, 33о23'39' E) збирали проби води й плаваючих матів зеленої водорості кладофори у весняні місяці 2002 р.

Мікрофільтрація. Залежно від завдання дослідження проби води фракціонували і концентрували (мал. 1, А) за допомогою фільтрувального устаткування Sartorius (Німеччина), нітроцелюлозних (Sartorius) або трекових (ядерних) мембран (Дубна, Росія) відразу ж після їх доставки в лабораторію. Для визначення оптимального протоколу приготування проб застосовували різні об’єми фільтрації (70—1000 мл), номінальний розмір пор на етапі фракціонування (3 або 12 мкм), тривалість експерименту (від 30 хв. до 80 год.). Протокол, застосовувана далі в польових дослідженнях, був такий: фракціонували проби за допомогою 12 мкм (море) або 3,0 мкм (озеро) нітроцелюлозних мембран (відповідно, SM 12500-047 і SM 11302-047), концентрували — на 0,2 мкм нітроцелюлозну мембрану (SM 11307-047), об’єм фільтрації — 100 мл.

Для дослідження внеску литичної інфекції у смертність ПБ на мембрані проби фільтрат <0,2 мкм, одержуваний після концентрування бактерій на фільтр, знову фільтрували в повторних циклах через той же фільтр з бактеріями, тим самим збільшуючи ймовірність інфікування клітин. Далі проводили стандартну мікрокалоріметрію. У контролі для циклів фільтрації використовували фільтрат < 0,01 мкм без фагів, приготований з тієї ж проби. Бактеріальну продукцію на мембрані визначали радіоізотопним методом (3H-лейцин; Kirchman, 2001) через 1 і 3 год. інкубування у 3 повторностях.

Проби фемтопланктона фракціонували (0,2 мкм) і концентрували (0,01 мкм, SM 11318-047) також, як пікопланктон (мал. 1 А). Проби плаваючих матів кладофори, відбірані у гіперсолоному озері, не потребували попереднього концентрування перед проведенням мікрокалоріметричних вимірювань.

Мікрокалоріметрія. Скляні ампули об’мом 3 мл, що містять 2 мл проби (мал. 1, А), герметично закупорювали й поміщали в мікрокалоріметр для термостатування на 30-50 хв. і подальшого вимірювання теплового потоку протягом 10-20 хв. при температурі 20?C за допомогою мікрокалоріметра LKB BioActivity Monitor (BAM 2277, виробництво Thermometric AB, Jarfalla, Швеція). Для дослідження мікробіологічних процесів в ампулі (див. нижче розділ 3) тривалість вимірювання збільшували до 15-70 год. Усього проведено близько 500 вимірювань різної тривалості.

Мікроскопія. Лічбу мікроорганізмів провадили в пробах морської води (No, мал. 1, А), фільтратах (NВБ) і на нітроцелюлозних мембранах (NПБ), коли цього вимагали завдання методологічного дослідження (у тому числі на різних стадіях експерименту), за допомогою світлової (Біолам, 1350, фарбування клітин на і у порах мембрани за допомогою ерітрозину) і епіфлуоресцентної мікроскопії (Jenalumar-a/d, Карл Цейс, HBO-202, 1000) з фарбуванням мікроорганізмів одним із флуорохромів, акридіном оранжевим, профлавіном або DAPI (Sherr et іal., 1993), залежно від конкретних завдань. 50 клітин проміряли в препаратах, пофарбованих ерітрозином, для подальшого розрахунку їх об’єму і поверхні відповідно до B. Sherr et al. (2001). Фарбування вірусоподібних часток (ВПЧ) у фемтофракції (фільтраті < 0,2 мкм) флуорохромом SYBR Gold (Molecular Probes, Inc., США) та їх лічбу проводили відповідно до протоколу R. Noble (2001).

Ідентифікацію мікроводоростей, кількісний облік і морфометрію мікроводоростей і бактерій у пробах з гіперсолоного озера проводили за допомогою світлової й епіфлуоресцентної мікроскопії.

