КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ПОПОВА ЛЮДМИЛА ДМИТРІВНА

УДК: 616.831:616.853:547.466

НЕЙРОХІМІЧНІ МЕХАНІЗМИ ФОРМУВАННЯ СУДОМНОЇ ГОТОВНОСТІ ГОЛОВНОГО МОЗКУ В ЩУРІВ

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ - 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Харківському державному медичному університеті МОЗ України

Науковий консультант:

доктор біологічних наук, доктор медичних наук, професор

Жуков Віктор Іванович,

Харківський державний медичний університет МОЗ України.

завідувач кафедри біологічної хімії

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

Воробйова Тамара Михайлівна,

Інститут неврології, психіатрії та наркології АМН України, м. Харків,

завідувач лабораторії нейрофізіології та імунології;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Весельський Станіслав Павлович,

Інститут фізіології імені академіка Петра Богача біологічного факультету Київського національного університету ім. Тараса Шевченка КМУ,

старший науковий співробітник відділу загальної фізіології;

доктор біологічних наук, професор

Ляшенко Валентина Петрівна,

Дніпропетровський національний університет МОН України,

завідувач кафедри фізіології людини і тварин;

Захист відбудеться 24.10.2007р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка (м. Київ, проспект академіка Глушкова, 2, біологічний факультет)

Поштова адреса: 01033, м. Київ-33, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитися у Науковій бібліотеці ім. М.Максимовича Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою:

01033, м. Київ-33, вул. Володимирська, 58

Автореферат розісланий 21.09. 2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Цимбалюк О.В.

ЗАГАЛЬНА ЧАСТИНА

Актуальність теми. Вивчення механізмів формування судомної готовності тривалий час залишається актуальною проблемою в сучасних нейронауках. Актуальність цих досліджень зумовлена тим, що розкриття механізмів формування судомних станів має певне значення для вирішення проблеми стосовно механізмів епілептогенезу. Функціональний стан головного мозку, його судомна готовність залежать від співвідношення гальмівних та збуджувальних процесів [Н.Г. Сергиенко, В.И. Грищенко, Г.А. Логинова 1992; Т.М. Вороьева, 1993, 2005; М’ясоєдов В.В., Жуков В.І., Гопкалов В.Г. та ін., 2000; В.П. Ляшенко, 2005]. Однією із ланок модифікації цього співвідношення є регуляція ефективності синапсів. Роль модуляторів ефективності синапсів можуть виконувати ендогенні біорегулятори як нейронального, так і позанейронального походження.

Серед ендогенних метаболітів, які можуть впливати на фукціональний стан головного мозку, особливу увагу привертають інтермедіати кінуренінового шляху обміну триптофану. Це пов’язано з декількома причинами: по-перше, вони синтезуються в головному мозку [D. Hayaishi. et al., 1984; A.C. Foster, R.J. White, P. Schwarcz, 1986; V. Carla, G. Lombardi, M.Beni, 1988; F. Moroni, P. Russi, G. Lombardi, 1988]; по-друге, кінуреніни, синтезовані на периферії (зокрема, L-кінуренін, 3-гідроксикінуренін, антранілова кислота), можуть робити істотний внесок до відповідного церебрального пулу [S.Fukui, 1991]; по-третє, деякі кінуреніни (зокрема, кінуренова та хінолінова кислоти) мають нейротропну активність [I.P. Lapin, 1981; J.P. Walsh et al., 1989; H.Q. Wu et al., 2000; T.W. Stone, 2001].

Нейротропна активність кінуренінів може реалізуватися декількома механізмами. По-перше, вплив кінуренінів може здійснюватися через тотальні зміни у процесах нейропередачі за рахунок структурно-функціональних перебудов мембран, оскільки кінуреніни здатні підлягати комплексу окислювально-відновних реакцій і, як наслідок, виявляти як прооксидантну, так і антиоксидантну активність [F. Fallarino, U. Grohmann, C. Vacca et al., 2002; G.Giles, C.A. Collins, T.W. Stone, C. Jacob, 2003]. З іншого боку, кінуреніни можуть модулювати рецепцію деяких медіаторів, у першу чергу збуджувальних амінокислот. По-третє, вони можуть впливати на певні ланки окремих медіаторних систем, що викликає зміни у співвідношенні між гальмівними та збуджувальними процесами. Це зумовлює актуальність і необхідність дослідження механізмів реалізації нейротропної дії кінуренінів саме у цих напрямках.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження виконані за проблемою “Біохімія і патохімія обміну речовин, механізми регуляції і медична ензимологія” у межах комплексної Державної програми 0.10.04. (№ державної реєстрації 01860021125), є фрагментом НДР “Наукове обгрунтування біохімічної моделі структурно-метаболічних зрушень в організмі внаслідок впливу екологічних чинників як прогностичної основи діагностики донозологічних станів” (№ державної реєстрації 0199U001763, 2000 р.) та науково-дослідної теми ХДМУ „Вивчення загальних закономірностей патологічних процесів і розробка способів їх корекції (№ державної реєстрації 0103U004546).

Мета дослідження. Метою роботи було дослідження нейрохімічних механізмів формування судомної готовності головного мозку і ролі в них кінуренінів.

Задачі:

1.

2.

3.

4.

5.

Об’єкт дослідження. Процеси проміжного обміну триптофану (за кінуреніновим шляхом) та їх зв’язок з нейромедіаторними процесами в щурів із різним рівнем судомної готовності.

