НАЦОНАЛЬНА АКАДЕМЯ НАУК УКРАНИ

НСТИТУТ МКРОБОЛОГ ВРУСОЛОГ м. Д.К.ЗАБОЛОТНОГО

МОСКАЛЕНКО

Наталя Василвна

УДК 579.841.11.22

СТРУКТУРНО-ФУНКЦОНАЛЬН ДОСЛДЖЕННЯ

ЛПОПОЛСАХАРИДВ Ralstonia solanacearum

03.00.07 - мкробологя

АВТОРЕФЕРАТ

дисертац на здобуття наукового ступеня

кандидата бологчних наук

КИВ - 1999

Дисертацю рукопис.

Робота виконана в нститут мкроболог врусолог м. Д.К.Заболотного НАН України, м. Кив.

Науковий кервник :

доктор бологчних наук,

ВАРБАНЕЦЬ Людмила Дмитрвна

нститут мкроболог врусолог м. Д.К.Заболотного,

завдувач вддлом бохм мкроорганзмв

Офцйн опоненти :

член-кореспондент НАН Украни, доктор бологчних наук, професор МАЛАШЕНКО Юрй Романович

нститут мкроболог врусолог м. Д.К.Заболотного,

завдувач вддлом болог газоокислюючих мкроорганзмв

доктор медичних наук, професор

БОРИСОВ Вадим Анатольович

Кивський унверситет м. Т.Г.Шевченка,

професор кафедри мкроболог та загально мунолог

Провдна установа

Одеський державний унверситет м. ..Мечникова, кафедра мкроболог.

Захист дисертац вдбудеться “ 20_” жовтня__ 1999 р. о 10.00 годин на засданн спеціалзовано вчено ради Д 26.233.01 в нститут мкроболог врусолог м. Д.К.Заболотного НАН Украни за адресою: 252143, м.Кив, вул. Заболотного, 154.

З дисертацю можна ознайомитись в бблотец нституту мкроболог врусолог м. Д.К.Заболотного НАН Украни за адресою: 252143, м.Київ, вул. Заболотного, 154.

Автореферат розсланий _17 вересня_ 1999 р.

Вчений секретар

спецалзовано вчено ради

кандидит бологчних наук Л.М.Пурш

Актуальність проблеми. Ліпополісахариди (ЛПС) являються специфчними компонентами клітинної оболонки грамнегативних бактерій. Вони розташован на зовнішній поверхн мембрани мікроорганізму і внаслідок сво унікальної будови виконують ряд важливих для клітини фізико-хімічних і біологічних функцій. ЛПС відіграють значну роль у підтримці цілсності мембрани, регулюють її проникність для різних сполук, приймають важливу участь у контактах мікроорганізму з іншими макро- та мкроорганзмами. Завдяки поверхневому розташуванню і особливостям будови визначають О-антигенну специфічність бактерій.

Одним з пояснень прояву такого широкого спектру бологчно активност рзномантнсть молекулярних форм ЛПС в межах одного виду, що обумовлено гетерогеннстю х структурних частин, а саме О-специфчного полсахариду (О-ПС), корового олгосахариду (кор-ОГ) та лпдного компоненту. Вивчення структурно органзац рзних молекулярних форм ЛПС одн культури та з’ясування х хмчно природи сприяють розшифруванню детермнант бологчно активност механзмв функцонування ЛПС при реалзац бологчних процесв, що проходять за х участю.

Склад і структура ЛПС є на сьогодні одним із визнаних хемотаксономічних критеріїв, що використовується в систематиці грамнегативних бактерій. Хмчна рзномантнсть типв структур О-специфчного полсахариду ЛПС обумовлю серологчну специфчнсть, що широко використовується при створенні вакцин і діагностикумів, а також при розробці внутрішньовидових серологчних класифікаційних схем грамнегативних мікроорганізмів, в тому числі фітопатогенних.

Все вищезгадане цлком стосуться такого гетерогенного за властивостями ще недостатньо вивченного фтопатогенного виду, як Ralstonia solanacearum.Цей мікроорганізм викликає бактеріальне зів’ялення широкого спектру рослин ( до 200 видів). Особливо небезпечний він для представників родини пасльонових. Хвороба, яку вн спричиня наносить значн збитки сльському господарству. Найчастше вона ма незворотнй характер бльшсть нфкованих рослини гине.

Особливістю виду R. solanacearum є штамове різноманіття біологічних властивостей. Це робить можливим розподілення штамв на раси, біовари, патовари, серовари за типом колоній, спеціалізації до фагів і т. і. Вивчення фізико-хімічних властивостей цього фітопатогену, зокрема особливостей будови бологчно активност ЛПС штамв R. solanacearum є актуальною проблемою. Одержані внаслідок таких досліджень відомості можуть бути використані для розробки методів діагностики штамів цього виду, виршення питань його таксоном, а також при дослдженнях, спрямованих на вивчення механзмв патогенезу хвороби, яку виклика цей мкроорганзм.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами Робота виконувалась у відділі біохімії мікроорганізмів нституту мікробіології вірусології м. Д.К.Заболотного включа дослдження виконан згдно плану науково-дослдних робт нституту за темами:

·

· “Вивчення молекулярних механзмв функцонування глкополмерв карбогдраз, розробка ботехнологй препаратв для практичного застосування” (1993-1997 рр, 07/11),

а також конкурсних проектів науково-технічних програм:

·

· “Вивчити імуномодулюючі властивості глікополімерів бактерій, встановити структуру і конформацію детермінант біологічної активності та конструювання на їх основі препаратів для лікування імунодефіцитних станів” (1992-1995 рр., Державна науково-технічна програма “Біотехнологія”, № проекту 1.11.05/003-92).