Накопичувальні культури й акваріумні проби. У дослідженні процесів у вимірювальній ампулі (див. нижче розділ 3) і при вимірюванні питомих потоків енергії в угрупованні пікопланктона (розділ 4) використовували серію накопичувальних культур гетеротрофного пікопланктона на рідкому живильному середовищі (1% w/v бактопептон, Spofa a.s., Прага, Чехія). Посіви інкубували в темряві при кімнатній температурі протягом 15 тижнів, проводили вимірювання їхньої теплопродукції, лічбу і визначення розмірів клітин. Для вимірювання питомих потоків енергії (розділ 4) проби пікопланктона додатково відбирали в проточному (0,25 м3 год.-1) акваріумі об’ємом 7 м3 (далі іменованому “мезокосмом”), що входить до системи сполучених 3- і 7-м3 акваріумів і накопичувальної ємності об’ємом 100 м3. Вода, що надходить у мезокосм із моря, проходила фільтр грубого очищення й барботувалась. Її температуру спеціально не регулювали.

Вимірювання питомої продукції і швидкості виїдання гетеротрофного пікопланктона найпростішими і зоопланктоном проводили за допомогою методу розбавлень (Tremaine, Mills, 1987) у його стандартній модифікації, тобто в додатку до сумарного угруповання (фракція >0,2 мкм). У кожному з експериментів додатково досліджували агреговані бактерії, або епібактерії (розмірна фракція >5 мкм), і “вільні”, або суспендовані, бактерії (фракція 0,2-5 мкм). Епібактерії вловлювали і рахували за допомогою ядерних фільтрів з діаметром пор 5 мкм. Через неможливість фільтраційними методами сепарувати епібактерії, що населяють планктонні агрегати, від нано- і мікропланктона для подальшого вимірювання їхньої теплопродукції, швидкість їх метаболізму в одиницях енергії розраховували з величин питомої і добової продукції.

Імітаційне моделювання мікробних процесів у вимірювальній ампулі. Вид кінетичної моделі бактеріального росту відновлювали на основі експериментальних даних (зворотне кінетичне завдання). За основу взяті такі положення (мал. 1, Б): бактеріальний ріст, що спостерігався в ампулі, задовольняв класичну модель Моно з константою спорідненості субстрату до мікроорганізму Ks і максимальною питомою швидкістю росту (або питомою продукцією) ?m; ріст бактеріальних клітин, сконцентрованих на нітроцелюлозній мембрані (“прикріплені бактерії”, ПБ; XПБ – біомаса ПБ), придушувався пропорційно до збільшення концентрації клітин на мембрані (повне неконкурентне інгібування з коефіцієнтом ? і константою Kx); чисельність ПБ зменшувалася згодом внаслідок лізису клітин (l) та їх експорту у воду (n); у фільтраті навколо мембрани бактерії формували швидко зростаючу “популяцію” суспендованих, або “вільних”, бактерій (ВБ; XВБ – біомаса ВБ); харчовий субстрат (S – його концентрація) споживався пропорційно приросту бактеріальної біомаси при постійному в часі економічному коефіцієнті YX/S: d/dt = -?X/YX/S, де X – біомаса бактерій. Як і в мікрокалоріметричних експериментах, початкова чисельність ПБ у моделі обиралася в діапазоні між 108 і 2 109 кл. (тобто на мембрану або на ампулу, амп.-1), що відповідає біомасі в одиницях вуглецю від 5,6 до 112,0 мкг. Кінетика бактеріального росту в моделі описувалася питомою продукцією біомаси (1/X)(d/dt), інтенсивністю дихання (1/X)(dCoxygen) і теплопродукції (1/X)(d/dt), де Coxygen – концентрація кисню, Q – кількість теплоти.

