НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

ОЛІШЕВСЬКИЙ СЕРГІЙ ВАЛЕРІЙОВИЧ

УДК: 616-006-085:615.371:612.017.1:57.084

ПІДВИЩЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ ПРОТИПУХЛИННОЇ ГЛІКОПЕПТИДНОЇ ВАКЦИНИ ЗА ДОПОМОГОЮ CрG ДНК З BACILLUS SUBTILIS

(експериментальні дослідження)

14.01.07 – онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Науковий керівник – доктор медичних наук, професор

Шляховенко Володимир Олексійович,

завідувач відділу ензимології пухлин

Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Офіційні опоненти: – доктор біологічних наук, професор

Воронцова Ада Леонідівна,

провідний науковий співробітник відділу експериментальних клітинних систем Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України;–

кандидат біологічних наук

Бендюг Галина Дмитрівна,

старший науковий співробітник відділу клінічної імунології Інституту онкології АМН України.

Провідна установа – Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, кафедра онкології, м. Київ.

Захист відбудеться “25” квітня 2007 року о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (03022, м. Київ, вул. Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Автореферат розісланий “___” березня 2007 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук Н.В. Бородай

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Незважаючи на стрімкі успіхи в галузі біології та медицини, лікування онкологічних хворих все ще залишається далеко невирішеною проблемою. Традиційні підходи до лікування досить часто, на жаль, виявляються недостатньо ефективними і супроводжуються значними побічними ефектами, що спричиняє постійний пошук додаткових засобів і стратегій, спрямованих на більш ефективне лікування. У наш час інтенсивно розробляється і впроваджується у клінічну практику вакцинотерапія – один з перспективних напрямків імунотерапевтичного лікування хворих на злоякісні новоутворення (Шляховенко В.А., 2000; Finn O.J., 2003; Berzofsky J.A. et al., 2004; Потебня Г.П. и соавт., 2004; Шляховенко В.О., Мосієнко В.С., 2006; Dalgleish A.G., 2006). Однак, низька імуногенність більшості антигенів пухлинних клітин, а також поява і накопичення в організмі онкологічного хворого низки порушень регуляторних і ефекторних систем імунобіологічного нагляду зумовлюють необхідність пошуку шляхів підвищення ефективності протипухлинних вакцин, яке здійснюється шляхом різноманітних модифікацій пухлинних антигенів, використання штучних генних конструкцій та різноманітних ад`ювантів (Vogel F.R., 1995; McCluskie M.J., Weeratna R.D., 2001; Коростелев С.А., 2003; Berzofsky J.A. et al., 2004; Stevenson F.K., 2005). Саме цій проблемі присвячена дана робота, яка мала за мету розробку нового ад`юванта на основі ДНК бактеріального походження та дослідження його імунобіологічних і протипухлинних властивостей як при самостійному застосуванні, так і у поєднанні з протипухлинною глікопептидною вакциною. Такий підхід до проблеми виглядає тим більше обґрунтованим, що імуномодулюючі ефекти бактеріальної ДНК вже були доведені групою японських (Tokunaga T. et al., 1984, 1999; Yamamoto S. et al., 1992) та американських (Krieg A.M. et al., 1995; Krieg A.M., 2001) дослідників. На думку останніх саме CG-динуклеотиди з неметильованим цитозином є відповідальними за потенційні імуностимулюючі властивості ДНК.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами і темами. Робота виконана у відділі ензимології пухлин Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України у відповідності з напрямком науково-дослідних робіт Інституту, за темами: „Розробити нові підходи до підвищення ефективності протипухлинних вакцин” (2001–2003 рр., державний реєстраційний № 0101U000784); „Визначення ролі ад’ювантів та імуномодуляторів в реалізації дії протипухлинних вакцин” (2004–2006 рр., державний реєстраційний № 0104U000589) та „Особливості функціонування онкогеному” (2002–2006 рр., державний реєстраційний № 0102U003228).

Фрагмент роботи, присвячений дослідженню інтерфероногенної активності бактеріальної ДНК, проводився у комплексі з лабораторією контролю якості імунобіологічних препаратів Київського науково-дослідного інституту епідеміології та інфекційних захворювань ім. Л.В. Громашевського АМН України за темою: „Вивчити молекулярно-біологічні особливості збудників опортуністичних інфекцій бактеріальної природи, стійких до антибіотиків, у хворих на СНІД” (2002–2004 рр., державний реєстраційний № 0102U000571).

Робота була частково підтримана стипендією від Всесвітньої Федерації Вчених (Лозанна, Швейцарія, 2006–2007 рр.).

Мета дослідження. Створення і дослідження нового ад`юванта для підвищення дії протипухлинної глікопептидної вакцини та визначення його імуномодулюючих і протипухлинних властивостей.

Задачі дослідження.

1. Виділити бактеріальну ДНК з культуральної рідини Bacillus subtilis та охарактеризувати її молекулярно-біологічні особливості.

2. Дослідити імунобіологічні ефекти бактеріальної ДНК з культуральної рідини B. subtilis, збагаченої неметильованими СpG-мотивами.

3. Визначити протипухлинну і антиметастатичну ефективність CpG ДНК з культуральної рідини B. subtilis на різних експериментальних моделях злоякісного росту.

4. Експериментально обґрунтувати можливість підвищення ефективності протипухлинної глікопептидної вакцини шляхом застосування ад`юванта, створеного на основі бактеріальної CpG ДНК з культуральної рідини B. subtilis.

Об`єкт дослідження. Бактеріальна ДНК, збагачена неметильованими СpG-мотивами, протипухлинна глікопептидна вакцина.