Мета роботи. Метою дослдження було вивчення складу структури, а також деяких аспектв бологчно активност (мунохмчн властивості та муномодулююча дя) ЛПС та х окремих структурних компонентв штамв R. solanacearum - представникв рзних боварв, як вдрзнялись мж собою також за географчним походженням рослиною-хазяїном .

Завдання дослідження

1.

1.

1.

1.

1.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше проведено широке систематичне вивчення ЛПС і їх окремих структурних компонентв штамів R. solanacearum, що відрізнялися приналежністю до певного біовару і які було вилучено із різних рослин та рзних географчних зон свту.

Встановлено, що О-ПС R. solanacearum представлені три-, тетра- та пентасахаридними лінійними або розгалуженими ланцюгами, що повторюються. Варіації в їх будові дали змогу розподілити О-ПС досліджуваних штамів на 7 структурних типів , 6 з яких описані вперше.

З’ясовано, що більшість досліджуваних штамів R. solanacearum гете-рогенна за складом ЛПС, які містять більше ніж один тип структури О-ПС.

Для виду R. solanacearum вперше проведені порівняльні дослідження залежності серологічної активності ліпополісахаридів від структурних особливостей їх О-ПС і визначено, які з них є суттєвими в прояві цієї активності.

Вперше показана здатність ліпополісахариду R. solanacearum і його окремих структурних компонентів проявляти інтерфероногенну та антиметастатичну дію.

Практичне значення одержаних результатів

Одержані дані про хмчний склад і особливост будови ЛПС та їх окремі структурні компоненти можуть бути використані для виршення нез’ясованих питань біології та систематики виду R. solanacearum , а саме, при досліжденнях, присвячених уточненню внутрішньовидового таксономічного стану представникв цього гетерогенного виду, а також при дослідженнях фізології та механізмів патогенезу хвороби рослин, яку він викликає. Проведені серологічні дослідження являються передумовою для подальших робіт, направлених на створення на основі О-антигенності ліпополісахаридів серологічної класифікаційної схеми виду R. solanacearum, що дасть змогу для ідентифікації штамів цього фітопатогену.

Вдомост, одержан при вивченн впливу ЛПС R. solanacearum та їх окремих структурних компонентв на мунну систему макроорганзму необхідні при розробц препаратв направлено д на рзн ланцюги мунтету.

Апробація результатів дисертації . Основн результати положення дисертац доповідались та обговорювались на Всесоюзній школі-конференції молодих вчених (Алушта, 1990); конференції фундаментальних досліджень нституту мкроболог і врусолог м. Заболотного (Київ, 1993); I Установ-чому з’їзді Українського мікробіологічного товариства (Одеса, 1993); XVII Мiжнародному симпозум по вуглеводам (Оттава, 1994); 5-тй Мжнароднй конференц з проблем патовару Pseudomonas syringae та спорднених патогенв (Берлн, 1995); вропейському симпозум з вуглеводв “Eurocarb-9” ( Голандя, 1997).

Публкац. За матералами дисертац опублковано 9 статей, з яких 2 - в мжнародних журналах, 3 - в журналах Росйсько академ наук, 4 - в журналах Нацонально академ наук Украни.

Особистий внесок здобувача. Основн експериментальн дан були одержан здобувачем особисто: одержано бактеральн маси 17 досліджуваних штамів Ralstonia solanacearum, з яких видлено ЛПС та х окрем структурн компоненти: О-ПС, кор-ОГ та лпди А. Проведено визначення моносахаридного, амнокислотного та жирнокислотного складу одержаних ЛПС та х окремих компонентв. Метилювання, перйодатне окислення, дезацетилювання, дезамнування, розпад за Смітом, встановлення конфігурації моносахаридів проведено особисто. Встановлення структур О-ПС дослджуваних штамв проведено спльно з д.х.н. Кнірель Ю.О., д.х.н. Шашковим О.О. та к.х.н. Кочаровою Н.О. (Інститут органічної хімії ім. Зелинського, Москва). ммунохімічні дослідження проведено особисто, автор висловлю подяку к.б.н.Кавун Е.М. (нститут бохм м. Палладна, Кив) за допомогу в розробц умов проведення муноферментного аналзу для дослджуваних препаратв. Встановлення нтерфероногенно активност ЛПС здйснено спльно з д.м.н. С.Л.Рибалко та к.м.н. Дядюн С.Т. (нститут епдемолог та нфекцйних хвороб м. Громашевського, Кив); визначення протипухлинно д ЛПС проведено за участю к.б.н. О. Е. Придатко та інж. Жуково О.В. (нститут експериментально патолог, онколог та радолог НАН Украни, Кив). Автор висловлює щиру подяку к.б.н. Мурас В.О. та нж. Житкевч Н. В. (нститут мкроболог та врусолог м. Заболотного) за допомогу у пдтримц мікробіологічно “чисто“ культури дослджуваних штамв.