Апроксимації і допущення, використовувані в моделі і польових дослідженнях. Коефіцієнт перелічування сухої біомаси морських бактерій у вуглець взято за такий, що дорівнює 0,5 (Sorokin, Kadota, 1972). Економічний коефіцієнт YX/S постійний у часі й дорівнює 1 г сух. в. г-1 С (Harwood, Pirt, 1972), що відповідає валовій ефективності росту К1 = 50%. У тих випадках, коли вимірювання бактеріальних клітин не проводили, їхню питому вагу (?) брали такими, що дорівнює 0,56 пг С мкм-3 (Bratbak, 1985), а бактеріальну біомасу розраховували як X = ?VN, де N – чисельність бактерій, V = 0,1 мкм3 – середній об’єм клітини (дані для Чорного моря, Чепурнова та ін., 1993). Дихання (1/X)(dCoxygen) і теплопродукцію (1/X)(d/dt) апроксимували в моделі, виходячи з таких допущень: (1) економічний коефіцієнт по кисню (YX/oxygen) дорівнює 1 г сух. в. г-1 О2) (Pirt, 1957, 1975); (2) кисень використовується виключно як акцептор електронів в енергодаючих процесах (Hernandez, Johnson, 1967); (3) оксі-калорійний коефіцієнт = –450 кДж моль-1 О2 (Gnaiger, Kemp, 1990); (4) аеробний метаболізм. Енергію, акумульовану угрупованням у вигляді біомаси (запас енергії, standing stock, SS), розраховували за допомогою коефіцієнта 43,5 і 44,17 Дж мг-1 С, відповідно для бактерій і мікроводоростей (Duboc et al., 1999). Добовий оборот біомаси (або запасу енергії) розраховували як відношення запас/продукція (доб.-1).

Статопрацювання і моделювання. Базову статистику (середні, 95% довірчі інтервали, стандартні відхилення, парний t-тест) і крос-кореляційні коефіцієнти розраховували в пакеті STATISTICA 5.5 (StatSoft, Inc.), побудова графіків і регресійний аналіз – SigmaPlot 4.0 і Grapher 2.0, моделювання – Turbo Basic і Visual Basic 6.0.

Мікробні процеси у вимірювальній ампулі і шляхи оптимізації вимірювань теплового потоку пікопланктона (розділ 3). По даним мікроскопії чисельність ПБ зменшувалася в довгострокових експериментах внаслідок того, що швидкість втрати клітин на мембрані (смертність + еміграція) перевищувала швидкість їх заповнення за рахунок росту (мал. 2, А). Чисельність ВБ, навпаки, росла приблизно до 108 клітин, у тому числі й за рахунок “імпорту” ПБ. Ці результати були відбиті в концептуальній схемі (див. вище мал. 1, Б) і імітаційної моделі мікробних процесів у вимірювальній ампулі.

Фільтрація пікопланктона в повторних циклах вела до збільшення продукції вірусоподібних часток (ВПЧ) (1,39 0,06 проти 0,29 0,10 108 ВПЧ мл-1 у контролі, зазначені станд. відхил.; t-тест: p < 0,05), зниження бактеріальної продукції в ході інкубування (1,90 0,71 проти 2,59 0,66 105 розпадів хв-1 у контролі; t-тест: p < 0,05) і утворенню детриту на мембрані внаслідок лізису бактерій (дані епіфлуоресцентної мікроскопії). Результати дають достатньо підстав для стверджування, що літична інфекція – один з факторів загибелі бактерій, які концентруються на мембрану. У комбінації з мікрокалоріметрією метод може бути використано для мікрокалоріметричної оцінки енергетичного бюджету вірусної “петлі” in situ.

