УМАНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ПИДА Світлана Василівна

УДК 581.13:631.847.21:524.1+633.367

ФІЗІОЛОГІЯ СИМБІОЗУ СИСТЕМ

BRADYRHIZOBIUM SP. (LUPINUS) –– LUPINUS L.:

АЛЕЛОПАТИЧНИЙ АНАЛІЗ

03.00.12 — фізіологія рослин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора сільськогосподарських наук

Умань — 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Тернопільському національному педагогічному університеті імені Володимира Гнатюка Міністерства освіти і науки України

Наукові консультанти: доктор біологічних наук, професор

Головко Ераст Анатолійович ,

Національний ботанічний сад ім. М.М. Гришка,

завідувач відділу алелопатії

доктор сільськогосподарських наук, професор

Солодюк Наталія Володимирівна

Національний науковий центр„Інститут землеробства

УААН”, головний науковий співробітник

відділу селекції інасінництва люпину

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Кур'ята Володимир Григорович,

Вінницький державний педагогічний університет

ім. Михайла Коцюбинського, завідувач кафедри біології

доктор сільськогосподарських наук, професор

Пузік Володимир Кузьмич, Інститут післядипломної

освіти Харківського національного аграрного

університету, директор

доктор сільськогосподарських наук, професор

Волкогон Віталій Васильович , Інститут

сільськогосподарської мікробіології УААН, директор

Провідна установа: Національний аграрний університет

Кабінету Міністрів України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться 14 червня 2007 р. об 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 74.844.02 в Уманському державному аграрному університеті за адресою: вул. Інститутська, 1, м. Умань, Черкаська обл., Україна 20305.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Уманського державного аграрного університету за адресою: вул. Давиденка, 2м. Умань, 20305, Україна.

Автореферат розісланий “12” травня 2007  р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради В.П.Карпенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На сучасному етапі однією з причин білкового дефіциту є недостатнє використання рослинних ресурсів, зокрема представників родини Fabaceae видів роду Lupinus L. Проте, висока продуктивність рослин люпину можлива лише за умов максимального їх забезпечення елементами мінерального живлення. Азот – основний поживний елемент, що обумовлює родючість ґрунтів і врожайність сільськогосподарських культур, а біологічна азотфіксація є важливим екологічно чистим та економічно доцільним способом надходження його до бобових рослин (Мишустін, Шильнікова, 1973; Коць і ін, 2001; Патика і ін, 2003; Коць, Михалків, 2005; Волкогон і ін., 2006).

Активність симбіотичної системи тісно пов’язана з вуглецевим живленням бобових рослин (Андреєва, 1982; Романов і ін., 1987) і залежить від їх алелопатичних особливостей (Райс, 1978), біотичних та абіотичних факторів довкілля (Антипчук, 1994). У природних і штучно створених фітоценозах рослини вступають у складні взаємовідносини, що визначають характер їх росту та продуктивність (Пузік, Наумов, 2003; Патика і ін., 2004). Тому вивчення алелопатичної взаємодії кореневих виділень є пріоритетним у формуванні концепції підвищення врожайності сільськогосподарських культур.

Дослідження алелопатичних і біохімічних властивостей рослин започатковані А.М. Гродзінським (1965, 1973, 1991) та його учнями (Горобець, 1982; Головко, 1984; Грахов, 1991; Біляновська, 1992; Мороз, 1990; Рахметов, 2001; Юрчак, 2003), розвиваються в роботах зарубіжних авторів (Rice, 1984; Rizvi, Rizvi, 1992; Wink, Twardowski, 1992; Willis, 1996). Але на сьогоднішній день алелопатична активність високобілкової кормової і харчової культури з великим азотфіксуючим потенціалом – люпину – з’ясована недостатньо.

Люпин – традиційна культура Полісся та Північного Лісостепу України. Найважливішою особливістю рослин люпину є здатність накопичувати в зерні 38-42% сирого протеїну, що дає можливість отримувати з гектара 1200-1500 кг перетравного протеїну (Солодюк, 1996). Проте в останні роки спостерігається різке зменшення посівних площ люпину, зумовлене, в першу чергу, зниженням суспільного попиту, а також порушенням системи його насінництва і технології вирощування. Люпин – це єдина бобова культура, яка не лише росте і формує високі врожаї на бідних, кислих, піщаних, дерново-підзолистих ґрунтах, а й підвищує їх родючість. Така особливість люпину робить його незамінним попередником для наступних культур сівозміни. Тому розробка наукових основ екологічно безпечної технології вирощування люпину та з’ясування фізіологічних особливостей формування і функціонування симбіотичних систем Bradyrhizobium sp. (Lupinus) – Lupinus L. є важливою науковою проблемою.

Одним із біотичних факторів, який впливає на продуктивність люпину та обмежує розширення його посівних площ, є ураження культури збудником антракнозу (Colletotrichum gloeosporioides). У літературі відсутні ґрунтовні дані стосовно впливу цього збудника на функціонування симбіотичних систем. Звідси актуальним завданням при вирощуванні люпину є отримання високих врожаїв, а також розробка науково обґрунтованих заходів, спрямованих на підвищення азотфіксуючої активності симбіотичних систем з високою їх стійкістю до цієї хвороби.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася в межах планових державних тем кафедри ботаніки Тернопільського національного педагогічного університету імені Володимира Гнатюка (ТНПУ) “Онтогенез рослин, рослинні угруповання в природному і трансформованому середовищі: фізіолого-біохімічні, екологічні та історичні аспекти”, № державної реєстрації 0105U000752, відомчої теми “Вплив інокуляції та фізіологічно-активних речовин на фіксацію молекулярного азоту, алелопатичні властивості, ріст і розвиток бобових рослин”, виконавцем, а з 2003 року керівником її є дисертант.