Структура та об’м роботи. Дисертаця складаться з вступу, огляду лтератури, опису матералв та методв дослдження, експериментально частини, яка включа виклад у чотирьох роздлах результатв роботи та х обговорення, висновкв, а також списку лтератури, який охоплю 139 публкацй. Робота викладена на 145 сторнках машинописного тексту. Фактичний матерал дисертац подано у вигляд 31 рисункв та 29 таблиць.

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

У двох підрозділах викладено відомості про біохімічні властивості та фітопатогенну дію представників виду R. solanacearum; про сучасний стан таксономічного положення цього виду, в систематиці якого на протязі останніх років відбулось декілька змін; про склад і будову ЛПС фітопатогенних бактерій родин Ralstonia, Burkholderia, Pseudomonas.

РОЗДІЛ 2.МАТЕРАЛИ ТА МЕТОДИ

Об’ктами достдження були 17 штамв Ralstonia solanacearum. Всі культури були люб'язно надані куратором ICMP доктором Дж. Янгом (Нова Зеландія), за що ми висловлюємо йому щиру подяку. Штами були виділен в рзних географчних зонах свту із різних рослин і за своми властивостями віднесен до різних біоварів (табл. 1).

Культивування бактерй проводили на рдкому синтетичному середовищ, що мстило як джерело вуглецю глюкозу, а азоту - хлористий амонй (Vidaver).

Видлення та очищення ЛПС проводили за методом Вестфаля та Янна. Деградацю ЛПС проводили м’яким кислотним гдролзом в 1% оцтовй кислот. Ультрацентрифугуванням (40 хв., 25000 g) вддляли гдрофльн та гдрофобн частини деградованого ЛПС. Окрем вуглеводн компоненти молекули ЛПС одержували гель-хроматографю на сефадекс G-50 з використанням 0.025М придин-ацетатного буферу, рН 4,5. Визначення клькост вуглеводв здйснювали за Dubois, нукленових кислот - за Спрним,

Таблиця 1

Штам | Біовар | Рослина-хазяїн

ICMP 5712 - типовий (NCPPB 325, ATCC 11696) | 1 | томати

ICMP 766 | 1 | томати

ICMP 767 | 1 | банан

ICMP 6523 | 1 | тютюн

ICMP 7942 | 1 | банан

ICMP 7944 | 1 | подорожник

ICMP 7955 | 3 | баклажан

ICMP 7956 | 2 | томати

ICMP 7959 | 2 | солодкий перець

ICMP 7960 | 4 | солодкий перець

ICMP 8066 | 1 | тютюн

ICMP 8072 | 1 | тютюн

ICMP 8089 | 3 | солодкий перець

ICMP 8093 | 1 | томати

ICMP 8110 | 3 | картопля

ICMP 8202 | 4 | картопля

ICMP 8277 | 4 | солодкий перець

блку - за Lowry. Гептози визначали реакцю з цистеном та срчаною кислотою, КДО - реакцю з тобарбитуровою кислотою. дентифкацю нейтральних моносахаридв здйснювали методом газово-рдинно хроматограф препаратв у вигляд ацетатв пололв на газовому хроматограф “Chrom-5”. дентифкацю та визначення вмсту амнокислот та гексозамінів проводили на аналзатор амнокислот “Hitachi”. Визначення жирнокислотного складу лпдв А проводили на газовому хроматограф “Цвет-100”, аналзуючи препарати у вигляд метилових ефрів жирних кислот, наявнсть оксикислот пдтверджували трифторацетилюванням.

Структури О-ПС встановлювали з застосовуванням бездеструктивних (1Н- та 13С-ЯМР-спектроскопія) та деструктивних (перйодатне окислення, розпад за Смітом, метилювання, дезацетилювання, дезамінування) методв, а також за допомогою метода комп'ютерного аналізу (Lipkind et al.).

мунохмчн властивост ЛПС вивчали застосовуючи метод твердофазного муноферментного аналзу.

нтерферонндукуючу активнсть встановлювали в дослдах in vitro. ндукцю нтерферона проводили шляхом внесення в суспензю лейкоцитв периферйно кров людини ( 5х106 клтин на 1 мл) полсахарида в кнцевй концентрац 200 мкг в проб. Активнсть нтерферону визначали за здатнстю пригнчувати цитотоксичну дю 100 тканинних цитоплазматичних доз (ТЦД) в 1 мл вруса-ндикатора (врус везикулярного стоматиту). За одиницю активност нтерферону (О50/мл) приймали значення, обернене його максимальному розведенню, що запобгало на 50% цитопатичнй д 100 ТЦД ВВС в культур лейкоцитв людини лн L41, що перевивалися.

Дослдження протипухлинно активност проводили на п’яти пухлинних штамах: метастазуюча карцинома легенв Льюс (3LL) та меланома В-16; асцитна саркома S-37 (недиферинцйована полморфноклтинна саркома) два лейкозних штами - лмфодна лейкемя L1210 лмфоцитарна лейкемя Р-388. Протипухлинний ефект оцнювали по нтенсивност росту значних пухлин (визначення х розмру) клькост клтин в асцитичнй рдин при асцитнй форм росту ( саркома S-37). Антилейкозну активнсть визначали на пдстав пдрахунку загально клькст клтин в асцитичнй рдин за тривалстю життя тварин. Як показник антиметастатично активност дослджували середнй сумарний об’м метастазв х кльксть на одну тварину.