Предмет дослідження. Взаємозв’язок між метаболітами кінуренінового шляху обміну триптофану і функціональним станом вільнорадикальних процесів, функціональною активністю біологічних мембран та нейромедіаторними системами в щурів із різним рівнем вихідної судомної готовності головного мозку.

Методи дослідження. У роботі використано етологічні (нейроповедінкові) дослідження; спектрофотометричні, флуорометричні, біохемілюмінесцентні методи; методи іонообмінної, високоефективної рідинної, газової, тонкошарової хроматографії; методи диференційного центрифугування; метод флуоресцентних зондів.

Наукова новизна отриманих результатів. У роботі доведено, що кінуреніни є важливою ланкою у ланцюзі нейрохімічних механізмів формування судомної готовності. Показано, що вихідна фонова активація кінуренінового шляху обміну триптофану сприяє формуванню підвищеної судомної готовності через зміни в системах ГАМК, катехоламінів та глутаматергічній передачі. У статевозрілих щурів виявлено залежність впливу кінуренінів на нейромедіаторні процеси і судомну готовність головного мозку від її вихідного стану. В експериментах на білих щурах із високою судомною готовністю вперше встановлено, що активація кінуренінового шляху обміну триптофану супроводжується підвищеною генерацією активних форм кисню. У щурів із високим рівнем судомної готовності виявлено посилення контролю вивільнення медіаторів за рахунок пресинаптичних рецепторів збуджувальних амінокислот, зниження негативного та зростання позитивного контролю збуджувальної нейропередачі. У цих тварин встановлено зменшення гальмівного контролю дофаміном збуджувальної дії глутамату в гіпоталамусі, що сприяє активації ГАМК-ергічної трансмісії в substantia nigra і має певне значення у формуванні високої судомної готовності. Показано, що вплив кінуренінів на вміст нейромедіаторів у головному мозку щурів залежить від вихідного стану судомної готовності. Загальною закономірністю цього впливу є усунення різниці між групами у вмісті більшості медіаторів. Доведено, що вплив кінуренінів на вміст ГАМК забезпечується змінами активності ферментів обміну ГАМК та глутаматергічної передачі і залежить від вихідного рівня судомної готовності. Обгрунтовано, що зміни вмісту гліцину та аспартату за впливу кінуренінів є адаптивними і спрямовані на підтримання балансу між гальмівними та збуджувальними процесами. На відміну від існуючого до цього часу поділу кінуренінів на конвульсанти та антиконвульсанти, у роботі показано, що вплив кінуренової кислоти на судомну готовність головного мозку залежить від вихідного стану останньої: у щурів із високим рівнем судомної готовності кінуренова кислота зменшує здатність до судом, у щурів із низьким рівнем – підвищує. Отримані у роботі результати дають можливість пояснити існуючі в літературі дані стосовно відсутності збуджувальних та судомних ефектів у типових конвульсантних кінуренінів на моделях тварин із підвищеною аудіогенною схильністю до судом, а також протиріччя між даними літератури щодо впливу деяких кінуренінів на нейрональні процеси. Виявлені закономірності дозволяють по-новому оцінити роль кінуренінів у функціональній активності головного мозку, у формуванні судомної готовності і розглядати кінуреніновий шлях метаболізму як одну із ланок забезпечення синаптичної пластичності та певного співвідношення між збуджувальними та гальмівними процесами в головному мозку.

Практичне значення одержаних результатів. Закономірності, виявлені у роботі, можуть бути використані для розробки нових, патогенетично-зумовлених методів лікування судомних станів. Виявлена у роботі залежність впливу кінуренінів на нейромедіаторні процеси і судомну готовність головного мозку від вихідного стану останньої є основою для більш диференційованого та цілеспрямованого їх використання у протисудомній терапії в залежності від ініціюючих механізмів судомних проявів фізіологічної активності. Результати, отримані при дослідженні особливостей впливу провокуючих факторів оксидативного стресу на стан окислювально-відновних процесів у щурів із різним рівнем судомної готовності, при дослідженні співвідношення між кінуренінами, що по-різному впливають на включення жирних кислот до біологічних мембран, при вивченні фосфоліпідного складу мембран у щурів із низькою та високою судомною готовністю, можуть бути основою для рекомендацій про доцільність введення з метою профілактичного захисту від ушкоджувальної дії провокуючих факторів оксидативного стресу на організм із низькою судомною готовністю – антиоксидантів, а на організм із високою судомною готовністю – антиоксидантів та поліненасичених жирних кислот. Результати, отримані в роботі, є основою і для обгрунтування механізму біологічної дії групи синтетичних органічних сполук (а саме поліетиленгліколів) та для розробки державних стандартів стосовно можливих граничних концентрацій цих сполук у воді водоймищ господарчо-питного і культурно-побутового призначення. За методичними прийомами, що використані у роботі, отримано патент, який занесено в реєстр галузевих нововведень МОЗ України № 18-19-2003 (реєстровий № 122/18/03).