Мета і задачі досліджень. Мета роботи – теоретичне обґрунтування і розробка наукових засад підвищення ефективності процесу фіксації молекулярного азоту симбіотичними системами Bradyrhizobium sp. (Lupinus) – Lupinus L. на основі фізіологічних й алелопатичних особливостей їх формування та функціонування для використання в сільському господарстві. Відповідно до мети передбачалося вирішення наступних завдань:–

виділити високоефективні штами Bradyrhizobium sp. (Lupinus) на основі скринінгу селекціонованих бульбочкових бактерій;–

проаналізувати особливості формування і функціонування симбіотичних систем у люпину білого та жовтого за інокуляції різними за активністю штамами Bradyrhizobium sp. (Lupinus);–

виявити вплив інокуляції люпину різноманітними штамами Bradyrhizobium sp. (Lupinus) на ростові процеси, накопичення хлорофілів і каротиноїдів та їх зв’язок з азотфіксуючою активністю;–

з’ясувати вплив збудника антракнозу (Colletotrichum gloeosporioides) на ростові процеси і функціонування симбіотичних систем люпину;–

визначити алелопатичну активність виділень насіння, різних органів, післяжнивних решток і ризосферного ґрунту протягом онтогенезу та після збирання врожаю сортів люпину білого й жовтого на фоні інокуляції селекціонованими штамами та їх природними расами;–

встановити кількісний і якісний склад екзометаболітів видів роду Lupinus та продуктів їх трансформації у ризосферному ґрунті;–

дослідити видільну активність коренів проростків різних сортів люпину та алелопатичну активність їх ексудатів;–

з’ясувати залежність між алелопатичним потенціалом рослин, азот- фіксуючою активністю симбіотичних систем і таксономічним та кількісним складом ґрунтової мікрофлори;–

вивчити алелопатичну взаємодію кореневих виділень люпину та рослин родин Fabaceae, Poaceae, Asteraceae;–

встановити значення біологічного азоту для підвищення зернової продуктивності і поліпшення якісного складу зерна сортів люпину білого та люпину жовтого за інокуляції високоефективними штамами бульбочкових бактерій;–

визначити економічну ефективність і біоенергетичну оцінку застосування активних штамів Bradyrhizobium sp. (Lupinus) для інокуляції сортів люпину білого та люпину жовтого.

Об’єкт дослідження – люпино-ризобіальні комплекси, ефективність їх алелопатично-симбіотичної взаємодії при різному складі мікро- і макросимбіонтів та їх вплив на алелопатичні властивості ґрунту й мікроорганізми.

Предмет дослідження – симбіотичні системи, створені люпином білим (Lupinus albus L.) сортів Олежка, Синій парус, Піщовий, алкалоїдна форма та люпином жовтим (Lupinus luteus L.) сортів Мотив-369, Промінь, Обрій, Бурштин, Борсельфа і бульбочковими бактеріями Bradyrhizobium sp. (Lupinus) штамів 367а, 1610 (виробничі), 1а, 2а, 3а, 4а, 5а, Саф. 1, Саф. 2, Саф. 3, 1614, 1630, 1631, 1632, 64.

Методи дослідження: польовий метод – вивчення фізіологічних властивостей системи ґрунт – Lupinus – Bradyrhizobium sp. (Lupinus), кількісних та якісних показників продуктивності люпину;

лабораторний (вегетаційний) метод – визначення фізіолого-біохімічними, алелопатичними і мікробіологічними методами кількісних та якісних характеристик предмету дослідження;

статистичний метод – встановлення на основі регресивного, дисперсійного і кореляційного методів дослідження достовірності отриманих результатів функціональних залежностей між різними факторами та процесами.

Наукова новизна одержаних результатів. Внаслідок комплексних досліджень встановлено, що взаємодія бульбочкових бактерій з люпином проявляє алелопатичний характер, та виявлено вплив еколого-алелопатичних факторів на формування і функціонування симбіотичних систем Bradyrhizobium sp. (Lupinus) – Lupinus.

Вперше досліджено симбіотичні властивості бульбочкових бактерій штамів 1а, 2а, 3а, 4а, 5а, Саф.1, Саф.2, Саф.3 у ґрунтово-кліматичних умовах Західного Лісостепу України. Встановлено, що їх використання індукує підвищення активності фіксації молекулярного азоту люпиново-ризобіальними системами, посилює накопичення хлорофілів і каротиноїдів у листках, збільшення зернової продуктивності люпину на 4,1-38,7% та вміст сирого протеїну в зерні на 0,75-4,27%.

Вперше доведено залежність алелопатичної активності вегетативних, генеративних органів і післяжнивних решток люпину, рівня акумуляції флавоноїдів у листках від видових й сортових особливостей рослин та активності штамів бульбочкових бактерій, що використовували для інокуляції.

Отримано патент на спосіб оцінки ефективності бобово-ризобіального симбіозу сортів люпину білого з Bradyrhizobium sp. (Lupinus).

Вперше ідентифіковано з листків люпину аглікон кверцетин (сорт Промінь, алкалоїдна форма) та кверцетин-3-рутинозид (сорти Мотив-369 і Обрій).

Оцінено алелопатичну активність екзометаболітів коренів проростків люпину і вперше показано її вплив на функціонування симбіотичних систем у фазі листкової розетки.

Вперше встановлено залежність ростових процесів і функціонування симбіотичного апарату в інокульованого різними штамами бульбочкових бактерій люпину жовтого від ураження Colletotrichum gloeosporioides.

Доведено, що мікробіологічні і біохімічні властивості ґрунту ризосфери сортів роду Lupinus L. залежать від видільної активності коренів рослин та алелопатичної активності ексудатів.

Поглиблено уявлення про алелопатичну взаємодію люпину з представниками родин Бобові (Fabaceae), Злакові (Poaceae) та Айстрові (Asteraceae) і обґрунтовано доцільність його використання як попередника у сівозміні.

