НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

РЗАЄВА ОЛЬГА МИКОЛАЇВНА

УДК 577.152.32:577.151.5:582

-L-РАМНОЗИДАЗА PENICILLIUM COMMUNE 266

03.00.07 — мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ — 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі біохімії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Варбанець Людмила Дмитрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України Костерін Сергій Олексійович, Інститут біохімії ім. О.В. Паладіна НАН України, завідувач відділом біохімії м’язів

доктор біологічних наук, професор Зайченко Олександр Максимович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач лабораторії вторинних метаболітів мікроміцетів

Захист відбудеться "17" жовтня 2007 р. о 1200 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680 МСП, м. Київ, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154).

Автореферат дисертації розіслано " " 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. В сучасних промислових технологічних процесах все більше значення набувають гідролітичні ферменти, які в багатьох виробництвах замінили процес кислотного гідролізу. Їх висока специфічність дозволяє одержувати готові продукти з мінімальною кількістю сторонніх речовин. Найбільш перспективними для широкого використання виявляються гідролітичні ферменти, продуцентами яких є мікроорганізми, завдяки необмеженій доступності вихідної сировини і більших можливостей, які відкриваються відбором та штучним мутагенезом для спрямованого синтезу. Унікальна специфічність дії і висока каталітична активність, а також все більш широка доступність індивідуальних ферментів спричинила їх широке використання в наукових дослідженнях в галузі молекулярної біології і генетики, а також для вирішення деяких практичних завдань медицини, харчової, мікробіологічної промисловостей, контролі оточуючого середовища.

б-L-Рамнозидаза - це фермент, який характеризується специфічністю щодо термінальних б-1,2-, б-1,4- та б-1,6-зв’язаних залишків L-рамнози, яка присутня в природних глікокон’югатах та синтетичних глікозидах. Ці властивості ферменту дозволяють використовувати його у двох основних напрямках досліджень:

1) теоретичному — для встановлення структури, а також для модифікації природних олігоцукридів, гліканів та глікокон’югатів;

2) практичному — а) для гідролізу рамнозильних залишків, наявних у флавоноїдних глікозидах, таких як нарингін, гесперидин, що поліпшує якість продуктів, які їх містять; б) для вивільнення з терпенових глікозидів (рутинозидів) ароматичних сполук, які сприяють підсиленню аромату виноградних соків, вин та отриманих з них напоїв; в) для перетворення біофлавоноїдів, таких, як рутин, кверцетрин та інші, в полімери, які можуть бути використані для попередження та лікування геморагічних діатезів, капіляротоксикозів, крововиливів, при гіпертонічній хворобі та атеросклерозі, а також при променевій хворобі; г) для отримання з біофлавоноїдів активних інгредієнтів з вираженими антибактеріальними властивостями, які можуть бути використані в косметології та фармацевтичній промисловості.

У літературі зустрічаються відомості щодо продуцентів б-L-рамнозидази бактеріального (Sphingomonas sp., Bacteroides JY-6, Pseudomonas paucimobilis, Clostridium stercorarium, Bacillus sp. Gl 1) та грибного (Penicillium, Aspergillus, Mucor, Fusarium) походження. Проте більшість з них мають ряд серйозних недоліків, які роблять продукуємий ними фермент непридатним або економічно і технологічно невигідним для використання у виробництві. На сьогодні відомо декілька комерційних препаратів б-L-рамнозидази (гесперидиназа Aspergillus niger, нарингіназа Penicillium decumbens), які випускаються в продаж фірмою “Sigma” (USA). В Україні препарати б-L-рамнозидази відсутні. Тому пошук ефективних вітчизняних продуцентів високоспецифічного та стабільного ферменту є актуальним. Найбільш технологічними джерелами одержання ферментів залишаються мікроорганізми, оскільки вони мають велику швидкість розмноження та здатні здійснювати синтез біологічно активних речовин в умовах, які можуть контролюватися людиною.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відповідності з напрямком науково-дослідних робіт Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України в рамках проведення досліджень за темою: “Дослідження молекулярних основ функціональної та біологічної активності полімерів (ліпо-, поліцукридів, ферментів) мікробної клітини (2002-2007 рр. № держ. реєстр. 0103U0005876, шифр теми за планом інституту 07.80)”.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було одержання очищеного препарату б-L-рамнозидази, вивчення його фізико-хімічних та каталітичних властивостей, субстратної специфічності для розробки основ його практичного застосування.

Відповідно до поставленої мети основними завданнями роботи було:

·

·

·

·

·

·

Об’єктом дослідження був позаклітинний фермент б-L-рамнозидаза (б-L-рамнозид-рамногідролаза – КФ 3.2.1.40) Penicillium commune Thom (syn. Penicillium palitans Westling) 266.

Предметом дослідження було вивчення умов біосинтезу ферменту, оптимізація умов культивування P. commune для отримання максимального виходу б-L-рамнозидази, розробка схем виділення і очистки ферменту, вивчення його фізико-хімічних властивостей, деяких каталітичних та кінетичних параметрів, специфічності дії.

Матеріали та методи дослідження. Завдання дослідження реалізувалися цілим комплексом засобів, які включали наступні методи: мікробіологічні (прове-дення скринінгу штамів-продуцентів б-L-рамнозидази, культивування P. commu-ne); біохімічні (визначення вмісту білка, вуглеводів, нуклеїнових кислот, компо-нентного складу); методи ензимології, препаративної біохімії, хімічної та біохі-мічної кінетики (виділення, очистка ферменту, вивчення його фізико-хімічних, кінетичних параметрів та субстратної специфічності, а також глікозидазних активностей); статистично-математичні (оптимізація живильного середовища та оцінка вірогідності отриманих результатів).