Предмет дослідження. Імунологічні та протипухлинні ефекти бактеріальної CpG ДНК і можливість її використання в якості самостійного протипухлинного засобу або в якості ад`юванта з протипухлинною глікопептидною вакциною.

Методи дослідження. Мікробіологічні – культивування бактерій B. subtilis і Staphylococcus aureus; молекулярно-біологічні і біохімічні – виділення і очистка ДНК, вивчення її молекулярно-біологічних особливостей; імунологічні – визначення функціональної активності природних кілерних клітин і перитонеальних макрофагів, дослідження розвитку імунної відповіді на гетерологічний антиген і цитолітичної активності сироватки крові; вірусологічні – визначення продукції інтерферону; цитологічні – вивчення загальної клітинності органів імунної системи; біофізичні – дослідження поверхневого потенціалу імунокомпетентних клітин; методи використання експериментальних модельних систем пухлинного росту; статистичні методи.

Наукова новизна. Вперше досліджені особливості накопичення позаклітинної ДНК у культуральній рідині в процесі культивування B. subtilis GP1-807-03 і вивчені особливості її збагачення на неметильовані CG-динуклеотиди. На основі цієї ДНК створено новий ад`ювант, виявлені його протипухлинні, антиметастатичні та імуномодулюючі властивості. В експериментальних дослідженнях in vivo доведена ефективність застосування бактеріальної CpG ДНК в якості самостійного протипухлинного засобу та в якості ад`юванта з протипухлинною глікопептидною вакциною.

Практичне значення одержаних результатів. Отримано експериментальне обґрунтування доцільності застосування неметильованої CpG ДНК, виділеної з культуральної рідини B. subtilis, в якості ад`юванта з самостійною протипухлинною активністю, який здатний підвищувати ефективність вакцинотерапії.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто була сформульована мета роботи, поставлені основні завдання і налагоджені методи дослідження. Автором зібрана та проаналізована сучасна наукова література за темою дисертації, самостійно виконані наукові дослідження, проведено аналіз первинного матеріалу, статистичну обробку отриманих даних і сформульовано основні наукові положення та висновки дисертації.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були представлені на: Науково-практичній конференції „Проблеми онкоімунології: наукові та прикладні аспекти” (Київ, 2003); Conference for young scientists, PhD students and students of molecular biology and genetics, dedicated to the golden jubilee of the double helix of the DNA and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics, NAS of Ukraine (Kyiv, 2003); VI конференції молодих онкологів України „Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології” (Київ, 2003); V українській конференції молодих вчених, присвяченій пам`яті академіка В.В. Фролькіса (Київ, 2004); First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology (Lviv, 2004); Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых “Биология – наука ХХI века” (Пущино, Россия, 2004); ІІІ съезде онкологов и радиологов СНГ (Минск, Беларусь, 2004); І Всеукраїнській науково-практичній конференції „Вітчизняні протипухлинні препарати: аналіз сьогодення та погляд в майбутнє” (Київ, 2004); доповіді на бюро відділення молекулярної біології, біохімії, експериментальної і клінічної фізіології Національної академії наук України (Київ, 2005); Першій Міжнародній конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2005); Міжнародному форумі “Основи молекулярно-генетичного оздоровлення людини і довкілля” (Київ, 2005); 16th European Students` Conference Charite (Berlin, Germany, 2005); Международной школе-конференции молодых ученых “Системная биология и биоинженерия” (Москва, Россия, 2006); ІІ науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів „Актуальні проблеми фармакології та токсикології” (Київ, 2005); VII конференції молодих онкологів України „Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології” (Київ, 2005); ХІ з`їзді онкологів України (Судак, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 24 наукових праці: 8 статей у провідних фахових виданнях і 15 тез; отримано 1 деклараційний патент України на корисну модель.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, 3-х розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків і списку використаних літературних джерел, який включає 297 найменувань, у тому числі 256 – англійською мовою. Основний зміст дисертації викладений на 183 сторінках машинописного тексту, містить 33 рисунки та 27 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Представлені у роботі дані одержані на експериментальному матеріалі. У дослідженнях використовували мишей чистих ліній (BALB/c, С57Bl/6, CBA), гібридних мишей BDF1 і нелінійних мишей (загальна кількість – 916 тварин), які були отримані з розплідника віварію ІЕПОР НАН України. Утримання мишей та робота з ними проводилися у відповідності до загальноприйнятих міжнародних правил виконання робіт з експериментальними тваринами.

Для створення експериментальних модельних систем злоякісного росту були використані штами пухлин, одержані з Національного банку культур тканин ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України, зокрема саркома 37, саркома 180, карцинома Ерліха, карцинома легені Льюїс, меланома В16 і лімфоїдна лейкемія L1210. Перебіг пухлинного процесу характеризували за стандартними показниками: частота прищеплюваності пухлин; середня тривалість життя (СТЖ) мишей; об`єм (у мм3) і маса (у г) пухлинного вузла; частота та інтенсивність метастазування; швидкість росту метастазів. Для оцінки протипухлинного ефекту розраховували гальмування росту пухлини (ГРП) і збільшення тривалості життя (ЗТЖ) (Трещалина Е.М., 2005).