Практичне значення одержаних результатів. На підставі дослідження фізіологічних особливостей формування і функціонування симбіотичних систем, утворених сортами люпину білого та люпину жовтого і штамами Bradyrhizobium sp. (Lupinus), встановлено шляхи підвищення азотфіксуючої активності кореневих бульбочок, накопичення хлорофілів й каротиноїдів у листках та збільшення зернової продуктивності рослин. Підібрано комплементарні пари симбіонтів “сорт люпину-штам Bradyrhizobium sp. (Lupinus)”: Олежка – 1а, 5а, Синій парус – 367а, Піщовий – 3а, 5а, алкалоїдна форма – 5а (білий), Мотив – 369 – штами 4а, Промінь – 2а, 1а, Обрій – 1а, Борсельфа – 4а, Бурштин – 1а, 3а (жовтий) і рекомендовано їх для використання у сільськогосподарському виробництві (акти впровадження додаються).

Запропоновано для впровадження “Спосіб оцінки ефективності бобово-ризобіального симбіозу сортів люпину білого з бульбочковими бактеріями” (деклараційний патент на корисну модель №9525, 17.10.05. Бюл. №10).

Удосконалено елементи технології вирощування люпину білого і люпину жовтого та впроваджено їх у виробництво в умовах Західного Лісостепу України. Для виробництва біопрепарату з метою інокуляції насіння люпину запропоновано високоефективні штами Bradyrhizobium sp. (Lupinus) 1а та 5а.

Результати досліджень алелопатичного впливу люпину жовтого на жито посівне, пшеницю м’яку, ячмінь звичайний, кукурудзу звичайну, сою культурну і люпин білий рекомендовано враховувати при складанні сівозмін.

Матеріали дисертаційної роботи апробовано при читанні курсів “Фізіологія рослин”, “Живлення і продуктивність рослин”, “Хімічна взаємодія рослин”, “Мікробіологія з основами вірусології”, “Основи сільського господарства” у Тернопільському національному педагогічному університеті імені Володимира Гнатюка, а також впроваджено в навчальний процес кафедрами ботаніки, екології, природничих дисциплін інших вищих навчальних закладів України (акти впровадження додаються), включено у Програми для студентів біологічних спеціальностей вищих педагогічних навчальних закладів з “Основ сільського господарства” та для спеціальностей 7.010103 “Методика польових досліджень”, “Екологія сільського господарства”.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є особистою науковою працею. Здобувачем проаналізовано відповідну літературу за фахом, опрацьовано робочу гіпотезу, розроблено програму досліджень, проведено лабораторні і польові досліди, статистичну обробку фактичного матеріалу. Аналіз результатів, їх узагальнення, інтерпретація та формулювання основних положень і висновків, а також друковані праці підготовлено за безпосередньою участю автора.

Нітрогеназну активність визначено дисертантом на газових хроматографах Інституту фізіології рослин і генетики НАН України. Якість зерна люпину, вміст фосфору і калію у ґрунті після його вирощування досліджено спільно з кандидатом сільськогосподарських наук В.І. Гамалеєм, вміст фенольних сполук у листках рослин і ґрунті та амінокислот – із кандидатом біологічних наук С.П. Машковською.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися і обговорювалися на засіданнях кафедри ботаніки, звітних наукових конференціях професорсько-викладацького складу ТНПУ імені Володимира Гнатюка (1995-2006 рр.), науково-виробничих зборах відділу селекції і насінництва люпину, методичній комісії Національного наукового центру “Інститут землеробства УААН” (1999-2002 рр.), оприлюднені на 9th International Lupin Conference (Klink/Muritz, Germany, 1999); VI симпозіумі з фенольних сполук (Москва, 2004); ІІ і Х з’їздах Українського мікробіологічного товариства (Чернігів, 2000; Одеса, 2004); ХІ і ХІІ з’їздах Українського ботанічного товариства (Харків, 2001; Одеса 2006); ІІІ з’їзді Українського товариства фізіологів рослин (Тернопіль, 2002); IV з’їзді товариства фізіологів рослин Росії (Пенза, 2003); Міжнародних науково-практичних конференціях – “Землеробство ХХІ століття – проблеми та шляхи вирішення” (Київ-Чабани, 1999); “Вивчення онтогенезу рослин природних та культурних флор у ботанічних закладах та дендропарках Євразії” (Біла Церква, 1999; Полтава, 2000); Міжнародній конференції, присвяченій 90-річчю заснування Інституту рослинництва ім. В.Я. Юр’єва УААН “Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва” (Харків, 1999); Міжнародних наукових конференціях “Онтогенез рослин, біологічна фіксація молекулярного азоту та азотний метаболізм” (Тернопіль, 2001); “Алелопатія та сучасна біологія” (Київ, 2006); Міжнародній науково-практичній конференції “Состояние и проблемы научного обеспечения люпиносеяния в России” (Брянск, 2001); International conference “Photosynthesis and crop production” (Kyiv, 2002); ІІІ Міжнародній науковій конференції “Регуляция роста, развития и продуктивности растений” (Минск, 2003); ІІ Міжнародній конференції “Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі: фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти” (Львів, 2004); VII Міжнародній науково-практичній конференції “Наука і освіта 2004” (Дніпропетровськ, 2004); Всеукраїнських конференціях – “Інтродукція і акліматизація рослин на Волино-Поділлі” (Тернопіль-Кременець, 1999); “Екологічний стрес і адаптація в біологічних системах” (Тернопіль, 1998); “Екологічна наука і освіта в педагогічних вузах України” (Умань, 2000); науковій конференції “Еколого-біологічні дослідження на природних та антропогенно змінених територіях” (Кривий Ріг, 2002); “Проблеми і перспективи наук в умовах глобалізації” (Тернопіль, 2005); науково-практичному семінарі молодих вчених і спеціалістів “Вчимося господарювати” (Київ-Чабани, 1999); VII молодіжній конференції ботаніків (Санкт-Петербург, 2000); конференції молодих вчених ботаніків України “Актуальні проблеми ботаніки та екології” (Зноб-Новгородське, 2001); Міжнародній конференції молодих вчених, присвяченої 185-річчю ХДАУ ім. В.В. Докучаєва “Рослина і середовище (фізіологія, генетика, фітоценологія, агроекологія)” (Харків, 2001); Всеукраїнській конференції студентів, аспірантів і молодих вчених “Біорізноманіття природних і техногенних біотопів України” (Донецьк, 2001); VIIІ конференції молодих вчених “Сучасні напрямки у фізіології та генетиці рослин” (Київ, 2002); ІХ конференції молодих дослідників, присвяченій 100-річчю від дня народження академіка АН УРСР і ВАСГНІЛ П.А. Власюка “Актуальні проблеми фізіології, генетики та біотехнології рослин і ґрунтових мікроорганізмів” (Київ, 2005).