Для кожної із проб пікопланктона одержували характерну куполоподібну теплопродукційну криву (нерідко з характерним пилкоподібним профілем – тепловим патерном). Мал. 2, Б ілюструє деякі з більш ніж 500 кривих, отриманих для пікопланктона Севастопольської бухти. Теплові патерни добре відтворювалися в повторних експериментах. При концентруванні різних об’ємів води їхня подібність зберігалася (кількість піків, їхня величина й послідовність), але профіль змінювався (“деформувався”), причому ці зміни були закономірними (мал. 2, Б). Залежність часу настання піку теплопродукції (T1, год., мал. 2, Б) від початкової чисельності ПБ (No) описувалася рівнянням експонентного загасання (r2 = 0,35, n = 30) внаслідок різних стартових умов росту: чим вищою була початкова чисельність бактерій на мембрані (і більше фільтрований об’єм), тим раніше реєстрували головний пік (див. криві на мал. 2, Б). Кількість теплоти, продукована пробою у ході експерименту (Q), росла зі збільшенням концентрованого об’єму до 300 мл, але залежність була статистично недостовірною. При об’ємах фільтрації понад 300 мл залежність була відсутня (вихід кривої на плато). Оскільки величина Q була пропорційною кількості доступного для бактерій легкозасвоюваного харчового субстрату (в одиницях енергії), яку вони асимілювали в досить короткий проміжок часу (години), це могло означати, що, по-перше, у ході фільтрації матрікс мембрани накопичував (адсорбував) субстрат (низькомолекулярні органічні сполуки, Брок, 1983) і, по-друге, насичення центрів адсорбції (Брок, 1983) відбувалося при об’ємах фільтрації понад 300 мл.

Оцінка інтенсивності теплопродукції. У пробах із Севастопольської бухти, відібраних у різні сезони, інтенсивність теплопродукції бактерій (Pi = Po/No) змінювалися від 3,8 до 65,7 фВт кл.-1 (12.5 14.5 фВт кл.-1, n = 39). Результати добре погоджуються з даними по інтенсивності дихання бактеріопланктона, опублікованими в західних (0,4-8,7 фмоль O2 кл. -1 доб.-1, що є еквівалентним 2-45 фВт кл.-1; Biddanda et al., 1994; Blight et al., 1995) і вітчизняних джерелах (дані Шумакової, 1987, для Севастопольської бухти: 0,2-0,4 пг О2 кл.-1 доб.-1, що є еквівалентним 29-67 фВт кл.-1).

Одним з наслідків концентрування бактерій на мембрані було придушення їхнього метаболізму. Гіперболічна залежність між початковою теплопродукцією (Po), тобто інтегральним метаболізмом ПБ, і чисельністю ПБ (No) описувалася рівнянням Михаэлиса-Ментена (мал. 3, А). Якщо одну з його констант приймали рівної 50 мкВт (экстремуму Po), приводячи рівняння до виду Po= 50 No / (No + Ki), де Ki – константа напівнасичення, точність апроксимації істотно не знижувалася (r2 > 0,97 для всіх проб на мал. 3, А). Таким чином, представлена залежність може бути використана для оцінки інтенсивності теплопродукції (Pi) бактерій, сконцентрованих на мембрану, з виправленням на придушення їхнього метаболізму.

Якщо чисельність сконцентрованих бактерій (No) не перевищувала 108 кл. (що відповідало об’єму фільтрації 100 мл для морських проб), помилка визначення Pi була невелика (залежність Po від No близька до лінійного, мал. 3, А), і виправлення на інгібування метаболізму бактерій не була потрібна. Важливо підкреслити, що мета з'ясувати точну природу інгібування, чи то ефект скупченості чи інша причина, не ставилася, оскільки це не є принциповим для математичного опису феномена й одержання поправочних коефіцієнтів на основі цього опису.

Результати моделювання. При своїй простоті імітаційна модель добре апроксимувала бактеріальний ріст в ампулі протягом першої доби експерименту, незважаючи на те, що вона не враховувала його багатосубстратну природу і тривалу “залишкову” активність угруповання, пов'язану з рециклінгом субстратів. Критерієм успішної верифікації моделі була відповідність абсолютних величин і динаміки зміни модельних змінних таким в експериментах (мал. 3, Б), у першу чергу, динаміки чисельності ПБ і ВБ, діапазону змін теплопродукції, форми теплових патернів як функції No, внеску ПБ і ВБ у сумарну теплопродукцію системи. Оптимальне співвідношення між параметрами моделі, що визначають кінетику бактеріального росту, So:Ks:Kx, становило 5:15:1, з абсолютними значеннями, відповідно, 70, 210 і 13 мкг С. Максимальна питома продукція (?), швидкості лізису клітин на мембрані (?) і їх експорту у фільтрат (?) співвідносилися як 30:15:1, тобто роль експорту клітин зводилася лише до їх “висіву” у більш сприятливі для росту мікроумови. Альтернативний сценарій передбачав: а) лише незначне інгібування росту ПБ на мембрані (Kx > 200 мкг С), б) переважання експорту ПБ у фільтрат над смертністю (? > ?), в) обмежені ресурси для бактеріального росту (So < 10 мкг С). Він адекватно імітував динаміку бактерій на мембрані й у фільтраті, але теплові патерни, одержувані в моделі, відповідали експериментальним лише при високих початкових чисельностях ПБ й, відповідно, більших об’ємах фільтрації).

