МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ
ПОБЄЛЄНСЬКИЙ ОЛЕГ МИКОЛАЙОВИЧ
УДК 615.361.018.441.014.41:57.085
Експериментальне Вивчення ефективності застосування крІоконсервованОЇ КУЛЬТУРИ мікрофрагментів підшлункової залози НА МОДЕЛІ алоксановОГО діабету
У ЩУРІВ
14.01.35 – кріомедицина
автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Науковий керівник
доктор медичних наук, професор
Хворостов Є.Д
Харків – 2007
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Харківському національному університеті імені В.Н.Каразіна Міністерство освіти і науки України, м. Харків.
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор
Хворостов Євген Дмитрович,
Харківський національний університет імені
В.Н.Каразіна, м.Харків,
завідувач кафедри хірургічних хвороб.
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор
Міміношвілі Омарі Ісидорович,
Інститут невідкладної відновної хірургії, м. Донецьк;
завідувач кафедри госпітальної хірургії,
зам. директора ІНВХ, завідувач відділу абдомінальної
хірургії і політравми.
доктор медичних наук
Компанієць Антоніна Михайлівна,
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН
України, м.Харків,
завідувач відділу кріопротекторів.
Провідна установа: Інститут загальної та невідкладної хірургії АМН України
м.Харків.
Захист відбудеться “_19 ” _червня 2007 р. о “13-30” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23).
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту проблем кріобіології
І кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23).
Автореферат розісланий “_18 ” _травня___2007 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради
член-кореспондент НАН України,
доктор медичних наук, професор Гольцев А.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. За даними ВОЗ цукровий діабет належить до захворювань, які не піддаються радикальному лікуванню [Ефимов А.С., 1994, 1996; Дедов И.И., 2000, 2001; Сhen C. et. al., 1996]. Необоротний розвиток проліферативної ретинопатії, нефропатії, мікроангіопатії нижніх кінцівок, полінейропатії та інших ускладнень, яки призводять до сліпоти, термінальної стадії ниркової недостатності, гангрени нижніх кінцівок, “діабетичної стопи” – ось неповний перелік причин ранньої інвалідизації і смерті хворих.
Клінічний досвід свідчить, що класична інсулінотерапія в цілому здатна вирішити проблему гострих ускладнень діабету, таких як кетоацидоз, але не завжди може зупинити розвиток хронічних ускладнень [Ефимов А.С. и соавт., 2000; Корпачев В.В., 2001]. У таких випадках доцільне поєднання консервативних і хірургічних методів лікування [Бойко Н.И., 1991; Ковалев А.А., 1996; Бекетов О.Д., 1998]. Досягнутий певний прогрес у застосуванні трансплантації острівців підшлункової залози, для якої може бути використаний відповідний матеріал - ізольовані -клітини, острівці, мікрофрагменти підшлункової залози як людини, так і новонароджених тварин (свині, кролики і т.п.) [Морозов Ю.И. и соавт., 1995; Шумаков В.И., 1993, 1998; Ковальская И.А., 1997, 2000; Волков И.А. и соавт., 1998; Дроздович И.И., Турчин И.С., Ларин А.С., 2003; Ricordi C., 1988, 2006; Maffi P. еt al., 2006; Pileggi A. еt al., 2006]. У останні роки знову спостерігається помітне зростання інтересу до ксенотрансплантації острівців підшлункової залози, що пов'язано з необхідністю пошуку альтернативних джерел інсулін-продукуючих клітин (Shumakov V. et al., 2006; Dufrane D. еt al., 2006; Melzi R. et al., 2006]. Експериментальними і клінічними дослідженнями показано, що ксенотрансплантація здатна стабілізувати перебіг цукрового діабету, зупинити у ряді випадків прогрес хронічних діабетичних ускладнень [Максименко С.Ф. и соавт., 1993; Демин Ю.А., 2000; Shumakov V. et al., 2006]. Проте накопичений клінічний досвід невеликий і не дозволяє остаточно деталізувати показання і протипоказання до застосування цієї операції. У літературі практично відсутні дані про використання для трансплантації кріоконсервованого матеріалу, не проведений порівняльний аналіз ефективності застосування нативного та кріоконсервованого матеріалу підшлункової залози, зокрема залежно від різних способів і локалізації введення. Вивчення цих питань в даний час є актуальним, таким, що має важливе теоретичне і практичне значення.
Зв'язок з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану науково-дослідної роботи кафедри хірургічних хвороб факультету фундаментальної медицини Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна “Нові технології в лікуванні цукрового діабету”, № державної реєстрації 0103U004282, 2002-2005 рр.
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було експериментальне дослідження ефективності застосування і особливостей впливу кріоконсервованої культури мікрофрагментів підшлункової залози (ККМФПЗ) новонароджених поросят на глюкозний гомеостаз, ліпідний обмін і імунний статус щурів з алоксановим діабетом залежно від локалізації введення біоматеріалу.
Для реалізації поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:
1. Вивчити вплив кріоконсервування на здатність ККМФПЗ синтезувати ендогенний інсулін в умовах in vitro і in vivo.
2. Вивчити ефективність застосування ККМФПЗ у щурів з експериментальним алоксановим діабетом залежно від локалізації введення біоматеріалу.
3. Вивчити вплив ККМФПЗ на глюкозний гомеостаз і ліпідний обмін у щурів з алоксановим діабетом.
4. Оцінити стан імунного статусу щурів з розвитком алоксанового діабету на фоні введення ККМФПЗ.
5. На підставі проведених експериментальних досліджень теоретично обґрунтувати можливість використання ККМФПЗ в клініці.
Об'єкт дослідження. Параметри глюкозного і ліпідного гомеостазу, ліпідної пероксидації, імунного статусу у щурів з алоксановим діабетом і після введення ККМФПЗ.
Предмет дослідження. Кріоконсервована культура мікрофрагментів підшлункової залози новонароджених поросят.