Публікації. Основні положення дисертації висвітлені в 67 публікаціях, з них: 1 брошура, 23 статті у фахових виданнях з сільськогосподарських наук, 6 – з біологічних наук, 10 статей у збірниках матеріалів конференцій, 23 тези доповідей на наукових конференціях, 3 навчальні програми для студентів. Отримано деклараційний патент на корисну модель.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 393 сторінках, з них основного тексту – 271, додатки – 22. Дисертація складається із вступу, огляду наукової літератури, опису умов, матеріалу та методів проведення досліджень, п’яти розділів експериментальної частини, заключної частини, висновків, пропозицій для мікробіологічної практики і сільськогосподарського виробництва, додатків. Робота містить 106 таблиць, 60 рисунків, 21 додаток. Список використаної літератури включає 485 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Наведено сучасні погляди вітчизняних і зарубіжних дослідників щодо особливостей алелопатичної взаємодії бобових рослин та бульбочкових бактерій в агроекосистемах. Узагальнено дані стосовно еколого-трофічних взаємовідносин вищих рослин і мікроорганізмів, хімічного складу й ролі кореневих виділень у взаємодії рослин та формуванні бобово-ризобіального симбіозу, взаємозв’язку процесів азотфіксації і фотосинтезу у симбіотичній системі люпин-бульбочкові бактерії та значення люпину у біологічному землеробстві. На підставі аналізу наукових даних обґрунтовано необхідність проведення досліджень за темою дисертації.

УМОВИ, МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕНЬ

Польові досліди закладали в 1995-2006 рр. у ґрунтово-кліматичних умовах Західного Лісостепу України на чорноземі опідзоленому середньосуглинковому на лесах агробіолабораторії Тернопільського національного педагогічного університету імені Володимира Гнатюка. Вміст гумусу в ґрунті становив 3,05% (за Тюріним) (Аринушкіна, 1970), лужногідролізованого азоту 11,4 мг на 100 г ґрунту (за Корнфілдом), калію – 6,3-8,1 (за Чіріковим у модифікації ЦІНАО) (Мінеєв і ін., 1989), бору – 1,6 мг/кг (Ринькис, 1963), цинку – 0,3 і марганцю – 67 (Мінеєв і ін., 1989). Кислотність ґрунту (рН) – 6,1-6,4, гідролітична- 1,4-1,9 мг-екв. на 100 г ґрунту (Голубєв, 1982).

Рослини вирощували також на темно-сірому опідзоленому середньосуглинковому ґрунті господарства с. Дернів (1995-2000 pp.) Кам’янко-Бузького району Львівської області. Вміст гумусу 2,4-2,6%, азоту – 6-9 мг/100 г ґрунту, фосфору- 11,1-13,8, калію- 10,1-12,3, рН сол. – 6,2-6,4.

Матеріалом дослідженя слугували сорти люпину білого (Lupinus albus L.) Олежка, Синій парус, Піщовий і алкалоїдна форма та люпину жовтого (Lupinus luteus L.) Мотив-369, Промінь, Обрій, Бурштин, селекціоновані в Інституті землеробства УААН й Борсельфа (виведений у Німеччині) й бульбочкові бактерії Bradyrhizobium sp. (Lupinus), отримані методами аналітичної селекції, штамів 367а (виробничий), 1а, 2а, 3а, 4а, 5а (селекціоновані в Інституті сільськогосподарської мікробіології УААН), Саф. 1, Саф. 2, Саф. 3 (отримані в Інституті фізіології рослин і генетики НАН України під керівництвом доктора біологічних наук Нічик М.М.), 1610 (виробничий), 1614, 1630, 1631, 1632, 64 (передані з колекції Всеросійського НДІ сільськогосподарської мікробіології РАСГН, м. Санкт-Петербург). Перед посівом насіння люпину протягом 20 хв. стерилізували 70% етанолом і промивали водопровідною водою.

Польові досліди закладали за схемою: на контрольній ділянці висівали неінокульоване насіння, а на дослідних – насіння, яке перед висіванням обробляли культурами Bradyrhizobium sp. (Lupinus) вищезгаданих штамів. На коренях рослин контрольного варіанта виявляли бульбочки спонтанного походження. Люпин висівали широкорядним способом із шириною міжрядь 45 см, глибина загортання насіння 2-4 см. Норма висіву люпину білого – 125, а люпину жовтого – 100 кг/га. Агротехніка загальноприйнята для зони Лісостепу. Повторність дослідів 4-5 разова, площа облікових ділянок 2-30 м2. Розміщення дослідних ділянок рендомізоване.

Протягом вегетаційного періоду проводили вимірювання динаміки росту стебла і його облиствіння, площу листків та їх питому поверхневу щільність (ППЩЛ) (Расулов, Аероков, 1982). У листках визначали кількість хлорофілів a, b та каротиноїдів спектрофотометричним методом (Починок, 1986; Мусієнко, 2001).

Активність процесу азотфіксації встановлювали ацетиленовим методом (Hardy et all., 1968; Крикунець, 1993; Біологічний азот, 2003) на газовому хроматографі “Chomatograf-504” (Польща). Для визначення маси бульбочок у польових умовах 4-5 разів протягом вегетації рослин відбирали моноліти ґрунту 25x25x30 см. Після відмивання коренів бульбочки обривали і висушували при 105°С у сушильній шафі та визначали масу сухої речовини із п’яти рендомізованих рослин, взятих з кожної повторності.