Питомі потоки енергії в одиниці біооб’єму (PV) і на одиницю біоповерхні (PS) пікопланктона як функція розмірної структури угруповання (розділ 4). У розділі розглядається фундаментальна залежність функціональних характеристик угруповання пікопланктона від його розмірної структури. Особливу увагу приділено проблемі визначення фізіологічної активності ультрамікробактерій (УМБ). Протягом 105-денного періоду старіння накопичувальної культури гетеротрофного пікопланктона середній об’єм клітин зменшувався з 1,09 ± 0,15 (95% дов. інт.) до 0,18 ± 0,02 мкм3, причому діапазон цих змін був ширший, ніж природна варіабельність розмірного спектра в угрупованні бактеріопланктона з прибережних вод і мезокосма. Інтенсивність теплопродукції знижувалася більше ніж на 2 порядки до екстремально низьких значень (мал. 4, А). Питомий тепловий потік на клітину (PC, Вт кл. -1) зменшувався швидше, ніж такий у одиниці біооб’єму у одиниці його біооб’єму (PV, Вт мкм-3) і на одиницю біоповерхні (PS, Вт мкм-2) – див. нахил регресійних ліній на мал. 4, А. Це могло вказувати на “стратегію” угруповання утримувати питому швидкість метаболічних процесів у одиниці його біооб’єму (PV) і швидкість транспорту ресурсів через біоповерхню (PS) такими високими, наскільки це дозволяли погіршені зовнішні умови. Зниження інтенсивності теплопродукції бактерій у культурі зі зменшенням середнього об’єму клітин (r2 = 0,45; n = 68) представлено регресією а на мал. 4, Б и В. У прибережних водах і мезокосмі інтенсивність метаболізму бактерій незначною мірою збільшувалася зі зменшенням середнього об’єму клітин (регресія с на мал. 4, Б і В), але цей зв'язок був статистично недостовірним (r2 < 0,1; n = 25). У строгому формулюванні питомі потоки енергії в одиниці біооб’єму угруповання і на одиницю його біоповерхні не залежали від середнього об’єму клітин (тобто розмірної структури угруповання). Таким чином, проби з переважанням дрібних клітин не поступалися у величинах питомих потоків енергії пробам з перевагою великих клітин. Це, на перший погляд, суперечило гіпотезі Стевенсона (Stеvenson, 1978) і експериментальним результатам Гезол та ін. (Gazol et al., 1995), згідно з яким УМБ – спочиваючі клітини, здатні в сприятливих умовах відновити ріст і нормальні розміри (що властиво копіотрофам).

Разом з тим не було отримано й достовірного підтвердження зворотного припущення, що в УМБ інтенсивність метаболізму в одиниці об'єму клітини вище, ніж у бактерій “нормального” розміру (Button, Robertson, 1989). Застосувавши до наших експериментальних даних модель Гезол та ін. (1995), відповідно до якої ймовірність для морської бактерії бути фізіологічно активною пропорційна її розміру, ми одержали експериментальне підтвердження того, що пул УМБ включає як спочиваючі форми копіотрофів, так і фізіологічно активні клітини. Таким чином, наші результати “примиряють” дві полярні точки зору на природу УМБ.

