УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР“

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ”

РУДЕНКО АНДРІЙ АНАТОЛІЙОВИЧ

УДК 619:616.98:579.84:636.92(043)

ПОШИРЕННЯ, БІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ЗБУДНИКА ТА УДОСКОНАЛЕННЯ ПРОФІЛАКТИКИ ПАСТЕРЕЛЬОЗУ КРОЛИКІВ

16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата

ветеринарних наук

Харків – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Луганському національному аграрному університеті.

Науковий керівник

Офіційні опоненти:

| доктор ветеринарних наук, професор,

член-кореспондент УААН, заслужений діяч науки і техніки України

Стегній Борис Тимофійович, Національний науковий центр “Інститут експериментальної

і клінічної ветеринарної медицини”, директор.

доктор ветеринарних наук, професор

Білокінь Віктор Степанович, Національний науковий центр “Інститут експериментальної

і клінічної ветеринарної медицини”, головний науковий співробітник лабораторії біотехнології;

доктор ветеринарних наук,

Кочмарський Віктор Андрійович, Харківська державна зооветеринарна академія, професор кафедри епізоотології та ветеринарного менеджменту.

Захист відбудеться “17” жовтня 2007 р. о 930 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 у Національному науковому центрі “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного наукового центра “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий “11” вересня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук, професор ___________________ Бабкін А. Ф.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Кролівництво є однією з перспективних галузей приватного тваринництва. В Україні, зокрема в Луганській, Донецькій та Запорізькій областях, значного поширення набули дрібні та середні кролівницькі ферми з маточним поголів’ям від 10 до 100 кролематок. Більшість таких кролеферм не мають елементарного ветеринарного обслуговування, профілактичні заходи проводяться безсистемно або взагалі відсутні. Усе вищенаведене призводить до виникнення інфекційних хвороб, які переважно вражають органи шлунково-кишкового та респіраторного трактів кроликів і завдають значних економічних збитків власникам.

Багато дослідників вважають, що пневмоентерити кроликів спричиняються не одним, а асоціацією умовно патогенних мікроорганізмів (Prescott J. F., 1978; Наймитенко Є. П., Павлюк Я. С., 1980; Rai R. B. et al., 1985; Duclos P. et al., 1986; Кирилов А. К., 1997; Ajuvape A. T., Aregbesola E. A., 2001; Cooper S. C. et al. 2001; Gu Z. L. et. al., 2004; Martino P. A. et al., 2004). У бактеріальних паразитоценозах кроликів домінантне місце займає Pasteurella multocida (Webster L. T., Burn C., 1927; Пінчук В. А., Волколупова В. А., 1976; Рютова В. П., 1985; Deeb B. J. et. al., 1990; Шевченко А. А. та ін., 1995; Зубченко Т., 2002; Черекаев А. А. та ін., 2002; Ружуаускас М., Снарските А., 2004).

Дослідження в зазначеному напрямку в кролівницьких фермах південно-східного регіону України не проводились. Етіологія, патогенез, діагностика та профілактика пневмоентеритів у кроликів, спричинених пастерелами та асоціаціями умовно патогенних бактерій, залишаються недостатньо вивченими. Визначення мікробного ценозу в кролівницьких фермах та з’ясування ролі пастерел в асоціаціях умовно патогенних бактерій, які спричиняють масові пневмоентерити кроликів, є актуальним і сприятиме підвищенню ефективності лікувально-профілактичних заходів у кролівництві України.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертації є частиною науково-дослідної роботи кафедри якості та безпеки продукції АПК Луганського національного аграрного університету, яка виконувалась згідно програми УААН “Вивчення інфекційної патології молодняка сільськогосподарських тварин і птиці і розробка ефективних заходів боротьби в господарствах південно-східної частини України” (0104U005403, 2003–2007 рр.).

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи є вивчення ролі P. multocida і бактеріальних асоціантів при пневмоентеритах кроликів та розробка засобів профілактики зазначених хвороб на основі протективних антигенів збудників.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі задачі:

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Об’єкт дослідження – пастерельоз кроликів, ускладнений умовно патогенними бактеріями.

Предмет дослідження – ступінь поширення і роль пастерел та інших умовно патогенних бактерій при пневмоентеритах кроликів, біологічні властивості пастерел, засоби діагностики та профілактики пастерельозу.

Методи досліджень. Робота виконувалась із використанням методів бактеріологічних, серологічних, гематологічних, біохімічних, імунологічних досліджень та статистичного аналізу експериментальних даних.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше теоретично та експериментально обґрунтовано спосіб виявлення кроликів-пастерелоносіїв шляхом провокації проявлення клінічних ознак хвороби за модифікованим нами методом Н. И. Розанова, що передбачає додаткове введення кроликам дексаметазону. Розроблено і апробовано селективне поживне середовище з м'ясо-пептонного бульйону, біоактиваторів росту пастерел та анілінових барвників-інгібіторів росту кокової мікрофлори у концентрації кристалвіолету 1:54000, метилвіолету 1:64000 і бриліантгрюну 1:100000. За регресійною моделлю різних концентрацій досліджуваних стимуляторів росту (аутолізат дріжджів, дефібринована кров, сироватка крові та дріжджований аутолізат крові) визначено ефективність накопичення біомаси пастерел у середовищі з дріжджованим аутолізатом крові, що має переваги за простотою виготовлення, стерилізації та застосування.