Виділяли фенольні сполуки (ФС) з листків (Александрова, Осипова, 1985). З ґрунту ФС виділяли шляхом використання іонообмінника катіоніта КУ-2-8 в Н+ формі, 96%-ний етанол та водний ацетон (ацетон:вода=1:2). Суму ФС визначали за методом, в основі якого лежить окиснення їх реактивом Фоліна-Чокальте (Гродзінський, Горобець, Крупа, 1988).

Фенолкарбонові кислоти (ФКК) отримували послідовним екстрагуванням фіксованої 96% етанолом рослинної сировини розчинниками: 85% етанолом, ефіром та 5%-ним розчином NaHCO3 (Мийдла, Халдре, Сависаар, 1975). ФКК з ґрунту виділяли шляхом лужного гідролізу з 2н розчином NaOH (Гродзінський, Горобець, Крупа, 1988). Кількісне визначення ФКК проводили за методикою (Мийдла та ін., 1975).

Флавоноїди із сухої, зазделегідь очищеної від смол, ліпідів і хлорофілів (екстрагування хлороформом в апараті Сокслета) рослинної сировини, екстрагували 70% етанолом на водяній бані із зворотним холодильником. Кількісний вміст флавоноїдів визначали електрохімічним методом, який ґрунтується на взаємодії їх з А1С13 (Фитохимический анализ, 1998). Розподіл флавоноїдів здійснювали за допомогою ТШХ, використовуючи систему бутанол-оцтова кислота-вода (10:1:3), пластинки 15x15 см “Silufol UV254” фірми “Kavalier” (Чехія). Візуалізацію плям проводили тетразолієвим бензидином (Гродзінський, Гродзінський, 1973). Ідентифікацію окремих груп флавоноїдів здійснювали з використанням стандартів фірми “Sigma”.

Амінокислоти із ґрунту екстрагували водним ацетоном (ацетон:вода=1:2), очищували їх від домішок за допомогою іонообмінної смоли КУ-2-8 (Н+) та десорбували з катіоніту 10%-ним розчином аміаку (Гродзінський, Горобець, Крупа, 1988). Для визначення якісного та кількісного складу амінокислот використовували амінокислотний аналізатор “Biotronik C-2001” (Німеччина) в режимі фізіологічних рідин.

У зерні визначали вміст сирого протеїну, олії, клітковини, золи, фосфору і калію на інфрачервоному аналізаторі NIR Systems 4500 в ННЦ “Інститут землеробства УААН”, у ґрунті – вміст загального азоту методом Кельдаля на аналізаторі КЕЛЬТЕК АВТО 1030 (Плешков, 1987).

Алелопатичну активність водорозчинних виділень органів рослин, післяжнивних решток та ґрунту здійснювали методом біологічних тестів (Гродзінський, 1973). Тест-об’єктами слугували однодобові проростки крес-салату (Lepidium sativum L.), озимої пшениці м’якої (Triticum aestivum L.) сортів Миронівська-61, Циганка, амаранту хвостатого (Amarantus caudatus L.) сорту Кармен (Власов та ін., 1979), гречки їстівної (Fagopyrus Moench.) сорту Крупинка, ячменю звичайного (Hordeum vulgare L.) сорту Рось, культура азотобактера (Azotobacter chroococcum) (Юрчак і ін., 1975). Визначення оптичної густини кореневих ексудатів проводили на спектрофотометрі СФ-46 при довжині хвиль 240 і 280 нм (Дубров, 1971).

Алелопатичну взаємодію кореневих виділень проростків люпину жовтого з видами родин Бобові, Злакові і Айстрові вивчали методом “промивних вод” (Исаева, Савельева, 1970), вирощуючи рослини в лійках Бюхнера на перліті.

Фітотоксичність ґрунту визначали прямим біотестуванням і методом Нейбауера-Шнейдера (Гродзінський і ін., 1990; Гродзінський, Гродзінський, 1973). Алелопатичну активність продуктів деструкції післяжнивних решток різних сортів видів роду Lupinus за відношенням до пирію повзучого (Elytrigia repens Nevski) встановлювали у вегетаційних умовах (Журбицький, 1968).

Груповий склад ґрунтових мікроорганізмів вивчали за методикою (Возняковська, 1980). Для підрахунку і виділення бактерій та актиноміцетів проводили поверхневий посів ґрунтової суспензії на капустяний агар (Гродзінський, Кострома і ін., 1990). Кількість спороутворюючих бактерій встановлювали методом глибинного посіву на середовищі Мішустіна (МПА+СА=1:1). Для мікроскопічних грибів в якості живильного середовища використовували сусло-агар і середовище Чапека, які підкислювали до рН=4,5, а для пригнічення росту бактеріальної флори в середовище додавали розчин антибіотика (50 мл стерильної водопровідної води, 100000 од. стрептоміцину) із розрахунку 2,0-2,5 мл на 200 мл теплого живильного середовища. На сусло-агарі визначали здебільшого швидко-, а на середовищі Чапека – повільноростучі мікроскопічні гриби. Виділення азотобактера здійснювали на середовищі Ешбі.

Антимікробну активність водорозчинних виділень насіння визначали методом осаджування мікрофлори повітря (Гродзінський, Головко, Безмєнов і ін., 1992). Вплив рідких виділень насіння на чисті культури мікроорганізмів досліджували методом колодязя (Топін, 1974; Векірчик, 2001) і дифузії речовин в живильне середовище із спеціально оброблених паперових дисків (Векірчик, 2001).

Назви рослин у дисертаційній роботі подані за Черепановим (1995). Статистичну обробку експериментальних даних здійснено за Доспєховим (1985) та Лакіним (1990) з використанням пакетів програм Statistica і Excel для Windows 2000. Статистичні помилки в дослідах коливались у межах 5%.