Епібактерії в планктонних агрегатах: високі швидкості росту, смертності і обороту біомаси (розділ 5). Питомі швидкості процесів (питома продукція K і смертність g) і швидкість обороту бактеріальної біомаси в агрегатах були достовірно вищими ніж у навколишній воді (мал. 5). Однак внесок агрегованих бактерій у сумарну чисельність угруповання (N) і, як наслідок, у його добову продукцію (P) і смертність (G) залишався незначним (мал. 5). У эпібактерій, що населяють агрегати, сумарні витрати на обмін і питому швидкість теплопродукції, становили, відповідно, 0,1-0,6 мкВт л-1 й 23-101 фВт кл. -1 проти 5,0-63,5 мкВт л-1 й 14-32 фВт кл. -1 у вільних бактерій у навколишній воді.

Установлено, що висока інтенсивність мікробіологічних процесів у планктонних агрегатах може істотно впливати на результати, одержувані традиційним методом розведень: розбіжності у величинах K і g, виміряних для сумарного бактеріопланктона (за допомогою стандартного методу) і тільки вільних бактерій поза агрегатами (за допомогою модифікованого методу), досягали 17% і були статистично достовірними (парний t-тест; p < 0,01 й < 0,05 для K й g, відповідно). Таким чином, новий підхід дозволяв визначати K й g з більшою точністю.

Це робить новий підхід ефективним інструментом дослідження детритного харчового ланцюга й локалізації мікробної активності у стовпі води.

Низький відсоток вибракування результатів і малі величини стандартних відхилень досліджуваних змінних свідчили про застосовність теоретичної моделі, покладеної в основу методу розведень, до мікробного населення суспензії. Отже, у його новій модифікації метод може служити ефективним інструментом дослідження детритного харчового ланцюга й локалізації мікробної активності у стовпі води.

Теплопродукція фемтофракції (ФФ) планктона (розділ 6). В 15 пробах води із Севастопольської бухти, відібраних у різні сезони 1999-2002 рр., теплопродукція ФФ була достовірно (p = 0,02) вищою (48.0 ± 23,7 мкВт л-1, 95% дов. інт.), ніж у пікопланктона (ПП) (23,7 ± 14,1 мкВт л-1). Феномен вимагав пояснення, оскільки концентрація біомаси у ФФ занадто мала (дрібні УМБ і віруси, що не мають “автономного” метаболізму). Теплові паттерни ФФ і ПП, одержувані для однієї і тієї ж проби, були схожими, що вказувало на спільну природу теплопродукованих процесів в обох фракціях. За даними мікроскопії, у ФФ відбувався активний бактеріальний ріст, що свідчить про наявність копіотрофів у пулі УМБ (рахунок і вимір клітин робили на мембранах 0,2 мкм). На відміну від ПП, піки на теплових кривих ФФ з'являлися із запізнюванням у часі, імовірно, через низьку стартову біомасу УМБ. В одиницях вуглецю й енергії добовий вихід бактеріальної біомаси у ФФ досягав, відповідно, 0,79 мкг C й 34 мДж, тобто, теоретично, бактерії повинні були за цей період часу дисипувати <34 мДж теплової енергії. У реальні ж експериментах добова теплопродукція ФФ становила від 147 до 1090 мДж, що можна пояснити лише наявністю додаткового джерела теплопродукції, відмінного від бактеріального метаболізму. Як позаклітинний процес, що міг би виступити таким джерелом, розглядається гідроліз високомолекулярних органічних сполук, обумовлений екзоферментативної активністю бактеріопланктона. Гіпотеза вимагає експериментальної перевірки. Якщо вона буде підтверджена, мікрокалориметричний метод відкриє нові можливості у вимірі інтегральної активності бактеріальних екзоферментыв у товщі води.