Вивчено режими інактивації пастерел, стафілококів, ешерихій та бордетел за допомогою пероксиду водню з метою отримання активних протективних антигенів. Уперше вивчено вплив вакцин, виготовлених на основі протективних антигенів, інактивованих пероксидом водню культур бактерій, на зменшення захворюваності кролепоголів’я. У порівняльному аспекті досліджено імунокорегуючі властивості вакцин на гематологічні та імунологічні показники крові у щеплених проти пастерельозу тварин.

Наукова новизна виконаної роботи підтверджена деклараційними патентами на корисну модель (11612. Спосіб ізоляції пастерел від кролів-пастерелоносіїв, опубл. 16.01.2006 р.; 18446. Епізоотичний штам Pasteurella multocida серовару Д, опубл. 15.11.2006 р.; 21254. Епізоотичний штам Pasteurella multocida серовару А для виготовлення інактивованого бактерину проти інфекційних пневмоентеритів кролів, опубл. 15.03.2007 р.).

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено технологію виготовлення інактивованої вакцини проти пастерельозу кроликів із застосуванням епізоотичних штамів Pasteurella multocida сероварів А і Д та Staphylococcus aureus, Escherichia coli O111 і Bordetella bronchiseptica, що найбільш часто ускладнюють перебіг хвороби та спосіб їх інактивації за допомогою пероксиду водню, теоретичні положення яких підтверджено експериментальними даними в лабораторних і виробничих умовах.

За результатами проведених досліджень розроблено і запропоновано для практичного використання:

- нормативну документацію на інактивовану вакцину проти пастерельозу кроликів (ТУ У 24.4-00493669-002:2007, інструкція з виготовлення і контролю вакцини за показниками якості та листівка-вкладка щодо застосування препарату), яка затверджена Державним департаментом ветеринарної медицини МАП України 16 січня 2007 р.;

- настанову з діагностики пастерельозу тварин;

- методичні вказівки з діагностики та організації протиепізоотичних заходів при патологіях кроликів, які викликаються умовно патогенними бактеріями, та методичні рекомендації щодо одержання біомаси пастерел при стаціонарному та глибинному культивуванні, що затверджені науково-методичною радою Державного департаменту ветеринарної медицини МАП України (протокол № 3 від 20.12.2006 р.).

Для практичної ветеринарної медицини розроблено спосіб ізоляції пастерел від кролів-пастерелоносіїв та запропоновано епізоотичні штами P. сероварів А і Д.

Основні положення дисертації використовуються в навчальному процесі на факультетах ветеринарної медицини Національного аграрного університету України, Державного агроекологічного університету, Дніпропетровського державного аграрного університету, Луганського національного аграрного університету, Львівської національної академії ветеринарної медицини ім. С. З. Гжицького, Сумського національного аграрного університету, Харківської державної зооветеринарної академії.

Особистий внесок здобувача. Автором обґрунтовано науковий напрямок, визначена програма досліджень, проведено аналіз літературних даних, виробничі та лабораторні досліди, виконано статистичну обробку матеріалів, аналіз отриманих результатів та їх інтерпретацію, сформульовано висновки і практичні пропозиції. Імунологічні дослідження здійснено на базі лабораторії імунології при обласній педіатричній лікарні м. Луганська спільно з канд. мед. наук Т. В Ричковою. Гематологічні та біохімічні дослідження крові піддослідних тварин виконано на базі приватної ветеринарної клініки ТОВ “Мауглі” м. Луганська. Експериментальні серії інактивованих вакцин із культур умовно патогенних бактерій, що циркулюють у господарстві, виготовлено разом із співробітниками кафедри епізоотології, патанатомії та судової ветеринарії Луганського НАУ, а саме за участю завідувача кафедри, канд. вет. наук, доц. А. Ф. Руденка та асистента С. С. Кліменка.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися і схвалені на звітних сесіях вченої ради, засіданнях методичної комісії факультету ветеринарної медицини Луганського НАУ (2005–2007 рр.); міжнародній науковій конференції “Ветеринарні препарати: розробка, контроль якості та застосування” (м. Львів, 2005 р.); міжнародній науково-практичній конференції “Здобутки і перспективи розвитку ветеринарної медицини” (м. Суми, 2005 р.); міжнародній науковій конференції “Актуальные вопросы борьбы с инфекционными заболеваниями в гуманной и ветеринарной медицине” (м. Харків, 2005 р.); міжнародній науковій конференції “Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини” (м. Харків, 2006 р.).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи викладені в 13 наукових працях, 10 із них у статтях (6 одноосібних, 5 з яких – у фахових виданнях, затверджених ВАК України) і описах 3 деклараційних патентів на винахід.

Обсяг і структура дисертації. Основний зміст роботи викладений на 112 сторінках комп’ютерного друку. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів виконання роботи, результатів експериментальних досліджень, аналізу та узагальнення результатів власних досліджень, висновків, списку використаних джерел та додатків. Робота ілюстрована 18 рисунками та 35 таблицями. Список використаних літературних джерел включає 363 найменування, в тому числі 251 зарубіжних авторів.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Робота виконана у період 2004–2007 рр. на кафедрі якості і безпеки продукції АПК Луганського національного аграрного університету. Окремі етапи досліджень проведено на базі приватної ветеринарної клініки ТОВ „Мауглі” м. Луганська, імунологічної лабораторії Луганської обласної дитячої лікарні та в 14 АКФ Луганської, Донецької та Запорізької областей.