ОСОБЛИВОСТІ ФОРМУВАННЯ І ФУНКЦІОНУВАННЯ СИМБІОТИЧНОГО АПАРАТУ ЗА ІНОКУЛЯЦІЇ BRADYRHIZOBIUM SP. (LUPINUS) ТА ДИНАМІКА НАКОПИЧЕННЯ
ФОТОСИНТЕТИЧНИХ ПІГМЕНТІВ

Селекція високоефективних штамів мікросимбіонтів. На основі скринінгу селекціонованих штамів бульбочкових бактерій, отриманих методами аналітичної селекції, відібрано високоактивні 1а, 2а, 3а, 4а, 5а, Саф.1, Саф.2, Саф.3 і використано їх у подальших дослідженнях.

Азотфіксуюча активність симбіотичних систем Lupinus-Bradyrhizobium sp. (Lupinus) в онтогенезі. На етапі преінфекції відбувається розпізнавання макро- і мікропартнерів та підготовка до формування симбіозу. Борнер (1958) показав, що при набуханні та проростанні насіння виділяються речовини, які створюють навколо проростка алелопатичну сферу і виступають біотичним фактором, що впливає на утворення бобово-ризобіальної системи. Корені бобових виділяють ексудати, які стимулюють розмноження і активний рух до них бульбочкових бактерій. Ризобії колонізують ризосферу і ризоплану у відповідь на дію екзометаболітів. Саме на цьому етапі відбувається алелопатична взаємодія між рослиною і бактеріями. Висока алелопатична активність ексудатів насіння і коренів алкалоїдної форми люпину білого й сорту Промінь люпину жовтого гальмувала розвиток та функціонування симбіотичних систем на початку їх вегетації. Найнижча алелопатична активність нами виявлена для кореневих виділень сорту Мотив-369. Це, очевидно, сприяло утворенню і активному функціонуванню його симбіотичних систем у фазі листкової розетки. Нітрогеназна активність бульбочок у цій фазі в деяких варіантах була у 17 разів вищою, порівняно з сортом Промінь (табл. 1).

Показано, що досліджувані штами вірулентні і сприяли утворенню бульбочок рожевого забарвлення на головному корені. Маса бульбочок в онтогенезі люпину зростала до фази зеленого бобу, де починався їх лізис, що вплинуло на величину нітрогеназної активності. У скоростиглих сортів люпину білого Олежки і Синього парусу найвища загальна азотфіксуюча активність (АФА) виявлена у всіх варіантах досліду під час цвітіння рослин. Необхідно зазначити, що максимальне значення питомої азотфіксуючої активності у сортів виявлено у різних фазах. Зокрема, у сорту Олежка – у фазі цвітіння, а у сорту Синій парус – 2-4 листки. У середньоскоростиглого сорту Піщовий найвища загальна азотфіксуюча активність зафіксована на початку цвітіння у рослин, інокульованих штамами 1а, 2а, 4а та 5а. Симбіотична система люпин білий – штам 3а найактивніше фіксувала азот з повітря під час цвітіння бічних пагонів. Рослини, які виросли з насіння, інокульованого місцевими расами бульбочкових бактерій, характеризувалися високою АФА у фазі зеленого бобу. Більшість симбіотичних систем середньостиглої алкалоїдної форми люпину білого найактивніше фіксували молекулярний азот з атмосфери під час бутонізації (крім варіантів 2а та 1а).

Сорти люпину жовтого Мотив–369, Промінь, Обрій і Бурштин є скоростиглими, а Борсельфа — пізньостиглим. У скоростиглих сортів маса бульбочок в інокульованих рослин зростала до фази сизого (Мотив–369) і зеленого бобу (інші), а у сорту Борсельфа — до фази цвітіння (К, 367а, 2а, 5а) та сизого бобу (1а, 3а, 4а). Найвища АФА симбіотичних систем люпину жовтого сорту Мотив–369 виявлена на початку цвітіння (крім варіантів 3а та 5а), сорту Бурштин — під час бутонізації (крім 2а), сорту Обрій — бутонізації (К, 1а, 3а) і цвітіння (367а, 2а, 4а, 5а), сорту Промінь — зеленого бобу, сорту Борсельфа — стеблування (крім 5а).

Найкомплементарнішими у грунтово–кліматичних умовах Західного Лісостепу України виявилися пари: люпин білий сортів Олежка — штами 1а, 5а, Синій парус — 367а, Піщовий — 3а, 5а, алкалоїдної форми — 5а, люпин жовтий сортів Мотив–369 — штамами 4а, Промінь — 1а, 2а, Обрій — 1а, Борсельфа — 4а, Бурштин — 1а, 3а. Активність бобово–ризобіальних комплексів була різною і залежала від штамових особливостей бульбочкових бактерій. На функціонування симбіотичних систем сортів люпину білого і жовтого впливали алелопатична активність виділень насіння й коренів, генотипи макро- та мікросимбіонтів, їх сумісність, фази росту і розвитку рослин, а також конкретні грунтово–погодні умови Західного Лісостепу України. Різні за активністю люпиново–ризобіальні комплекси специфічно впливали на ріст і перебіг фізіолого–біохімічних процесів інокульованих рослин.

Таблиця 1

Азотфіксуюча активність люпину жовтого при інокуляції бульбочковими бактеріями, 1998-2000рр.