Особистий внесок здобувача. Дисертація є особистою науковою працею автора. У роботі узагальнено результати досліджень, в яких автором особисто визначено актуальність проблеми, мету і методи досліджень, проведено фізіологічне тестування тварин на судомну готовність, проведено дослідження активності індоламін-2,3-диоксигенази, вмісту триптофану, серотоніну, кінуреніну, кінуренової та хінолінової кислот у структурах головного мозку, проведено комплекс досліджень по визначенню інтенсивності протікання вільнорадикальних процесів та перекисного окислення ліпідів, проведено визначення стану системи антиоксидантного захисту організму, досліджено мікросомальну окислювальну систему печінки, фосфоліпідний склад синаптосом, мембран печінки та еритроцитів, активність мембранозв’язаних ферментів. Автором особисто проведено дослідження впливу кінуренінів на параметри зв’язування збуджувальних амінокислот; нікотинаміду, триптофану та кінуренової кислоти - на вміст медіаторів; кінуренової кислоти - на рівень кінуренінів і на судомну готовність головного мозку. Автором за участю ас. каф. біохімії ХДМУ С.О. Стеценко було розроблено метод визначення параметрів зв’язування нейроактивних амінокислот (Патент № 33927 А, G01N 33/48. Спосіб визначення параметрів зв’язування нейроактивних амінокислот. Попова Л.Д., Стеценко С.О. Харківський державний медичний університет. Заявка № 99042447 від 29.04.1999. Опубл.: 15.02.2001, бюл. №1). Дослідження впливу триптофану, нікотинаміду, кінуренової кислоти на вміст глутамату, ГАМК, аспартату та гліцину були проведені за участю к.б.н., с.н.с. Г.А. Логінової (ЦНДЛ Харківського державного медичного університету). Визначення вмісту токоферолів у сироватці крові проведено за участю к.б.н., с.н.с. А.І. Кобзаря (НДІ Терапії). Технічна допомога при виконанні експериментальної частини забезпечувалась старшими лаборантами кафедри біохімії ХДМУ. Автором самостійно проведено оброблення фактичних даних досліджень за допомогою методів варіаційної статистики. Наукова гіпотеза, теоретичне оброблення результатів, визначення наукової новизни, формулювання наукових положень, висновків, практичних рекомендацій належать особисто автору.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертації доповідались та обговорювались на з’їздах, конференціях та симпозіумах: XII з’їзд фізіологічного товариства ім. І.П. Павлова, Львів, 1986; Всесоюзный симпозиум “Медиаторы в генетической регуляции поведения”, Новосибирск, 1986; Всесоюзный съезд физиологического общества, Кишинев, 1987; научная конференция ЦНИЛ Тбилисского ГИУВ “Центральная регуляция вегетативных функций”, Тбилиси, 1987; I съезд Украинского научного общества генетиков, Львов, 1988; VI Український біохімічний з’їзд, Київ, 1992; конференция “Биохимия стресса и пути повышения эффективности лечения заболеваний стрессорной природы”, Запорожье,1992; VII Український біохімічний з’їзд, Київ, 1997; VIII Український біохімічний з’їзд, Чернівці, 2002; международная научно-техническая конференция “Экология и здоровье человека. Охрана водного и воздушного бассейна”, Бердянск, 2002-2004; IX Український біохімічний з’їзд, Харків, 2006.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, розділу – огляд літератури, розділу “Загальна методика і основні методи дослідження”, 4 розділів власних досліджень, розділу “Аналіз і узагальнення результатів дослідження”, висновків, списку використаних джерел. Викладена на 292 сторінках машинописного тексту. Список літератури налічує 410 джерел, з них – 263 джерела іноземних авторів. Дисертація ілюстрована 95 таблицями та 11 рисунками.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 79 робіт, з них 32 - у журналах, 14 - у збірниках наукових праць, 33 – у матеріалах і тезах з’їздів і конференцій, 37 – у виданнях, рекомендованих ВАК. Отримано 1 патент на винахід, опубліковано 2 монографії.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Всі експерименти були проведені відповідно до існуючих міжнародних вимог і норм гуманного відношення до тварин. Дослідження проводилось на щурах із низькою (група Н) та високою (група В) судомною готовністю, які були відібрані із загальної популяції щурів лінії Вістар, тестованих за допомогою аудіогенного подразника (електричного дзвоника силою 96 дБ протягом 120 с [Б.А. Захария, 1974]. Ураховували орієнтувальні та рухові реакції, гіперкінези, рухові компоненті судомного прояву активності, локальні та генералізовані судомні реакції, їх тривалість, що дозволило оцінювати різні рівні аудіогенної готовності. Характер аудіогенних судомних реакцій визначали за бальною шкалою, розробленою Л.В. Крушинським. Із загальної популяції було відібрано 2 групи: з низькою (відсутність патологічної реакції протягом 120 с дії звуку, 0 балів за класифікацією Л.В.Крушинського, група Н) та високою (3 – 4 бали за класифікацією Л.В.Крушинського, група В) судомною готовністю.