Для бактеріологічного дослідження від загиблих або вимушено забитих кроликів робили висіви з селезінки, серця, легень, печінки, лімфатичних вузлів середостіння і брижі, слизової оболонки носової порожнини на м’ясо-пептонний агар (МПА), м’ясо-пептонний бульйон (МПБ), глюкозо-сироватковий бульйон та агар Сабуро. Після інкубації в термостаті за температури 37–38? С або за кімнатних умов (агар Сабуро) протягом 24–72 годин з колоній різного типу робили пересіви на МПА, середовище Ендо, кров’яний МПА та агар Борде-Жангу в чашках Петрі. Подальшу ідентифікацію виділених мікробів здійснювали з використанням загальноприйнятих методик досліджень відповідно до „Определителя бактерий Берджи” (1997).

Ізольовані культури бактерій вивчали за тинкторіальними, культурально-морфологічними, біохімічними, патогенними властивостями, а також за чутливістю до антибактеріальних препаратів (бензилпеніцилін, оксацилін, ампіцилін натрієвої солі, цефазолін, цефтриаксон, гентаміцин, амікацин, стрептоміцин сульфату, доксициклін, левоміцетин, пефлоксацин, ципрофлоксацин та енрофлоксацин).

Для порівняння ефективності антибактеріальних засобів розраховували мінімальні інгібуючі концентрації протимікробного препарату, що поширюються на 50 % (МІС50) та 90 % (МІС90) культур пастерел, за допомогою пробіт-аналізу (Gales A. C., 2005).

Визначення серогруп Е. со1і проводили за допомогою набору аглютинуючих О-колі-сироваток. Для серологічної типізації пастерел використовували референтні штами 12, 3 та 31 P. multocida серологічних типів А, Д і В, відповідно. Капсульні антигени (КАГ) та К-антисироватки отримували за методом Iordashe A. et. al. (1980), еритроцитарний діагностикум готували за Сидоровим М. А. із співавт. (1984). Постановку реакції непрямої гемаглютинації (РНГА) здійснювали за загальноприйнятим мікрометодом (Костенко Г. С., Родионова В. Б., Скородумов Д. И., 2001). Серовар А ідентифікували також за несерологічним методом з використанням гіалуронідази золотистого стафілококу, а пастерел сероваріанту Д за допомогою розчину трипафлавіну (1:500) (Сидоров М. А. та ін., 1995).

LD50 і ImD50 визначали на білих мишах і обраховували за формулою Кербера в модифікації И. П. Ашмарина (1962).

Інгібуючу дію анілінових барвників на P. multocida вивчали за допомогою методу двократного серійного розведення (1:500–1:1240000) з використанням бромтимолового синього, метилового блакитного, фуксину основного, бриліантгрюну, кристалічного фіолетового, метилового фіолетового, метилового оранжевого, метилового червоного, сафраніну та фенолового червоного в 2,0 см3 МПБ. Інгібуючі властивості різних барвників порівнювали за розрахованими середньогеометричними титрами.

При вдосконаленні поживного середовища для накопичення пастерел ріст визначали за кількістю мікробних клітин (м. к.) на кров’яному агарі і виражали у колоніїутворюючих одиницях (КУО). У рідких середовищах інтенсивність росту визначали за найбільш вірогідним числом (НВЧ) (Герхард Ф., 1983). В якості стимуляторів росту P. multocida нами використані аутолізат дріжджів, дефібринована кров, а також розроблений нами дріжджований аутолізат крові (ДАК).

Для провокації пастерельозу у кроликів-мікробоносіїв тваринам інтраназально інстилювали по 0,2 см3 0,5 %-ного водного розчину бриліантгрюну 1 раз на добу впродовж 3 діб (Розанов Н. И.,1955) і додатково проводили імуносупресію дексаметазоном (наша модифікація), який застосовували внутрішньо-м’язово в дозі 2 мг/кг живої маси 2 рази на добу протягом трьох діб.

В АКФ у порівняльному досліді на 246 кроликах віком 2–5 місяців випробувано дві серії вакцини, виготовленої за розробленою нами технологією. Препарати вводили кроликам підшкірно дворазово з інтервалом 14 діб у дозі 1,0 см3. За вакцинованими тваринами вели спостереження протягом 68 діб. Через 28 діб у них відбирали кров для гематологічних, серологічних та імунологічних досліджень.

Загальну кількість Т-лімфоцитів визначали за методом спонтанного розеткоутворення з еритроцитами барана (Е-РУК) (Jondell M. et al., 1972; Чередеев А. И., 1976). Вивчали теофілінчутливість (ТФЧ) та резистентність Т-клітин до дії теофіліну (ТФР) (Limatibul S. et. al., 1978). При цьому кількість теофілінчутливих Т-лімфоцитів визначали за різницею між числом теофілінрезистентних Т-клітин і загальним числом Т-лімфоцитів (Е-РУК). Імунорегуляторний індекс (ІРІ) розраховували за співвідношенням ТФР/ТФЧ. Число О-клітин підраховували за різницею суми кількості Т-лімфоцитів (Е-РУК) та В-лімфоцитів (ЕАС-РУК) від загальної кількості лімфоцитів. Визначення імуноглобулінів основних класів (A, M, G) у сироватці крові проводили за методом простої радіальної імунодифузії в гелі (Manchini G. et al., 1965), а загальний рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) та їх фракційний склад за молекулярною масою (Digeon M. et. al., 1977).