Штами Bradyrhi-zobium(Lupinus) | Загальна | Питома | Загальна | Питома | Загальна | Питома | Загальна | питома | Сорт Промінь | Фаза | 8-10 листків | бутонізації | цвітіння | зелений біб | Контроль | 0,277±0,048 | 25,9 | 3,152±0,649 | 24,8 | 0,035±0,005 | 0,18 | 4,656±0,321 | 18,2 | 367а | 0,615±0,033 | 38,2 | 4,921±0,306 | 35,2 | 0,334±0,054 | 1,00 | 17,055±1,056 | 42,5 | 1а | 0,677±0,082 | 36,2 | 11,723±1,397 | 64,5 | 0,081±0,028 | 0,24 | 17,668±1,245 | 39,1 | 2а | 0,568±0,021 | 40,0 | 8,441±0,309 | 58,9 | 0,410±0,006 | 0,94 | 47,074±3,790 | 106,3 | 3а | 0,523±0,015 | 37,6 | 8,138±1,198 | 52,7 | 0,453±0,078 | 0,82 | 19,879±1,929 | 51,3 | 4а | 0,241±0,047 | 16,0 | 8,197±1,745 | 47,3 | 0,213±0,071 | 0,57 | 10,632±0,928 | 26,1 | 5а | 0,214±0,084 | 15,2 | 2,489±0,613 | 17,7 | 0,371±0,073 | 1,31 | 32,057±1,662 | 89,7 | Сорт Борсельфа | Фаза | 8-10 листків | стеблування | сизий біб | зелений біб | Контроль | 4,810± 0,346 | 31,70 | 12,658± 1,482 | 26,82 | 0,029± 0,008 | 0,58 | 3,811±0,711 | 7,75 | 367а | 9,624± 1,000 | 49,79 | 13,738± 0,765 | 28,02 | 0,186± 0,003 | 0,27 | 4,695± 0,060 | 8,43 | 1а | 7,603±0,049 | 38,34 | 14,262±1,324 | 36,69 | 0,243±0,065 | 0,39 | 0,385± 0,044 | 0,52 | 2а | 6,053± 0,760 | 36,68 | 6,171±0, 047 | 14,05 | 0,015± 0,001 | 0,02 | 1,763± 0,039 | 3,10 | За | 5,521± 0,544 | 31,97 | 11,075±0,827 | 20,32 | 0,059±0,014 | 0,15 | 0,580± 0,043 | 0,57 | 4а | 3,555± 0,360 | 17,07 | 19,035±1,791 | 32,99 | 1,537± 0,070 | 2,36 | 5,322± 0,394 | 7,42 | 5а | 9,498± 0,686 | 46,33 | 5,005±0,058 | 11,84 | 0,224± 0,076 | 0,35 | 0,767± 0,077 | 1,30 | Сорт Мотив–369 | Фаза | 8-10 листків | бутонізація початок цвітіння | сизий біб | зелений біб | Контроль | 1,617±0,062 | 11,7 | 3,377±0,560 | 22,03 | 0,152±0,006 | 0,51 | 0,050±0,014 | 0,37 | 367а | 1,660±0,045 | 14,47 | 2,870±0,586 | 10,79 | 0,128±0,006 | 0,39 | 0,140±0,039 | 0,53 | 1а | 0,801±0,065 | 6,47 | 3,090±0,229 | 12,94 | 0,203±0,016 | 0,49 | 0,214±0,066 | 1,18 | 2а | 2,372±0,043 | 16,36 | 7,342±0,853 | 25,49 | 0,148±0,008 | 0,42 | 0,104±0,021 | 0,74 | 3а | 3,510±0,221 | 20,17 | 1,660±0,052 | 7,25 | 0,166±0,011 | 0,62 | 0,489±0,048 | 5,05 | 4а | 2,552±0,078 | 24,14 | 5,309±0,577 | 16,94 | 1,605±0,001 | 2,31 | 0,913±0,034 | 3,83 | 5а | 3,315±0,253 | 36,31 | 1,387±0,038 | 6,61 | 0,093±0,003 | 0,31 | 0,041±0,007 | 0,23 | Примітка: загальна азотфіксуюча активність в мкмоль C2H4/(рослину год.); питома – мкмоль C2H4/(1 г сухих бульбочок год.)

Вплив інокуляції насіння бульбочковими бактеріями на ростові процеси люпину. У фазі листкової розетки висота стебла інокульованого люпину істотно не відрізнялася від висоти рослин контрольного варіанта, що пояснюється низькою активністю симбіотичних апаратів. Стимулюючий вплив інокуляції на ріст стебла проявлявся на початку цвітіння і у фазі утворення бобів, тоді, коли симбіотичні системи оптимально розвинуті та здатні забезпечити рослини біологічним азотом. Активні штами Bradyrhizobium sp. (Lupinus) сприяли збільшенню кількості листків на стеблах інокульованого люпину у генеративних фазах розвитку.

Динаміка накопичення хлорофілів і каротиноїдів залежно від інокуляції різними за активністю штамами Bradyrhizobium sp. (Lupinus). Сорти люпину білого і жовтого відрізнялися за вмістом зелених та жовтих пігментів у листках, а активність фіксації азоту бобово-ризобіальними комплексами зумовлювала мінливість цих показників у межах сорту. Так, на початку бутонізації люпину білого сорту Олежка істотне накопичення хлорофілу а, порівняно з контролем, зафіксовано нами у листках рослин, інокульованих штамами 2а, 3а і 4а (t =4,3-22,3), а каротиноїдів- 2а, 3а, 4а та 5а (t =3,0-14,2).

У фазі цвітіння за цими показниками домінували особини варіантів 2а, 3а і 1а (t =2,56-4,29). Бульбочкові бактерії штамів 1а, 2а і 3а у симбіозі з люпином активно фіксували молекулярний азот з повітря у фазі цвітіння, що сприяло інтенсивнішому накопиченню пігментів у листках рослин. У фазі сизого бобу кількість зелених пігментів зростала, порівняно з фазою цвітіння, майже у всіх варіантах досліду. Максимальну їх кількість визначено у листках рослин, інокульованих штамом 3а, лише у варіанті 1а (t = 3,64) вміст хлорофілів в обох фазах був однаковим. У процесі вегетації рослин співвідношення між хлорофілом а і b було максимальним на початку бутонізації. При переході рослин у генеративну фазу розвитку даний показник знижувався. Співвідношення між хлорофілами і каротиноїдами в онтогенезі рослин зростало й залежало від особливостей штамів бульбочкових бактерій, що використовували для передпосівної бактеризації насіння.