Інтенсивність кінуренінового шляху обміну триптофану оцінювали за активністю індоламін-2,3-диоксигенази (КФ 1.13.11.17) [M. Fujiwara et al., 1978] та вмістом основних метаболітів цього шляху, які досліджували методом високоефективної рідинної хроматографії [C. Costa et al., 1984; Moroni et al., 1984; W.A. Turski et аl., 1988]. Інтенсивність перебігу вільнорадикальних процесів та перекисного окислення ліпідів оцінювали методами спонтанної та індукованої (іонами відновленого заліза, пероксидом водню, люмінолзалежної) біохемілюмінесценції [В.А. Барабой и др., 1991], за інтенсивністю утворення дієнових кон’югатів [Л.Б. Косухин, Б.С. Ахметова, 1987] та ТБК-позитивних продуктів [Т.Н. Федорова и др., 1983]. Для оцінки стану антиоксидантної системи досліджували активність супероксиддисмутази (КФ 1.15.1.1) [Гуревич В.С. и др., 1990], глутатіонпероксидази (КФ 1.11.1.9) [В.И.Моин, 1986], каталази (КФ 1.11.1.6) [М.А. Королюк и др., 1988], вміст глутатіону [С.Е.Северин, Т.А. Соловьева, 1989], вітаміну С [Ю.Б. Филиппович и др., 1975], гемоглобіну [М.С. Кушаковский, 1968], гаптоглобіну (уніфікованим методом з використанням тест-наборів), токоферолу [методом газо-рідинної хроматографії - Osterlux G., Nyhhein A., 1980], активність церулоплазміну (КФ 1.16.3.1) [за методом Ravin у модифікації К.А.Мошкова і ін., 1986]. Екстракцію ліпідів при визначенні фосфоліпідного складу мембран проводили за методом Кейтса [1975]. Для розподілення індивідуальних фосфоліпідів на фракції використовували двомірну мікротонкошарову хроматографію [V.E.Vaskovsky, T.A. Terechova, 1979]. Кількісний вміст загальних та індивідуальних фосфоліпідів у ліпідних екстрактах оцінювали за кількістю неорганічного фосфору, який визначали за допомогою молібденового реагенту [R.M. Brockhuse, 1974]. З метою дослідження мікросомальної окислювальної системи печінки було вивчено вміст цитохромів Р450 та b5, а також активність НАД(Ф)Н–цитохром с–редуктаз. Мембрани ендоплазматичного ретикулуму виділяли за методом S.A.Komoth., K.A. Narayan [1972]. Вміст цитохромів Р450 та b5 визначали методом диференційної спектрофотометрії T. Omura, R. Sato [1964]. НАД(Ф)Н-цитохром с-редуктазну активність реєстрували на двопроменевому спектрофотометрі “Specord ” за методом L. Ernster et al. [1962]. Для виявлення змін у проникності еритроцитарних мембран використовували метод вимірювання швидкості вільного та індукованого специфічним іонофором (валіноміцином) виходу іонів К у безкалієве середовище за допомогою скляного селективного електроду 2407 К. Вимірювання активності Са2-, Mg2- АТФази проводили за загальноприйнятими методиками (КФ 3.6.1.4) [А.А. Болдырев, 1977]. Активність ацетилхолінестерази досліджували електрометричним методом (КФ 3.1.1.7) [В.С.Асатиани, 1969]. Синаптосоми отримували за методом F. Hajos [1975]. Визначення параметрів зв’язування медіаторів проводили методом флуоресцентних зондів [Ю.А. Владимиров, Г.Е. Добрецов, 1980; Г.Е.Добрецов, 1989; Л.Д. Попова, С.О. Стеценко, 2001]. Вміст білка визначали за допомогою модифікованого методу за Lowry [Р.П.Марцишаускас и др., 1981]. Концентрацію глутамінової кислоти у головному моку визначали високоспецифічним ензиматичним методом [E.Bernt, H.U. Bergmeyer, 1970], ГАМК - методом іонообмінної хроматографії [E. Carmona et al., 1980], аспартату та гліцину – методом тонкошарової хроматографії [Г.Н. Зайцева, Н.Н. Тюленева, 1958], вміст тирозину, норадреналіну та дофаміну – за методом J. Endo та J. Ogura [1973], серотоніну – за методом C. Atack and T. Magnusson [1978]. Активність глутаматдекарбоксилази (4.1.1.15) та ГАМК-трансамінази (2.6.1.19) визначали за методом Н.С. Нілової [1973]. Для вивчення впливу метаболітів кінуренінового шляху обміну та амінокислоти – попередника на різні медіаторні системи тварини утримувались на раціоні, що містив або 50 мг триптофана на 1 кг маси тіла на добу (протягом 20 днів) [E.M. Gal et al., 1978], або 75 мг нікотинаміду на 1 кг маси тіла на добу (протягом 2 тижнів) [Л.Д. Попова, 1986], або 75 мг кінуренової кислоти на 1 кг маси тіла на добу (протягом 2 тижнів) [S.G. Zhu et al., 1989]. Для дослідження впливу провокуючого фактору оксидативного стресу (поліетиленгліколю Л-502) на щурів із різним рівнем аудіогенної судомної готовності тваринам експериментальних груп щоденно вводили за допомогою зонда водний розчин Л-502 у дозі 1/100 ЛД50 протягом 30 діб. Тваринам контрольної групи вводили воду.

Результати дослідження та їх обговорення

Оцінка інтенсивності перебігу кінуренінового шляху обміну триптофану. Дані, отримані в роботі, свідчать про те, що тварини з різним рівнем судомної готовності відрізняються за інтенсивністю перебігу кінуренінового шляху обміну триптофану.

У тварин групи В спостерігається активація кінуренінового шляху обміну триптофану, що виявляється початково детермінованим зростанням індоламін-2,3-діоксигеназної активності (рис. 1) та накопиченням хінолінової кислоти (табл. 1).

Вплив кінуренінів на стан біологічних мембран у клітинах тварин із різним рівнем судомної готовності. Оскільки індоламін-2,3-диоксигеназа для процесу каталізу потребує супероксидний аніон [D. Hayaishi et al., 1984], а хінолінова кислота є генератором вільних радикалів [T.W. Stone et al., 2000], можна припустити активацію вільнорадикальних процесів та перекисного окислення ліпідів у щурів із високою судомною готовністю. Це може позначитися на структурно-функціональному стані мембран. У зв’язку з цим, наступною ланкою нашого дослідження було вивчення стану біологічних мембран у клітинах тканин щурів із різним рівнем судомної готовності.