У роботі було використано два штами бактерії Bacillus subtilis (B. subtilis 7025 і B. subtilis GP1-807-03), з культуральної рідини (КР) якої було ізольовано ДНК-вмісні фракції за стандартною схемою виділення плазмідної ДНК із застосуванням поліетиленгліколю 6000 з подальшою преципітацією у 70% етанолі (Маниатис Т. и соавт., 1984). Концентрацію ДНК визначали за допомогою спектрофотометра СФ-26 („ЛОМО”, СРСР) при довжині хвилі 260 нм, ступінь чистоти зразка ДНК – за співвідношенням оптичної густини 260 та 280 нм. Температуру плавлення ДНК визначали згідно (Зенгер В., 1987). Визначення якості та встановлення розміру молекул ДНК, а також ідентифікацію білків здійснювали за допомогою електрофорезу у вертикальних пластинах поліакриламідного гелю (ПААГ) з використанням 0,1% додецилсульфату натрію (Остерман Л.А., 1983). Для визначення присутності неметильованих CG-динуклеотидів у складі бактеріальної ДНК застосовували рестрикційний аналіз з ендонуклеазою НраІІ (“Sigma”, США) (Sun S., 1996). Результати дії ендонуклеази НраІІ реєстрували за допомогою імпульсного електрофорезу в агарозному гелі з інверсією електричного поля (Elia M.C., 1991). Негативи знімків електрофореграм аналізували за допомогою денситометра Chromoscan LKB (Швеція). В якості негативного контролю у деяких тестах in vitro використовували бактеріальну ДНК, оброблену ДНКазою І. Протипухлинна глікопептидна вакцина (gp50) була отримана з клітин різних штамів пухлин згідно (Шляховенко В.О. і співавт., 2004).

Визначення клітинності лімфоїдних органів і перитонеального змиву проводили за стандартними методиками, використовуючи суправітальне забарвлення трипановим синім. Функціональну активність перитонеальних макрофагів (ПМФ) досліджували за здатністю останніх фагоцитувати і перетравлювати бактеріальні клітини (Априкян В.С. и соавт., 2001), а також у тесті відновлення нітросинього тетразолію (НСТ-тесті). В якості індуктора відновлення НСТ використовували форбол мирістат ацетат (ФМА; “Sigma”, США) у концентрації 10 нг/мл. Для дослідження особливостей генерування ПМФ супероксидних радикал-аніонів і оксиду азоту (NO) було застосовано метод електронного парамагнітного резонансу (Lai C.-S., Komarov A.M., 1994; Buettner G.R., Mason R.P., 2003). В якості спінових уловлювачів були використані гідроксиламін-2,2,6,6-тетраметил-4-оксипіперидин (Інститут хімічної фізики, РАН, Росія) – для визначення супероксидних радикал-аніонів, і диетилдитіокарбамат (“Sigma”, США) – для визначення NO. Цитолітичну активність природних кілерних клітин (ПКК) вивчали в тесті неспецифічного цитолізу in vitro: в якості клітин-мішеней використовували клітини асцитної карциноми Ерліха, співвідношення між пухлинними клітинами (ПК) і ПКК складало 1 : 3. Перед проведенням цитолітичного тесту ПКК або ПК преінкубували (2 год при 37?С) з бактеріальною CpG ДНК у концентрації 0,1 і 1,0 мкг/мл або з розчином ФМА (“Sigma”, США) – 250 нг/мл; інкубація тривала 18 год; у тесті суправітального забарвлення трипановим синім визначали кількість живих ПК у контролі та досліді і розраховували цитолітичний індекс (Фільчаков Ф.В. і співавт., 1997; Шпакова А.П. и соавт., 2000). Здатність лейкоцитів периферійної крові здорових донорів продукувати інтерферон (ІФН) визначали методом пригнічення цитопатогенної дії вірусу везикулярного стоматиту у гомологічній культурі клітин А549 (Ho M., Enders J., 1959). В якості еталонного індуктора ІФН використовували polyI:polyC (“Sigma”, США) у концентрації 10 мкг/мл. Клітинну імунну відповідь характеризували за рівнем реакції гіперчутливості уповільненого типу (РГУТ) на еритроцити барана (ЕБ) (Ильинская А.И. и соавт., 2004). Цитолітичну активність (ЦЛА) сироватки крові мишей визначали за методом (Брондз Б.Д., 1964) у модифікації згідно (Потебня Г.П., 2003). Електрокінетичний потенціал імунокомпетентних клітин у здорових мишей та мишей з пухлинами досліджували методом клітинного електрофорезу (Богуславский Л.И., 1978; Иенсен Г.Л., 1979). Для визначення середньоквадратичної похибки та достовірності отриманих даних використовували комп`ютерну програму GraphPad Instat. Математичну обробку результатів проводили з використанням критерію Стьюдента і застосуванням тесту Стьюдента-Ньюмена-Кельса чи тесту Даннета. Виживаність тварин аналізували за допомогою тесту Каплана-Мейєра.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Виділення, фізико-хімічна характеристика та особливості накопичення бактеріальної ДНК у культуральній рідині B. subtilis. З фільтрату КР B. subtilis на 9-ту добу культивування були виділені чисті фракції ДНК з коефіцієнтом 260/280 – 1,75–1,85. Вихід ДНК при цьому становив у середньому 1,0–1,5 мг на 100 мл КР B. subtilis GP1-807-03 і близько 0,5–0,8 мг на 100 мл КР у випадку B. subtilis 7025. Температура плавлення ізольованої ДНК становила 92,5?С, гіперхромний ефект – 32%; вміст GC- і АТ-пар – 56,6 і 44,4 моль% відповідно. За допомогою електрофорезу у ПААГ показано, що фракції ДНК, виділені з КР на 9-ту добу культивування обох штамів B. subtilis, є подібними і містять два найбільш виражені і постійні компоненти з величиною молекул 2650 та 3050 пар нуклеотидів (рис. 1).