Середньоарифметичну (М), середньогеометричне (Мгеом), середньоквадратичне відхилення (?), середньоквадратичну помилку (m), достовірність середньоквадратичної помилки (Pm), достовірність різниці (P), пробіт-аналіз та регресійний аналіз обчислювали на портативному комп’ютері Acer TravelMate 2413NLM за допомогою програми Statіstіca 6.0 (Реброва О. Ю., 2002; Боровиков В. П., 2003).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Роль P. multocida в етіології пневмоентеритів кроликів у господарствах південно-східної частини України. Вивчення ролі P. multocida в етіології респіраторних та шлунково-кишкових захворювань кроликів проведено в фермерських господарствах Луганської (10), Донецької (2) та Запорізької (2) областей.

Епізоотологічними обстеженнями встановлено, що в усіх фермах кролівники-аматори заради отримання максимальної економічної вигоди не завжди проводять необхідні ветеринарно-санітарні заходи щодо профілактики пневмоентеритів. Майже в усіх АКФ для утримання кроликів використовують пристосовані приміщення, в яких раніше утримували тварин інших видів. Приміщення не відповідають зоогігієнічним нормативам щодо утримання кроликів (недостатня площа на одну голову, невідповідне сумісне утримання різних статево-вікових груп, недостатня вентиляція). В усіх крільчатниках відсутні санпропускники, приміщення для карантинування та лікування хворих тварин. У деяких АКФ до крільчатників мають доступ кури, качки, кішки та сторонні особи. Більшість господарств не мають елементарного ветеринарного обслуговування: профілактичні заходи несистемні або взагалі не проводяться, не з’ясовуються причини інфекційних захворювань, застосовуються антибактеріальні засоби без визначення чутливості збудників і в занижених дозах.

Вищезазначене свідчить про те, що в господарствах відсутні умови для забезпечення розриву ланок епізоотичного ланцюга, внаслідок чого відбувається накопичення та підвищення вірулентності умовно патогенних бактерій, спроможних викликати різноманітні патології у кроликів.

При бактеріологічних дослідженнях 226 трупів кроленят було виділено 863 культури 14 видів умовно патогенних бактерій. Частіше за все ізолювали P. multocida (34,1 %), S. aureus (23,6 %), E. coli (13,8 %) та Staphylococcus epidermidis (7,5; менш розповсюдженими виявилися B. bronchiseptica (4,2 %), Streptococcus pyogenes (3,8 %), Klebsiella pneumoniae (3,8 %), Streptococcus pneumoniae (2,7 %), Staphylococcus saprophyticus (2,3 %), Pseudomonas aeruginosa (2,1 %) і зовсім рідко виділялися бактерії інших видів: Proteus vulgaris, Streptococcus faecalis, Proteus mirabilis та Micrococcus luteus (2,1 %).

В обстежених господарствах кількість патогенів коливалась від 3 до 9. Найбільш широке розповсюдження в господарствах мали P. multocida та E. (в 12-ти), S. aureus (в 11-ти), менше – P. aeruginosa, S. pyogenes (в 6-ти), K. pneumoniae, S. epidermidis, S. saprophyticus (в 5-ти), P. vulgaris, B., S. pneumoniae (в 4-ох), і рідко P. mirabilis, S. faecalis (в 2-ох) та M. luteus (в 1-ому з 14 АКФ).

При серологічній ідентифікації 119 ізолятів кишкової палички було визначено, що в кролівницьких господарствах південно-східної частини України частіше циркулюють серогрупи О111 (52,9 %), О78 (24,4 %) і О8 (16,0 %), а також О126 (6,7 %).

При визначенні кількісного складу бактеріального паразитоценозу в кроликів, хворих на респіраторні, кишкові захворювання та пневмоентерити, встановлено, що асоціації умовно патогенних бактерій складаються з 2 – 3 співчленів. В якісному відношенні було виділено 21 варіант асоціацій умовно патогенних бактерій, з яких частіше всього зустрічалися: P.+ S. (20,9 %), P. multocida + S. epidermidis (19,2 %), P. multocida + E. (11,8 %), E. coli + S. aureus (10,5 %), S. + S. (7,8 %), P.+ S. pneumoniae (6,9 %) та P. multocida + B. bronchiseptica (5,0 %); рідше – P. multocida + B. bronchiseptica + S. aureus (3,2 %), S. aureus + S. (2,3 %), P. multocida + E. coli + S. aureus (2,7 %), E. coli + S. (1,4 %), P. multocida + K. pneumoniae (1,4 %), E. coli + S. (0,9 %), S. aureus + M. luteus (0,9 %), E. coli + B. bronchiseptica (0,9 %), P. multocida + S. saprophyticus (0,9 %), P. multocida + S. (0,9 B. bronchiseptica + S. aureus (0,9 %), B. bronchiseptica + S. epidermidis (0,5 %), K. pneumoniae + S. epidermidis (0,5 %) та S. pneumoniae + S. (0,5 %).

Біологічні властивості культур P. multocida, ізольованих від хворих і загиблих кроликів. Усі ізоляти P. multocida за культуральними та морфологічними властивостями не відрізнялись між собою. При мікроскопії бактерії розташовувались ізольовано, рідше парами та короткими ланцюжками. У мазках із патологічного матеріалу та свіжовиділених агарових культур, фарбованих за Міхиним, пастерели завжди мали біполярність. При фарбуванні тушшю за методом Буррі-Гінса більшість свіжовиділених ізолятів (79,6 %) мали капсулу.