Інокуляція насіння сприяла росту листкової поверхні у люпину жовтого сорту Бурштин на 3,5-10,1% у фазі листкової розетки, 8,0-13,0 – бутонізації і 23,0-34,8% – цвітіння, що приводило до зниження питомої поверхневої щільності листків. Нітрогеназна активність симбіотичних систем і кількість пігментів в онтогенезі сортів люпину жовтого була вищою, порівняно з люпином білим. Динаміка накопичення пігментів у листках видів роду Lupinus корелювала із процесом азотфіксації.

Вплив збудника антракнозу на ростові процеси та азотфіксуючу активність люпиново-ризобіальних систем. Colletotrichum gloeоsporioides гальмував ріст і розвиток інокульованого люпину жовтого. У фазі цвітіння висота стебла здорових рослин люпину жовтого сорту Обрій була 47,6 (контроль) – 50,2 см (1а, 5а), а уражених – 29,4 (2а) – 38,8 см (367а). Найменша висота травостою (59,9% від здорових рослин) виявлена в ураженого люпину, інокульованого штамом 2а.

У фазі зеленого бобу відсоток висоти стебла уражених рослин до здорових досягав 60,1 (3а) – 81,4 см (367а). У цій фазі найнижчими серед здорових рослин були особини варіантів з інокуляцією штамами 2а, 3а, 4а, а серед уражених – люпин, інокульований штамами 3а та 4а. Збудник антракнозу бобових гальмував ростові процеси і в люпину жовтого сорту Бурштин.

Штами Bradyrhizobium sp. (Lupinus) по-різному впливали на формування і активність симбіотичних систем люпину жовтого (табл. 2). Високоактивними щодо формування бульбочок на коренях рослин сортів Обрій виявилися бактерії штамів 2а, 1а, 3а і 5а, а для сорту Бурштин – 2а, 3а та 1а. Інокуляція насіння Bradyrhizobium sp. (Lupinus) штамів 1а, 4а, 5а (сорт Обрій) та 1а, 3а, 5а (сорт Бурштин) сприяла зростанню азотфіксуючої активності кореневих бульбочок. Уражені рослини контрольного варіанту, які утворили симбіотичну систему із місцевими расами бульбочкових бактерій ґрунту, виявляли найвищу нітрогеназну активність. У селекціонованих штамів, які в симбіозі з люпином жовтим вищезгаданих сортів проявляли високу нітрогеназну активність, збудник антракнозу, навпаки, її різко знижував. Місцеві раси бульбочкових бактерій є пристосованішими до несприятливих умов довкілля. Стандартний штам Bradyrhizobium sp. (Lupinus) 367а також відзначався високою адаптацією до стресового фактора, яким виступав збудник антракнозу люпину. Інтродуковані штами ризобіїв, порівняно із стандартним, проявляли вищу активність, але були менш пристосовані до патогенного гриба Colletotrichum gloeоsporioides.

Таблиця 2

Вплив збудника антракнозу бобових на формування та активність симбіотичних систем люпину жовтого (фаза зеленого бобу)

Штами Bradyrhi-zobium(Lupinus) | Суха маса бульбочок, мг | Азотфіксуюча активність,

мкмоль С2Н4/год на 1 рослину | рослини | % до здорових рослин | рослини | % до здорових рослин | здорові | уражені | здорові | уражені | Сорт Обрій | Контроль | 227,7±13,1 | 155,5±12,6 | 68,3 | 0,264 ± 0,025 | 0,533 ± 0,016 | 201,9 | 367 а | 228,2±15,5 | 204,7±14,7 | 89,7 | 0,350 ± 0,020 | 0,449 ± 0,078 | 128,3 | 1а | 313,7±13,9 | 191,7±17,7 | 61,1 | 3,806 ± 0,070 | 0,067 ± 0,018 | 1,8 | 2а | 361,0±16,1 | 243,7±14,2 | 67,5 | 0,157 ± 0,021 | 0,236 ± 0,012 | 150,3 | 3а | 307,7±11,5 | 189,2±16,2 | 61,5 | 0,590 ± 0,034 | 0,079 ± 0,004 | 13,4 | 4а | 238,0±16,5 | 137,7±10,1 | 57,8 | 1,880 ± 0,039 | 0,215 ± 0,042 | 11,4 | 5а | 291,0±14,1 | 141,3±19,6 | 48,5 | 1,035 ± 0,041 | 0,029 ± 0,001 | 2,8 |

АЛЕЛОПАТИЧНА АКТИВНІСТЬ ЛЮПИНУ БІЛОГО
(LUPINUS ALBUS L.) І ЛЮПИНУ ЖОВТОГО (LUPINUS LUTEUS L.) ПРИ ІНОКУЛЯЦІЇ БУЛЬБОЧКОВИМИ БАКТЕРІЯМИ

Алелопатична активність насіння люпину. Найвищу алелопатичну активність проявляли водні витяжки насіння алкалоїдної форми люпину білого, а найнижчу – сорту Піщовий, які є харчового і кормового напрямків використання. При застосуванні біотесту гречки їстівної вміст гальмувачів у екстрактах насіння алкалоїдної форми дослідних варіантів при розведенні 1:10 становив у середньому 35,7 (367а) – 43,7 (3а) відсотків (t =7,33 і 9,32). При розведенні витяжок (1:100) алелопатична активність їх знижувалася. Вони стимулювали ріст корінців гречки, але достовірна різниця у показнику алелопатичної активності зафіксована при інокуляції штамами 4а та 5а (t=3,43 і 5,51). Витяжки з насіння люпину алкалоїдної форми при розведеннях 1:10 та 1:100 проявляли також гальмівний вплив на ріст корінців амаранту, який реагує на речовини цитокінінової природи. Вміст гальмувачів у екстрактах відповідно становив 43,5 (контроль) – 55,4 (1а) та 13,8 (1а) – 43,2 (3а)% .

Сорт Синій парус, що є кормового напрямку використання (Солодюк, 1996), за алелопатичною активністю водних витяжок з насіння при використанні біотесту гречки їстівної займав проміжне положення між алкалоїдною формою і сортом Піщовий.

Водні витяжки з насіння