Результати, наведені на рис. 2, свідчать, що позаклітинна ДНК накопичувалась у КР досить нерівномірно і це залежало від тривалості культивування бактерії. Найбільший вміст бактеріальної ДНК у КР B. subtilis GP1-807-03 (0,90–1,55 мг/100 мл КР) спостерігався на 6 і 9-ту добу культивування, зі значеннями коефіцієнта 260/280 – близько 1,75–1,85; при цьому в отриманих фракціях у жодному з випадків присутність білків на електрофореграмах не реєструвалась.

Встановлено, що ДНК-вмісні фракції, ізольовані з КР B. subtilis штамів 7025 і GP1-807-03 на 9-ту добу культивування, виявляли досить високу чутливість до дії НраІІ, що свідчить про відносно високий вміст неметильованих CG-динуклеотидів у їх складі. На рис. 3 показано, що ДНК хребетних (у даному випадку – ДНК з еритроцитів курчати), яка за даними літератури має невисокий вміст CG-динуклеотидів і гіперметильована за залишком цитозину (Krieg A.M., 1995; Pisetsky D.S., 1996), є відносно стійкою до дії НраІІ, порівняно з досліджуваною ДНК з КР B. subtilis GP1-807-03.

Всі фракції ДНК, отримані з КР протягом 10 діб культивування B. subtilis GP1-807-03, виявились досить чутливими до дії НраІІ, однак найбільша чутливість ізольованої бактеріальної ДНК до НраІІ, а отже і збільшення вмісту неметильованих CG-динуклеотидів у її складі, спостерігалися на 7–9-ту добу культивування. Гідроліз ДНК під дією ферменту становив 85–95% (рис. 4).

Таким чином, оскільки ступінь метилювання бактеріальної ДНК був визначений як один з вагомих критеріїв відбору фракцій ДНК з метою подальшого імунотерапевтичного застосування, за результатами даних досліджень для отримання бактеріальної ДНК з КР B. subtilis можна рекомендувати 7–9-ту добу культивування бактерії.

Імунобіологічні властивості бактеріальної CpG ДНК з культуральної рідини B. subtilis. Незважаючи на те, що бактеріальна ДНК, збагачена неметильованими CpG-мотивами, має плейотропний імуностимулюючий ефект, у даному дослідженні доцільним було насамперед вивчити вплив CpG ДНК з КР B. subtilis на показники неспецифічного імунітету, такі як функціональна активність ПМФ і ПКК та інтерфероногенез. Важливо було також з`ясувати вплив бактеріальної CpG ДНК на формування в організмі специфічної імунної відповіді, зокрема реакції імунної системи на введення гетерологічного тимус-залежного антигену і реакції комплемент-залежної цитотоксичності сироватки крові мишей.

У результаті проведених досліджень, встановлено, що одноразове підшкірне введення мишам лінії BALB/c бактеріальної CpG ДНК у дозі 5,0 мг/кг маси тіла призводило до розвитку транзиторної гіперплазії лімфатичних вузлів (л/в) (рис. 5), яка проявлялася у збільшенні маси і клітинності відповідаючого підколінного л/в з максимумом на 8-му добу спостереження (клітинність – (15,5±1,5)?106 клітин у порівнянні з (1,3±0,08)?106 клітин у контрольному л/в). Після одноразового внутрішньочеревного введення бактеріальної CpG ДНК з КР B. subtilis у мишей cпостерігали розвиток транзиторної спленомегалії (рис. 6). При цьому найвищі показники спленічного індексу та клітинності селезінки також були зафіксовані на 8-му добу спостереження і становили: спленічний індекс – 2,5±0,17, клітинність – (228,0±12,8)?106 клітин (p<0,01) проти відповідних контрольних значень – 1,0±0,05 та (105,2±8,2)?106 клітин.

Крім того, на введення бактеріальної CpG ДНК у черевну порожнину дослідні тварини реагували різко вираженою запальною реакцією за типом асептичного перитоніту. На 2-гу добу після введення бактеріальної CpG ДНК клітинність перитонеального змиву досягала пікових значень – 35,5±4,5?106 клітин, а починаючи з 4-ї доби – починала знижуватись, досягаючи показників норми на 12-ту добу спостереження (7,5±0,7?106 клітин) (рис. 7).

Слід зазначити, що всі ефекти, які спостерігались при введенні бактеріальної ДНК тваринам, принаймні ступінь їх прояву, чітко залежали від рівня збагачення ДНК неметильованими CG-динуклеотидами, що було підтверджено дослідженнями, проведеними з використанням ДНК з еритроцитів курчати.

В основу комплексного дослідження впливу бактеріальної CpG ДНК з КР B. subtilis на функціональну активність ПМФ, було покладено низку стандартизованих тестів для вивчення фагоцитарної та метаболічної активності ПМФ. В умовах in vitro та in vivo вивчали модулюючий вплив бактеріальної CpG ДНК на фагоцитарну активність і кисневозалежний окислювальний метаболізм ПМФ (у спонтанному та індукованому НСТ-тестах) у здорових мишей і мишей з солідною карциномою Ерліха.

Вивчення впливу бактеріальної CpG ДНК in vitro (табл. 1. А) та in vivo (табл. 1. Б) на фагоцитарну активність ПМФ показало, що досліджувана субстанція має виражений стимулюючий ефект, який спостерігався на різних етапах фагоцитозу: посилювалась здатність ПМФ вступати у фагоцитоз (виражена у вигляді індексу Гамбурга) і зростали їх поглинаючі можливості (виражені у вигляді індексу Райта). Крім того, у ПМФ відмічалося підвищення здатності до розпластування і перетравлювання захоплених бактерій.