При дослідженні інтенсивності перебігу вільнорадикальних процесів не було виявлено різницю у спонтанній біохемілюмінесценції сироватки крові в щурів із різним рівнем судомної готовності (табл. 2). У той же час, спонтанна біохемілюмінесценція гомогенатів мозку в тварин групи В була статистично достовірно вищою, що свідчить про активацію вільнорадикальних процесів у головному мозку цих тварин. Оскільки індукована Fe2 біохемілюмінесценція віддзеркалює вміст гідропероксидів у відповідних тканинах [А.Н. Саприн, Е.В. Калинина, 1999], отримані результати (табл. 2) свідчать про підвищений рівень гідропероксидів у сироватці крові та про відсутність змін у кількості гідропероксидів у головному мозку щурів групи В.

Система Н2О2-індукованої біохемілюмінесценції дозволяє оцінити ефективність генерації, перш за все, ОН- радикала з Н2О2 завдяки реакції Фентона [М.Л. Кессельман и др., 1997]. Дані щодо індукованої Н2О2 біохемілюмінесценції (4972±300 імп/с/г тканини проти 3056±47 імп/с/г тканини у щурів групи Н) свідчать про більшу ефективність генерації гідроксильного радикала з пероксиду водню в головному мозку щурів групи В, що може бути пов’язано або з більшою концентрацією негемового заліза у мозку цих тварин, або з більшою спроможністю мозку до відновлення заліза.

За даними літератури, для біохемілюмінесценції у присутності люмінолу потрібен його окислювач [А.И. Журавлев, 1983]. Цими окислювачами можуть бути гідроксильний радикал та супероксидний аніон, тобто люмінолзалежна біохемілюмінесценція здатна виявляти утворення цих радикалів [В.А. Шестаков и др., 1979; Ю.А. Владимиров и др., 1991]. Виявлено (рис.2) суттєве підвищення люмінолзалежної біохемілюмінесценції у гіпокампі (на 139%) та гіпоталамусі (на 303%) на фоні менш значного (на 34%) її зниження у темпоральній корі щурів групи В у порівнянні з групою Н. Отримані результати свідчать про більш високий вміст гідроксильного радикала та супероксидного аніона (ініціаторів вільнорадикальних процесів) у головному мозку щурів групи В.

Дослідження перекисного окислення ліпідів. Незважаючи на більш інтенсивне продукування активних форм кисню у мозку тварин групи В, не виявлено різниці у вмісті дієнових кон’югатів в гомогенатах головного мозку та печінки, а також у крові тварин із різним рівнем судомної готовності. Вміст ТБК-позитивних продуктів теж залишався без змін у головному мозку та крові, але достовірно підвищувався у печінці щурів групи В (0,96±0,08 нмоль/мг білка проти 0,64±0,06 – у щурів групи Н, р<0,05).

Дослідження стану антиоксидантної системи. Для вивчення механізмів захисту організму щурів із високою судомною готовністю від підвищеного утворення активних форм кисню нами було досліджено компоненти як ферментативної, так і неферментативної антиоксидантної системи. Зміни у вмісті глутатіону, в активності супероксиддисмутази, каталази та глутатіонпероксидази в гомогенатах головного мозку в щурів груп Н та В були статистично невірогідними, проте концентрація токоферолу у сироватці крові щурів групи В статистично вірогідно нижча порівняно з групою Н (21,130,43 мкмоль/л порівняно з 13,000,70 мкмоль/л – у щурів групи Н, р<0,05). Синергистом -токоферолу у його антиоксидантній активності є аскорбінова кислота, яка підтримує токоферол у відновленому стані і тим самим сприяє перериванню вільнорадикальних процесів. Вміст аскорбінової кислоти у печінці щурів групи В залишався без змін (0,970,03 мкмоль/г у порівнянні з 1,010,04 мкмоль/г у щурів групи Н), але в наднирниках він був вірогідно нижчим (9,660,25 мкмоль/г у порівнянні з 11,010,27 мкмоль/г у щурів групи Н, р<0,05), що свідчить про виснаження резерву цього вітаміну у щурів групи В.

Виявлені зміни з перебігу вільнорадикальних процесів у щурів групи В можуть позначитися на фракційному складі фосфоліпідних мембран, їхній проникності та функціональній активності. Порівняння вмісту фосфоліпідів у синаптосомах гіппокаму та мозочку щурів із різним рівнем судомної готовності не виявило ніяких змін у концентрації як загальних фосфоліпідів, так і окремих фосфоліпідних фракцій, за винятком сфінгомієліну, вміст якого у щурів групи В був вірогідно нижчим (2,70,1% від суми ліпідного Р порівняно з 3,70,1% у синаптосомах гіпокампу в щурів групи Н, р<0,05; 2,40,1% порівняно з 2,90,1% у синаптосомах мозочку в щурів групи Н, р<0,05). Для підтримання біологічних мембран у належному функціональному стані важливим є певне співвідношення рівнів холестерину та фосфоліпідів [K.P. Whiting et al., 1998]. У досліджених відділах мозку вміст холестерину та співвідношення холестерин/фосфоліпіди у тварин із різною судомною готовністю не відрізнялись. Хоча головний мозок здатен синтезувати всі фракції фосфоліпідів, процес синтезу залежить від надходження есенціальних поліненасичених жирних кислот (лінолевої та ліноленової). Десатурація жирних кислот відбувається в ендоплазматичному ретикулумі. Найбільш інтенсивно процес мікросомального окислення протікає у печінці. При дослідженні мікросомальної окислювальної системи печінки у щурів групи В спостерігалися зміни тільки вмісту цитохрому b5 (табл. 3). Як відомо, цитохром b5 бере участь у процесах утворення ненасичених жирних кислот [R.K. Murray et al., 1996].