Наукова новизна отриманих результатів.

· Вперше виявлений штам P. commune, здатний синтезувати високоактивну б-L-рамнозидазу. Розроблено схему виділення з культуральної рідини та очистки ферментного препарату.

· Вперше показано, що продуцент виділяє у зовнішньоклітинне середовище дві б-L-рамнозидази 1 та 2, які відрізняються за молекулярними масами, зарядом, компонентним складом, субстратною специфічністю, але характеризуються однаковими фізико-хімічними властивостями, такими як рН- та термооптимум, рН- та термостабільність.

· Вперше встановлено, що синтетичні похідні порфіринів, комплекси бісцитратогерманієвої кислоти з аспарагіновою кислотою, треоніном та L-глутаміновою кислотою здатні активувати б-L-рамнозидазу 1 і 2 P. commune від 10 до 430

· Показано, що б-L-рамнозидази 1 і 2 P. commune є металонезалежними ферментами.

· Вперше встановлено, що каталітично активними групами ферментів P. commune, які відповідають за прояв б-L-рамнозидазної активності, є карбоксильна група С-кінцевої амінокислоти (можливо аспарагінової або глутамінової) та імідазольна група гістидину.

Практичне значення одержаних результатів. б-L-Рамнозидаза, яка вибірково відщеплює термінальні -1,2-зв’язані залишки рамнози, може бути використана як аналітичний інструмент в біохімічних і хімічних дослідженнях, зокрема при встановленні структурної організації складних глікополімерів, а також при модифікації природних олігоцукридів, гліканів та глікокон’югатів. Результати досліджень фізико-хімічних і каталітичних властивостей, субстратної специфічності ферменту можуть бути використані для практичних цілей (внаслідок гідролізу рамнозовмісних субстратів – біофлавоноїдів, терпенових глікозидів, синтетичних субстратів, можна отримати продукти реакції, які використовують в харчовій промисловості, медицині, фармакології, косметології). Встановлення зв'язку між будовою активних центрів, з одного боку, та специфічністю дії досліджуваних глікозидаз, з іншого, дозволить встановити детермінанти активності біополімерів. Все це створює передумови для створення в Україні новітніх біотехнологій.

Особистий внесок здобувача. Результати, викладені в дисертації, отримано здобувачем самостійно. Дисертантом особисто зібрана і проаналізована література з теми дисертації, розроблені методичні підходи щодо виконання поставленої мети, експериментального її обґрунтування, узагальнення одержаних результатів. Основні експериментальні дані були одержані здобувачем особисто у відділі біохімії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України: проведено скринінг продуцентів б-L-рамнозидази серед бактерій та мікроміцетів, відібрано перспективний штам P. commune для отримання ферменту, за допомогою методів математичного моделювання оптимізовано поживне середовище для культивування P. commune, вивчено вплив деяких речовин різної хімічної природи на індукцію біосинтезу та стимуляцію активності б-L-рамнозидази, розроблено схему виділення та очистки ферментних препаратів, вивчено субстратну специфічність, фізико-хімічні, кінетичні та каталітичні властивості отриманих ферментів, досліджено вплив різних іонів металів, аніонів та специфічних хімічних реагентів на активність б-L-рамнозидаз P. commune.

Координаційні сполуки германію, синтетичні похідні порфіринів, флуорену та поверхнево-активні речовини отримані від д.х.н., проф. І.Й. Сейфулліної, к.х.н. О.Е. Марцинко, к.х.н. О.Г. Песарогло (Одеський національний університет ім. І.І. Мечнікова), д.х.н., проф. Філіппової Т.О., к.б.н. Жилиної З.І., к.б.н. Ішкова Ю.В. (Одеський національний університет ім. І.І. Мечнікова); д.б.н. Карпенко О.В., к.б.н. Шульги О.М. (Львівське відділення Інституту фізичної хімії НАН України). Штами мікроорганізмів для скринінгу продуцентів б-L-рамнозидази були надані співробітниками відділів антибіотиків (к.б.н., с.н.с. Л.А. Сафроновою) і фізіології та систематики мікроміцетів (д.б.н., проф. Н.М. Ждановою, к.б.н., с.н.с. О.В. Соколовою, м.н.с. О.С. Харкевич) ІМВ НАН України.

Автор висловлює особливу подяку науковому керівнику д.б.н., проф. Л.Д. Варбанець за всебічну допомогу при інтерпретації та формулюванні основних положень і висновків, підготовці публікацій за результатами досліджень та представленні їх на наукових конференціях.

Апробація результатів дисертації. Основні результати і положення дисертації доповідались на молодіжній конференції експериментальних досліджень Інституту мікробіології і вірусології НАН України (Київ, 2005 р.) та конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників “Молодь та сучасні проблеми мікробіології і вірусології” (Київ, 2006 р.); на міжнародній науковій конференції “Мікробні біотехнології”(Одеса, 2006 р.); на III міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів “Молодь та поступ біології”(Львів, 2007 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 наукових робіт, з них 5 статтей (у фахових виданнях) та 4 тези.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 189 сторінках машинописного тексту і складається з розділів "Вступ", "Огляд літератури", "Експериментальна частина", "Аналіз і узагальнення результатів", "Висновки", "Список використаних джерел", який включає 201 найменування (56 вітчизняних та країн СНД та 145 іноземних авторів). Робота містить 46 таблиць, 39 рисунків.