Відмічена здатність бактеріальної CpG ДНК потенціювати фагоцитарну активність ПМФ, отриманих від мишей з солідною карциномою Ерліха на 10-ту добу після трансплантації пухлини (табл. 1 А і Б).

Встановлено, що інкубація ПМФ з бактеріальною CpG ДНК (табл. 2. А) чи одноразове введення її мишам (табл. 2. Б) призводить до значної активації метаболічних процесів усередині ПМФ, рівень яких детектували в НСТ-тесті. У випадку ПМФ, отриманих від мишей з підшкірно трансплантованою карциномою Ерліха, під впливом бактеріальної CpG ДНК спостерігали не лише відновлення метаболічної активності цих клітин, а й значне зростання рівня останньої (табл. 2). Слід відмітити, що інкубація ПМФ з бактеріальною CpG ДНК, обробленою ДНКазою І, не впливала на рівень їх метаболічної активності (табл. 2. А), що виключає ймовірність прояву імуностимулюючої дії з боку ендотоксину, присутнього у складі досліджуваних зразків бактеріальної ДНК.

Таблиця 1

Вплив бактеріальної CpG ДНК з КР B. subtilis in vitro (А) та in vivo (Б) на

фагоцитарну активність ПМФ мишей

Група

мишей | Показник інтенсивності фагоцитозу

ІГ, % | ІР | ОІП | ІЗФ | РКМ

Без пухлини | Контроль | 53,0±5,0 | 2,5±0,2– | 50,5±4,5 | 39,0±4,5

CpG ДНК | 2,0 мкг/мл | 70,0±7,5** | 4,6±0,5** | 184,0±6,5 | 75,0±6,0** | 56,0±8,0**

5,0 мкг/мл | 95,0±7,0** | 4,5±0,3** | 180,0±8,0 | 87,0±5,5** | 59,0±6,5**

З

пухлиною | Контроль | 44,5±4,5 | 2,2±0,4– | 39,5±6,0 | 36,0±3,0

CpG ДНК | 2,0 мкг/мл | 59,2±9,0* | 2,9±0,3** | 132,0±7,5 | 50,0±8,0* | 44,0±5,5

5,0 мкг/мл | 81,0±9,0** | 3,3±0,2** | 150,0±6,5 | 56,5±7,5** | 51,0±9,0**

Таблиця 2

Вплив бактеріальної CpG ДНК з КР B. subtilis in vitro (А) та in vivo (Б) на

метаболічну активність ПМФ мишей

Примітки: ІНСТспонт. – індекс активності ПМФ у спонтанному НСТ-тесті, ІНСТіндук. – індекс активності ПМФ у індукованому НСТ-тесті, РК – резервний коефіціент; *p<0,05, **p<0,01 відносно відповідного контролю; #p<0,05, ##p<0,01 відносно показника у групі „5,0 мкг/мл CpG ДНК”.

Слід відмітити, що введення тваринам з пухлиною бактеріальної CpG ДНК з КР B. subtilis помітно відображалося на функціональному резерві ПМФ, особливо у випадку застосування досліджуваної субстанції у дозі 0,5 мг/кг маси тіла, коли резервний коефіціент (РК) становив 1,350,2 (p<0,05) проти 1,00,25 у контролі (табл. 2. Б).

Показано, що бактеріальна CpG ДНК з КР B. subtilis має дозозалежний вплив на цитолітичну активність ПКК і на чутливість ПК до неспецифічного цитолізу (рис. 8). Слід зазначити, що преінкубація ПКК з 1,0 мкг/мл бактеріальної CpG ДНК підвищувала цитолітичний потенціал ПКК на рівні дії еталонного стимулятора клітин лімфоїдно-макрофагальних ліній – ФМА. При цьому значення цитолітичного індексу зростало до 24% (p<0,05) у порівнянні з 16% у контролі.

Отримані результати наступної серії досліджень свідчать, що бактеріальна CpG ДНК з КР B. subtilis є потенційним індуктором ІФН. Як видно з табл. 3, після інкубації лейкоцитів периферійної крові здорових донорів з різними концентраціми бактеріальної CpG ДНК має місце виражений інгібуючий вплив отриманих супернатантів на цитопатогенну дію вірусу везикулярного стоматиту, що пояснюється наявністю в них ІФН-б і -г з сумарною активністю близько 2560 МО/мл. Слід відмітити, що у даному дослідженні здатність бактеріальної CpG ДНК індукувати синтез і секрецію ІФН лейкоцитами периферійної крові знаходилася на рівні такої при дії еталонного індуктора ІФН – рolyІ:polyС.

Таблиця 3

Інтерфероногенні властивості бактеріальної CpG ДНК з КР B. subtilis

Концентрація CpG ДНК, мкг/мл | Активність ІФН, МО/мл | Тип ІФН | pH 2 | + pH 2 | 1,0 | 2560 | 1280 | б і г2,5 | 2560 | 640 | б і г17,5 | 2560 | 1280 | б і гКонтроль | 4 | 4 | бPolyІ:polyС | ? 2560 | б

Примітки: – pH 2” – рН тестованих супернатантів залишали незміненим, „+ pH 2” – рН тестованих супернатантів змінювали до 2,0.

Показано, що одноразове введення мишам бактеріальної CpG ДНК з КР B. subtilis у різних дозах здатне потенціювати розвиток РГУТ на ЕБ. У всіх випадках спостерігалася позитивна модуляція РГУТ під впливом бактеріальної CpG ДНК, однак, статистично достовірне зростання даного показника мало місце лише тоді, коли введення досліджуваної субстанції здійснювали за 24 год до проведення сенсибілізації ЕБ (рис. 9).