Методи дослідження: хірургічні, кріобіологічні, біохімічні, імунологічні, патоморфологічні і статистичні. При виборі експериментальної моделі діабету враховувалися сучасні уявлення про клінічний розвиток патології і можливість екстраполяції отриманих результатів на людину. Для оцінки стану глюкозного гомеостазу використані як функціональні і біохімічні показники, так і математичний аналіз складових (функція панкреатичних -клітин в умовах базальної глікемії). Оксидативний статус оцінювали за основними показниками, що характеризують інтенсивність ліпоперо-ксидації.
З метою вивчення проявів алоксанового діабету в острівковій тканині ПЗ і дії на неї біоматеріалу, що вводиться, було проводено гістологічну оцінку морфологічних змін в цих структурах.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне дослідження вуглеводного і ліпідного обміну, імунного статусу щурів з експериментальним цукровим (алоксановим) діабетом на фоні застосування ККМФПЗ, новонароджених поросят. Встановлена їх здатність чинити виражений антиглікемічнй ефект, нормалізувати глюкозний гомеостаз і метаболізм ліпідів у щурів з алоксановим діабетом. Показана залежність ефективності застосування ККМФПЗ від локалізації введення: в печінку, в селезінку, під капсулу нирки, в парапанкреатичну клітковину і внутрішньом'язово. Показано, що введення ККМФПЗ є ефективним методом корекції імунного статусу у щурів з розвитком алоксанового діабету. Вперше проведено морфологічне дослідження підшлункової залози щурів з розвитком алоксанового діабету і після введення ККМФПЗ, встановлена стимулююча дія біоматеріалу на репарацію островкових клітин тварин.
Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень, спрямовані на вивчення ефективності застосування кріоконсервованого біологічного об'єкту – ККМФПЗ новонароджених поросят, як альтернативного джерела інсулінпродукуючих клітин, відкриває нові перспективи в лікуванні цукрового діабету.
На підставі порівняльного аналізу ефективності застосування ККМФПЗ при введенні в різні органи і тканини щурам з алоксановим діабетом вибрана локалізація – у парапанкреатичну клітковину, використання якої сприяє найбільш вираженій корекції патологічних порушень.
Експериментально обґрунтована доцільність застосування ККМФПЗ новонароджених поросят з метою досягнення тривалого клінічного ефекту – зниження глікемії, нормалізації ліпідного обміну і імунного статусу в комплексному лікуванні цукрового діабету в клінічній практиці.
Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно проведено аналіз даних літератури, отримані результати експериментальних досліджень, здійснений їх первинний аналіз і статистична обробка. Спільно з науковим керівником проведено планування експериментальної роботи, інтерпретовані отримані результати і сформульовані остаточні висновки. В опублікованих спільно з співавторами роботах особистий внесок здобувача полягає:
у роботі [1] – у проведенні хірургічних досліджень по корекції цукрового діабету;
у роботі [2] – у обґрунтуванні і проведенні моделювання аллоксанового діабету;
у роботі [3] – у проведенні клінічних досліджень на експериментальній моделі аллоксанового діабету у щурів;
у роботі [4] – у проведенні експериментальних досліджень біохімічних показників і рівня глікемії у щурів з АД і після застосування ККМФПЗ;
у роботі [5] – у плануванні експериментів та вивченні морфології під-шлункової залози щурів з АД і після застосування ККМФПЗ;
у роботі [6] – у проведенні моделювання АД у щурів, хірургічного введення ККМФПЗ та проведенні статистичної обробки отриманих результатів.
у патенті [7] – запропонував і проводив трансплантацію острівцевих клітин підшлункової залози методом лапароскопії.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були доповідались і обговорювались на конференціях “Гастроентерологічний тиждень”, м. Москва, 1997, 1998 р.; “Актуальні питання госпітальної хірургії” м. Ужгород, 1999 р.; “Хірургічна корекція цукрового діабету”, м. Київ, 2003 р.
Публікації матеріалів дисертації. За матеріалами дисертаційної роботи у наукових фахових виданнях опубліковано 6 статей та отримано 1 патент на винахід.
Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 162 сторінках друкованого тексту, з яких 130 сторінок основного змісту. Дисертаційна робота складається із введення, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків і списку використаних літературних джерел, який налічує 330 найменувань, розміщених на 32 сторінках. Робота містить 19 таблиць, 11 рисунків і 12 мікрофотографій.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи дослідження
У роботі були використані статевозріли щури-самці лінії Вістар масою 180-210 г, що утримувалися в стандартних умовах віварію Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України при нормальному освітленні і годуванні ad libitum. Дослідження проводилися відповідно до національних "Загальних етичних принципів експериментів на тваринах", які узгоджуються з положеннями "Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для експериментальних і інших наукових цілей" (Страсбург, 1985).
Дослідження було проведено на експериментальній моделі цукрового діабету I типу - аллоксанового діабету. Для його моделювання алоксан - моногідрат (ICN Biomedical Inc.) вводили одноразово під шкіру щурам в дозі 130 мг/кг маси тварини після попереднього 24-годинного голодування при вільному доступі їх до води.
175 щурів були розподілені на 7 груп: 1 контрольна – 7 інтактних щурів; 2 - з розвитком патології алоксанового діабету (АД), які не отримували біоматеріал – 28 щурів; 5-ти іншим групам щурів після появи розгорненої картини АД на 14-у добу було введено ККМФПЗ: в печінку – 28 щурів, в селезінку – 28 щурів, під капсулу нирки – 28 щурів, в парапанкреатичну клітковину – 28 щурів і внутрішньом'язово – 28 щурів. З експерименту тварин виводили шляхом декапітації під ефірним наркозом на 3-ю, 7-у, 14-у, 28-у добу до і після введення ККМФПЗ.