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з 7-ми підрозділів, в яких висвітлені питання щодо поширення б-L-рамнозидази у природі, її біологічної ролі та особливостей біосинтезу. Охарактеризовані традиційні та сучасні підходи щодо виділення та очистки мікробних б-L-рамнозидаз, розглянуто механізм каталітичної дії глікозидаз, порівняно фізико-хімічні властивості б-L-рамнозидаз різного походження, їх субстратну специфічність. Наведені дані щодо вивчення регуляції синтезу б-L-рамнозидаз, висвітлено деякі аспекти їх практичного застосування.

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єктом досліджень був позаклітинний фермент – б-L-рамнозидаза P. commune 266. Штам був ізольований з шампіньйонних компостів.

Культивування гриба здійснювали періодичним способом в умовах качалок (n=220 об/хв) при температурі 26 1 оС на середовищі такого складуг/л): нарингін (або рамноза, якщо це оговорено) - 5; NaNO3 - 2,0; KH2PO4 - 1,0; MgSO47Н2О- 0,5; KCl - 0,5; FeSO47Н2О - 0,015; рН 5,0.

Вивчення впливу різних сполук на синтез та активність ферментів здійснювали на оптимізованому за складом та параметрами культивування середовищі, досліджувані синтезовані речовини (похідні порфірину та флуорену, координаційні сполуки германію з оксикислотами, комплекси бісцитратогерманієвої кислоти з амінокислотами, поверхнево-активні речовини) вносили у концентраціях: 0,01 та 0,1

При визначенні -L-рамнозидазної та інших глікозидазних активностей (- і -глюкозидазної, - і -галактозидазної, - і -ксилозидазної, -фукозидазної, -манозидазної, - і -N-ацетилглюкозамінідазної, - і -N-ацетилгалактозамінідаз-ної) використовували відповідні синтетичні субстрати: n-нітрофеніл--L-рамнопіранозид (“Sigma”, USA), n-нітрофеніл-- і -D-глюкопіранозид (“Sigma”, USA), n-нітрофеніл-- і -D-ксилопіранозид (“Koch-Light”, UK), n-нітрофеніл-- і -D-галактопіранозид (“Sigma”, USA), n-нітрофеніл--L-фукопіранозид (“Koch-Light”, UK), n-нітрофеніл--D-манопіранозид (“Koch-Light”, UK), n-нітрофеніл-N-ацетил-- і -D-глюкозамінід (“Koch-Light”, UK), n-нітрофеніл-N-ацетил--D-галактозамінід (“Sigma”, USA), n-нітрофеніл-N-ацетил--D-галактозамінід (“Serva”, Germany). Ступінь гідролізу нітрофенільних субстратів визначали колориметричним методом (Chaplin, 1986).

Інвертазну активність оцінювали за допомогою глюкозооксидазного методу (Білай, 1982). Визначення протеолітичної активності здійснювали за методом Ансона в модифікації Петрової (Петрова, 1966).

За одиницю активності б-L-рамнозидази та інших глікозидаз приймали таку кількість ферменту, яка каталізує гідроліз 1 мкмоля субстрату за хв в стандартних умовах досліду (температура 37 оC, рН 5,2).

За одиницю питомої активності приймали кількість одиниць активності в перерахунку на 1 мг білка.

Білок визначали за методом Lowry et al. (1951), вміст нуклеїнових кислот - за методом Спірина (1958), вміст нейтральних моноцукридів - за методом Dubois et al. (1956). Ідентифікацію нейтральних моноцукридів здійснювали методом хромато-мас-спектрометрії на приборі “Agilent” 6890N/5973 inert у вигляді ацетатів поліолів з використанням комп’ютерної бази даних ChemStation (Albersheim et al, 1976). Вміст амінокислот та гексозамінів визначали на аналізаторі амінокислот "Hitachi KLA-5" (Japan).

Для виділення та очистки б-L-рамнозидази застосовували осадження її з культуральної рідини (NH4)2SO4 від 30до 90насичення, хроматографію на DEAE-TSK 650 М гелі (Toyo Soda, Japan). Молекулярну масу в нативній системі оцінювали на Sepharose 6B (Andrews, 1964) з використанням білків-маркерів фірми "Pharmacia" (Sweden): альдолази (158 кДа), каталази (232 кДа), феритину (440 кДа) та тіроглобуліну (669 кДа).

Максимальну швидкість реакції і константу Михаеліса визначали за методом Лайнуівера-Берка (Корниш-Боуден, 1979). Для ідентифікації функціональних груп активного центру застосовували метод інгібіторного аналізу з використанням аніонів, іонів металів та специфічних хімічних реагентів.

Результати дослідів обробляли статистично з використанням t-критерію Ст’юдента.

РОЗДІЛ 3. СКРИНІНГ ПРОДУЦЕНТІВ б-L-рамнозидазИ

В результаті скринінгу, який проводили серед 692 штамів бактерій та грибів (58 родів мікроміцетів та 1 рід бактерій), встановлено, що найбільша кількість культур, які продукують б-L-рамнозидазу, є представниками мікроміцетів (27,7 % активних штамів), що належали до родів Aspergillus, Myrothecium, Penicillium, Eupenicillium, Fusarium, а також Undetermined fungus (табл.1).