Ефект бактеріальної CpG ДНК на розвиток гуморальної імунної відповіді було досліджено в реакції комплемент-залежного цитолізу сироватки крові мишей з підшкірно трансплантованою карциномою Ерліха. Як показано в табл. 4, підвищення ЦЛА сироватки крові у мишей залежало від дози бактеріальної CpG ДНК, кількості введень, а також від тривалості росту пухлини.

Найбільш виражене та стійке підвищення ЦЛА сироватки крові спостерігалося при введенні мишам бактеріальної CpG ДНК у дозі 1,0 мг/кг маси тіла. За цих умов вже після 2-го введення рівень ЦЛА сироватки крові втричі перевищував контрольне значення, а після 3-го введення – досягав 68,3%, тоді як у контролі даний показник становив лише близько 14,5%.

Таблиця 4

Цитолітична активність сироватки крові мишей з солідною карциномою Ерліха після введення бактеріальної CpG ДНК

Доза CpG ДНК,

мг/кг маси тіла | Кількість введень CpG ДНК/ доба після перещеплення пухлини | ЦІ, % | 0,25 | 1/2-а | 11,5,7* | 2/5-а | 48,4,5** | 3/12-а | 36,5,0** | 1,0 | 1/2-а | 15,0,5* | 2/5-а | 54,2,0** | 3/12-а | 68,3,5** | Контроль | 0/2-а | 5,8±1,1 | 0/5-а | 17,2,5 | 0/12-а | 14,5,0 |

Таким чином, результати проведених експериментальних досліджень вказують на те, що бактеріальна CpG ДНК з КР B. subtilis проявляє імуногенні властивості, а також виражену імуномодулюючу та ад`ювантну активність.

Застосування бактеріальної CpG ДНК з культуральної рідини B. subtilis в імунотерапії тварин з пухлинами. Зважаючи на те, що бактеріальна CpG ДНК, виділена з КР B. subtilis, має виражені імуностимулюючі та ад`ювантні властивості, стратегія її імунотерапевтичного застосування базувалася на двох основних напрямках: застосуванні у монорежимі та використанні бактеріальної CpG ДНК в якості ад`юванта з метою підвищення ефективності протипухлинної глікопептидної вакцини – gp50. Окремі підрозділи роботи присвячені вивченню особливостей локального застосування та антиметастатичної активності бактеріальної CpG ДНК окремо та у поєднанні з gp50.

Протипухлинну ефективність оцінювали за умов профілактичного і терапевтичного режимів введення досліджуваних препаратів. У першому випадку бактеріальну CpG ДНК (доза – 0,5 мг/кг маси тіла) чи gp50 (доза – 10.000 екв. ПК/тварину) вводили підшкірно у подушечку задньої лапки тричі в об`ємі 0,1 мл фізіологічного розчину хлориду натрію з інтервалом у 3 доби. Через 7 діб після останнього введення тваринам трансплантували відповідну пухлину. При терапевтичному режимі застосування бактеріальну CpG ДНК чи gp50 вводили аналогічно, здійснюючи першу ін`єкцію через 24 год після трансплантації ПК. Введення досліджуваних субстанцій проводили тричі з інтервалом у три доби. Тварини контрольних груп отримували ін`єкції фізіологічного розчину хлориду натрію за аналогічними схемами.

На моделі солідної саркоми 37, підшкірно трансплантованої білим нелінійним мишам, було показано, що застосування бактеріальної CpG ДНК з КР B. subtilis у монорежимі призводить до статистично достовірного зростання СТЖ у мишей з транспантованими пухлинами у порівнянні з контрольними тваринами. Слід відмітити, що показник ЗТЖ був вищим у групі тварин, яким вводили бактеріальну CpG ДНК за терапевтичною схемою (p<0,01) (табл. 5).

Таблиця 5

Ефективність застосування бактеріальної CpG ДНК окремо та поєднано з gp50 на моделі солідної форми саркоми 37

Група (n=10) | Режим застосування | СТЖ, діб | ЗТЖ, % | Контроль | профілактичний | 42,8±11,3–

CpG ДНК | 57,2±19,9* | 33,6

gp50 | 39,64,4– | 7,5

gp50+CpG ДНК | 65,6±11,4**/## | 53,3

Контроль | терапевтичний | 42,8±9,2

CpG ДНК | 67,4±16,2** | 57,5

gp50 | 40,2±8,3 | 6,1

gp50+CpG ДНК | 65,3±22,8**/## | 52,6

Комбіноване застосування бактеріальної CpG ДНК з gp50 покращувало ефективність останньої. Показники СТЖ у групах тварин, яким вводили бактеріальну CpG ДНК і gp50 складали 65,6±11,4 і 65,3±22,8 діб (p<0,01) при профілактичному і терапевтичному режимах застосування відповідно, тоді як при введенні лише gp50 – 39,6±4,4 і 40,2±8,3 діб відповідно. Було досягнуто збільшення тривалості життя тварин з пухлинами на 53,3 і 52,6 % у випадку профілактичного і терапевтичного режимів застосування досліджуваних препаратів відповідно. Крім того, слід відмітити, що 30% тварин, яким за терапевтичною схемою проводили комбіноване введення gp50 з бактеріальною CpG ДНК, залишалися живими на день завершення експерименту (90-а доба після перещеплення пухлини).