Тканину ПЗ новонароджених поросят для культивування отримували по методу [Турчін І.С., 1996]. Технологія її кріоконсервування була розроблена у відділі експериментальної кріомедицини Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України [Сандомирський Б.П., Волкова Н.О., Гальченко С.Є., Белочкіна І.В., 2000]. Для кріоконсервування брали мікрофрагменти острівкової тканини ПЗ новонароджених поросят після культивування.
Загальна схема підготовки матеріалу наступна: експлантація ПЗ мікродисекція ПЗ в живильному середовищі 199 культивування впродовж 5-7-ми діб в живильному середовищі 199 з додаванням 10% ембріональної телячої сироватки (ЕТС) і антибіотиків (100 од/мл) заморожування в середовищі з 10% ДМСО за двоетапною програмою: 10С/хв. до – 70С/хв з подальшою зупинкою, потім 100 С/ хв. до – 300 С/хв. з подальшим зануренням в рідкий азот (-1960). Зберігання біоматеріалу при даній температурі в герметично закритих контейнерах здійснювали протягом року в низькотемпературному банку Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.
У експеримент брали біоматеріал, який від моменту культивування і кріоконсервування до застосування зберігали в умовах низькотемпературного банку від 2-3-х тижнів до 10-12-ти місяців. Для культивування і подальшого кріоконсервування брали тканину острівців ПЗ у поросят у віці одного дня.
Перед введенням ККМФПЗ розморожували на водяній лазні при 370С, триразово відмивали фізіологічним розчином від кріопротектору. Введення ККМФПЗ щурам виконували під легким ефірним наркозом пункціями в паренхіму печінки і селезінки, під капсулу нирки, в клітковину панкреатичної залози, а також у м'язу бічної поверхні стегна. Доза біоматеріалу, що вводилася, складала 0,5 г. Всі операції проводили в умовах операційної з дотриманням стерильності.
У всіх тварин, що використовувалися в експерименті, проводився контроль рівня глюкози в крові в базальному стані. Кров для аналізу брали з хвостової вени після попереднього чотирьохгодинного голодування. Рівень глюкози в крові визначали глюкозооксидазним методом із застосуванням аналізатора глюкози “Ексан-Г” (Литва).
Рівень імунореактивного інсуліну в сироватці крові визначали за допомогою стандартних наборів “рио-ИНС-ПГ-125І” (Білорусь) методом радіоімунологічного аналізу “in vitro”. Індекс функції -клітин (ФБК) розраховували за допомогою алгоритму НОМА (Homeostasis Model Assessment), який базується на одночасному визначенні індивідуальних рівнів інсуліну і базальної глікемії [Matthews D.R. et. al., 1985], по формулі:
ФБК= (20 х інсулін 0)/(глікемія 0– 3,5),
де інсулін 0 – рівень імунореактивного інсуліну (мкОд/мл) в сироватці крові натщесерце, глікемія 0 – базальна глікемія (ммоль/л) в сироватці крові натщесерце.
Визначення вмісту фруктозаміну в сироватці крові проводили в ході реакції відновлення з використанням нітросинього тетразолія в карбонатному буфері (0,1 моль/л, рН 10,8), оптичну щільність вимірювали при 530 нм [Johnson R.N. et. al., 1982]. Вміст загального холестерину і тригліцеридів в сироватці крові визначали з використанням стандартних наборів фірми “Lachema” (Чехія). Концентрацію неестерифікованих жирних кислот (НЕЖК) в сироватці крові визначали фотоколориметричним методом з використанням мідного реактиву і диетилдитіокарбоната [Duncomb W.C., 1963]. Сумарний вміст атерогенної фракції ліпопротеїнов низької і дуже низької щільності (ЛПНЩ+ЛПОНЩ) в сироватці крові оцінювали турбодиметричним методом [Колб В.Г., Камышников В.С., 1982]. Вміст первинних продуктів перекісного окислення ліпідів (ПОЛ) – дієнових, оксидієнових і триєнових кон’югатів – визначали в гептан/ізопропанольних екстрактах сироватки крові методом [Плацер З. и соавт., 1970; Волчегорский и соавт., 1989], що характеризує ступінь ініціації ліпопероксидації. Проводилося також визначення змісту кінцевих продуктів ліпопероксидації, а саме продуктів, які реагують з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-активні продукти, ТБКАП), згідно методу [Стальная И.Д., Гаришвили Г.Т., 1977]. У гомогенаті печінки визначали початковий і індукований двовалентним залізом і аскорбатом натрію рівень ТБКАП [Yan H.Harding, 1997]. Інтенсивність вільнорадикального окислення ліпідів визначали по величині хемілюмінесценції (ХЛ) [Бабенко Г.А. и соавт., 1983] з використанням хемілюмінометру, в режимі рахунку фотонів в сироватці крові і в суспензії печінки по методу [Oda A. еt. al., 1994].
З гематологічних показників оцінювали кількість еритроцитів – 1012/л і лейкоцитів – 109/л шляхом підрахунку в камері Горяєва по методу [Кост Е.А., 1968], швидкість осідання еритроцитів (ШОЕ) мікрометодом Панченкова [Назаренко Е.А., 2000], визначення гемоглобіну – ціанметгемоглобіновим методом [Кост Е.А.,1968] і лейкоцитарну формулу загальноприйнятим методом [Меньшиков В.В., 1987].