Результати дослідів статистично обробляли, використовуючи коефциент Ст’юдента.

РОЗДІЛ 3. ВИДЛЕННЯ ЛПОПОЛСАХАРИДВ R. solanacearum , ВИЗНАЧЕННЯ Х КОМПОНЕНТНОГО СКЛАДУ

Із 17 досліджуваних штамів R. solanacearum одержані бактеріальні маси, з яких у подальшому виділен ЛПС. З'ясовано, що для представників виду R. solanacearum, більша частина ЛПС (від їх сумарного вмісту) екстра-гується у водний шар водно-фенольно сумш : 70-85% (у фенольній фрак-ції виявляли 30-15%). Таке розподілення між фракціями реакцйно сумiш вказу, що до складу досліджуваних ЛПС входять переважно гідрофільні ком-поненти. ЛПС із фенольної фракції набагато більше забруднені нуклеїно-вими кислотами, ніж ЛПС із водного шару (відповідно, 40-50 та 20-35%). За яксним складом ЛПС із фенольної та водної фракцій не вдрзнялись.

Встановлено, що штами даного виду відрізняються між собою відносним вмістом ЛПС: хоча екстракція ЛПС всіх досліджуваних штамів відбувалась за однакових умов, х кінцевий вихід по відношенню до сухої бактеріальної маси між окремими штамами коливався від 1,2 % у R. solanacearum шт. 7942 до 15,4 % у шт. 7956, для більшості ж штамів він становив 5-10%. Треба вдзначити, що за вдносним вмстом ЛПС представ-ники виду R. solanacearum деклька вдрзняються вд нших грамнегативних бактерй, для яких вмст цих сполук склада в середньому вд 1 до 5 %.

ЛПС всх дослджуваних штамв були вільні від домішок білку, вміст якого визначався слідовими кількостями. Але вс ЛПС характери-зувалися достатньо високим вмістом нуклеїнових кислот (до 35 %), позбав-лялися вд яких застосовуючи декілька циклів ультрацентрифугування, при цьому х вміст зменшувався до 1,5-5 %. Однак для ЛПС деяких штамів, заз-начений метод виявився недостатньо ефективним - після ультрацентрифугу-вання вміст нуклеїнових кислот залишався досить високим (вд 6 до 13,5 %). Для ЛПС цих штамів проводили подальше очищення за допомогою насиченого розчину трихлороцтової кислоти. Виявлено, що цей метод очищення набагато дійовіший (вміст нуклеїнових кислот зменшувався до 0, 5 - 2 %), однак при його застосуванні збитки кількості ЛПС значно більші.

Аналіз моносахаридного складу ЛПС показав, що домінуючим моносахаридом всіх ЛПС є рамноза (70 - 90 %). ЛПС практично всіх штамів мали глюкозу (1 -23 %), за цим показником декілька виділявся серед інших шт. 7956 (35 %). Характерною виявилась також ксилоза (1-8 %) . ЛПС деяких штамів мали менш поширені для даного виду вуглеводні залишки: рибозу, галактозу, манозу та арабнозу. Вмст гептоз, в залежності від штаму, складав від 0,5 до 3,0 %. До складу всіх ЛПС входив в достатньо значній клькост глюкозамін (4-18 %), в ЛПС двох штамв (шт. 7944 та 8089) визначено ще і галактозамін.

Щодо амінокислотного складу ЛПС, то ці сполуки являються мінорними компонентами. За якісним складом картина х розподілення досить різноманітна: представлені майже всі амінокислоти (за виключенням лейцину та тирозину), але найбільш поширеними виявились аланін та гистидин, з перевагою аланіну у кількісному відношенні.

Деградацю подальшою гель-хроматографію вуглеводно частини деградованого ЛПС отримані окрем структурн компоненти молекули. ЛПС всіх досліджуваних штамів за своєю структурою належать до S-форми – складаються із О-специфічного полісахариду, олігосахариду кору та ліпіду А. Для більшості штамів було характерно розділення вуглеводної частини на три піки (О-ПС та кор-ОГ) - рис. 1. Особливістю другої групи, що представлена 4 штамами (шт. 766, 8072, 8110 та 8202), була наявність ще однієї, більш високомолекулярної фракції ( у кількісному відношенні значно меншо - лише 3-8 % від фракції О-ПС) - рис. 2. За якісним складом О-ПС і О’-ПС практично не відрізнялись, різниця була обумовлена, як правило, більшим вмістом глюкози у складі О’-ПС.

рис. 1 Профіль елюції деградованого ЛПС R.solanacearum шт. 5712

рис. 2 Профіль елюції деградованого ЛПС R.solanacearum шт. 8110

РОЗДІЛ 4. СТРУКТУРН КОМПОНЕНТИ ЛІПОПОЛІСАХАРИДІВ

О-специфчн полсахариди

Домінуючим моносахаридом О-ПС досліджуваних штамів була рамноза (60 - 93%). Для багатьох штамів характерними були також ксилоза (3 - 12 %) та глюкоза (2-19%). О-ПС деяких штамів містили невелику кількість арабінози (1-6 %), а також галактози (1-10%) і лише О-ПС шт. 8089 відрізнявся від інших значним вмістом останньої - 31,6 %.