У МПБ всі культури пастерел протягом першої доби викликали рівномірне помутніння середовища та незначний слизовий осад на дні пробірки. На МПА через 18–24 годин спостерігали ріст дрібних напівпрозорих, росинчастих, злегка блакитнуватих округлих колоній, із рівними краями та гладенькою блискучою опуклою поверхнею. При боковому освітленні такі колонії мали своєрідне світіння – „флуоресценцію”. Усі культури пастерел у м’ясо-пептонному напіврідкому агарі росли чітко за уколом голки. В сироватковому та кров’яному агарі епізоотичні культури пастерел давали більш пишний та соковитий ріст, ніж на простому МПА. Ні один з отриманих ізолятів не викликав гемолізу в 5 %-му кров’яному агарі.

За характером росту на твердих поживних середовищах виявили 3 типи колоній культур P. multocida, а саме: S- 129 (43,9 %), M- 141 (47,9 %) та R-форми 24 (8,2 %). В окремих АКФ кількість пастерел S-форм коливалась від 0,0 до 10,9 %; M-форм – від 0,0 до 18,7 % та R-форм – від 0,0 до 2,0 %.

За біохімічними властивостями виділені культури пастерел також варіювали. Усі культури володіли каталазною властивістю та ферментували сорбіт, часто ферментували глюкозу (96,3 %), сахарозу (93,5 %), манозу (88,4 %), утворювали сірководень (99,7 %), індол (94,9 %) орнітиндекарбоксилазу (92,2 %); рідше розщеплювали мальтозу (54,1 %); рідко маніт (23,8 %); дуже рідко лактозу (2,4 %), дульцит (0,3 %); зовсім не утворювали лізиндекарбоксилазу, ?-галактозидазу, ацетилметилкарбінол; не утилізували цитрат та малонат натрію.

За допомогою РНГА 173 культури (58,8 %) було віднесено до серовару А, 98 (33,4 %) – до серовару D. У 23 ізолятів (7,8 %) не встановлено сероваріантної належності. У 10 господарствах (83,3 %) ізольовано культури пастерел сероварів А та D і не виявлено жодного ізоляту P. multocida серовару В. При несерологічному типуванні пастерел 173 культури (58,8 %) були позитивними в стафілококовому тесті, а 121 (41,2 %) – утворювали флокулят у трипафлавіновій пробі.

За патогенними властивостями культури пастерел суттєво відрізнялись між собою: ізоляти із внутрішніх органів хворих кроликів викликали загибель 64,1 % мишей, і навпаки культури з носової порожнини були патогенними тільки для 29,9 % мишей.

Отримані ізоляти пастерел були найбільш чутливими до цефтриаксону, амікацину, ципрофлоксацину, цефазоліну та пефлоксацину. Середню антибактеріальну активність відносно пастерел показали оксацилін, ампіцилін, левоміцетин та енрофлоксацин, найменшу – стрептоміцин, доксициклін, гентаміцин та бензилпеніцилін.

Удосконалення діагностики P.multocida-інфекції кроликів. Для виявлення джерел P.multocida-інфекції кроликів нами було поставлено завдання удосконалити методику індикації та вивчити перебіг прихованої інфекції у кроликів-пастерелоносіїв.

У досліді використано 11 кроликів-пастерелоносіїв. У 5 голів провокацію захворювання проводили за методом Н. И. Розанова (перша група), у 6 голів – за цим методом у нашій модифікації (друга група). Чотири здорових тварини було взято в якості контролю (третя група).

Установлено, що у тварин-бактеріоносіїв у порівнянні з контрольними відбуваються зміни в загально-клінічному стані, які маніфестуються помірною тахікардією, тахіпное та субфебрильним підвищенням ректальної температури тіла. У дослідній групі тварин, клінічний прояв пастерельозу в яких спровоковано за методом Н. И. Розанова, частота дихальних рухів (ЧДР), частота серцевих скорочень (ЧСС) та ректальна температура тіла до кінця терміну спостереження знизились до нормальних значень і в 3-х кроликів (60,0зникли ознаки риніту та кон’юнктивіту. Проте, необхідно відмітити, що у тварин дослідної групи, провокацію в яких здійснювали за методом Н.И. Розанова в нашій модифікації, протягом усього періоду спостереження у всіх кроликів були виражені стійкі клінічні ознаки риніту. Через 24 години після введення дексаметазону в кроликів-пастерелоносіїв відзначено незначне підвищення ЧДР, ЧСС та достовірне підвищення температури тіла. На 48 годину досліду було встановлено подальше погіршення загального стану оброблених гормоном кроликів, що проявлялось більше вираженою тахікардією, тахіпное, лихоманкою. Після закінчення досліду (через 72 годин) 2 тварини (33,3цієї групи загинули, а в кроликів, які вижили, показники ЧДР та ЧСС ще незначно збільшились, проте ректальна температура різко знизилась на 3,0 ?С.

Після закінчення досліду легені кроликів, які загинули під час проведення експерименту, а також еутаназованих під наркозом, піддали бактеріологічному дослідженню для ізоляції культур. Найбільш ефективним виявився метод виявлення кроликів-пастерелоносіїв за нашою модифікацією. Частота виділення пастерел у цих тварин у 5,0 разів перевищувала показник ізоляції аналогічних культур від кроликів, у яких інфекція була спровокована за класичним методом Н.И. Розанова.