Динаміку змін імунного статусу щурів визначали за змістом кількості Т-хелперів (CD4+) і Т-супресорів (CD8+) методом прямої мембранної імунофлюоресценції [Шторх В., Еммрах И., 1987], використовуючи відповідні антищурячі ФІТЦ - мічені моноклональні антитіла (МАТ) (CALTAG, США). Підрахунок проводили в люмінесцентному мікроскопі ЛЮМАМ Р1 (ЛОМО). Визначення циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) проводили по методу [Стручков П.В. и соавт., 1985]. Зміну щільності розчину реєстрували на спектрофотометрі СФ-46. Константу К розраховували як відношення концентрації С4 і С3. Кількість адгезівних клітин перітонеальної порожнини (АКПП) оцінювали за допомогою тесту їх приліпання до поверхні пластикових чашок Петрі. Число АКПП визначали як різницю між кількістю внесених клітин і кількістю клітин в надосадку [Пастер Е.У. и соавт., 1989]. Вивчення фагоцитарної активності клітин ПП визначали по методу [Александров М.Т. и соавт., 1988], підраховуючи кількість фагоцитуючих клітин (фагоцитарний індекс – ФІ) і середнє число поглинених мікробних тіл однією клітиною(фагоцитарне число – ФЧ).
Вивчення морфологічних змін у тканині острівців ПЗ у щурів з розвитком АД і після введення ККМФПЗ проводили на гістологічних препаратах Меркулов Г.А., 1980. Мікроскопію забарвлених гематоксилін-еозином гістологічних препаратів здійснювали в світловому мікроскопі ЛОМО, х 100; х 400.
Статистичну обробку отриманих результатів проводили на персональному комп'ютері, використовуючи пакет програм Exel і Statistica. Залежно від характеру розподілу даних використовували параметричний метод статистичного аналізу (t-критерій Ст’юдента) або непараметричний Манна-Уітні, а також використовували r критерій Пірсона для оцінки кореляції параметрів [Гланц З., 1999]. Як критерій статистичної достовірності відмінностей приймали рівень 95% (р<0,05).
Результати досліджень і їх обговорення
Найбільш інформативним критерієм функціональної повноцінності ККМФПЗ є її чутливість до екзогенних стимуляторів продукції інсуліну в умовах культивування.
Таблиця 1
Продукція інсуліну - клітинами ПЗ в культурі до кріоконсервування
Середовище
культивування | Середня швидкість виходу інсуліну в середовище
культивування (мкОд/год. на одну ПЗ)
1 доб. культура | 2 доб. культура | 3 доб. культура
Базальне середовище
(5,6 мМ глюкози) | 728,6 | 45,65,3 | 48,73,8
Стимулююче середовище (16,7 мМ глюкози) | - | 319,27,4 | 331,16,7
У таблицях 1 і 2 представлені дані по продукції інсуліну - клітинами у вигляді середньої швидкості його виходу – мкОд/год. на одну ПЗ в середу культивування. Як випливає з наведених даних, кріоконсервування супроводжується зниженням порівняно з даними для нативної тканини, як базальної, так і стимулюьованої секреції інсуліну, що відображає пошкодження клітинних структур на етапах заморожування-відігрівання.
Таблиця 2
Продукція інсуліну - клітинами ПЗ в культурі після кріоконсервування
Середовище
культивування | Середня швидкість виходу інсуліну в середовище культивування (мкОд/год. на одну ПЗ)
1 доб. культура | 2 доб. культура | 3 доб. культура
Базальне середовище
(5,6 мМ глюкози) | 43,72,5 | 28,32,7 | 33,73,5
Стимулююче середовище (16,7 мМ глюкози) | - | 86,74,1 | 104,82,8
Проте, отримані дані показують, що збільшення концентрації глюкози до стимулюючих значень (16,7 ммоль/л) і інкубація ККМФПЗ в такому середовищі протягом 3-х годин приводить до прискорення секреції інсуліну і істотного збільшення його вмісту в середовищі, що складало в даній серії експериментів не менше 1000 мкОд на пробу (одна ПЗ) на добу (середня швидкість виходу інсуліну – 86,7 мкОд/год. на 2-гу добу і 104,8 мкОд/год. – на 3-ю добу культивування). Не виключено, що певний внесок в цей показник вносить інсулін, що пасивно вийшов в культуральне середовище з частини зруйнованих інсулінпродукуючих клітин, про що може свідчити зростання швидкості виходу інсуліну на 3-ю добу культивування (табл. 2). Повернення біоматеріалу в умови з низьким вмістом глюкози (5,6 ммоль/л) призводить до зниження продукції інсуліну до значень менше 800 мкОд/доб.
Таким чином, описана динаміка продукції інсуліну впродовж 3-х діб після відігрівання свідчить про функціональну повноцінність кріоконсервованого матеріалу протягом цього часу. Тобто, кріоконсервований біоматеріал певною мірою зберігає свою основну функцію – здібність до вироблення інсуліну і може бути використаний як гормонпродукуюча тканина для корекції порушень глюкозного гомеостазу.
Далі був проведений порівняльний аналіз ефективності застосування ККМФПЗ щурам з АД в залежності від локалізації введення. На 14-ту добу розвитку АД у тварин спостерігалися класичні клінічні прояви тяжкого цукрового діабету: адинамія, сонливість, втрата маси тіла, випадіння шерсті, різкий запах ацетону, підвищення рівня глюкози у крові до 16,7±0,51 ммоль/л. При рівні глюкози 22,0 ммоль/л, який реєструвався з 15-17-ої діб патології, відзначалася поява симптомів діабетичної коми, яка приводила до загибелі тварин. Проте у щурів, яким застосовували ККМФПЗ, спостерігали поступову нормалізацію рівня глюкози в сироватці крові (табл. 3) і зникнення симптомів діабету.
Слід підкреслити, що антиглікемічна дія ККМФПЗ виявлялася неоднаково, в різні терміни після ії введення експериментальним тваринам і залежала від місця введення. Так, при введенні в парапанкреатичну клітковину даний ефект починав виявлятися вже з 4-ї доби, в селезінку і під капсулу нирки – з 6-ї доби, в печінку – з 9-ї доби, а внутрішньом'язово - тільки з 14-ї доби. Але вже на 28-у добу післяопераційного періоду у всіх експериментальних тварин було визначалося значне зниження рівня глюкози у сироватці крові. У цей період у всіх досліджених щурів відзначали наростання шерсті і її блиску, збільшення маси тіла і рухливості, зникала сонливість, був відсутній запах ацетону, що підтверджує антиглікемічну дію ККМФПЗ у всіх щурів, незалежно від області введення, що визначалося по зниженню рівня глюкози (табл.3) і відсутності клінічних симптомів діабету. Суттєвим результатом даної серії експериментів є встановлений факт залежності швидкості зниження концентрації глюкози від локалізації застосування введення ККМФПЖ. Так, при введенні у парапанкреатичну клітковину зниження концентрації глюкози виявилося значно ефективніше, ніж внутрішньом’язове.