Результати, отримані при дослідженні мікросомальної окислювальної системи, та розрахунки співвідношення між метаболітами кінуренінового шляху, що сприяють включенню у фосфоліпіди насичених або ненасичених жирних кислот, свідчать про підвищену потребу організму щурів із високою судомною готовністю в поліненасичених жирних кислотах та можливість підвищеного включення цих кислот у фосфоліпіди головного мозку. За умов впливу провокуючого фактору оксидативного стресу (саме поліетиленгліколю Л-502) у тварин групи В спостерігалось зростання як цитохрому Р450, так і b5, а у тварин групи Н – тільки Р450, що узгоджується з даними літератури про те, що зазвичай оксидативний стрес призводить до зниження кількості поліненасичених і підвищення кількості насичених жирних кислот у фосфоліпідах мембран.

Для з’ясування значення отриманих змін у фосфоліпідному складі мембран у щурів групи В для функціональної активності мембранних білків було проведено вивчення активності деяких мембранних ферментів, зокрема ацетилхолінестерази мозку, Ca–АТФ-ази печінки. Змін активності цих ферментів у шурів із різним рівнем судомної готовності не виявлено. Однак на мембранах еритроцитів у тварин групи В виявлено підвищення як вільного (у 2,4 рази), так і індукованого валіноміцином (в 1,7 рази) виходу К+. Зростання виходу іонів К+, можливо, пов’язано зі зміною в проникності іонного калієвого каналу, який забезпечує пасивний вихід К+. Підвищення проникності мембран для іонів К+ може привести до змін у різниці потенціалів мембран і, як наслідок, до змін збудливості нейронів.

Таким чином, зміни у фосфоліпідному складі синаптосом головного мозку щурів із високою судомною готовністю стосуються тільки сфінгомієлінової фракції, що зумовлено захисною дією токоферолу, посиленням оновлення фосфоліпідних фракцій та збалансованістю протилежних ефектів метаболітів триптофану з їх співвідношенням у головному мозку цих тварин.

Вплив кінуренінів на параметри зв’язування збуджувальних амінокислот. Кінуреніновий шлях обміну триптофану утворює ліганди глутаматних рецепторів: хінолінову кислоту – вибірковий агоніст NMDA-рецепторів, кінуренову кислоту – антагоніст деяких підтипів глутаматних рецепторів [T.W. Stone, J.I. Addae, 2002]. Зважаючи на це, було досліджено вплив хінолінової та кінуренової кислот на параметри зв’язування збуджувальних амінокислот (глутамінової та аспарагінової) синаптосомами головного мозку. Параметри зв’язування збуджувальних амінокислот досліджувались на синаптосомах, які, як відомо, на 90% складаються з пре- та 10% пост-синаптичних мембран [М.И. Прохорова, 1972], тому отримані нами результати віддзеркалювали стан ауто- та гетерорецепторів збуджувальних амінокислот.

Пресинаптичні рецептори збуджувальних амінокислот представлені, в основному, метаботропними, каїнатними та NMDA-рецепторами. Аспартат є природним агоністом NMDA-рецепторів [С.А. Чепурнов, Н.Е. Чепурнова, 1997]. Пресинаптичні NMDA-рецептори здійснюють позитивний, а метаботропні рецептори II та III типу – негативний контроль вивільнення глутамату. У щурів групи В виявлено зростання спорідненості рецепторів до глутамату у трьох з п’яти досліджених структур (темпоральній корі, гіпокампі, стовбурі мозку) і суттєве зниження (більш ніж у 6 разів) у гіпоталамусі (табл. 4). Спорідненість рецепторів до аспартату в цих тварин підвищена в гіпокампі, гіпоталамусі та мозочку, в інших структурах вона вірогідно нижча у порівнянні з групою Н (табл. 5). Специфічне зв’язування аспартату є маркером міcця пресинаптичного поглинання глутамату [M.D. Simpson et al., 1988]. Збільшення майже у 2 рази Кд до аспартату і зменшення більш ніж у 3 рази щільності місць зв’язування аспартату свідчить про зменшення поглинання глутамату пресинаптичними мембранами і посилення збуджувальної передачі в темпоральній корі.

У гіпоталамусі виявлено існування пресинаптичних метаботропних рецепторів ІІ типу, які гальмують збуджувальну передачу в гіпоталамічних синапсах (S.R Bradley et al., 2000). Збуджувальні входи із гіпоталамуса контролюють substantia nigra, тому активація цих рецепторів гальмує синаптичне збудження в substantia nigra pars reticulata. У гіпоталамусі щурів групи В спорідненість рецепторів до глутамату майже в 6 разів менша порівняно з групою Н, що свідчить про посилення глутаматергічної передачі в гіпоталамусі, а відтак і про посилення ГАМК-ергічної передачі в substantia nigra цих тварин.

У мозочку виявлено пресинаптичні метаботропні рецептори II [M.D.Glitsch, J.J. Jack, 2001] та III типу [M. Lorez et al., 2003], а також пресинаптичні NMDA-рецептори [M. Glitsch, A. Marty, 1999]. У мозочку пресинаптичні NMDA-рецептори мають специфічні характеристики, що відрізняють їх від NMDA-рецепторів інших структур. Згідно отриманим результатам, пресинаптичні NMDA-рецептори мозочку у щурів групи В мають більшу спорідненість до аспартату, тобто у них посилений контроль вивільнення медіаторів через цей тип рецепторів. Аналіз даних літератури стосовно локалізації пресинаптичних NMDA-рецепторів у мозочку, їхнього впливу на вивільнення глутамату та ГАМК [M. Casado et al., 2000; M. Glitsch, A. Marty, 1999; I.C. Duquid, T.G. Smart, 2004] свідчить про те, що активація цих рецепторів сприятиме зменшенню збуджувального і збільшенню гальмівного впливу на клітини Пуркін’є. Зважаючи на те, що нейрони Пуркін’є є виключно гальмівними, зменшення активації і посилення гальмування цих клітин сприятиме зменшенню їхнього гальмівного впливу.