Для всх О-ПС визначено значну кількість глюкозаміну (5-20%). До складу О-ПС трьох штамів (шт. 7944, 7955 та 8089) входив також галактозамін. У своїй більшості досліджувані О-ПС були вільні від амінокислот і лише О-ПС окремих штамв містили одну чи дв амінокислоти в дуже низьких концентраціях (0,1-0,7%), причому, перевага, як і в разі ЛПС, була за аланіном та гистидином.

Виходячи з аналзу 1Н- та 13С-ЯМР-спектроскопі встановлено, що О-ПС дослджуваних штамв складаються з три- тетра- та пентасахаридних лінійних або розгалужених ланцюгв, що повторюються (рис. 3).

рис. 3 13С-ЯМР-спектри О-ПС R.solanacearum.

З застосовуванням деструктивних методв, як дозволили встановити тип замщення, положення конфгурацю глікозидних зв’язкв окремих моносахаридних залишкв, а також за допомогою метода комп'ютерного аналізу було встановлено 7 типів структур О-ПС, 6 з яких описані вперше (табл. 2).

Таблиця 2

Розподілення типів структур ланцюга, що повторюється

О-ПС дослджуваних штамів R. solanacearum

структура |

Будова ланцюга, що повторються | Штам | Наявнсть типв структур | Спввдношення типв структ. у %

6523

1 | 3)--D-GlcpNAc-(12)--L-Rhap-(12)--L-Rhap-(13)--L-Rhap-(1 | 7956 | 1 | 100

А B C D | 8110

8202

767

2 | 3)--D-GlcpNAc-(13)--L-Rhap-(12)--L-Rhap-(13)--L-Rhap-(1

A B C D | 7942 | 2 | 100

3 |

3)--D-GlcpNAc-(13)--L-Rhap-(12)--L-Rhap-(13)- -L-Rhap-(1

A B C 4

1

-L-Xylp | 5712

766

7959

8066 | 3 : 2 | 70 : 30

E | 7960 | 25 : 75

8093

4 |

3)- -D-GlcpNAc-(13)--L-Rhap-(12)--L-Rhap-(13)--L-Rhap-(1

A B C D |

7955 |

4: (3+2) |

70 : 30

5 |

3)--D-GlcpNAc-(12)--L-Rhap-(12)--L-Rhap-(13)- -L-Rhap-(1

A B C 4

1

-L-Xylp

E |

8072 |

5 : 1 : 3 |

40:50:10

6 |

-L-Rhap E

1

3

3)--D-GlcpNAc-(12)--L-Rhap-(12)--L-Rhap-(13)- -L-Rhap-(1

A B C D |

7944

8277 |

6 : 1 |

40:60

7 |

3)--D-Rhap-(13)--D-Rhap-(14)--D-GalpNAc-(1 |

8089 |

7 |

100

Серед дослджуваних штамв значно відрізнявся від інших О-ПС шт. 8089: він побудован із лінійних трисахаридних ланцюгів, які включають 2 залишки D-рамнози та 1 залишок N-ацетилгалактозамну.

О-ПС 7 штамів характеризувались лінійною структурою з тетрасахаридними ланцюгами, що повторюються , які складались із трьох залишків L-рамнози та одного залишка N-ацетилглюкозамну. Вони відрізнялись між собою варіаціями у типі конфігурації глікозидного зв’язку залишку N-ацетилглюкозамну : - в структурах 1 4 та - в структур 2, а також позицією його прикріплення до залишку рамнози : 12 в структур 1 та 13 в структурах 2 4. О-ПС із структурою 1 було визначено також японськими дослідниками Акіяма з співавт. (1985) і на початок наших досліджень це була єдина відома структура О-ПС представників цього виду.

Для більшості штамів було визначено наявність розгалужених пентасахаридних ланцюгів, основу яких складали лінійні тетрасахаридні структури 1 чи 2. Різниця стосувалась типу бічного замісника: ксилоза в структурах 3 та 5 чи рамноза в структур 6, а також місця його прикріплення до головного ланцюга. Треба відмітити, що ксилоза являється рідкісним компонентом бактеріальних ПС і на цей час відома як складова О-ПС лише у P. maltophylia .

Для багатьох штамів було визначено наявність в складі О-ПС декількох типів структур, причому іноді різниця між штамами стосувалась лише співвідношення типів структур (див. табл. 1, група структури 3). Подбна гетерогеннсть була встановлена також ранше Здоровенко з спвавт. при вивченн Pseudomonas syringae (1988-1991) та Солдаткною (1989) при вивченн О-ПС Burkholderia cepacia .

За якісним складом О-ПС досліджувані штами можна розподілити на 3 хемотипи: представники I мали у складі О-ПС L-рамнозу та N-ацетилглюкозамн; II - крм того ще і ксилозу; III - D-рамнозу та N-ацетилгалактозамн.

Кореляції між структурою О-ПС і належністю штаму до певного біовару чи рослини-хазяїна або географчно зони, з якої цей штам походить, не виявилось.

Кор -олгосахариди.