Таблиця 3
Рівень глюкози в сироватці крові щурів з АД і після введення ККМФПЗ
Група тварин | Концентрація глюкози (ммоль/л)
АД |
Строк спостереження, доба
3-я | 7-а | 14-а | 28-а
ККМФПЗ в печінку | 16,70,511 | 15,130,37 | 14,560,36 | 8,450,411 | 5,600,371,2
ККМФПЗ в селезінку | 14,940,30 | 12,010,341 | 6,610,251 | 4,360,281,2
ККМФПЗ під капсулу нирки | 15,110,30 | 12,250,401 | 7,010,251 | 4,850,111,2
ККМФПЗ в парапан-креатичну клітковину | 12,930,331 | 10,720,201 | 5,660,321,2 | 4,370,201,2
ККМФПЗ
внутрішньом'язово | 15,820,32 | 15,050,31 | 12,450,221 | 8,930,321
Інтактні щури | 4,220,16
Примітки: 1 – відмінності достовірні в порівнянні з показником до введення, р<0,05; 2 – відмінності не достовірні в порівнянні з інтактними щурами, р>0,5
Дослідження концентрації інсуліна в сироватці крові і функції ?-клітин (індекс ФБК) виявилося інформативним показником ефективності застосування ККМФПЗ ( табл. 4). Так, у щурів з АД вже на 7-му добу розвитку патології виявилося різке – з 105,67±7,48 до 15,82±1,88 пмоль/л – падіння рівня інсуліну в сироватці крові, на 14-ту і 28-му добу спостережень цей показник зменшувався повільно. Застосування ККМФПЗ приводило до поступового підвищення рівня інсуліна у щурів на 28-му добу спостережень (табл.4). Різниці між досліджуваними показниками в залежності від локалізації введення, за вийнятком внутрішньом’язового застосування, встановлено не було.
Ефективність використання ККМФПЗ підтвердилася дослідженням динаміки індексу ФБК, який складається з рівня роботи як власних залишкових панкреатичних -клітин, так і введених в ході експерименту. Так на 7-му добу після введення ККМФПЗ індекс ФБК відзначений на однаково низькому рівні у всіх експериментальних тварин незалежно від локалізації (табл.4). Але вже з 14-ої доби спостерігалося вірогідне підвищення даного показника у всіх групах, за винятком тварин з внутрішньом’язовим введенням ККМФПЗ. на 28-му добу індекси складали від 17% вихідної величини при веденні в печінку і до 70,5% - при введенні в парапанкреатичну клітковину. Слід підкреслити, що тількі в групі експериментальних тварин з введенням ККМФПЗ в парапанкреатичну клітковину індекс ФБК на 28-му добу вірогідно не відрізнявся від показника у інтактних щурів, р > 0,5.
З метою підтвердження вираженої антиглікемічної дії ККМФПЗ використовували метод неферментативного глікозилірування з визначенням вмісту фруктоз- аміну. Даний метод дозволив встановити, що у щурів з АД на 7-му добу розвитку патології спостерігається підвищення концентрації фруктозаміну в сироватці крові. Цей ефект, як видно, пов'язаний з інтенсивністю протікання процесів неферментативного глікозилірування - посиленням метаболізму глюкози по гексозоаміновому шляху і утворенням фруктози в інсуліннечутливих тканинах [Shield et al, 1994]. Найшвидше рівень фруктозаміну знижувався при введенні ККМФПЗ в парапанкреатичну клітковину.
Після введення ККМФПЗ рівень фруктозаміну поступово знижувався і на 28-му добу після введенняі в селезінку, під капсулу нирки, в парапанкреатичну клітковину вірогідно не відрізнявся від такого у інтактних щурів, що свідчить про фізіологічний рівень не тільки базальної, але і постпрандіальної глікемії (табл. 5).
Важливою ланкою метаболічних порушень при розвитку ЦД є зниження ліпогенної дії і зняття впливу гормонів, що інгібують при інсуліновій недостатності ліполіз в печінці і жировій тканині.
Згідно гіпотезі MсGarry J.D. підвищення НЕЖК в крові пригнічує синтез інсуліну -клітинами ПЗ і тим самим призводить до розвитку інсулінрезистентності, в умовах наявності інсулінсекретуючої активності ПЗ при ЦД I типу.
У щурів при моделюванні АД спостерігали значне підвищення рівня тригліцеридів в сироватці крові і концентрації НЕЖК, причому триразове збільшення НЕЖК на 14-ту добу спостереження, замінювалося деяким зниженням на 28-му добу, що може пояснюватися загальним виснаженням периферичної жирової тканини – джерела НЕЖК і падінням їх синтезу de novo внаслідок недоліку енергетичного субстрату для забезпечення реакції – НАДФН (табл. 6).
Таблиця 4.
