УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР

“ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ

ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ”

Пономаренко Діана Олександрівна

УДК:619:616-022.7:578.834:579.887:636.5(477.61)

ОСОБЛИВОСТІ МІКОПЛАЗМЕННО – ВІРУСНОЇ ІНФЕКЦІЇ КУРЕЙ В ПТАХОГОСПОДАРСТВАХ ПІВДЕННО-СХІДНОГО РЕГІОНУ УКРАЇНИ

16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Харків – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Луганському національному аграрному університеті

Міністерства аграрної політики України

Науковий керівник: кандидат ветеринарних наук

Пархоменко Людмила Іванівна, Луганський

національний аграрний університет МАП України,

доцент кафедри мікробіології і вірусології.

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук

Чечоткіна Наталія Павлівна,

Національний науковий центр “Інститут

експериментальної і клінічної

ветеринарної медицини” УААН,

завідувач лабораторії інфекційної патології

відтворення тварин;

доктор ветеринарних наук, професор

Ковальов Василь Львович,

Південний філіал “Кримський агротехнологічний

університет” Національного аграрного університету,

завідувач кафедри епізоотології, паразитології та

ветсанекспертизи.

Провідна установа: Сумський національний аграрний університет, МАП

України, кафедра вірусології, патанатомії та

хвороб птиці, м. Суми.

Захист дисертації відбудеться “ 24 ” січня 2007 р. о 9. 30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 в ННЦ “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ННЦ “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий “ 20 ” грудня 2006 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук, професор А.Ф. Бабкін

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В останні роки в птахогосподарствах із різним напрямком продуктивності реєструють захворювання, обумовлені впливом інфекційних агентів, які спричиняють порушення імунної системи організму птиці та значні економічні збитки, пов’язані із вибраковкою, загибеллю, зниженням запланованої продуктивності, низькою імунною відповіддю щодо вакцинних штамів вірусів.

Найбільш поширеними серед птиці, що утримується в птахогосподарствах України, є респіраторні інфекції, спричинені вірусами, мікоплазмами та їх асоціаціями (Байдевлятов А.Б.,1995; Биженко В.П., Манченко В.М.,1995; Бусол В.А.,1995; Прискока В.А., Достоєвський П.П., Борзяк А.Г., 1995; Красников Г.А., Маценко Е.В., Келеберда Н.И., 2001).

Поширення змішаних інфекцій пов’язане із комплектацією птахогосподарств птицею із різних регіонів та далекого зарубіжжя, імунізацією живими вакцинами, які обумовлюють поствакцинальну реакцію з наступним ускладненням вторинною мікрофлорою (мікоплазми, E.coli, сальмонели, пастерели, кокова мікрофлора, віруси) внаслідок зміни мікробної рівноваги в організмі птиці (Кіприч В.В., Трускова Т.Ю., 1998; Колганов А.В.,1998; Зон Г.А., 2005).

Асоціація мікоплазм та вірусу інфекційного бронхіту курей (ВІБК) займає значне місце серед змішаних респіраторних інфекцій птиці (Стегній Б.Т., Калін П.С., 2001; Борхсениус С.Н.,2002).

За останні роки респіраторний мікоплазмоз разом з адено- та реовірусними інфекціями, колібактеріозом та іншими захворюваннями вірусної та бактеріальної етіології призводить до зниження імунологічної реактивності птиці, гальмує формування поствакцинального імунітету у курчат, в тому числі щодо ІБК (Белая О.Ф., 1986; Прискока В.А., 1995; Branton S.L. та інші, 1997; Van saene H.K., 1998; Борисов О.В., Хлібова Т.В., 1998; Ігнатов М.М., Герман В.В., 2001).

На цей час актуальними задачами є удосконалення методів діагностики та попередження виникнення асоціації інфекційного бронхіту курей та респіраторного мікоплазмозу. Виникає необхідність у проведенні комплексних досліджень з індикацією та ідентифікацією збудників за допомогою сучасних методів.

Впровадження у діагностику асоційованих інфекцій, поряд із основними методами, імунологічних та гістоморфологічних критеріїв оцінки впливу збудників на організм є необхідною умовою постійного контролю епізоотичного стану, вирощування здорової птиці та отримання екологічно чистої продукції птахівництва.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Робота виконана на кафедрі мікробіології і вірусології в лабораторії науково - виробничого центру ветеринарної медицини птахівництва (НВЦВМП) Луганського національного аграрного університету, ННЦ „Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини”, м. Харків, згідно з темою “Вивчення інфекційної патології молодняка сільськогосподарських тварин і птиці, розробка ефективних заходів боротьби в господарствах південно – східної частини України” № 01040005403 держреєстрації.

Мета і задачі досліджень. Метою нашої роботи було: визначення ролі асоційованої інфекції респіраторного мікоплазмозу та інфекційного бронхіту курей в етіології захворювань птиці, особливостей перебігу цієї асоціації в птахогосподарствах різних напрямків продуктивності, враховуючи всі складові асоційованої інфекції та їх вплив на імунну систему птиці для оптимізації діагностики асоційованого перебігу РМ та інфекційного бронхіту курей.

Для досягнення мети були поставлені такі задачі:

1.