Хінолінова кислота у більшості структур нівелювала різницю у контролі вивільнення медіаторів пресинаптичними рецепторами збуджувальних амінокислот (табл. 4, 5). Ті ж тенденції спостерігались і за впливу кінуренової кислоти. Однак кінуренова кислота (через низький вміст у головному мозку) [F.Moroni et al., 1988], очевидно, не зможе виявляти модуляторні ефекти при фізіологічних концентраціях. Згідно отриманим нами результатам, у щурів групи В концентрація хінолінової кислоти відповідає Кд у корі, гіпокампі та гіпоталамусі, а у щурів групи Н – тільки у гіпоталамусі. Очевидно, хінолінова кислота може виявляти модуляторний вплив у щурів групи Н тільки у гіпоталамусі, а у щурів групи В – в усіх досліджених структурах, за виключенням мозочку та стовбуру. Зважаючи на це, а також на те, що хінолінова кислота реалізує свої ефекти саме через NMDA-рецептори, можна вважати, що вона може у деякій мірі нівелювати зміни у рецепції збуджувальних амінокислот, зумовлені структурною реорганізацією глутаматних рецепторів, у темпоральній корі щурів групи В. Однак відмінності у параметрах зв’язування, що залишалися, все ж таки свідчили про посилення збуджувальної передачі в цій структурі.

Вплив кінуренінів на вміст збуджувальних і гальмівних медіаторів. Одним із механізмів участі кінуренінів у генезі судомної готовності головного мозку може бути вплив на вміст збуджувальних та гальмівних медіаторів. За думкою R. Schwarcz & R. Pellicciari [2002], фізіологічні флуктуації вмісту нейроактивних інтермедіатів кінуренінового шляху обміну триптофану в головному мозку могли модулювати нейротрансмітерні системи. У щурів із високою судомною готовністю зміни вмісту медіаторів порівняно з групою Н стосувалися, в основному, ГАМК та катехоламінів.

У щурів групи В спостерігалося суттєве зниження вмісту норадреналіну в усіх досліджених структурах, за виключенням стовбуру мозку (табл. 6). Зменшення вмісту норадреналіну (НА) у щурів групи В може бути пов’язано або зі зменшенням синтезу медіатора, або зі зростанням швидкості його використання. Згідно отриманим результатам, у щурів групи В виявлено зростання співвідношення тирозин/НА в усіх досліджених структурах та співвідношення дофамін(ДА)/НА в усіх структурах, за винятком гіпоталамуса (табл. 7), що свідчить про зниження синтезу норадреналіну і узгоджується з даними літератури про зменшення активності дофамін-в-гідроксилази у центральному ядрі inferior colliculus, гіпокампі, корі у щурів, схильних до судом [J.C. Lauterborn, C.E. Ribak, 1989]. Проте не слід виключати і можливості підвищеної утилізації норадреналіну завдяки активації ГАМК норадренергічних нейронів [B. Biswas, A. Carlsson, 1977]. Зростання співвідношення [тирозин]/[ДА] у тварин групи В також свідчить про зменшення синтезу дофаміну з тирозину, а збільшення співвідношення [ДА]/[НА] – про менш інтенсивне перетворення дофаміну до норадреналіну. Згідно даним літератури, ГАМК гальмує дофамінергічні нейрони [B. Biswas, A. Carlsson, 1977].

Різницю у вмісті дофаміну у щурів груп Н та В виявлено тільки у гіпоталамусі. Оскільки головним механізмом впливу дофаміну на нейрони гіпоталамуса є гальмування збуджувальної дії глутамату [A.N. Van den Pol, V. Cao, A.B. Belousov, 1996], зменшення кількості дофаміну в гіпоталамусі щурів групи В призведе до посилення в цій структурі глутаматергічної передачі і, як наслідок, до посилення ГАМК-ергічної передачі в substantia nigra. Показано, що гальмування ГАМК-ергічних нейронів в substantia nigra призводить до стримування судом на різних моделях епілепсії [C. Deransart, L. Vercueil, C. Marescorux, A. Depaulis, 1998], тобто активація цих нейронів сприяє їх розвитку.

Вміст ГАМК у щурів групи В був підвищений в усіх досліджених структурах (табл. 8). Отримані дані відповідають результатам робіт, в яких було показано зростання вмісту ГАМК та кількості ГАМК-ергічних нейронів у центральному ядрі inferior colliculus (структурі, що належить до стовбуру мозку) [C.E. Ribak, C.L. Morin, 1995] та рівня ГАМК у корі, гіпокампі та мозочку у щурів, генетично схильних до судом [K. Fukoo, T. Momijama, K. Ishihare еt al., 1998]. Зростання вмісту ГАМК у щурів групи В пов’язано зі зростанням активності глутаматдекарбоксилази (рис.3), що, очевидно, зумовлено збільшенням розміру та кількості ГАМК-ергічних терміналей, зокрема у мозочку, гіпокампі та інших структурах, в період розвитку мозку за умов активації NMDA-рецепторів, про що свідчать дані літератури [P.A. Farias et al., 1992; M.C. Fiszman et al., 2005].