Дисипація енергії, продуктивність і швидкість обороту біомаси в угрупованні бактеріопланктона: порівняльне дослідження двох екосистем (розділ 7). В екосистемі Севастопольської бухти (СевБ) у літні місяці середні величини біомаси (B), продуктивності (P), сумарних трат на обмін (M) та інтенсивності теплопродукції (H) бактеріопланктона були вищими ніж біля узбережжя Аберістуїта (Аб) (достовірні відмінності отримані тільки для P і M, мал. 6). Після того, як величини М, H і P, спостережувані в СевБ (при 24 о С), призвели до температури в Аб (17,7 оС) (мал. 6, сірий фон), достовірна відмінність (p < 0,01) між екосистемами збереглася тільки для змінної P. Таким чином, потоки енергії (М, H) залежали від температурних умов більшою мірою, ніж потік речовини (P). Висока продуктивність угруповання в СевБ була забезпечена надлишком ресурсів для бактеріального росту внаслідок антропогенного забруднення акваторії органічними речовинами й у меншому ступені залежала від температури.

У межах СевБ інтенсивність теплопродукції бактерій Н була нижчою (p < 0,05) на більш забруднених кутових станціях 3 і 4 (мал. 6) – закономірність, раніше встановлена для швидкості дихання бактерій (Чепурнова та ін., 1993). Оскільки співвідношення бактеріальних біомас на станціях було зворотним (на кутових станціях більш, ніж в 2 рази вище, ніж на виході з бухти, p < 0,01), (p < 0,01), відмінність чистих і забруднених вод СевБ по швидкості потоків речовини (P) та енергії (M) у бактеріопланктоні не була статистично достовірною (мал. 6).

Швидкість продукції ентропії (E) угрупованням бактеріопланктона в одиниці об'єму води була істотно вищою в екосистемі СевБ, а в межах СевБ – незначно вищою на кутових станціях (мал. 6), що узгоджується з гіпотезою про збільшення Е у водних екосистемах при їх евтрофуванні стану (Aoki, 1994). Величина Е також може служити показником нерівновагості біологічної системи, що пояснює високу варіабельность змінних у СевБ. Примітно, що середні значення іншої термодинамічної змінної, питомої дисипативної функції (E/Be), виявилися близькими в досліджуваних екосистемах (3,1 у СевБ і 2,8 год.-1 К-1 в Аб, мал. 6), незважаючи на істотну різницю в їхніх температурних режимах і ступені забруднення.

Ефективність планктонної мікробної “петлі” і баланс фотоавтотрофних і гетеротрофних процесів у гіперсолоній водоймі (розділ 8). Фотоавтотрофи, що населяють мати кладофори (Cladophora sp.), були представлені діатомовими (до 9 105 кл. мл-1), ціанобактеріями (Gloeocapsa spp.; до 5 104 кл. мл-1) і мікрофлагелятами (до 6 104 кл. мл-1). Їхня загальна біомаса становила менше 1% біомаси мата. Внесок фітопланктона в загальну біомасу фотоавтотрофів у стовпі води також був незначним. Пік у розвитку кладофори припадав на квітень, коли її біомаса досягала 580 м С м-2. Максимальна біомаса гетеротрофних бактерій у маті й стовпі води під ним у весняний період становила лише 384 мг С м-2.

Енергетичний бюджет пелагіалі озера в його спрощеній схемі включав запаси енергії (S), акумульованої у вигляді живої біомаси фотоавтотрофних і гетеротрофних мікроорганізмів, і її потоки (F) через кожну з компонен біоценозу (мал. 7, А). Яскраво виражений дисбаланс між автотрофними й гетеротрофними компонентами бюджету (3 і 2 порядки величин відповідно для S і F, мал. 7, Б) вказував на те, що лише незначна частина (< 3%) первинної продукції матів могла бути мінерализована бактеріями, тобто ефективність мікробної “петлі” у стовпі води у весняні місяці була винятково низькою, незважаючи на високу інтенсивність метаболізму гетеротрофів в одиниці їх біооб’єму Pv (мал. 7, Б). Пізніше, із завершенням фотосинтетичної активності в матах через 3-4 місяці, вони втрачали плавучість й занурювалися на дно водойми. Відповідно до наших розрахунків, співвідношення процесів седиментації й мінералізації в пелагіалі озера досягало 80:1, що є характерним для екосистем гіперсолоних водойм, у яких мінералізація органічної речовини, що накопичується у товщі води, відбувається переважно в донних опадах (Post, Stube, 1988; Cayol et al., 1995).