2.

3.

4.

5.

Об’єкт дослідження: збудники респіраторного мікоплазмозу та інфекційного бронхіту курей.

Предмет дослідження: епізоотологічний моніторинг щодо асоціації респіраторного мікоплазмозу та інфекційного бронхіту курей в птахогосподарствах з різним напрямком продуктивності; динаміка формування специфічного імунітету щодо вірусу інфекційного бронхіту курей; індикація та ідентифікація мікоплазми; стан гуморального та клітинного імунітету при асоційованому перебігу респіраторного мікоплазмозу та інфекційного бронхіту курей; функціональні та морфологічні зміни в імунокомпетентних органах при асоційованому перебігу інфекційного бронхіту курей та респіраторного мікоплазмозу.

Методи досліджень: епізоотологічні, клінічні, патологоанатомічні, серологічні, бактеріологічні, імунологічні, гістоморфологічні, біологічні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Визначена епізоотична ситуація відносно респіраторного мікоплазмозу серед курчат, а також асоційований перебіг цієї інфекції з вірусом інфекційного бронхіту курей та іншими супутніми вірусними та бактеріальними збудниками серед дорослої птиці в птахогосподарствах південно-східного регіону України.

У виробничих умовах та експериментально доведено негативний вплив мікоплазм на формування поствакцинального імунітету щодо вірусу інфекційного бронхіту курей. Встановлено і з'ясовано характер змін імунологічних та гематологічних показників крові птиці різного напрямку продуктивності при циркуляції в стаді мікоплазм та вірусу інфекційного бронхіту в умовах птахогосподарства та в експерименті.

Вперше визначений рівень гістоморфологічних змін імунокомпетентних органів при зараженні курчат мікоплазмами та вірусом інфекційного бронхіту курей як моно, так і в асоціації.

На підставі серологічного та імунологічного моніторингу, а також вивчення гістоструктури імунокомпетентних органів зроблено обґрунтовані пропозиції щодо визначення стану імунної системи організму птиці для оптимізації діагностики асоційованого перебігу респіраторного мікоплазмозу та інфекційного бронхіту курей.

Практичне значення отриманих результатів.

Впровадження у діагностику асоційованих інфекцій поряд із основними методами імунологічних та гістоморфологічних критеріїв оцінки впливу збудників на організм дає можливість прогнозувати виникнення мікоплазменної інфекції, а також імунну відповідь на введення вакцинних штамів вірусу інфекційного бронхіту курей при наявності респіраторного мікоплазмозу та коригувати імунну резистентність курчат різних кросів та напрямків продуктивності. Результати експериментальних досліджень щодо визначення впливу асоційованих інфекцій на імунний стан птиці та напруженість імунітету до вакцинного штаму ВІБК використані у методичних рекомендаціях “Стан імунної системи організму курей різних напрямків продуктивності при асоційованому перебігу респіраторного мікоплазмозу та інфекційного бронхіту в птахогосподарствах Луганської області” та “Визначення імунологічних та гістоморфологічних показників при асоційованому перебігу мікоплазмозу та інфекційного бронхіту птиці”, які затверджені вченою радою Луганського НАУ та управлінням ветеринарної медицини Луганської області у 2006 році і запропоновані для використання фахівцям лабораторій ветеринарної медицини та промислових птахофабрик.

Матеріали дисертаційної роботи використовуються в навчальному процесі на кафедрі мікробіології і вірусології Луганського НАУ.

Особистий внесок здобувача полягає у самостійному виконанні експериментальної частини роботи, зокрема: серологічних, гематологічних, імунологічних досліджень крові птиці різних вікових груп та напрямків продуктивності, ізоляції мікоплазми та її культивування, відбору матеріалу та виготовлення гістологічних препаратів. Частина досліджень виконана у відділах гістоморфології та молекулярної діагностики ННЦ ІЕКВМ. Узагальнення первинних даних, їх аналіз і статистична обробка, а також оформлення рукопису здійснені автором особисто.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були повідомлені та обговорені на засіданнях кафедри мікробіології і вірусології Луганського НАУ, на щорічних звітних наукових конференціях Луганського НАУ в 2002 - 2006 рр.; на ІІ-й науково-практичній конференції міжнародної асоціації паразитоценологів (Луганськ, 2002 р); міжнародній науково-практичній конференції “Ветеринарная медицина – 2004: современные аспекты разработки, маркетинга и производства ветеринарных препаратов” (м.Феодосія, 2004 р); міжнародній науково-практичній конференції “Ветеринарна медицина – 2005: сучасний стан та актуальні проблеми забезпечення ветеринарного благополуччя тваринництва” (Ялта, 2005 р).

Публікації. Основний зміст дисертації викладений у 10 друкованих працях у фахових виданнях України та Istanbul Turkey (Турция).