Динамика інсулінемії і функція -клітин у щурів з АД і після введення ККМФПЗ, n=7
Група тварин | Строк спостереження, доба | Інсулін, пмоль/л | Глюкоза, ммоль/л | ФБК
АД |
7-а | 15,82±1,88 | 16,59±0,82 | 3,78±0,36
14-а | 13,65±0,96 | 18,07±0,951 | 2,93±0,18
28-а | 12,36±1,52 | 18,87±1,861 | 2,51±0,231
ККМФПЖ
в печінку | 7-а | 26,47±2,16 | 14,02±0,71 | 8,27±1,31
14-а | 37,25±5,75 | 8,45±0,411 | 25,11±4,771
28-а | 41,33±6,211 | 5,60±0,371,2 | 73,95±17,121
ККМФПЖ
в селезінку | 7-а | 30,00±3,74 | 12,01±0,48 | 11,30±1,59
14-а | 43,33±3,721 | 6,66±0,211 | 44,68±6,141
28-а | 42,17±2,021 | 4,39±0,231,2 | 213,52±61,031
ККМФПЖ під капсулу нирки | 7-а | 35,90±4,34 | 12,13±0,92 | 14,00±2,43
14-а | 41,00±5,59 | 6,88±0,351 | 38,32±3,661
28-а | 45,17±3,62 | 4,73±0,141,2 | 124,92±19,641
ККМФПЖ в парапанкреати
чну клітковину | 7-а | 29,50±2,65 | 10,55±0,38 | 13,49±1,63
14-а | 40,42±3,701 | 5,54±0,451 | 97,07±35,031
28-а | 41,43±3,531 | 4,40±0,291,2 | 301,61±136,701,2
ККМФПЖ внутрішньо-м’язово | 7-а | 19,32±1,68 | 15,59±0,32 | 5,02±0,48
14-а | 18,35±0,74 | 12,37±0,251 | 6,49±0,33
28-а | 22,70±1,37 | 8,84±0,361 | 13,87±1,851
Інтактні щури | 105,67±7,48 | 4,16±0,07 | 532,47±56,10
Примітки: 1 – відмінності достовірні в порівнянні з показником до введення, р<0,05; 2 – відмінності не достовірні в порівнянні з інтактними щурами, р>0,05
Таблиця 5
Концентрація фруктозаміну у щурів з АД і після введення ККМФПЗ
Група тварин | Концентрація фруктозаміну, ммоль/л
Строк спостереження, доба
7-а | 14-а | 28-а
АД 3,54±0,29 | 3,92±0,34 | 4,22±0,42
ККМФПЗ
в печінку | 3,28±0,10 | 2,91±0,24 | 2,42±0,221
ККМФПЗ
в селезінку | 3,20±0,18 | 2,82±0,28 | 2,03±0,061,2
ККМФПЗ під капсулу нирки | 3,15±0,16 | 3,02±0,30 | 2,11±0,091,2
ККМФПЗ в парапанкреатичну клітковину | 3,14±0,15 | 2,76±0,24 | 1,90±0,111,2
ККМФПЗ внутрішньом'язово | 3,33±0,22 | 3,21±0,19 | 3,01±0,19
Інтактні щури | 1,72±0,115
Примітки: 1 – відмінності статистично достовірні в порівнянні з показником на 7-му добу, р<0,05; 2 – відмінності не достовірні в порівнянні з інтактними щурами, р>0,5
Таблиця 6
Концентрація тригліцеридів і неестерифікованих жирних кислот в сироватці крові щурів з АД і після введення ККМФПЗ
Група тварин | Строк спостереження, доба | Трігліцеріди, мг | НЕЖК, ммоль/л
АД | 7-а | 1,02±0,05 | 1,21±0,10
14-а | 1,73±0,042 | 1,06±0,042
28-а | 1,58±0,061 | 0,93±0, 071
ККМФПЗ в печінку | 7-а | 1,07±0,04 | 1,19±0, 08
14-а | 1,05±0,061 | 0,73±0, 071
28-а | 1,02±0,052 | 0,63±0, 041,2
ККМФПЗ в селезінку | 7-а | 1,06±0,06 | 1,16±0,09
14-а | 1,03±0,071 | 1,66±0,211
28-а | 0,81±0,051,2,3 | 0,52±0,0531,2,3
ККМФПЗ під капсулу нирки | 7-а | 1,01±0,05 | 1,24±0,12
14-а | 1,00±0,09 | 0,88±0,051
28-а | 0,88±0,052 | 0,58±0,071,2
ККМФПЗ в парапанкреатичну клітковину | 7-а | 0,99±0,05 | 1,13±0,10
14-а | 0,82±0,071 | 0,54±0,051
28-а | 0,79±0,051,2,3 | 0,45±0,041,2,3
ККМФПЗ внутрішньом'язово | 7-а | 1,032±0,06 | 1,25±0,092
14-а | 1,035±0,074 | 1,07±0,051
28-а | 1,13±0,062 | 0,76±0,061
Інтактні щури | 0,73±0,042 | 0,36±0,042
Примітки: 1 – відмінності статистично достовірні в порівнянні з показником на 7-му добу, р<0,05; 2 – відмінності достовірні в порівнянні з контролем, р<0,05; 3 – відмінності не достовірні в порівнянні з нормою, р>0,5.
Введення ККМФПЗ запобігало патологічному підвищенню рівня тригліцеридів в крові, незалежно від місця введення. Проте, при введенні в селезінку або в парапанкреатичну клітковину концентрація НЕЖК достовірно не відрізнялася від контрольних значень і корелювала з довгостроковим глікемічним контролем.
Істотне підвищення вмісту холестерину в сироватці крові щурів при розвитку АД попереджалося введенням ККМФПЗ. Виняток становило внутрішньом'язове введення, при якому зниження даного параметра не приводило до його нормалізації, навіть на 28-му добу спостережень (табл. 7).