Ефективність локального застосування бактеріальної CpG ДНК з КР B. subtilis досліджували на моделі саркоми 180, підшкірно трансплантованої мишам BALB/c. Досліджували ефективність застосування бактеріальної CpG ДНК окремо та у комплексі з gp50 за умов перипухлинного (п/п) і внутрішньопухлинного (в/п) способів введення. Бактеріальну CpG ДНК (доза – 0,25 мг/кг маси тіла), gp50 (доза – 10.000 екв. ПК/тварину) чи їх комплекс вводили тричі: на 7-му, 10 і 14-ту добу після трансплантації пухлини. Результати, представлені в табл. 8, свідчать, що локальне застосування бактеріальної CpG ДНК окремо мало виражений гальмівний вплив на ріст пухлин лише у випадку п/п введення досліджуваної субстанції, тоді як при в/п введенні бактеріальної CpG ДНК не було відмічено статистично достовірного протипухлинного ефекту. Слід зазначити, що застосування gp50 окремо також призводило до уповільнення росту пухлин, достовірно вираженого (p<0,05) лише у випадку в/п способу вакцинації (табл. 6), у той час як застосування бактеріальної CpG ДНК у якості ад`юванта статистично достовірно підвищувало ефективність gp50 (p<0,01). Показник ГРП за цих умов більше, ніж у 1,5 рази перевищував такий при локальному введенні gp50 окремо.

Таблиця 6

Вплив локального застосування бактеріальної CpG ДНК, gp50 та їх комбінації на пухлинний ріст у мишей з трансплантованою саркомою 180

Група | n | Середня маса пухлини, мг | ГРП, %

Контроль | 12 | 1968,8±1172,6–

CpG ДНК п/п | 8 | 800,0±706,9** | 59,4

CpG ДНК в/п | 8 | 2087,5±795,9– | 6,0

gp50 п/п | 8 | 1159,9±875,4 | 41,1

gp50 в/п | 8 | 1000,0±268,3* | 49,2

{gp50+CpG ДНК} п/п | 9 | 524,6±391,0** | 73,4

{gp50+CpG ДНК} в/п | 9 | 471,6239,5** | 76,0

Примітки: *p<0,05, **p<0,01 порівняно з контролем.

Результати, наведені в табл. 7, демонструють виражену антиметастатичну активність бактеріальної CpG ДНК, застосування якої суттєво впливає на частоту метастазування у мишей C57Bl/6 з перещепленою меланомою В16, а також на ріст і поширення метастазів. Закономірності особливостей метастазування, виявлені за умов профілактичної схеми застосування бактеріальної CpG ДНК, є подібними до таких при терапевтичному введенні даної субстанції, однак отриманий антиметастатичний ефект був більш вираженим.

Таким чином, результати проведених експериментальних досліджень, свідчать, що бактеріальна CpG ДНК, виділена з КР B. subtilis, проявляє імуногенні властивості, а також має виражену імуномодулюючу та ад`ювантну активність, яка проявляється у вигляді стимуляції функціональних показників, що характеризують неспецифічну та адаптивну імунну відповідь.

Таблиця 7

Вплив застосування бактеріальної CpG ДНК на показники метастазування у мишей з перещепленою меланомою В16

Група | Режим застосування | Частота метастазування, % | Середня кількість метастазів | Середній об`єм метастазів, мм3 | Контроль | профілактичний | 90,0 | 19,8±3,5 | 171,1±11,2

CpG ДНК | 50,0 | 10,0±3,0** | 67,9±17,3**

Контроль | терапевтичний | 100,0 | 23,5±5,8 | 180,4±15,2

CpG ДНК | 70,0 | 13,4±4,0** | 110,8±21,5**

Примітки: **p<0,01 порівняно з відповідним контролем.

Важливо відмітити, що при наявності пухлини в організмі застосування бактеріальної CpG ДНК з КР B. subtilis дозволяє не лише подолати спричинену ростом пухлини імуносупресію, а й значно підвищує досліджувані показники імунітету у тварин з трансплантованими пухлинами. Дослідженнями встановлено виражену протипухлинну та антиметастатичну активність бактеріальної CpG ДНК, а також виявлено, що при застосуванні останньої в поєднанні з протипухлинною глікопептидною вакциною спостерігається суттєвий ад`ювантний ефект, який проявляється у підвищенні ефективності вакцинації і залежить від пухлинної моделі та режиму введення препаратів. Враховуючи наведені вище результати досліджень можна стверджувати про доцільність застосування збагаченої на неметильовані CpG-мотиви бактеріальної ДНК, ізольованої з КР B. subtilis, в імунотерапії злоякісних новоутворень в якості окремого імунотерапевтичного агента, а також в якості ад`юванта для підвищення ефективності протипухлинної глікопептидної вакцини.

ВИСНОВКИ

Робота присвячена проблемі імунотерапії злоякісних новоутворень, а саме створенню нового ад`юванта на основі CpG ДНК бактеріального походження, експериментальному дослідженню його імуномодулюючих властивостей і протипухлинної та антиметастатичної ефективності при застосуванні окремо та у поєднанні з протипухлинною глікопептидною вакциною.

1. Ідентифіковано, виділено та охарактеризовано позаклітинну ДНК з культуральної рідини Bacillus subtilis; визначено оптимальну тривалість культивування штаму B. subtilis GP1-807-03, яка сприяє максимальному виходу позаклітинної ДНК, збагаченої на залишки неметильованого цитозину.

2. Показано, що введення експериментальним тваринам CpG ДНК з культуральної рідини B. subtilis, на відміну від ДНК хребетних, викликає зміни в лімфоїдних органах, які полягають у збільшенні їх маси та клітинності і мають транзиторний характер.

3. CpG ДНК з культуральної рідини B. subtilis здатна підвищувати функціональну активність клітин-ефекторів неспецифічного імунітету (макрофагів і природних кілерних клітин) та індукувати інтерферони б і г при застосуванні in vitro та in vivo.