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 125 сторінках, складається із вступу, огляду літератури, власних досліджень, їх аналізу і узагальнення, висновків та пропозиції для виробництва, списку використаних джерел, який включає 310 джерел, з них 80 іноземних, містить 30 таблиць, 23 рисунки та 6 додатків.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Роботу виконували протягом 2001-2004 років на базі лабораторії кафедри мікробіології і вірусології Луганського НАУ, вірусологічному, серологічному та бактеріологічному відділах обласної державної лабораторії ветеринарної медицини м. Луганська, відділі гістоморфології, хвороб птахів та молекулярної діагностики ННЦ ІЕКВМ, в трьох птахогосподарствах Луганської області різних напрямків продуктивності: ВАТ “Сімейкінське”, СТОВ “Авіс” та ТОВ “СФ Агроукрптаха”.

Матеріалом для досліджень служили: 40 трупів курей віком від 110 до 300 діб, 125 голів курчат 15 – 60-добового віку; 230 задохликів; сироватки крові 1600 проб; стабілізованої крові 150 проб.

Рівень поствакцинальних та постінфекційних антитіл щодо вірусу інфекційного бронхіту, реовірусу, аденовірусу визначали в РНГА за методиками В.В. Германа (1988). В реакції непрямої гемаглютинації використовували еритроцитарні діагностикуми ННЦ “ІЕКВМ”.

Для прижиттєвої діагностики мікоплазмозу застосовували сироватко-краплинну реакцію аглютинації та імуноферментний аналіз. Методом ІФА виявляли також наявність антитіл до вірусу інфекційного бронхіту Дослідження методом ІФА проводили в Біо-тест – лабораторії з використанням діагностичних тест-систем фірми IDEXX згідно з настанов по їх застосуванню.

Бактеріологічні дослідження проводили згідно з “Методичними рекомендаціями з діагностики, профілактики та лікування респiраторного мікоплазмозу (М. gall. – інфекція) та колібактеріозу в промислових птахогосподарствах” – Бєлгород (1978). Для визначення гемаглютинаційних властивостей мікоплазми застосовували РГА. ДНК мікоплазми та вірусу інфекційного бронхіту курей виділяли з патологічного матеріалу, використовуючи Ampli Taq Cold DNA полімерази, згідно з учбово-методичним посібником “Детекція збудників інфекційних захворювань тварин за допомогою полімеразної ланцюгової реакції” (ХДЗВА, 2003). Для визначення патогенності виділених культур мікоплазм ставили біопробу на курчатах 20 – 30-добового віку.

З метою визначення взаємовпливу виділених культур мікоплазм та вірусу інфекційного бронхіту на організм курчат 20 – 30-добового віку було проведено три експериментальних досліди в умовах віварію ЛНАУ. В першому досліді використовували курчат з ВАТ “Сімейкінське”, з яких було сформовано дві дослідні групи. В другому досліді курчат отримали від домашньої неімунізованої птиці, сформували чотири групи. В третьому – курчата, з яких було сформовано сім дослідних груп, мали материнські антитіла до вірусу інфекційного бронхіту. Курчат заражали у віці 20 - 30 діб бульйонною культурою M. gallisepticum 3-го, 10-го та 11-го пасажів (концентрація мікробних клітин 220 млн/см3) та суспензією з патологічного матеріалу, оброблену пеніциліном та ацетатом талію, а також вакцинними штамами МА-5, 4/91 та епізоотичним штамом ЛІ-1 вірусу інфекційного бронхіту зі штамом 4/91, сокультивованих на курячих зародках, які вводили інтраназально та інтраокулярно у дозі 0,25 см3/голову як моно, так і одночасно.

У віці 110 діб (дослід 1) та 50 діб (досліди 2, 3) курчат досліджували клінічно, патологоанатомічно, імунологічно, серологічно (ІФА, РНГА), бактеріологічно, в полімеразно-ланцюговій реакції, а також проводили гістологічні дослідження імунокомпетентних органів.

Виділення лімфоцитів проводили за методом Bojum (1968). Загальну кількість Т – лімфоцитів визначали методом спонтанного розеткоутворення з еритроцитами барана за модифікованим методом А.Н.Чередєєва та співавторів (1984). Кількість В – лімфоцитів визначали за методом N.F. Mendes (1973) комплементарним розеткоутворенням з еритроцитами барана, що містять активні компоненти. Визначення кількості теофілін–чутливих (Т – супресорів) та резистентних до дії теофіліну (Т – хелпери) клітин проводили за методом В.М. Фролова (1989). Імунорегуляторний індекс розраховували як співвідношення Т - хелперів до Т – супресорів. Загальний рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) та їх фракційний склад за молекулярною масою визначали у модифікації В.М. Фролова (1989). Ig A, Ig M, Ig G– визначали за методом Манчіні (1976). Еритроцити, лейкоцити та тромбоцити підраховували за методом О.О. Кудрявцева (1969). Лейкограму виводили методом підрахунку в мазках крові, пофарбованих за сумішшю Лейшмана. Імунологічні показники крові курчат птахогосподарства “Агроукрптаха" порівнювали із загальноприйнятими фізіологічними нормами щодо курей (Вильям Дж. Риган та ін., 2000) у зв'язку з віковою різницею та біологічними особливостями.