З культуральної рідини 11 продуцентів шляхом фракціонування сульфатом амонію (30 та 90 % насичення) було отримано комплексні препарати -L-рамнозидази. У 7 найбільш активних штамів було вивчено pH- та термооптимуми, pH- та термостабільності, в результаті чого відібрано один, найбільш перспективний штам – P. commune 266 (раніше P. palitans), який проявив високу активність (18,94 од/мл у препараті, одержаному при 90 % насичення сульфатом амонію) та стабільність при технологічних значеннях рН і температури (5,0 і 18° С) впродовж доби.

Вивчення спектру глікозидазних активностей в препараті б-L-рамнозидази свідчить, що, крім б-L-рамнозидази, яка була домінуючою, виявлено також і ряд інших глікозидаз, але їх активність, окрім -D-глюкозидази, була незначною. Одержаний препарат не містив інвертазну та протеолітичну активності, що робить його перспективним для використання в харчовій промисловості та медицині.

РОЗДІЛ 4. ОПТИМІЗАЦІЯ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ P. commune 266 ДЛЯ СИНТЕЗУ б-L-рамнозидазИ

Відомо, що більшість продуцентів грибного походження здатні синтезувати досить величезну кількість різноманітних за своїми властивостями та специфічністю дії гідролітичних ферментів. Це дозволяє їм використовувати широке коло субстратів. Тому існує реальна можливість регуляції їх біосинтетичної активності фізіологічними факторами. З метою збільшення виходу ферменту було проведено оптимізацію поживного середовища та режиму ферментації, що є ключовими параметрами технології культивування будь-якого продуценту.

Дослідження трофічних властивостей P. commune 266 показало, що для біосинтезу б-L-рамнозидази найбільш ефективним джерелом вуглецю (в порядку зменшення) є рамноза, сорбоза, рафіноза, мальтоза. Кращим джерелом азоту виявився нітрат натрію, а також суміш сечовини з сульфатом амонію у співвідношенні 2:3.

З метою збільшення виходу ферменту було проведено оптимізацію поживного середовища та режиму ферментації за допомогою методів математичного планування експериментів: відсіювального експерименту, дробового факторного експерименту, методу стрімкого сходження та повного факторного експерименту. В якості базового використовували частково адаптоване середовище з рамнозою та NaNO3, як джерелами вуглецю та азоту відповідно.

Встановлено, що для оптимального біосинтезу б-L-рамнозидази P. commune необхідно: 1) вирощувати в середовищі наступного складу (г/л): рамноза – 10, NaNO3 – 5, KH2PO4 – 1, KCl – 1,5, MgSO4Ч7Н2О – 2,5, FeSO4Ч7Н2О – 0,002, рН 5,0; 2) культивувати в колбах при швидкості обертання качалки 160 об/хв, температурі 26 оC; 3) вносити посівний матеріал в кількості 5% до об’єму культурального середовища, Кs – 16,76 мг О2/лгод. Тривалість культивування – 4 доби.

При культивуванні P. commune 266 в таких умовах активність -L-рамнозидази було підвищено майже в 3 рази.

Таблиця 1

Скринінг продуцентів -L-рамнозидази

Рід | Загальна кількість досліджуваних штамів | Кількість активних штамів | Активність, од/мл

МІКРОМІЦЕТИ Всього : 58 родів, 543 штами

Alternaria Nees: Fr. | 11 | 2 | 0,01 - 0,07

Aspergillus Micheli: Fr. | 117 | 41

(11) | 0,01 - 0,335

0,1 - 0,335

Aureobasidium Viala et Boyer | 1 | 1 | 0,03

Emericella Berk. et Br. | 7 | 2 | 0,16

Eurotium Link: Fr. | 4 | 2 | 0,05 - 0,16

Eupenicillium Ludwig | 6 | 5 (3) | 0,19 - 0,3

Fusarium Link: Fr. | 110 | 54

(9) | 0,01- 0,07

0,11-0,17

Gliocladium Corda | 6 | 5 | 0,015 - 0,065

Humicola Traaen | 2 | 2 (1) | 0,01 - 0,15

Mortierella Coem. | 7 | 4 (1) | 0,01 - 0,16

Myrothecium Tode: Fr. | 6 | 2 | 0,16-0,18

Nigrospora Zimm. | 1 | 1 | 0,145

Penicillium Link: Fr. | 105 | 45 (16) | 0,005 - 0,09

0,1 - 0,24

Phoma Sacc. | 14 | 5 (1) | 0,005-0,03

0,13

Sordaria Ces. et de Not. | 1 | 1 | 0,16

Trichoderma Pers. | 10 | 6 (1) | 0,01 – 0,03

0,17

Trichothecium Link | 2 | 2 (1) | 0,02 - 0,13

Undetermined fungus | 22 | 14 (7) | 0,01 - 0,075

0,09 - 0,29

БАКТЕРІЇ: Всього : 1рід , 149 штамів

Bacillus | 149 | 8 (2) | 0,02- 0,065

0,2 - 0,28

Примітки: * в таблиці представлені лише найбільш чисельні за дослідженими штамами роди;

жирним шрифтом - активність штамів вище 0,09 од/мл

РОЗДІЛ 5. Вплив деяких речовин на біосинтез б-L-рамнозидази P. 266

Як відомо, на утворення і секрецію екзогідролаз впливає значна кількість різних факторів, які зокрема включають склад живильного середовища, умови росту мікроорганізмів. Суттєвим фактором, який впливає на біосинтез і секрецію ферментів, є також додавання у середовище різних речовин: як безпосередніх субстратів, так і взагалі нефізіологічних. Наші дослідження дозволили виявити ряд речовин, здатних активувати біосинтез ферменту, який ми оцінювали за зміною питомої активності.