Для прискорення постановки діагнозу проведено пошукові дослідження щодо вивчення ефективності в якості біостимуляторів дефібринованої крові великої рогатої худоби, аутолізату дріжджів, нормальної сироватки крові коней та запропонованого нами дріжджованого аутолізату крові.

Установлено, що досліджувані інгредієнти поживного середовища помітно впливають на ріст пастерел. Середнє число живих мікробних клітин P. multocida збільшується у відповідності з підвищенням концентрації стимулюючих біодобавок до МПБ. Максимальне накопичення пастерел відбувається відповідно при 15 %-ній концентрації аутолізату дріжджів, 10 %-ній дефібринованої крові, 15 %-ній сироватки крові та 15 %-ній ДАК. При подальшому збільшенні концентрації дріжджового аутолізату, дефібринованої крові та нормальної сироватки крові в МПБ кількість бактеріальних клітин, навпаки, зменшується. Використання 20 %-го ДАК у МПБ забезпечує накопичення бактеріальної маси P. multocida на тому ж рівні, що і при 15 %-ній концентрації цієї добавки.

Найбільш інтенсивно стимулювала ріст пастерел дефібринована кров. Кількість пастерел, які виросли в середовищі з цією добавкою, була в 8,4–11,6 рази більше, ніж у простому МПБ. Дещо менше поліпшували ріст мікробів сироватка крові (в 3,2–5,8 рази) і ДАК (в 3,8–5,4 рази) та найбільше слабко (в 1,3–2,2 рази) – аутолізат дріжджів.

Розраховану нами функціональну залежність числа бактеріальних клітин пастерел (y) від концентрації (x) аутолізату дріжджів (у1), дефібринованої крові (у2), сироватки крові (у3) і ДАК (у4) можна відповідно представити наступними рівняннями регресій: у1 – ,012.x2 + ,264.x ,056; у2 = – ,064.х2 + ,747.х ,483; у3 = ,016.х2 + ,575.х ,083 та у4 =  ,026.х2  + ,776.х + ,375.

На моделі 14 видів культур умовно патогенних бактерій, які були виділені при шлунково-респіраторних захворюваннях кроликів в АКФ південно-східної частини України, вивчено інгібуючі властивості анілінових барвників на ріст бактерій у МПБ.

Найбільш чутливими до випробуваних барвників виявилися стрептококи (S. pneumoniae, S. faecalis та S. pyogenes), мікрококи (M. luteus) і стафілококи (S. aureus, S. epidermidis та S. saprophyticus). Ріст цих мікроорганізмів відбувався переважно при додаванні до живильного середовища фуксину основного (1,0–5,1?10-4), бриліантгрюну (1,0–9,2?10-5), кристалвіолету (5,1?10-4–1,2Ч10-6), метилвіолету (6,4?10-4–1,2Ч10-6). P. multocida мала практично однакову чутливість до барвників з іншими грамнегативними бактеріями.

Удосконалення специфічної профілактики асоційованого перебігу пастерельозу кроликів. Для встановлення ролі P. multocida в етіології пневмоентеритів кроликів нами також було використано імунобіологічний метод. Для цього виготовили і в порівняльному експерименті випробували одну дос-лідну серію вакцини з асоціації мікробів, а другу – з P. multocida, які були виділені у хворих на пневмоентерити кроликів.

При виготовленні антигенів для експериментальних серій вакцин було відібрано 5 культур мікроорганізмів: P. multocida сероварів A та D, S. aureus, E. coli О111 та B. bronchiseptica. Усі ізоляти були типовими для відповідного виду мікроорганізмів, із S-формою росту і мали досить високу вірулентність для білих мишей. Показники LD50 відібраних для досліду культур суттєво відрізнялись між собою: найвищу вірулентність мала культура P. multocida 127 серовару А (25,3 м. к.), нижчу – ізоляти P. multocida 99 серовару D (7,3.105 м. к.), E. coli 88 серогрупи О111 (2,4.106 м. к.), B. bronchiseptica 129 (3,6.106 м. к.), штам 115 S. aureus (4,6.107 м. к.).

Суттєвим у розробці інактивованих біопрепаратів є інактивація мікроорганізмів при збереженні їх імуногенних властивостей. Метою даного етапу досліджень було вивчення впливу різних концентрацій (0,06–1,00 %) пероксиду водню (ПВ), дімеру етиленіміну (ДЕІ) та формальдегіду (ФА) на життєздатність пастерел, стафілококів, ешерихій та бордетел.

Установлено, що інактивація мікробів за допомогою ФА протікає швидше, ніж при використанні ПВ та ДЕІ. Інактивація досліджуваних мікроорганізмів відбувалась у концентрації ПВ не нижче, ніж 0,5 %, а при вмісті його в концентрації 0,06 % в жодній із проб знешкодження бактерій не було відмічено. ДЕІ інактивував культури пастерел і стафілококів за 24 години в концентрації 0,25 %. Повна стерилізація цим інактиватором ешерихій та бордетел відбувалась у концентрації 1,0 % при експозиції 12 годин. ФА викликав загибель пастерел та бордетел у концентрації 0,125 % за 24 години. Для стафілококів та ешерихій цей інактиватор виявився ефективним лише в концентрації 0,25 % і при експозиції 24 години.

Ураховуючи біологічну неоднорідність збудників пневмоентеритів кроликів, наступним етапом наших досліджень було вивчення динаміки інактивації пастерел, стафілококів, ешерихій та бордетел за допомогою 0,5 % ПВ, 1,0 % ДЕІ та 0,25 % ФА.