За думкою S.R. Snodgrass [1992], теорія епілепсії, пов’язана з дефіцитом ГАМК, у наш час менш переконлива. Посилення ГАМК-ергічної трансмісії може як зменшувати, так і підвищувати збудливість головного мозку – в залежності від того, в якій структурі це відбувається [K. Gale, 1992]. Ймовірно, що зростання вмісту ГАМК в більшості з досліджених структур є компенсаторним механізмом, спрямованим на нормалізацію так званої “об’ємної” трансмісії, що створює певний мозковий тонус, на тлі якого відбувається синаптична передача сигналів. Серед інших медіаторів ГАМК є одним з найбільш вірогідних претендентів на створення такого фону, бо, як і глутамат, присутній у мозку у великій кількості, але, на відміну від глутамату, виконує тільки медіаторну та модуляторну функції.

У щурів із високою судомною готовністю спостерігалось зменшення вмісту глутамату в гіпоталамусі і підвищення у мозочку порівняно з групою Н. Дані стосовно вмісту глутамату узгоджуються з тенденціями щодо посилення глутаматергічної передачі та зменшення спорідненості до глутамату. Різниці у вмісті аспартату в досліджених структурах мозку між щурами груп Н та В не спостерігалося. При дослідженні вмісту гліцину у щурів групи В виявлено зменшення його рівня у стовбурі мозку та тенденція до зниження у мозочку (табл. 8). Можливо ці зміни є компенсаторними у відповідь на посилення гальмівної передачі у даній структурі.

Вплив нікотинаміду на вміст медіаторів. Оскільки нікотинамід гальмує активність ключового ферменту кінуренінового шляху перетворення триптофану в печінці та головному мозку [Л.Д. Попова, 1986], зміни у вмісті нейромедіаторів за впливу нікотинаміду будуть, в деякій мірі, віддзеркалювати вміст медіаторів за умов гальмування кінуренінового шляху обміну триптофану. Однак не слід виключати і його здатності до зв’язування з бензодіазепіновими рецепторами [Г.Н. Крыжановский, А.А. Шандра, А.С.Годлевский, 1981] та підвищення активності ферментів антиоксидантної системи [Л.В. Яніцька та ін., 2005].

У щурів групи Н нікотинамід зменшував вміст глутамату у корі та гіпоталамусі, а у щурів групи В – в усіх структурах, за виключенням стовбуру мозку (табл. 8). Зменшення вмісту глутамату в більшості структур, очевидно, пов’язано зі зменшенням вмісту кінуренінів і необхідністю забезпечення нейротрансмісії через NMDA-рецептори тільки збуджувальними амінокислотами.

Вміст ГАМК у щурів групи Н не змінювався, а в щурів групи В істотно зменшувався в усіх структурах, за виключенням стовбуру мозку (табл. 8). Зменшення вмісту ГАМК у головному мозку щурів групи В, очевидно, зумовлено зменшенням нікотинамідом глутаматдекарбоксилазної активності (рис. 3) та збільшенням ГАМК-ергічної передачі завдяки здатності нікотинаміду зв’язуватись з бензодіазепіновими рецепторами [Г.Н. Крыжановский, А.А. Шандра, А.С.Годлевский, 1981].

Вплив нікотинаміду на систему катехоламінів був односпрямованим. (табл. 6). Різниця між рівнями норадреналіну й дофаміну між групами Н та В у дослідній групі тварин повністю усувалася. Співвідношення [тирозин]/[НА], [ДА]/[НА], [тирозин]/[ДА] (табл. 9) свідчать про те, що у щурів групи Н зростання вмісту катехоламінів тільки у стовбурі мозку зумовлено зростанням їх синтезу, а в інших структурах, можливо, зменшенням їх використання. Розрахунки вищеозначених співвідношень у щурів групи В свідчать про посилення синтезу норадреналіну в усіх досліджених структурах, а дофаміну – в усіх структурах, за винятком темпоральної кори. Нікотинамід є попередникком НАД. Відновлений НАД стимулює ендогенний синтез дофаміну більш швидким відновленням дигідробіоптерину до тетрагідробіоптерину [K.Vrecko et al., 1997]. Крім того, НАДН попереджає гальмування активності тирозингідроксилази (ключового ферменту в синтезі катехоламінів) пероксинітритом (активною формою кисню) [D.M. Kuhn, T.J. Geddes, 2002]. Саме у щурів групи В спостерігалось підвищене утворення активних форм кисню.

За думкою D. Weinshenker, P.Szot, N.S. Miller et al. [2001], норадреналін – потужний ендогенний антиконвульсант. Зростання норадреналіну у стовбурі мозку (де знаходиться locus coeruleus – місце локалізації більшості норадренергічних нейронів), корі, гіпоталамусі (що отримують норадренергічну трансмісію) є важливим для зменшення судомної готовності. Однак, згідно деяким дослідженням, саме зростання вмісту дофаміну корелює зі зменшенням кількості судом [J.W. Dailey, P.C. Jobe, 1984]. Зміни в рівні аспартату та гліцину, можливо, є адаптивними по відношенню до змін у концентраціях, відповідно, глутамату та ГАМК.

Вплив триптофану на вміст медіаторів. Зміни у вмісті нейромедіаторів за впливу триптофану можна розглядати як наслідок посилення кінуренінового шляху обміну триптофану [E.M. Gal, R.B. Young, A.D. Sherman, 1978].

Вплив триптофану на вміст норадреналіну у щурів груп Н та В був різним в усіх структурах, за виключенням стовбуру мозку;