Встановлено, що ряд синтетичних похідних порфірину були здатні стимулювати активність -L-рамнозидази. Так, германієвий комплекс мезо-тетра(4-N-метилпіридил)порфірин тозилату, олов’яний комплекс мезо-тетра(N-метил-6-хінолініл)хлорин тозилату та марганцевий комплекс мезо-тетра(N-метил-6-хінолініл)порфірин тозилату збільшували активність на 42 - 65%. В залежності від концентрації похідне флуорену – 2,7-біс-[2-(диетиламіно)-етокси]-флуорен-9-он дигідрохлорид або підвищувало (на 28%) або інгібувало (на 40%) активність ферменту (рис. 1). Вплив інших сполук був або в межах контролю, або в незначній мірі збільшував активність. І тільки цинковий комплекс мезо-тетрафенілпорфірину, у концентрації 0,1% повністю пригнічував біосинтез -L-рамнозидази культурою.

Рис. 1. Вплив деяких речовин на біосинтез б L-рамнозидази P. commune 266

Комплекси бісцитратогерманієвої кислоти з різними амінокислотами збільшували активність б-L-рамнозидази. Максимальні значення були отримані при додаванні в середовище комплексів бісцитратогерманієвої кислоти з аспарагіновою кислотою, треоніном та L-глутаміновою кислотою в обох концентраціях. Питома активність ферменту збільшувалась в 3-4 рази. Виключення складав комплекс бісцитратогерманієвої кислоти з фенілаланіном (HPhe)2 [Ge(H4Citr)2], який при концентрації 0,1% інгібував активність ферменту на 14

Координаційні сполуки германію з оксикислотами, навпаки, в обох концентраціях інгібували біосинтез -L-рамнозидази культурою.

Інгібуючий вплив майже до 50на біосинтез ферменту проявили також поверхнево-активні речовини: трегалозо-, рамно- і пептидоліпіди, які були ізольовані з Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas species P S-17, Bacillus sp. C14, відповідно.

Нами не встановлено залежності між наявністю певної хімічної групи або певного металу і здатністю сполук підвищувати біосинтез. Але дослідження такого широкого спектру різних речовин дало можливість встановити, що комплекси бісцитратогерманієвої кислоти з аспарагіновою кислотою здатні в 3-4 рази стимулювати активність ферменту при їх додаванні в живильне середовище.

РОЗДІЛ 6. ВИДІЛЕННЯ ТА ОЧИСТКА б-L-рамнозидази

P. commune 266

Для визначення найбільш оптимального методу виділення б-L-рамнозидази з культуральної рідини P. commune було проведено порівняльне вивчення трьох методів: 1) осадження етанолом, 2) фракціонування сульфатом амонію (від 30 до 90насичення), 3) осадження сульфатом амонію при 90% насичення з попереднім ацидуванням та обробкою культуральної рідини MnCl2. Препарат ферменту, одержаний за методом 1, майже на порядок був нижчим за рівнем питомої активності, ніж препарати, отримані методами 2 і 3. Препарат, одержаний за методом 3, характеризувався найбільш низьким вмістом нуклеїнових кислот та вуглеводів (табл. 2), але поступався за рівнем питомої активності препарату, отриманому за методом . Тому в подальшому для виділення ферменту з культуральної рідини P. 266 застосовували фракціонування сульфатом амонію від 30 до 90% насичення.

Таблиця 2

Методи виділення -L-рамнозидази P. commune 266

Метод виділення | Склад препарату в % до сухої маси | Питома активність, од/мг білка

білок | нуклеїнові кислоти | вуглеводи

Культуральна рідина | 35 | 14 | 20 | 0,76

1. Осадження етанолом | 29 | 10 | 8,9 | 0,79

2. Осадження (NH4)2SO4 від 30 до 90% насичення | 23 | 15 | 17 | 4,75

3. Осадження (NH4)2SO4 при 90% насичення з попереднім ацидуванням та обробкою MnCl2 культуральної рідини | 27 | 11 | 17 | 3,8

При діалізі одержаних препаратів не було відмічено зниження активності ферменту, тому у подальших дослідженнях використовували віддіалізований препарат, який зберігали в 3,2 М розчині сульфату амонію. При таких умовах зберігання препарати -L-рамнозидази не втрачали своєї активності впродовж двох років.

Подальшу очистку ферменту здійснювали іонообмінною хроматографією на DEAE-TSK 650 M гелі із застосуванням градієнта NaCl (0-1,0 M) (рис. 2). Було отримано дві фракції (препарат 1 і препарат 2), в яких виявлена активність -L-рамнозидази. В препараті 1 була визначена також активність -D-глюкозидази (рис. 2).

Рис.2. Профіль елюції комплексного ферментного препарату P. commune 266 на DEAE- TSK 650 М гелі з застосуванням градієнта NaCl (0 – 1,0 М)

1 – перша фракція з -L-рамнозидазною активністю;

2 – друга фракція з -L-рамнозидазною активністю.

Схема : етапи очистки -L-рамнозидази P. commune 266

Внаслідок іонообмінної хроматографії майже в 34 рази було підвищено активність препарату 1 з виходом в 11 % ферменту з питомою активністю 157 од/мг білка та в 10 разів препарату 2 -L-рамнозидази з виходом 4,5ферменту та питомою активністю 51 од/мг білка P. сommune 266 (схема).

Таким чином, фракціонуванням сульфатом амонію та іонообмінною хроматографією вдалось в 207 та 67 разів, відповідно, підвищити в порівнянні з культуральною рідиною активність -L-рамнозидази 1 і 2 P. commune 266.