Хоча відомо, що кор-ОГ є досить консервативною частиною молекули ЛПС, для дослджуваних штамв було виявлено значні варіації щодо вмісту окремих компонентів. Найбільш поширеними були рамноза та глюкоза. Але х вміст коливався в дуже широких діапазонах : рамнози - від 1 до 81,3 %; глюкози - від 2 до 98 %. Крім цих вуглеводів у кор-ОГ більшості штамів виявлено ряд інших моносахаридів: по-перше слід відмітити галактозу, причому, для двох штамв (шт. 8066 та 8072) вона була, разом із рамнозою, домінуючим моносахаридом, в той час, як глюкоза в них визначалась в незначнй кількості (шт. 8072), чи була повнстю відсутня (шт. 8066). Кор-ОГ ряду штамів мали у своєму складі ксилозу та рибозу. Визначення рибози в кор-ОГ поясню дентифкацю при аналз ЛПС. Незвичайна картина моносахаридного складу спостерігалась для кор-ОГ шт.7942: 39 % манози і 31 % еритриту.

Цікавим виявився вміст в кор-ОГ досліджуваних штамів аміносполук. Крім глюкозаміну, звичайного компоненту кор-олігосахаридів багатьох видв бактерй, до складу кор-ОГ більшості штамів входив в досить високих концентраціях етаноламін - 0,5- 2,5%. Кор-ОГ всх штамв характеризувались досить постійним набором амінокислот, а саме, аланіну, гліцину та глутаміново кислоти.

Лпди А.

Як вдомо, лпд А являться найбільш консервативною в процес еволюц частиною молекули ЛПС. Лпди А рзних видв бактерй вдрзняються мж собою, в першу чергу, складом жирних кислот, який досить стабльним показником використовуться як один з хемотаксономчних критерв.

Для представникв виду R. solanacearum в склад лпдв А переважали жирн кислоти з парним числов атомв вуглецю, а саме п’ять домнуючих компонентв: н-тетра-, н-гексадеканова кислоти, а також 3-окситетра-, 3-оксигекса- та 3-оксиоктадеканова кислоти. Наявнсть 3-ОН-С14:0 та 3-ОН-С16:0 у склад лпдв А характерною ознакою представникв II рРНК-гомологчно групи родини Pseudomonadaceae, до яко належав до недавнього часу рд Ralstonia. Наявність 3-оксиоктадеканово кислоти можливо одню з специфчних ознак виду R.solanacearum.

РОЗДІЛ 5. БОЛОГЧНА АКТИВНСТЬ ЛПОПОЛСАХАРИДВ

мунохмчн властивост

Вдомо, що варац в структур О-ПС лежать в основ серологчних класифкацйних схем. Для виду R. solanacearum на сьогодн тако схеми не сну. Тому було проведено дослдження з метою встановлення можливо кореляц мж серологчною активнстю ЛПС та структурою його О-ПС, а також спроби з’ясування антигенно детермнанти.

Серологічну активність ЛПС вивчали за допомогою антисироватки, отриманої до грітої бактеріальної суспензії R. solanacearum шт. 8110, ЛПС якого характеризувався наявністю тільки одного типу структури О-ПС. Цей ЛПС показав високу серологічну активність у відношенні до зазначеної антисироватки використовувався як позитивний контроль, порівненням з яким оцінювалась активність інших антигенв. Як негативний контроль було використано ЛПС шт. 4157, О-ПС якого за своєю структурою принципово відрізнявся від дослджуваних:

6)--D-GlcNAc-(1 4)--D-GalNAc-(1

4

1

-L-Araf

який виявився серологічно інертним до антисироватки.

За серологчною активнстю дослджуван ЛПС, вдрзнялась мж собою. На рис. 4 вдображено розподілення ЛПС досліджуваних штамів за структурним типом О-ПС та “відносну” серологічну активність, яку вони проявили при зазначених умовах тестування. з аналзу ц даграми витка:

1. ЛПС, в структур яких N-ацетилглюкозамн зв’язан з залишками рамнози - (12)-зв’язками (шт. 8110, 6523, 7956, 8202) являються серологчно активними, в той час, як ЛПС з - (13)- зв’язками (шт. 767, 7942) - серологчно iнертн в реакцi з використаною в дослдженн антисироваткою.

2. Розгалуження ланцюга лнйно структури поява залишку L-ксилози як бчного замсника залишку рамнози (D) призводить до перетворення “неактивно“ структури 2 в таку, яка виявля серологчну активнсть подбну, а нколи i вищу (шт. 7960, 8093, 5712, 766, 7956) за активнсть ЛПС шт. 8110. Причому спввдношення клькост розгалужених лнйних ланцюгв О-ПС, що входять до складу певного ЛПС (вдповдно, 25:75% для шт. 7960, 8093 та 70:30% для шт. 5712, 766, 7959), не ма суттвого впливу на прояв активност антигену.

3. В той же час ксилозування залишку рамнози (D) в “активнй” структур 1 (шт. 8072 ) не спричиню змн в активност ЛПС.

4. На вдмну вд ксилозування, рамнозилювання головного ланцюга “активно“ структури 1 (шт. 7944, 8277) призводить до значного падння серологчно активност.