При гістологічних дослідженнях визначали масу тіла, тимусу, бурси Фабріциуса та селезінки. Патологічні зміни і ступінь морфофункціональної активності визначали згідно з “Методическими рекомендациями по гистоморфологической оценке иммунокомпетентных органов цыплят в норме и при иммунодефицитах” (1989). В бурсі Фабриціуса визначали загальну площу медіанного зрізу органу в мм2, щільність заповнення складок фолікулами, розміри фолікулів на довгій осі, ширину коркового слою фолікулів в рядах клітин. Обчислювали морфофункціональний потенціал фолікулів (ПТФ). В тимусі визначали мозково-кортикальне співвідношення (МКС). Визначали площу медіанного зрізу селезінки, ступінь розвитку ретикулярної та лімфоїдної частин, кількість лімфоїдних і плазматичних скупчень, а також гермінативних фолікулів.

Статистична обробка отриманих даних проводилася на комп'ютерному комплексі за допомогою електронних таблиць Microsoft Excel XP Professional за методом В.В.Обливанцева (2001).

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

Визначення епізоотичної ситуації в птахогосподарствах з різним напрямком продуктивності за допомогою серологічного моніторингу. В кожному птахогосподарстві індивідуально складено схему вакцинопрофілактики, яка містить різні живі та інактивовані вакцини проти ВІБК (штами 4/91, МА-5, Н-120), які використовують як моно, так і в комплексі з іншими вакцинами.

Проведений серологічний контроль у птахогосподарствах південно-східного регіону України впродовж 2001-2004 років та аналіз результатів надали змогу встановити циркуляцію одночасно реовірусу у 20%, аденовірусу у 80% птахопоголів'я, вакцинація по відношенню до яких не проводиться. Для виявлення шляхів розповсюдження інфекцій дослідження почали з племрепродуктора II порядку ВАТ “Сімейкінське” в 2001 році (рис. 1).

Рис.1 Рівень групового імунітету птиці до інфекційного бронхіту курей, рео-, аденовірусу в ВАТ “Сімейкінське”.

При дослідженні батьківського стада кросу Хайсекс-коричневий у віці 303 доби реєстрували підвищення титру АТ до 3,5 log2 у 90% птиці, що може свідчити про циркуляцію в стаді епізоотичного штаму вірусу інфекційного бронхіту курей.

Серомоніторинг за 2002 - 2004 рр. в племрепродукторі ІІ порядку ВАТ „Сімейкінське” виявив низький рівень напруженості імунітету птиці щодо ІБК, що зумовлено циркуляцією серед поголів'я 30 – 60-добового віку Mycoplasma gallisepticum (MG) та Mycoplasma synoviae (MS), а також епізоотичних штамів адено- та реовірусів. Дані ІФА (рис. 2) підтверджують наявність антитіл до MG та ВІБК.

Рис.2 Рівень титру антитіл до вірусу інфекційного бронхіту курей,

M. gallisepticum и M. synoviaе за даними ІФА.

У 2004 році середній рівень антитіл до вірусу інфекційного бронхіту у птиці 160-добового віку становив 1:23142, що перевищує базові норми і вказує на контакт з епізоотичним збудником ІБК.

У 2002 році середній титр антитіл по групі курей віком 280 діб склав 1:15210. Також зареєстровано, що рівень антитіл в сироватках крові коливався від 1:2736 до 1:21335, верхня межа якого перевищує норму.

Вплив мікоплазменно-вірусної асоціації на ефективність імунізації курчат щодо ВІБК визначали в птахогосподарствах з різним напрямком продуктивності, що формуються з племрепродуктора ВАТ "Сімейкінське" та інших з циркуляцією епізоотичних штамів мікоплазм та вірусу інфекційного бронхіту, племрепродукторів.

Результати серологічного моніторингу щодо вивчення ефективності вакцинопрофілактики інфекційного бронхіту курей в трьох птахогосподарствах Луганської області (рис. 3) свідчать про низький рівень поствакцинального імунітету, при цьому груповий захист не досягав 80%.

Рис. 3 Рівень групового імунітету птиці до інфекційного бронхіту курей у трьох птахогосподарствах різних напрямків продуктивності (2003 рік).

У СТОВ “Авіс” – птахогосподарство яєчного напрямку продуктивності, що комплектує птахопоголів'я з племреподуктора II порядку ВАТ “Сімейкінське” Луганської області та “Зугрес” Донецької області, клінічний прояв респіраторного мікоплазмозу відмічали серед курчат 50-добового віку. Одночасно з цим в РНГА встановлено підвищення рівня антитіл до вірусу хвороби Марека (3,2 log2) у 70% та аденовірусу у 30% поголів'я.

У ТОВ “Агроукрптаха”, яке спеціалізується на вирощуванні бройлерів, прояв респіраторного мікоплазмозу спостерігали у 12-добовому віці, що також позначилось на зниженні кількості реагуючих до вакцинного штаму вірусу інфекційного бронхіту курей. Таким чином, можна зробити висновок про негативний вплив циркулюючих епізоотичних штамів вірусу інфекційного бронхіту курей, реовірусу, аденовірусу, хвороби Марека та мікоплазми на формування поствакцинального імунітету до вірусу інфекційного бронхіту курей.