Чисельність бактерій (107 кл. мл-1) та їхні розміри (до 0,8 мкм3) у пелагіалі озера були приблизно на порядок вище, ніж у морському прибережному бактеріопланктоні, однак інтенсивність бактеріальної теплопродукції була низькою: 5 ? 25 фВт кл. -1, 9 ? 33 фВт мкм-3 і 1 ? 5 фВт мкм-2 (див. мал. 4, Б и В для порівняння з даними по бухті).

ВИСНОВКИ

1. Застосування мікрокалоріметрії для вимірювання теплопродукції пікопланктона методологічно виправдане. Проблема недостатньої чутливості методу може бути вирішена за допомогою концентрування клітин на нітроцелюлозну мембрану безпосередньо перед проведенням вимірювань. Тривалість готування проби й мікрокалориметрії - від 60 до 90 хв.

2. Мікробні процеси, що протікають у вимірювальній ампулі (утримуючої фільтрат морської води й мембрану з обложеними на ній мікроорганізмами) на тимчасовій шкалі від декількох годин до декількох доби після концентрування проби, включають: експорт (змив і міграцію) клітин з мембрани у фільтрат; ріст клітин на мембрані й у фільтраті; інгібування метаболізму клітин пропорційно до їхньої чисельності на мембрані; лізис клітин на мембрані.

3. Форма теплопродукційних кривих (тепловий патерн), одержуваних для даної проби пікопланктона, змінюється закономірно й передбачувано при збільшенні фильтруемого об’єму води (і, відповідно, збільшенні чисельності мікроорганізмів на мембрані). Ці зміни можуть пояснюватися концепцією процесів, представленою вище (п. 2) і задовільно описані математично.

4. Теплопродукційні криві, одержувані в ході багатогодинних експериментів, відображають сумарний метаболізм обох “популяцій” клітин, сконцентрованих на мембрані й суспендованих у воді, причому внесок останніх у загальну теплопродукцію зростає з часом.

5. Запропоновано наступні шляхи підвищення якості оцінок інтенсивності теплопродукції пікопланктона: А. Розрахунок з поправкою на придушення бактеріального метаболізму внаслідок концентрування клітин на мембрані. Б. Вибір об’єму фільтрації, при якому чисельність бактерій на мембрані становить близько 108 кл., тобто досить велика для коректного виміру їхньої теплопродукції, і, у той же час, досить низка, щоб уникнути інгібування бактеріального метаболізму.

6. Не встановлено статистично достовірної залежності питомих потоків енергії через угруповання гетеротрофного пікопланктона від його розмірної структури (середнього розміру клітин). З результатів мікрокалоріметрії слідує, що пул ультрамікобактерій включає як спочиваючі (копіотрофи), так і фізіологічно активні бактеріальні клітини (олігобактерії).

7. Старіння накопичувальної культури гетеротрофного пікопланктона протягом 105 днів культивування супроводжувалося зменшенням середнього розміру бактеріальних клітин з 1,1 до 0,1 мкм3 і зниженням їхньої питомої теплопродукції на 3 порядки до значень, які ніколи не спостерігалися в природі (< 1 фВт кл-1).

8. Метод розбавлень у його новій модифікації дозволяє: а) вимірювати швидкості росту й виїдання бактеріопланктону найпростішими з більшою точністю, ніж традиційний метод; б) досліджувати смертність і продукцію эпібактерій, що населяють планктонні агрегати, тобто одержувати інформацію про функціонування детритного харчового ланцюга.

9. У морський прибережної екосистемі питомі швидкості росту й виїдання бактерій нано- і мікрогетеротрофами у планктонних агрегатах були в 1,5-2 рази вище, ніж поза ними, у навколишній воді.

10. Активний ріст копіотрофних бактерій, спостережуваний у фемтофракції планктона після її концентрування, міг пояснити менш 10% загальної кількості теплової енергії, дисипованої фракцією за 24 год. Виходячи із цього, зроблений висновок, що більша частина теплопродукції фемтофракції обумовлена позаклітинними процесами, приблизно, гідролізом високомолекулярних органічних сполук.