Ці значення знаходяться майже на рівні відомих продуцентів промислових препаратів б-L-рамнозидази, але дещо поступаються за рівнем питомої активності б-L-рамнозидазі, що випускається фірмою "Sigma", проте остання містить -D-глюкозидазну активність, від якої нам вдалося позбавитись в препараті 2.

РОЗДІЛ 7. Стимуляція активності б-L-рамнозидази P. 266

Для підвищення активності виділених ферментів було вивчено вплив тих же речовин, які використовували для підвищення їх біосинтезу. Найбільший стимулюючий ефект проявляли мезо-тетра(N-метил-6-хінолініл)порфірин тозилату, марганцевий комплекс мезо-тетра(N-метил-6-хінолініл)порфірин ацетату, олов’яний комплекс мезо-тетра(N-метил-6-хінолініл)хлорин тозилату, які підвищували активність обох препаратів б-L-рамнозидази на 4,5-45,6Марганцевий комплекс мезо-тетра(N-метил-6-хінолініл)порфірин тозилату при концентрації 0,1% стимулював активність препарату 1 на 31препарату 2 - на 16Похідне флуорену при концентрації 0,1повністю інгібувало активність обох препаратів, в той час як при 0,01підвищувало активність препарату б-L-рамнозидази 2 на 22

Вивчення впливу координаційних сполук германію з оксикислотами дає підставу вважати їх інгібіторами активності б-L-рамнозидази 1.

Комплекси бісцитратогерманієвої кислоти з амінокислотами лише до 44% підвищували активність б-L-рамнозидаз, а деякі навіть інгібували.

Поверхнево-активні речовини інгібували активність обох препаратів б-L-рамнозидази і тільки рамноліпід в концентрації 0,01% в незначній мірі (на 7,5підвищував активність препарату 1.

Таким чином нами вперше вивчено дію деяких синтетичних похідних порфірину, флуорену, координаційних сполук германію і поверхнево-активних речовин на біосинтез і активність б-L-рамнозидази і встановлено, що для підвищення рівня питомої активності у культуральній рідині більш ефективними є комплекси бісцитратогерманієвої кислоти з аспарагіновою, L-глутаміновою кислотами та треоніном (180-430а як стимулятори активності - похідні порфіринів і флуорену, а також комплекс бісцитратогерманієвої кислоти з метіоніном (до 45,6

РОЗДІЛ 8. ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ P. commune 266

Дослідження властивостей ферментів проводили на препаратах, отриманих після іонообмінної хроматографії на DEAE-TSK 650 M гелі.

Вивчення амінокислотного складу свідчить, що препарати 1 та 2 -L-рамнозидази містять у своєму складі 25 та 36неполярних гідрофобних амінокислот, 29 та 24основних позитивно заряджених амінокислот, 10 та 13кислих амінокислот, відповідно (табл. ). За кількісним і якісним амінокислотним складом досліджувані ферментні препарати відрізнялись між собою. Так, в препараті 1 відсутній пролін, а в препараті 2 – метіонін. Обидва ферментні препарати не містили триптофану, проте характеризувалися значним вмістом тирозину та гістидину (більше 10 %).

Вміст вуглеводів складав до 2 % від сухої маси речовини. В препараті б-L-рамнозидази 1 були ідентифіковані як нейтральні моноцукриди: галактоза, маноза та рамноза, так і заряджені — глюкозамін, в той час як в препараті 2, на відміну від препарату 1, відсутня маноза та глюкозамін.

Таблиця 3

Компонентний склад препаратів -L-рамнозидази P.  commune 266 |

% від загальної суми площ піків

-L-рамнозидаза 1 | -L-рамнозидаза 2

Амінокислотний склад

Аспарагінова кислота | 6,1 | 4,5

Треонін | 4,1 | 3,6

Серін | 11,0 | 5,9

Глутамінова кислота | 4,1 | 9,3

Пролін | 17,4

Гліцин | 6,7 | 3,1

Аланін | 5,1 | 3,2

Цистеїн | 2,1 | 1,9

Валін | 5,1 | 4,2

Метіонін | 1,3

Ізолейцин | 3,9 | 3,0

Лейцин | 5,0 | 3,4

Тирозин | 11,1 | 11,5

Фенілаланін | 5,3 | 5,7

Гістидин | 16,9 | 15,5

Лізин | 9,1 | 3,4

Аргінін | 3,1 | 4,4

Моноцукридний склад

Галактоза | 14,1 | 75,9

Маноза | 6,7

Рамноза | 1,9 | 24,1

Глюкозамін | 77,3

Примітка. “” – не виявлено.

За даними гель-фільтрації на сефарозі 6В -L-рамнозидази 1 та 2 відрізнялись молекулярними масами: 120 та 105 кДа, відповідно (табл. ).

Вивчення фізико-хімічних властивостей показало, що оптимальними умовами для гідролізу п-нітрофеніл--L-рамнопіранозиду (п-НФР) препаратами -L-рамнозидази 1 і 2 є значення рН 4,0-4,2, температури 60 оС. Ферментні препарати стабільні в діапазоні рН від 3,0 до 6,0 протягом доби, а при температурі 37 оС впродовж 2 год. Тобто, незважаючи на відмінність за молекулярною масою та компонентним складом, препарати -L-рамнозидази 1 та 2 виявили подібні фізико-хімічні властивості (табл. ).