Особливості клінічних та патологоанатомічних змін при асоційованому перебігу респіраторного мікоплазмозу та інфекційного бронхіту курей в умовах птахогосподарства. Оскільки в регіоні комплектація птицею птахогосподарств впродовж останніх років проходить за рахунок племрепродуктора ІІ порядку ВАТ “Сімейкінське”, а також виявлені інфекційні асоціації, була простежена інкубація яйця батьківських ліній курей, постачальником яких є Можайський племрепродуктор Вологодської області.

При цьому встановлено нижчий відсоток виводу півнів із інкубаційного яйця (64,6 %) по відношенню до материнської лінії (73,2 %).

При аналізі отриманих результатів розтину постінкубаційних відходів ми враховували порушення, які могли бути причиною збільшення відсотку слабкого та нежиттєздатного молодняка, а також завмерлих ембріонів. Встановлені патологоанатомічні зміни вказують на низьку якість інкубаційного яйця, а також на трансоваріальну передачу деяких вірусів та мікоплазми.

Характерні клінічні ознаки захворювання на респіраторний мікоплазмоз: набряк та гіперемія інфраорбітальних синусів, серозний конюнктивіт та наявність ексудату в носових синусах виявляли лише у курчат. При патологоанатомічному дослідженні, окрім помутніння стінок повітряносних міхурів, пневмонії та гіперплазії селезінки, відмічали також збільшення нирок з венозним застоєм, гіпертрофію бурси Фабриціуса (БФ) з крововиливами та наявністю кісти. Запалення суглобів відмічали не лише у молодняка, а й серед дорослої птиці.

Асоційований перебіг респіраторного мікоплазмозу та інфекційного бронхіту призвів до більшого відсотку уражень респіраторного тракту, печінки, імунокомпетентних органів (селезінки та БФ), нирок та репродуктивних органів у курей.

Результати вивчення імунного стану птиці, хворої на респіраторний мікоплазмоз та інфекційний бронхіт в умовах птахогосподарств. Провели порівняльний аналіз імунологічних показників крові курчат з метою визначення резистентності птиці в умовах птахогосподарств при наявності асоційованої інфекції РМ та ІБК.

При аналізі даних лейкограми крові курчат відмічали достовірне збільшення в усіх трьох групах птиці кількості лейкоцитів у 1,5 – 2 рази (Р < 0,001), що пов’язано з мобілізацією захисних систем організму. Лише у курчат з СТОВ “Авіс” відмічали вірогідне підвищення кількості базофілів на 84%, моноцитів та еозинофілів на 50%. Виявлена тромбоцитопенія свідчить про гостру фазу захворювання. Показники клітинного та гуморального імунітету у птиці в ВАТ “Сімейкінське” та СТОВ “Авіс” характеризувалися збільшенням кількості Е-РУК на 40% та 36%, ЕАС-РУК на 47% та 19%, вірогідне збільшення ЕА-РУК на 45% і 42%, імуноглобуліну класу А на 40%, що вказує на пригнічення імунної системи та перехід захворювання у хронічну форму. На відміну від цієї групи показники курчат п/г „Авіс” вказують на затяжний перебіг захворювання та розвиток імуносупресії, про що свідчить підвищення рівню середньомолекулярних та дрібномолекулярних циркулюючих імунних комплексів.

Підвищення активності лейкоцитів, клітинного імунітету та рівню дрібномолекулярних циркулюючих імунних комплексів у курчат з птахогосподарства „Агроукрптаха” вказують на наявність захворювання.

Індикація збудника мікоплазмозу. Для подальшого вивчення впливу мікоплазми на формування імунітету до вірусу ІБК із патологічного матеріалу від вимушено забитої та загиблої птиці проведена ізоляція збудника респіраторного мікоплазмозу. Одночасно бактеріологічним методом виявлено іншу бактеріальну мікрофлору: E.coli, S.aureus, S.typhymurium, P.vulgaris, S.enteritidis, Ps.aeruginosa, S.dublin, Str.albus.

Ізольовані (із 165 зразків патологічного матеріалу) від птахів 39 культур мікоплазм за культуральними властивостями, морфологією та в РА і РГА ідентифіковані як Mycoplasma galliseptіcum. Під час культивування культур мікоплазм на середовищі Едварда в третьому пасажі відмічали легку опалесценцію з утворенням білого осаду, який при легкому струшуванні підіймався у вигляді косички, в мазках, пофарбованих за методом Романовського-Гімза, культура мала коккоподібну форму. В культурі, яку виділили від курчат з ТОВ “Агроукрптаха”, вже у Х пасажі відмічали рихлий осад на дні пробірок, який розбивався з рівномірним помутнінням середовища.

Клінічні ознаки та патологоанатомічні зміни при експериментальному зараженні курчат мікоплазмою та вірусом інфекційного бронхіту моно- і в асоціації. Аналіз даних щодо клінічних ознак та патологоанатомічних змін у курчат, інфікованих різними штамами вірусу інфекційного бронхіту, та культурами M. gallisepticum як моно, так і в асоціації вказує на відміну у розвитку захворювання. Так, при інфікуванні курчат культурами M. gallisepticum 10-го та 11-го пасажів було встановлено їх нижчу патогенність, ніж культури 3-го пасажу та патологічного матеріалу, введення яких викликало ураження повітряносних міхурів та легень. Негативний вплив M. gallisepticum на респіраторний тракт та імунітет експериментально інфікованих курчат посилюється в асоціації із вірусом інфекційного бронхіту. Інфікування курчат патологічним матеріалом від хворої на респіраторний мікоплазмоз птиці та штамом 4/91 ВІБК сприяє захворюванню на мікоплазмоз із розвитком кістозу бурси Фабриціуса.