Таблиця 7
Оцінка загального холестерину і атерогенної фракції ліпопротеїнів в сироватці крові у щурів з АД і після введення ККМФПЗ
Група тварин | Строк
спостереження, доба | Загальний холестерин, ммоль/л | ЛПНП+ЛПОНП, мг/мл
Інтактні щури | 7-а | 1,94±0,12 | 1,54±0,082
28-а | 2,01±0,122 | 1,57±0,092
АД | 7-а | 2,09±0,093 | 2,20±0,10
28-а | 2,98±0,161 | 3,76±0,141
ККМФПЗ
в печінку | 7-а | 2,04±0,113 | 2,25±0,10
28-а | 2,31±0,122,3 | 1,69±0,071,2,3
ККМФПЗ
в селезінку | 7-а | 2,01±0,103 | 2,07±0,11
28-а | 2,10±0,112,3 | 1,66±0,081,2,3
ККМФПЗ
під капсулу нирки | 7-а | 2,08±0,123 | 2,11±0,10
28-а | 2,12±0,122,3 | 1,71±0,071,2,3
ККМФПЗ в парапанкреатичну клітковину | 7-а | 2,02±0,143 | 2,06±0,08
28-а | 2,09±0,122,3 | 1,68±0,091,2,3
ККМФПЗ
внутрішньом'язово | 7-а | 2,08±0,133 | 2,17±0,12
28-а | 2,49±0,142 | 1,90±0,092
Примітки: 1 – відмінності статистично достовірні в порівнянні з показником на 7-му добу, р<0,05; 2 – відмінності достовірні в порівнянні з контролем, р<0,05; 3 – відмінності не достовірні в порівнянні з нормою, р>0,5
Була проведена комплексна оцінка інтенсивності пероксидації ліпідів у щурів з АД до і після застосування ККМФПЖ по рівню початкових (ДК, ТК, ОДК) і кінцевих (ТБКАП) продуктів ПОЛ у сироватці крові, визначенню інтенсивності ХЛ, індукованої Fe2+ і Н2О2, у сироватці крові і печинці тварин. Встановлено, що найбільш виражене вірогідне зниження концентрації ДК, ТК, ОДК і ТБКАП у крові спостерігалося на 14 добу після введення ККМФПЖ в парапанкреатичну клітковину, на 28 – після введення під капсулу нирки і в селезінку; наіменший ефект був отриманий при введенні біоматеріалу внутрішньом?язово і в печінку. Введення ККМФПЖ внутрішньом?язово і у парапанкреатичну клітковину приводило до вірогідного зниження Fe2+- і Н2О2-індукованої ХЛ у сироватці крові щурів на 28 добу після застосування відносно показників при АД.
Дослідження методом ХЛ вільнорадикальних процесів у печінці щурів показало, що при АД активується утворення вільних радикалів (ХЛ, індукована Fe2+) і зменшується стійкість до перекисного окислення (ХЛ, індукована Н2О2); спостерігається, також, значне (у 4,1 раза) зростання ХЛ після попередньої інкубації гомогената печінки з аскорбатом (неферментативна активація ПОЛ). Застосування ККМФПЖ введенням у парапанкреатичну клітковину і внутрішньом?язово сприяло зниженню досліджених показників, особливо ХЛ, індукованої Fe2+, а також кількості аскорбат-індукованого ТБКАП, тоді як для початкового і індукованого Fe2+ рівня ТБКАП встановлено лише слабку тенденцію до зниження.
Порівняльна оцінка ефективності застосування ККМФПЖ свідчить про те, що зниження активності вільно радикальних процесів у щурів з АД відбувається опосередковано, через відновлення рівня глюкози в крові, і залежить від локалізації введення біоматеріалу. Більш ранні строки стабільного зниження рівня глюкози в крові після введення ККМФПЖ у парапанкреатичну клітковину поєднуються з більш вираженою і швидкою нормалізацією рівня вільно радикальних процесів у експериментальних тварин.
Дослідження гематологічних показників крові щурів з розвитком АД дозволило встановити, що введення ККМФПЗ на 14-ту добу, у термін найбільш яскравих клінічних проявів, володіє здатністю нормалізувати показники периферичної крові, а саме: підвищувати вміст еритроцитів і знижувати кількість лейкоцитів, нормалізувати такі важливі показники, як ШОЕ, вміст лімфоцитів з одночасним зниженням кількості моноцитів і нейрофільних гранулоцитів. Так, здатність ККМФПЗ нормалізувати показники периферичної крові щурів з розвитком патологічного процесу залежить від локалізації введення біоматеріалу. Найбільш виражену тенденцію до нормалізації цих показників спостерігали у щурів при введенні ККМФПЗ в парапанкреатичну клітковину. В такому випадку досліджені параметри найбільш наближалися до показників інтактного контролю.
Вивчення стану імунної системи (ІС) при розвитку патології ЦД І типу, що відноситься до аутоімунних захворювань (Малышев В.А., 1998; Yang Z. et. al., 2002; Chen C. et. al., 2003; Chen Y. et. al., 2004), пов'язано з особливостями взаємодії імунної і ендокринної систем. Порушення функції ендокринної системи, що пов’язана насамперед з продукцією гормонів ПЗ, спричиняє зміни і в ІС, а саме в її клітинній і гуморальній ланках.
Судячи з отриманих даних, застосування ККМФПЗ може або поcередньо, або безпосередньо коригувати стан ІС, насамперед, її клітинну ланку, що знаходиться в щонайтіснішому взаємозв'язку з ендокринною сферою організму щура. Так для Т-ланки ІС найбільш значущими було повернення до норми абсолютного змісту CD4+ клітин (Т-хелперів). Не дивлячись на тенденцію до підвищення концентрації CD8+клітин (Т-супресорів) порівняно з нелікованими щурами, достовірних змін їх відносного вмісту досягнуто не було. Це відображається в показниках ІРІ (табл. 8).