рис. 4 “Відносна” серологічна активність ЛПС R.solanacearum

Одержан дан дозволяють зробити припущення, що суттвим в прояв серологчно активност дослджуваних ЛПС можливо особливост будови х О-ПС, а саме т “варабельно“ област ланцюга, яка складаться з залишкв N-ацетилглюкозамну (А) сусднх з ним залишкв L-рамнози (B) (D). В залежност вд змн хмчно будови ц област активуються чи, навпаки, екрануються антигенн детермнанти ЛПС, що обумовлю прояв його серологчно активност (табл.3).

Таблиця3

Тип струк

тури |

“Варабельна” область ланцюга, що повторються О-ПС | Вплив на серологчну активнсть ЛПС

1 | 3)--L-Rhap-(13)- -D-GlcpNAc-(12)--L-Rhap-(1

D A B | активна

2 | 3)--L-Rhap-(13)- -D-GlcpNAc-(13)--L-Rhap-(1

D A B | неактивна

3 | 3)--L-Rhap-(13)- -D-GlcpNAc-(13)--L-Rhap-(1

14 А В

-L-Xylp | активна

5 | 3)--L-Rhap-(13)- -D-GlcpNAc-(12)--L-Rhap-(1

14 А В

-L-Xylp | активна

6 | 3)--L-Rhap-(13)- -D-GlcpNAc-(12)--L-Rhap-(1

D A В13

-L-Rhap | неактивна

Крім дослідження антигенної активності цілої молекули ЛПС, були проведен аналогичні експерменти з ліпідами А. За виключенням R. solanacearum шт. 5712, спостергалась кореляця мж серологчною активнстю ЛПС лпда А. Практично вс лпди А проявляли значно бльшу серологчну активнсть, нж вдповдн м ЛПС.

Оскльки на сьогодн доведено, що ЛПС деяких видв грамнегативних бактерй проявляють досить високий рвень ммуномодулюючої активност, нами було проведено дослдження нтерфероногенно та протипухлинно активност ЛПС R. solanacearum та його окремих структурних компонентв.

нтерфероногенна активнсть

нтерфероногенну активнсть ЛПС R. solanacearum вивчали у порвнянн до такої класичного нтерфероногена - ЛПС E. coli 055:В5 фрми“Sigma”.

Встановлено, що ЛПС R. solanacearum являється індуктором утворення -інтерферону. з одержаних даних (табл. 4) виткає, що нтерфероногенна активнсть препаратв ЛПС R. solanacearum та E. coli 055:В5 була аналогчною - 530 од. Дослдження окремих структурних компонентв молекули ЛПС показало, що головний внесок в загальну активнсть належить лпду А та кор-ОГ. Визначено також незначну (у порвнянн до ЛПС) активнсть фракц О-ПС.

Таблиця 4

нтерфероногенна активнсть ЛПС та його окремих компонентв

Штами | Препарати | нтерфероногенна активнсть, О50/мл

R. solanacearum шт. 5712 | ЛПС | 530 + 110

О-ПС | 320 + 66

кор-ОГ | 1070 + 210

лпд А | 1070 + 210

E. coli O55:B5 (“Sigma”) | ЛПС | 530 + 110

Протипухлинна, антилейкозна та антиметастатична активнсть

При вивченн протипухлинної активност ЛПС R. solanacearum встановлено, що ЛПС пдсилював рст карциноми легенв Льюїс та меланоми В-16, що виявилось в пдвищенн їх розмру. Цей результат був пдтверджений в експеримент з саркомою S-37.

При визначенн антилейкозної активност ЛПС встановлено, що тривалсть життя тварин з експериментальними лейкозами пд його впливом деклька збльшується. При цьому ЛПС не вплива на кльксть лейкозних клтин в асцитичнй рдин (табл. 5) .

Таблиця 5

Вплив ЛПС на кльксть лейкозних клтин та продовження життя мишей ДВА2 з лмфоцитарною лейкемю Р-388 лмфодною лейкемю L1210*

Варант

дослду | Кльксть клтин в асцитичнй рдин (х107) | Тривалсть життя мишей, дб

Лмфодна лейкемя L 1210

ЛПС | 2.2 + 0.2 | 9.2 + 0.2

Контроль | 2.5 + 0.2 | 7.6 + 0.2

Лмфоцитарна лейкемя Р-388

ЛПС | 4.2 + 0.2 | 8.0 + 0.2

Контроль | 4.1 + 0.3 | 6.7 + 0.1

Примтка: * Р 0,05

Встановлено, що ЛПС проявляв виражену антиметастатичну дю, яка виявлялась у зменшенн об’ємів та клькост метастазв (табл. 6). Необхдно вдмтити, що антиметастатичний ефект ЛПС поєднуювся з його стимуляцйним впливом на рст первинної пухлини.

При визначенн антиметастатично активност окремих компонентв ЛПС (табл.6), встановлено, що ЛПС та О-ПС статистично достоврно зменшують об’єм та кльксть метастазв (на 60-70% та 40-50%, вдповдно). Введення мишам кор-ОГ також знижу об’єм метастазв на 63%. Лпд А не проявля статистично достовірної дї на метастатичний процес.