Серологічні дані експериментального зараження курчат мікоплазмою та вірусом інфекційного бронхіту моно- і в асоціації. Результати серологічного контролю (табл. 1) в ІФА та РНГА свідчать про пригнічуючу дію M. gallisepticum на формування імунітету щодо ВІБ.

Таблиця 1

Результати серологічного контролю курчат дослідних груп, (n=5)

№ груп | Матеріал, яким інфікували | Середній титр антитіл, log2

в ІФА | в РНГА

до MG | до ВІБК | до ВІБК

1.1 | БК МG Х пасажу та штам 4/91-ЛІ-1 ВІБ | 5,73±0,61 | 9,6±0,28 | 2,2

1.2 | Контроль | 0 | 0 | 0

2.1 | Бульйонною культурою МG ХІ пасажу | 1,6±1,02 | - | -

2.2 | Вакцинний штам МА-5 ВІБК | - | 10,9±0,76 | 3,0

2.3 | БК МG ХІ пасажу та штамом МА-5 ВІБ | 5,28±1,36 | 10,4±0,85 | 2,0

2.4 | Контроль | 0 | 0 | 0

3.1 | Контроль | 0 | 0 | 0

3.2 | Вакцинним штамом 4/91 ВІБК | - | 11,8±0,73 | 3,5

3.3 | Вакцинним штамом МА-5 ВІБК | - | 13,2±0,26 | 3,0

3.4 | ПМ та вакцинним штамом 4/91 ВІБК | 13,1±0,22 | 11,4±0,56 | 2,0

3.5 | ПМ від хворої на РМ птиці | 13,5±0,16 | - | -

3.6 | ВШ МА-5 ВІБ та БК МG ІІІ пасажу | 11,5±0,8 | 10,6±0,9 | 3,0

3.7 | Бульйонною культурою МG ІІІ пасажу | 12,2±0,82 | - | -

Примітка: “-“ не досліджували; “0” – антитіла не виявили; БК – бульйонна культура; ПМ – патологічний матеріал; ВШ – вакцинний штам;

В групі 1.1 (табл.1) антитіла до МG присутні в низькій концентрації, що вказує на низьку патогенність бульйонної культури M. gallisepticum 10-го та 11-го пасажів. При зараженні курчат штамом МА-5 ВІБК разом із бульйонною культурою МG 3-го пасажу (група 3.6) рівень антитіл щодо вірусу інфекційного бронхіту в ІФА становив 10,6 log2, тоді як при інфікуванні курчат тільки штамом МА-5 рівень антитіл дорівнював 13,2 log2.

Реізоляція збудника мікоплазмозу від дослідних курчат. Бактеріологічним методом вдалося реізолювати збудника мікоплазмозу лише від дослідних курчат, заражених бульйонною культурою M. gallisepticum 3-го пасажу та патологічним матеріалом від хворих на респіраторний мікоплазмоз птахів, та провести індикацію збудника за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції й від курчат, заражених бульйонною культурою 10-го та 11-го пасажів, при відсутності росту на поживному середовищі Едварда.

Імунологічні показники крові у дослідних курчат. При зараженні курчат бульйонною культурою M. gallisepticum 3-го пасажу, як і патологічним матеріалом, на 30 добу від моменту інфікування, спостерігали вірогідне зростання кількості лейкоцитів, лімфоцитів, моноцитів та базофілів (рис.4).

При визначенні клітинної ланки імунітету спостерігали вірогідне підвищення загальної кількості Е-РУК, ЕА-РУК, а також Е(т.р.) та Е(т.ч.) (рис.5).

Імунорегуляторний індекс в цих групах знизився на 15% порівняно з контролем, що відображає дисфункцію клітинних популяцій імунної системи. Загальна кількість циркулюючих імунних комплексів підвищувалась за рахунок великомолекулярних та середньомолекулярних комплексів (рис.6).

Одночасне зараження курчат мікоплазмою та вакцинним штамом вірусу інфекційного бронхіту призвело до підвищення всіх показників лейкограми (рис.4). Кількість лейкоцитів дещо вища за контроль на 34% (Р0,01), вміст лімфоцитів на 33% (Р0,01). Рівень тромбоцитів нижчий за контроль на 38% (Р0,01). На фоні підвищення кількості ЕА-РУК та ЕАС-РУК (рис.5) не спостерігалось підвищення рівня сироваткових імуноглобулінів класів А і М і навіть знижувався рівень Ig G на 45% від контролю, з вірогідністю (Р0,01).

Збільшення кількості Е(т.р.)-РУК на 45% (Р0,01) з одночасним підвищенням рівня Е(т.ч.)-РУК на 48% (Р0,01) при зниженні імунорегуляторного індексу. Підвищення загального вмісту циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) у 3 рази за рахунок середньо- та дрібномолекулярних ЦІК, які є більш патогенними на відміну від велико молекулярних ЦІК. Збільшення кількості ЦІК пов'язано з надлишком антигену та дефіцитом антитіл в організмі курчат. Виявлені зміни імунологічних показників крові курчат відображають супресивний вплив даної асоціації.