Таблиця 4

Фізико-хімічні властивості препаратів -L-рамнозидази P.  commune 266

Властивість | Препарат 1 | Препарат 2

Молекулярна маса, кДа | 120 | 105

рН-Оптимум гідролізу синтетичного субстрату

(п-НФР) | 4,0 | 4,2

рН-Стабільність | 3,0-6,0 | 3,0-6,0

Термооптимум гідролізу синтетичного субстрату

(п-НФР), °С | 60 | 60

За даними кінетичних аналізів отримані ферментні препарати виявляли більшу спорідненість до природних субстратів, в яких L-рамноза з’єднана з агліконом за допомогою -1,2-зв’язку, про що свідчать значення Km та Vmax (табл. ).

Дослідження субстратної специфічності ферментних препаратів показало, що препарат -L-рамнозидази 1 був здатним відщеплювати -D-глюкозу, -D-ксилозу, -D-манозу, -D-галактозу, -ацетил---глюкозамінід від відповідних п-нітрофенільних субстратів, тобто проявляє досить широку субстратну специфічність, в той час як -L-рамнозидаза 2 може гідролізувати тільки -L-рамнозиди, тобто препарат 2 характеризується вузькою субстратною специфічністю щодо природних субстратів. Цей факт представляє безсумнівний інтерес, оскільки чим більш високу специфічність виявляє фермент, тим більшу цінність він представляє як тонкий та надзвичайно точний інструмент біохімічних досліджень.

Таблиця 5

Субстратна специфічність препаратів -L-рамнозидази P.  commune 266

Субстрат | -L-рамнозидаза 1 | -L-рамнозидаза 2

Питома активність (од/мг білка) | Km, мМ | Vmax, (мкмоль/хв/мг білка) | Питома активність (од/мг білка) | Km, мМ | Vmax, (мкмоль/хв/мг білка)

п-нітрофеніл--L-рамнопіранозид | 157,3 | 2,97 | 33,9 | 50,9 | 2,81 | 11

п-нітрофеніл---галактозид | 4,4 | 0

п-нітрофеніл--ацетил---глюкозамінід | 5,8 | 0

п-нітрофеніл---глюкозид | 48,3 | 0

п-нітрофеніл---ксилозид | 39,1 | 0

п-нітрофеніл---манозид | 23,3 | 0

нарингін | 164,1 | 1,7 | 15,0 | 55,9 | 1,32 | 17,8

неогесперидин | 128,3 | 1,6 | 16,3 | 37,5 | 1,95 | 30,7

Примітка. “” – дослідження не проводили.

РОЗДІЛ 9. ДОСЛІДЖЕННЯ ФУНКЦІОНАЛЬНИХ ГРУП В АКТИВНОМУ ЦЕНТРІ б-L-рамнозидази P.  commune 266

Для управління ферментативним процесом та зміщення реакції в напрямку збільшення виходу цільового продукту необхідно встановити механізм каталітичної дії б-L-рамнозидази. Важливим підходом до цього є ідентифікація функціональних груп активного центру ферменту, які безпосередньо приймають участь в каталізі.

Аналіз кінетичних кривих залежності швидкості б-L-рамнозидазної реакції від величини рН дозволив встановити наявність двох груп, що іонізуються в активному центрі б-L-рамнозидази 1 та 2 з відповідними значеннями рКв1 та рКа1 – 2,8 та 5,7; та рКв2 та рКа2 — 3,2 та 5,8, відповідно, які, згідно Діксону та Уеббу, відповідають карбоксильній групі С-кінцевої амінокислоти та імідазольній групі гістидину.

Наявність імідазольної групи гістидину також була підтверджена дослідами з фотоокислення в присутності метиленового синього. Нами спостерігалася фотоінактивація, яка зростала в часі та при збільшенні концентрації Н+-іонів у середовищі, що є характерним саме для цієї групи.

Для ідентифікації інших функціональних груп в активному центрі був застосований інгібіторний аналіз ферментативної реакції з використанням іонів металів та специфічних хімічних реагентів.

Показано, що задіяні катіони виявляли різноманітний вплив на активність б-L-рамнозидаз, причому їх дія на б-L-рамнозидазу 1 та 2 дещо відрізнялася. Так показано, що активність -L-рамнозидази 1 не залежала від присутності більшості з досліджених металів. Більш суттєвий вплив виявили катіони: Cu2+, Mn2+, Ag+, Hg2+, які зменшували активність ферменту на 45-55 %. Інгібіторну дію на -L-рамнозидазу 2 виявили також іони Ba2+ та Mn2+ (повне інгібування) та Ag+, Pb2+ (45в той час як - Ca2+ на 14% активував.

Встановлено, що ЕДТА, азид натрію, п-хлормеркурібензоат (п-ХМБ) та о-фенантролін зменшували активність обох препаратів на 10-40проте однозначно стверджувати про те, що в каталізі, який здійснюється обома б-L-рамнозидазами, приймають участь функціональні групи, що містять атоми металу не можна, оскільки не спостерігалось повного інгібування, або значної зростання активності препаратів ферментів. Відчутне пригнічення б-L-рамнозидазної активності іонами Ag+, Hg2 для обох препаратів та Ba2+ та Mn2+ для препарату 2, може бути наслідком їх взаємодії, в першу чергу, із сульфгідрильними, карбоксильними або імідазольними групами ферменту (табл. 6).