Таблиця 6

Вплив ЛПС його структурних компонентв на кльксть об’м (мм3) метастазв у мишей з карциномою легенв Льюс*

Варант дослду | Кльксть метастазв | Об’м метастазв

ЛПС | 4.85 + 0.64 | 81.06 + 2.57

О-ПС | 5.45 + 0.51 | 63.27 + 27.21

Контроль | 9.15 + 0.81 | 208.48 + 51.15

кор-ОГ | 5.40 + 0.63 | 52.35 + 12.50

лпд А | 7.05 + 0.70 | 90.41 + 22.68

Контроль (з ДМСО) | 6.75 + 0.70 | 138.83 + 30.46

Примтка: * Р 0,05

Важливим на нашу думку виявлення муномодулюючих властивостей саме полсахаридно частини молекули ЛПС. Адже основною проблемою можливого використання вдомих на сьогодн препаратв бактерального походження високий рвень х прогенност та токсичност, обумовлений лпдною частиною ЛПС.

РОЗДІЛ 6. УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕННЯ

В даному розділі викладено узагальнення основних експериментальних результатів дослідження, які дозволяють зробити наступні висновки:

ВИСНОВКИ

1.

1.

·

· тип його зв’язку з сусіднм залишком рамнози;

· наявності бічних замісників.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

СПИСОК РОБТ, ОПУБЛКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦ

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

Москаленко Н.В. Структурно-функцональн дослдження лпополсахаридв Ralstonia solanacearum. - Рукопис.

Дисертаця на здобуття наукового ступеня кандидата бологчних наук за спецальнстю 03.00.07 - мкробологя. - нститут мкроболог врусолог м. Д.К.Заболотного НАН Украни, м. Кив, 1999.

В робот проведено систематичне дослдження лпополсахаридв (ЛПС) Ralstonia solanacearum. Видлено охарактеризовано за яксним кльксним складом ЛПС х окрем структурн компоненти (О-специфчн полсахариди, олгосахариди кору лпди А) з 17 штамв R. solanacearum, представникв рзних боварв, як вдрзнялись також рослиною-хазяном та географчним походженням. Встановлено 7 типв структур О-специфчних полсахаридв дослджуваних ЛПС, 6 з яких описан вперше. Показано, що особливості структури О-специфчних полсахаридв впливають на прояв серологічної активності ЛПС: при змінах в хімічній будові “варабельно“ зони активуються чи екрануються антигенні детермінанти молекули ЛПС. Встановлено, що ЛПС R. solanacearum ндуку утворення -нтерферону, вдповдальними за нтерфероногенну активнсть ЛПС лпд А та кор-ОГ. ЛПС R. solanacearum проявля виражену антиметастатичну дю.

Ключов слова: Ralstonia solanacearum, лпополсахарид, О-специфчний полсахарид, олгосахарид кору, лпд А, нтерфероногенна активнсть, антиметастатична дя..

Москаленко Н. В. Структурно-функциональные исследования липополисахаридов Ralstonia solanacearum. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой ступени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 - микробиология. - Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного НАН Украины, г. Киев, 1999.

В работе проведено систематическое исследование липополисахаридов (ЛПС) Ralstonia solanacearum. Выделено и охарактеризовано по качественному и количественному составу ЛПС и их отдельные структурные компоненты (О-специфические полисахариды, олигосахариды кора и липиды А) из 17 штаммов R. solanacearum, представителей разных биоваров, которые отличались также растением-хозяином и географическим происхождением. Установлено 7 типов структур О-специфических полисахаридов (О-ПС) исследуемых ЛПС, 6 из которых описаны впервые. О-ПС 7 штаммов характеризовались линейной структурой с тетрасахаридными повторяющимися звеньями, состоящими из трех остатков L-рамнозы и одного остатка N-ацетилглюкозамина. Они различались между собой вариациями в типе конфигурации гликозиднй связи остатка N-ацетилглюкозамина : - в структурах 1 и 4 или - в структуре 2, а также позицией его прикрепления к остатку рамнозы : 12 в структуре 1 или 13 в структурах 2 и 4. Для большинства штаммов обнаружено наличие разветвленных пентасахаридних повторяющихся звеньев основу которых составляли линейные тетрасахариды структуры 1 или 2. Различие между ними состояло в типе бокового заместителя: ксилоза (структуры 3 и 5) или рамноза (структура 6) и месте его присоединения к основной цепи. Среди исследуемых штаммов значительно выделялся по структуре О-ПС шт. 8089: он состоял из линейных трисахаридных повторяющихся звеньев, включающих 2 остатка D-рамнозы и 1 остаток N-ацетилгалактозамина (структура 7). Для многих штаммов было определено наличие в составе О-ПС нескольких типов структур повторяющегося звена, причем иногда разница между ними была обусловлена лишь соотношением типов структур. По качественному составу О-ПС исследуемые штаммы можно разделить на три хемотипа: представители I содержали в составе О-ПС L-рамнозу и N-ацетилглюкозамин; II - кроме того еще и ксилозу; III - D-рамнозу и N-ацетилгалактозамин. Корреляции между структурой О-ПС и принадлежностью штамма к определенному биовару или растению-хозяину не обнаружено. Показано, что особенности структуры О-специфических полисахаридов влияют на проявление серологической активности ЛПС: при изменениях химической структуры “вариабельной“ зоны (состоящей из остатка N-ацетилглюкозамина и двух