Гістоморфологічні зміни в імунокомпетентних органах дослідних курчат. Конкретну причину виявленої імуносупресії дозволили розкрити проведені гістологічні та морфологічні дослідження (таблиця 2). При визначенні маси тіла та індексів органів імунної системи у курчат контрольної та піддослідних груп було встановлено, що введення вакцинного ВІБ штаму МА – 5 позитивно впливає на курчат.

Таблиця 2

Дані морфометричної структури органів імунітету

в групах дослідної птиці, (n=5)

Критерії оцінки | Групи курчат віком 50 діб

контроль | заражені культурою

мікоплазми | заражені

ВІБ

шт. МА –5 | заражені одночасно мікоплазмою та шт. МА –5

Маса тіла, г | 212 ± 15,1 | 189,6 ± 9,23 | 223 ± 30,7 | 191,2 ± 21,41

Абсолютна маса БФ, мг | 485 ± 79,5 | 467 ± 53,3 | 536 ± 10,5 | 344 ± 46

Відносний індекс БФ | 2,23 ± 0,28 | 2,48 ± 0,23 | 2,38 ± 0,18 | 1,82 ± 0,09

Довжина фолікулів БФ, мкм | 665 ± 75,3 | 441 ± 82,9 | 419,4 ± 35,9 | 383 ± 25,2**

Ширина кори БФ (рядів клітин) | 8,08 ± 0,41 | 7,4 ± 0,7 | 7,68 ± 1,13 | 6,36 ± 1,07

Морфофункціональний

потенціал фолікулів (ПТФ) | 53 ± 5,96 | 34 ± 10,6 | 32,7 ± 6,5* | 24,87 ± 4,4**

Абсолютна маса селезінки, мг | 220 ± 40,2 | 227 ± 43,9 | 266 ± 60,6 | 226 ± 53

Відносн. індекс маси селезінки | 1,03 ± 0,09 | 1,2± 0,2 | 1,9 ± 0,07*** | 1,18 ± 0,1

Площа серединного

перетину селезінки | 20,3 ± 1,31 | 27,8 ± 4,36 | 37,1 ± 2,11* | 19 ± 6,3

Абсолютна маса тимусу, мг | 615 ± 68,2 | 766 ± 101,2 | 838 ± 172 | 686 ± 132

Відносний індекс тимусу | 2,9 ± 0,26 | 4,06 ± 0,42* | 3,74 ± 0,46 | 3,59 ± 0,46

Мозково-коркове

співвідношення (МКС) | 1 ± 0,26 | 0,77 ± 0,06 | 0,81 ± 0,13 | 0,76 ± 0,09

Примітка: 1). ПТФ – добуток від множення довжини фолікулів на ширину їх коркової речовини, ділений на 100. 2). МКС – зменшується при збільшенні ширини коркової речовини. 3). *- Р < 0,05; ** - Р < 0,01; *** - Р < 0,001

Більш однозначні результати були отримані в дослідах із зараженням курчат мікоплазмою. У курчат цієї групи, в порівнянні з контролем, відмічалось одночасне зменшення як маси БФ (467 ± 57,3 проти 485 ± 79,5 в контролі), так і потенціалу фолікулів (34 ± 10,6 проти 53 ± 5,96 в контролі). Значно уражені ретикулярно-ендотеліальні клітини в бурсі Фабриціуса. Визначали деяке пригнічення морфофункціонального стану фолікулів бурси фабриціуса. Площа серединного перетину селезінки в цій групі була декілька більшою, ніж у контролі, і коливалася від 20 до 49, і становила у середньому 27,8 мм2. Відмічалося ураження клітин ретикулярної системи, зокрема в ретикулярних муфтах. В цілому складається уявлення, що мікоплазми діють в усіх трьох досліджених органах, де вони обумовлюють загибель ретикулярних клітин і макрофагів.

На морфофункціональний стан бурси Фабриціуса значно впливало одночасне зараження мікоплазмою та введення вакцини ВІБ. При дослідженні гістозрізів із бурси Фабриціуса більш за все звертає на себе увагу гіпоплазія органу. Зменшення розмірів фолікулів здійснюється, в основному, за рахунок мозкової речовини.

Загибель ретикулярних клітин з утворенням багаточисельних ячеїстих пустот, кількість їх становила 50 у площині зрізу фолікула як у корковому, так і у мозковому слої. На фоні загибелі макрофагів визначалося збільшення кількості лімфоцитів, в результаті чого межа між корковою та мозковою речовиною не визначена. В селезінці відмічали гіперемію і велику кількість ретикулярних клітин як у ретикулярних муфтах, так і за їх межами з залишками продуктів дрібноглибчастого розпаду (рексіса).

Виявлене підвищення показників морфофункціонального стану тимусу та селезінки можна, в якійсь мірі, розцінювати як компенсаторну реакцію цих органів на зниження активності бурси Фабриціуса. Це свідчить, що мікоплазма та вірус інфекційного бронхіту курей можуть діяти конкурентно, взаємопослаблюючи імунну відповідь.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1.