Установлено, що в процесі інактивації культур мікроорганізмів щогодини відбувається зменшення числа живих мікробних клітин (ж. м. к.). При застосуванні 0,5 % розчину ПВ пов-на інактивація ізолятів P. multocida, E. coli та B. здійснювалася через 6 годин, а культури S. aureus лише через 8 годин дії інактиватора. Повна інактивація культур пастерел, стафілококів 1,0розчином ДЕІ відбувалася за 8 годин, в той час як бактеріальна суспензія ешерихій та бордетел при зазначеній експозиції мала ще незначну кількість ж. м. к. При стерилізації досліджуваних культур за допомогою 0,25 %-ного розчину ФА повна інактивація культур відбувалася впродовж 6 годин. У той же час регламент стерилізації стафілококів, ешерихій та бордетел становив 8 годин.

У великих об’ємах бактеріальної суспензії, яка піддається інактивації, завжди існує ймовірність виживання деякої кількості бактеріальних клітин, виявити які загальноприйнятими методами неможливо. Виходячи з цього, пот-рібна теоретична оцінка процесу інактивації, яка б дозволила прогнозувати зниження числа життєздатних бактерій до допустимого рівня. При виробництві невеликих серій біопрепаратів часто інактивацію мікробів здійснюють у реакторах ємкістю 10 л, а рівень інактивації оцінюють за числом ж. м. к. в 1 см3. У цьому випадку рівень залишкової вірулентності матеріалу повинний бути менше 10-4 ж. м. к./см3, тобто логарифм життєздатних клітин становитиме ?–4. Отримані цифрові значення дали нам можливість за допомогою регресійного аналізу виявити залежність логарифму життєздатності досліджуваних бактерій від тривалості інактивації. Установлено, що регресійний зв'язок близький до прямолінійного і його можна виразити рівнянням прямої лінії yx =a –.x, де yx – lg ж. м. к.; x – тривалість інактивації, годин; a і b – коефіцієнти регресії (b – константа інактивації, год-1). Рівняння регресії виражають функціональний зв'язок між стерилізуючою активністю інактиваторів у вигляді динаміки НВЧ мікробів у часовій перспективі.

Необхідно відзначити, що функціональна залежність НВЧ клітин бактерій (y) від часу інактивації (x) P. multocida серовару А (у1), P. multocida серовару D (у2), S. aureus (у3), E. coli (у4) і B. bronchiseptica (у5) за допомогою 0,5 % ПВ можна відповідно представити наступними рівняннями регресій: у1 = – ,8.х ,9; у2 = – ,7.х ,2; у3 = – ,1.х ,7; у4 = – 1,7.х+8,4 та у5 = –1,6.х ,4. Кінетика інактивації пастерел, стафілококів, ешерихій та бордетел при використанні 1 %-го ДЕІ може бути описана відповідними рівняннями, а саме: у1 = – ,3.х + 8,8; у2 = – ,2.х + 8,4; у3 = – ,2.х + 8,4; у4 = – ,3.х ,9 та у5 = – ,2.х ,2. При стерилізації вказаних бактерій 0,25 %-ним ФА рівняння регресії відповідно мають вигляд: у1 = – 1,6.х + 8,0; у2 = – 1,6.х + 7,9; у3 = – 1,2.х + 7,9; у4 = – 1,2.х + 8,1 та у5 = – 1,3.х + 9,1.

Величина достовірності апроксимації (R2) кінетики інактивації досліджуваних бактерій відповідно дорівнювала 0,98; 0,92; 0,81; 0,82 та 0,86 при використанні в якості інактиванту 0,5 %-го ПВ, 0,91; 0,89; 0,88; 0,92; 0,86 при інактивації культур 1 %-ним ДЕІ і 0,81; 0,78; 0,83; 0,85 при стерилізації 0,25 %-ним ФА, що вказує на близькість значень теоретично розрахованих ліній регресій до фактичних експериментальних даних.

На підставі проведеного регресійного аналізу зроблено висновок, що безпечний поріг інактивації P. multocida серовару А, P. multocida серовару D, S., E. coli та B. bronchiseptica при застосуванні ПВ наступить відповідно через 7,7; 7,8; 10,6; 7,3 та 7,8 годин, а при використанні ДЕІ і ФА – через 9,9; 10,3; 10,3; 9,9; 10,2 та 7,5; 7,4; 9,9; 8,4; 10,3 годин.

Інактивовані антигени пастерел сероварів А і D, стафілококів, ешерихій та бордетел детально були перевірені на імуногенність (ImD50) та токсичність (LD50).

За тестом активного захисту мишей, установлено, що всі інактивовані антигени зберігали імуногенність. Проте, необхідно відмітити, що антигени з культур P. multocida серовару А, P. multocida серовару D, S. aureus, E. coli та B. bronchiseptica, які були інактивовані з використанням ДЕІ, мали найвищу імуногенну активність. Показники ImD50 відповідно становили 4,07?107; 6,17Ч107; 1,07Ч108; 6,18Ч107 та 3,56?107 м.к. Інактивовані за допомогою ПВ біопрепарати, що були виготовлені з асоціації цих мікроорганізмів, мали середню імуногенну активність, проте, вона була більш вираженою в порівнянні з аналогічними за складом антигенами, інактивованими за допомогою ФА. Так, для захисту 50 % мишей від зараження (4 LD50) вихідними культурами пастерел сероварів А і D, стафілококів та бордетел була відповідно необхідна в 6,9; 3,0; 2,3 та 1,3 рази менша доза інактивованих ПВ антигенів, ніж ФА. Що стосується імуногенності антигенів E. coli, виготовлених у різний спосіб, то треба відзначити, що інактивовані ФА антигени в 1,7, а інактивовані ДЕІ в 6,8 рази були більш активними порівняно з інактивованими ПВ.