4. Спектр імунологічних ефектів CpG ДНК з культуральної рідини B. subtilis включає активуючий вплив на клітинні і гуморальні реакції адаптивного імунітету: CpG ДНК підвищує гіперчутливість сповільненого типу на введення гетерологічного антигену, а також специфічну цитотоксичність сироватки крові мишей.

5. На різних моделях пухлинного росту показано, що застосування CpG ДНК з культуральної рідини B. subtilis супроводжується протипухлинним та антиметастатичним ефектами, вираженість яких може залежати від штаму пухлини, режиму застосування і способу введення CpG ДНК.

6. Експериментально доведена можливість використання CpG ДНК з культуральної рідини B. subtilis в якості ад`юванта для підвищення ефективності протипухлинної глікопептидної вакцини.

Автор висловлює щиру подяку д.м.н., проф. Сидорику, д.б.н. А.П. Бурлаці, д.м.н. Г.П. Потебні, к.б.н. В.В. Козак, к.б.н. Ю.В. Янішу (ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України); д.м.н. С.Л. Рибалко (Київський науково-дослідний інститут епідеміології та інфекційних захворювань ім. Л.В. Громашевського АМН України); к.б.н. І.П. Олексієнку (Національний аграрний університет України) за надання методичної та консультативної допомоги.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Shlyakhovenko V.A., Olishevsky S.V., Kozak V.V., Yanish Y.V., Rybalko S.L. Anticancer and immunostimulatory effects of nucleoprotein fraction of Bacillus subtilis 7025 culture medium filtrate // Experimental Oncology – 2003. – V.25, № 2. – Р. 119–123. (Здобувачем особисто проведено дослідження впливу нуклеопротеїдної фракції з фільтрату культуральної рідини Bacillus subtilis 7025 на цитолітичну активність природних кілерних клітин, здійснено аналіз і математичну обробку результатів дослідження, підготовлено роботу до друку).

2. Olishevsky S.V., Kozak V.V., Yanish Y.V., Shlyakhovenko V.A. Immunostimmulatory CpG DNA in cancer vaccinotherapy // Experimental Oncology – 2003. – V.25, № 2. – P. 83–92. (Здобувачем особисто підібрано і проаналізовано наукову літературу стосовно можливостей застосування CpG ДНК в імунотерапії злоякісних новоутворень, підготовлено роботу до друку).

3. Olishevsky S., Kozak V., Yanish Yu., Potebnya G., Lisovenko G., Olixienko I., Mazur O., Rybalko S., Shlyakhovenko V. Characteristics of extracellular DNA containing unmethylated CpG motifs isolated from Bacillus subtilis culture medium filtrate // Experimental Oncology – 2004. – V.26, № 4. – P. 265–270. (Здобувачем особисто проведено планування схеми експерименту, виділення бактеріальної ДНК з культуральної рідини B. subtilis, підготовлено зразки ДНК до проведення електрофорезу і проведено рестрикційний аналіз ДНК; здійснено аналіз та узагальнення результатів дослідження).

4. Olishevsky S., Shlyakhovenko V., Kozak V., Yanish Yu. Response of different organs of immune system of mice upon administration bacterial CpG DNA // Experimental Oncology – 2005. – V.27, № 4. – Р. 290–297. (Здобувачем особисто проведено планування схеми експерименту і виділення бактеріальної ДНК з культуральної рідини B. subtilis, здійснено імунізацію тварин і визначення клітинності лімфоїдних органів, аналіз та математичну обробку результатів, підготовлено роботу до друку).

5. Олішевський С.В., Яніш Ю.В., Козак В.В., Шляховенко В.О. Вплив бактеріальної CpG ДНК на електрокінетичний потенціал клітин імунної системи мишей // Доповіді НАН України. – 2005. – № 11. – С. 178–182. Здобувачем особисто проведено планування схеми експерименту, виділення бактеріальної ДНК з культуральної рідини B. subtilis, здійснено імунізацію тварин та отримання імунокомпетентних клітин з лімфоїдних органів, підготовлено роботу до друку).

6. Olishevsky S, Burlaka A, Sidorik E, Shlyakhovenko V, Garpenko Yu, Kozak V. Modulation of ROS/NO production by murine peritoneal macrophages in response to bacterial CpG DNA stimulation. Exp. Oncol. – 2006. – V.28, № 2. – Р. 114–120. (Здобувачем особисто проведено виділення бактеріальної ДНК з культуральної рідини B. subtilis, здійснено імунізацію тварин, отримання імунокомпетентних клітин з лімфоїдних органів, проведено аналіз та узагальнення результатів, підготовлено роботу до друку).

7. Олішевський С.В., Козак В.В., Яніш Ю.В., Артамонова А.Б., Шляховенко В.О. Зміни в органах імуногенезу мишей, викликані бактеріальною ДНК, збагаченою неметильованими CG-динуклеотидами // Доповіді НАН України. – 2006. – № 3. – С. 175–181. (Здобувачем особисто проведено планування схеми експерименту, виділення бактеріальної ДНК з культуральної рідини B. subtilis, здійснено імунізацію тварин та визначення клітинності лімфоїдних органів, аналіз і математичну обробку результатів, підготовлено роботу до друку).

8. Олишевский С.В., Козак В.В., Яниш Ю.В., Рыбалко С.Л., Шляховенко В.А. Иммуностимулирующая CpG ДНК: перспективы клинического применения в онкологии // Онкология. – 2006. – Т. 8, № 2. – С. 209–217. (Здобувачем особисто підібрано і проаналізовано наукову літературу стосовно можливостей застосування CpG ДНК в імунотерапії злоякісних новоутворень, підготовлено роботу до друку).

9. Деклараційний патент на