2.

3.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Пономаренко Д. О. Асоційований перебіг респіраторного мікоплазмозу та інфекційного бронхіту курей // Вісник СНАУ. – Суми, 2003. - Вип.9. - С. 105-108.

2. Пономаренко Д.О. Вплив мікоплазменно - вірусних інфекцій на ефективність вакцинації курей у птахогосподарствах Луганської області // Ветеринарна медицина: міжвідомчий тематичний науковий збірник. - Харків, 2004. – Вип. 84.-С. 580-588.

3. Пономаренко Д.О., Пархоменко Л.І. Вплив асоційованої інфекції рео-, аденовірусів, ВІБ та мікоплазми на імунну систему птиці в умовах господарства// Збірник наукових праць ЛНАУ. - Луганськ, 2003. - № 31/43. - С. 427-432.

Дисертантка провела імунологічне дослідження з метою вивчення рівня гуморального і клітинного імунітету серед сільськогосподарської птиці при виявленні змішаних інфекцій.

4. Определение иммунного статуса кур к инфекционному бронхиту с учетом циркуляции эпизоотических штаммов рео-, и аденовирусов ассоциированных с микоплазмой/ Д.А. Пономаренко, Л.И. Пархоменко, Л.Ю. Петренко, О.А. Землянская, Л.М. Пороло, Е.П. Ткачева // Сборник научных работ ЛНАУ. - Луганськ, 2003. - № 27/39. - С. 77-82. Автором проведено ряд серологічних та імунологічних дослідів, а також статистична обробка даних.

5. Діагностика асоційованої аденовірусної інфекції, мікоплазмозу та колібактеріозу курей/ О.О. Землянская, Д.О. Пономаренко, Л.Ю. Петренко, Л.І. Пархоменко // Збірник наукових праць ЛНАУ.- Луганськ, 2004. - № 35/47. - С. 66-73. Пономаренко Д.О. проведено бактеріологічні дослідження по індикації та ідентифікації мікоплазми та Е.coli, а також дослідження з визначення клітинного та гуморального імунітету курчат.

6. Взаємовплив збудників респіраторного мікоплазмозу та вірусу інфекційного бронхіту на організм курчат/ Д.О. Пономаренко, Л.І. Пархоменко, Л.М. Пороло, О.П. Ткачова // Збірник наукових праць ЛНАУ. – Луганськ, 2005. - С. 173-182. Автором експериментально досліджено вплив МG та вакцинних штамів ВІБК на організм курчат як моно -, так і в асоціації. Визначено зміни морфології культури МG, культивованої на середовищі Едварда впродовж ХІ пасажів.

7. Красников Г.А., Пархоменко Л.И., Пономаренко Д.А. Иммуноморфология органов иммунитета цыплят после введения микоплазм и иммунизации вакцинным штаммом вируса инфекционного бронхита// Ветеринарна медицина: міжвідомчий тематичний науковий збірник. - Харків, 2005. - Вип. 85. - С. 601-607. Дисертанткою проведено особисто гістологічні дослідження фабрицієвої бурси, селезінки та тимусу курчат експериментально заражених МG, як моно- так і в асоціації з ВІБ.

8. Антигенна та імуногенна варіабельність вірусу ІБ курей./ Л.Ю. Петренко, О.О. Землянська, Д.О. Пономаренко, Л.І. Пархоменко //Вісник СНАУ. – Суми, 2003.- Вип.9. - С. 99-101. В даній статті дисертанткою зроблено аналіз літератури щодо ефективності вакцинних препаратів проти ВІБК.

9.Viral and bacterial parasitocinosis among farm, synanthropic and ornamental birds / Ludmila Parhomenko, Nikolay Ignatov, Larisa Petrenko, Olga Zemlyanskaya, Diana Ponomarenko, Maksim Popov, Yana Zelukina // Emerging Diseases and Diseases of Complex or Unknown Etiology. - 14th world veterinary poultry congress (Istanbul Turkey), 2005 - P. 483. Дисертанткою проведена індикація та ідентифікація M. gallisepticum на середовищі Едварда та за допомогою ПЛР. За клінічними ознаками, патологоанатомічними змінами, імунологічними та гістоморфологічними даними доведено синергійну дію мікоплазми з ВІБК.

10.Пономаренко Д.О. Економічна ефективність ветеринарно-санітарних заходів при асоційованому перебігу мікоплазменно-вірусної інфекції курей: збірник наукових праць ЛНАУ. - Луганськ, 2006. - № 63/86 - С. 119-124.

Пономаренко Діана Олександрівна. Особливості мікоплазменно - вірусної інфекції курей в птахогосподарствах південно-східного регіону України.-Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03-– мікробіологія та вірусологія. – Луганський національний аграрний університет, Луганськ, 2007.

Дисертація присвячена питанню оптимізації діагностики асоційованого перебігу респіраторного мікоплазмозу та інфекційного бронхіту курей.

В результаті проведення серологічного моніторингу за допомогою РНГА та ІФА встановлена нестабільна епізоотична ситуація в птахогосподарствах різних напрямків