Токсичність антигенів оцінювали за тестом летальності для мишей. Результати досліджень свідчать про істотно нижчу токсичність інактивованих ПВ антигенів у порівнянні з інактивованими за допомогою ДЕІ та ФА. Так, 50летальні дози для білих мишей антигенів, виготовлених шляхом стерилізації бактеріальної суспензії 0,5 %-ним розчином ПВ, були у 15,7 (B.), 12,1 (P. multocida серовару D), 5,2 (P. multocida серовару А), 5,2 (E. coli) та 4,2 (S. aureus) рази вищими, ніж в аналогічних біопрепаратів, виготовлених за допомогою інактивації 1,0 %-ним розчином ДЕІ. Інактивовані ПВ антигени мали у 6,9 (B. bronchiseptica), 4,0 (P. multocida серовару D), 2,4 (S. aureus), 1,7 (P. multocida серовару А) та 1,6 (E. coli) рази меншу токсичність, ніж у відповідних біологічних препаратів, виготовлених шляхом інактивації 0,25 %-ним розчином ФА.

В аматорській кролівницькій фермі в порівняльному досліді нами випробувано дві серії інактивованих вакцин: перша – протипастерельозна, виготовлена тільки з P. multocida сероварів A та D; друга – асоційована, виготовлена з мікроорганізмів (P. multocida сероварів A та D, S. aureus, E. coli, B.), що були ізольовані в цьому господарстві від кроликів 3–5-місячного віку, хворих на шлунково-респіраторні захворювання.

Для виготовлення дослідних зразків інактивованих вакцин використовували суспензії бактерій, які інактивували 0,5 %-ним розчином ПВ. Конструювання вакцин проводили з таким розрахунком, щоб в 1,0 см3 імунологічного біопрепарату містилося 5?109 м. к. Для вакцини першої серії використовували антигени пастерел сероварів А і D у співвідношенні 1:1. При виготовленні асоційованого препарату (серія 2) застосовували співвідношення бактеріальних антигенів, в якому вони ізолювались в АКФ (пастерели – 40 %, стафілококи – 30 %, ешерихії – 20 % та бордетели – 10 %). Після додавання ад’юванту, в якості якого використовували 10 %-ний аеросил (6 %) в 0,9 %-му розчині натрію хлориду, розфасовки готових вакцин, етикетування та проведення контролю на стерильність і нешкідливість для кроликів, виготовлені біопрепарати були випробувані в господарстві (табл. 1).

Установлено, що інактивована вакцина, яка була виготовлена з асоціації культур мікроорганізмів (серія 2), мала вищі превентивні властивості. Декілька нижчою захисною ефективністю володів вакцинний препарат, виготовлений тільки з культур пастерел (серія 1).

Таблиця 1

Результати клінічних випробувань виготовлених вакцин

у кролівницькому господарстві

Група тварин, щеплених вакцинами | Кількість тварин у групі | З них:

захворіло | вимушено забито | загинуло

голів | % | голів | % | голів | %

1 | 93 | 26 | 28,0 | 9 | 9,7 | 1 | 1,0

2 | 102 | 19 | 18,6 | 5 | 4,9 | 0 | 0,0

Контроль | 51 | 34 | 66,7 | 29 | 56,9 | 5 | 9,8

Вивчення біологічних властивостей інактивованих вакцин. Реактогенність виготовлених вакцин визначали через 12, 24 та 48 годин після ін’єкції. Враховували температурну реакцію, загальний стан та місцеву реакцію у піддослідних тварин.

Реакції на щеплення звичайно реєструвалися через 12 годин після ін’єкції вакцин, найбільш вираженими вони були через 24 години, а через 48 годин дещо зменшувались. Загальна реакція на вакцинацію через 12 годин після ін’єкції проявлялась незначним пригніченням, зниженням апетиту та підвищенням ректальної температури тіла. Післявакцинальні реакції у тварин, які були щеплені проти пастерельозу як моно- (23,7 %), так і асоційованою (24,5вакциною, були майже однаковими. Проте, при застосуванні першого біопрепарату тільки в одного кроленяти через 24 години була відмічена сильна загальна реакція, яка зникла через добу. Реакції місцевого характеру були найбільш вираженими через 24 години після ін’єкції як протипастерельозної, так і асоційованої вакцин у 38,7 та 40,2 % кроликів, відповідно. В однієї тварини, щепленої вакциною першої серії, була відмічена більш сильна місцева реакція, яка проявлялася збільшенням підколінного лімфовузла. Віддалених реакцій на препарати не було виявлено.

При визначенні антигенних властивостей експериментальних серій вакцин установлено, що протипастерельозна і асоційована вакцини спричиняли підвищення титрів аглютинуючих антитіл до бактерій, з яких були виготовлені біопрепарати, відповідно до 6,52±0,49 та 7,12±0,37 log2 у порівнянні з аналогіч-ними показниками тварин цієї ж групи до щеплення, які становили відповідно 3,72±0,25 та 3,32±0,0 log2, що