Таблиця 8
Відносний вміст CD4+ і CD8+ Т лімфоцитів крові щурів з AД і після введення ККМФПЗ
Група тваринСтрок спостереження, доба3-я | 7-а | 14-а | 28-а | Т-лімфоцити | Т-лімфоцитиТ-лімфоцитиТ-лімфоцити | СD4+ | CD8+ | ІРІ | СD4+ | CD8+ | ІРІ | СD4+ | CD8+ | ІРІ | СD4+ | CD8+ | ІРІ
ККМФПЗ в печінку | 10,961± 1,211 | 10,003±1,0 1 | 1,096±
0,10 1 | 7,901± 0,90 | 10,403±
1,10 | 0,759±
0,102 | 17,92±
1,402 | 22,50±
2,602 | 0,796±
0,68 | 24,234±
2,50 1 | 20,633±
3,143 1 | 1,175±
0,795 1
ККМФПЗ в селезінку | 12,444±
1,412 | 8,603± 0,914 | 1,446±
0,102 | 14,50± 1,50 | 21,414±
2,302 | 0,677±
0,05 | 24,612±2,902 | 26,010±2,44 1,2 | 0,946±
0,202 1 | 26,712±
3,10 1 | 18,7±
2,23 | 1,428±
0,390 1
ККМФПЗ під капсулу нирки | 10,832±
1,901 | 5,215±
0,60 | 2,077± 0,20 1 | 10,117±1,20 | 12,20±
1,316 | 0,829 0,08 | 25,110±2,80 | 7,633±
0,902 | 3,289±
0,104 | 22,823±
2,803 | 15,600±1,90 | 1,463±
0,475 1 | ККМФПЗ в парапанкреатичну клітковину | 15,212±
1,710 | 12,0±
1,40 | 1,267± 0,201 | 14,900±1,235 | 15,914±
1,60 | 0,936±
0,10 | 22,215±2,603 | 21,30±
2,7331,2 | 1,043± 0,952 1,2 | 28,0±
3,20 2 | 19,0±
2,30 | 1,474±
0,391
ККМФПЗ внутрішньо-м’язово | 14,654±
1,614 | 4,201± 0,510 | 3,488± 0,440 | 14,212± 1,502 1 | 7,933±
0,904 | 1,792±
0,402 | 25,215±3,20 | 19,402±1,602 1,2 | 1,299±
0,998 1 | 22,623±
2,302 1 | 12,6±
1,016 1 | 1,795±
0,076
АД 14-а доба | СD4+ – 15,02±1,320 CD8+ – 7,16±0,76 ІРІ– 2,098±0,318
Інтактні щури | СD4+ – 35,31±1,36 CD8+ – 22,24±1,83 ІРІ – 1,588,581 | Примітка: 1 - відмінності статистично достовірні порівняно з показниками АД (p < 0,05); 2 - відмінності статистично достовірні порівняно з контролем (p < 0,05)
Під контролем клітинної ланки імунітету знаходиться і гуморальна ланка. Тому логічними є позитивні зміни в ній у щурів з АД, що спостерігалися вже на 14-ту добу після введення ККМФПЗ. І хоча у всіх тварин було встановлено достовірне збільшення мЦІК у порівнянні з контролем, досліджувані показники гуморальної ланки ІС змінювалися в кращу сторону. У групі щурів з введенням ККМФПЗ в парапанкретичну клітковину кількість мЦІК досягала рівня контрольних значень (рис. 1).
Рис.1. Вміст мЦІК в сироватці крові щурів з розвитком АД і після введення ККМФПЗ
Зміна концентрації ЦІК чітко коригувала із зміною активності клітин МФС. Так ФІ при введенні ККМФПЗ носило виражену тенденцію до відновлення у всіх групах тварин вже на 7-у добу, така ж особливість була відмічена і для зміни ФЧ. Слід зазначити, що інтегральна фагоцитарна активність клітин ПП реципієнтів всіх досліджуваних груп впродовж 28-и діб після початку лікування наближалася до контролю (рис. 2).
Рис. 2. Фагоцитарна активність клітин ПП щурів з розвитком АД і після введення ККМФПЗ; фагоцитарний індекс (а) і фагоцитарне число (б)
При вивченні здібності клітин ПП до адгезії були отримані цікаві дані про те, що на відміну від нелікованих тварин початок відновлення цього показника до рівня початкових значень спостерігався вже з 7-ї доби, незалежно від області введення, і цей процес відбувався активніше, ніж відновлення інших показників (рис. 3).
Рис. 3. Адгезуюча активність клітин ПП у щурів з розвитком АД і після введення ККМФПЗ; кількість клітин ПП (а), адгезія (б)
Отримані результати дослідження ІС дозволяють зробити висновок, що терапія з використанням ККМФПЗ є ефективним методом її корекції у щурів з АД. В першу чергу ККМФПЗ коригує стан клітинної ланки імунітету, а потім через нього відбувається відновлення гуморальної ланки імунітету. Найбільш виражена корекція стану ІС у щурів з розвитком АД спостерігалася після введення ККМФПЗ в парапанкреатичну клітковину.
Відповідно до даних гістологічних досліджень, було встановлено, що на 14-ту добу розвитку АД екзокринна частина ПЗ була повністю відновлена, з чіткими межами і розміром А-клітин. Острівці Лангерганса залишалися вдвічі зменшеними, з некротизованими -клітинами.
Визначено стимулюючу дію введених ККМФПЗ на репарацію острівцевої тканини, появу нових -клітин між ацинарними клітинами і біля протоків, що може бути пов'язане з своєрідною трансформацією епітелію проток і ацинарних клітин в -клітини. Така стимуляція регенерації острівців Лангерганса і поява нових -клітин була особливо виражена і в більш ранній період при введенні ККМФПЗ в парапанкреатичну клітковину.
Крім того, в окремих острівцях саме при даному методі введення ККМФПЗ спостерігалася гіперплазія острівців Лангерганса.
З іншого боку, враховуючи той факт, що в результаті застосування ККМФПЗ щурам з АД при інших локалізаціях введення також відновлялася здатність -клітин ПЗ виробляти інсулін, але менш виражено і в більш віддалені терміни, можна припустити, що досліджений біоматеріал виробляє або впливає на біологічно активні гуморальні чинники, які