Таблиця 6

Вплив хімічних реагентів та іонів металів на активність -L-рамнозидаз P. commune 266 (M m, n=5)

Концентрація реагента, 10-3 М | Залишкова активність, %

-L-рамнозидаза 1 | -L-рамнозидаза 2

Контроль | 100,0 | 100,0

ЕДТА | 68,0 4,2 | 55,0 4,0

п-хлормеркурібензоат | 60,4 2,5 | 64,0 2,0

о-фенантролін | 68,0 3,0 | 75,0 2,3

дитіотреїтол | 100 5,0 | 83,3 3,4

L-цистеїн | 93,0 5,3 | 93,3 2,8

-меркаптоетанол | 95,5 5,0 | 98,0 1,5

азид натрію | 65,6 3,3 | 90,0 3,8

арсеніт натрію | 91,3 4,5 | 46,8 2,0

Fe3+ | 102,7 0,5 | 102,7 5,1

Cu2+ | 55,8 3,5 | 89,5 3,6

Са2+ | 71,2 5,3 | 114,0 1,8

Pb2+ | 70,6 2,6 | 56,1 5,5

Ag+ | 38,6 1,5 | 56,0 2,8

Hg+2 | 39,6 2,2 | 84,2 0,9

Ba2+ | 72,1 3,0 | 0

Ba2+* | 8,3 2,1*

Mn2+ | 55,7 5,3 | 0

Mn2+* | 25,0 1,5*

Примітки: час експозиції 90 хв;

“*” - концентрація катіонів у реакційній суміші 10-4 М;

“” – дослідження не проводились.

Зменшення активності -L-рамнозидази 2 на 53,2при дії арсеніту натрія може бути обумовлено наявністю близько розташованих SH-груп, в результаті чого утворюються дитіоарсеніти.

Такий сильний тіоловий інгібітор як п-ХМБ, значно інгібував активність обох ферментів. При дослідженні факту зняття гальмування, яке було спричинене п-хлормеркурібензоатом, як реактиватори -L-рамнозидази використовували L-цистеїн, дитіотреїтол, -меркаптоетанол в концентраціях 10-3, 210-3, 410-3 М. Всі ці речовини, у зазначених концентраціях були здатними відновлювати активність ферментних препаратів -L-рамнозидази P. commune. Це свідчить про те, що в молекулі ферменту, можливо на деякій відстані від активного центра, присутні SH-групи, які є необхідними для підтримки каталітично активної конформації молекули.

ВИСНОВКИ

Робота містить наукові положення і результати, які вказують на те, що P. commune продукує дві високоефективні -L-рамнозидази – 1 і 2. Висока ферментативна активність, особливості фізико-хімічних властивостей, широка субстратна специфічність -L-рамнозидази 1 і вузька - -L-рамнозидази 2 є основою їх застосування при проведенні структурних аналізів, отриманні речовин, які придатні для використання в медицині, фармакології, косметології та харчовій промисловості, що відкриває нові, перспективні напрями в мікробній біотехнології України.

Основні наукові та практичні результати роботи викладено у наступних висновках:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Рзаєва О.М., Борзова Н.В., Варбанець Л.Д., Соколова О.В., Харкевич О.С., Жданова Н.М., Сафронова Л.А. Скринінг мікроорганізмів – продуцентів б-L-рамнозидази // Мікробіол. журн. – 2005.– Т. 67, №5. – С.19-27. (Здобувачем особисто був проведений скринінг продуцентів б-L-рамнозидази серед 543 штамів мікроміцетів, та 149 штамів бактеріальних культур. Досліджено фізико-хімічні властивості та спектр глікозидазних активностей у 7 найбільш активних штамів. Відібрано штам Penicillium соmmune (syn. P.) 266 як продуцент б-L-рамнозидази).

2. Рзаєва О.М., Варбанець Л.Д. б-L-рамнозидаза мікроорганізмів // Мікробіол. журн. – 2006.– Т. 68, №1. – С.69-84. (Здобувачем особисто висвітлені питання щодо поширення б-L-рамнозидази у природі, її біологічної ролі та особливостей біосинтезу. Охарактеризовані традиційні та сучасні підходи щодо виділення та очистки мікробних б-L-рамнозидаз, розглянуто механізм каталітичної дії глікозидаз, порівняно фізико-хімічні властивості б-L-рамнозидаз різного походження, їх субстратну специфічність. Наведені дані щодо вивчення регуляції синтезу б-L-рамнозидаз, висвітлено деякі аспекти їх практичного застосування).

3. Рзаєва О.М., Варбанець Л.Д. Оптимізація умов культивування Penicillium palitans штаму 266, що синтезує б-L-рамнозидазу // Мікробіол. журн. – 2006.– Т. 68, №6. – С.10-20. (Здобувачем особисто вивчено трофічні властивості продуцента P. соmmune (раніше P. palitans), за допомогою методів математичного планування експериментів здійснено оптимізацію поживного середовища та режиму ферментації).

4. Варбанец Л.Д., Рзаева О.Н., Мишак Е.В., Сейфуллина И.И., Марцинко Е.Э., Песарогло А.Г. Влияние координационных соединений германия на активность ряда гликозидаз // Мікробіол. журн. – 2007.– Т. 69, №3. – С.11-19. (Здобувачем особисто досліджено вплив координаційних сполук германію з оксикислотами на біосинтез та активність б-L-рамнозидази).

5. Варбанець Л.Д., Рзаєва О.М., Сейфулліна І.Й., Марцинко О.Е., Пєсарогло А.Г., Філіппова Т.О., Жилина З.І., Ішков Ю.В., Карпенко О.В., Шульга О.М. Індукція синтезу та активація б-L-рамнозидази // Укр. біохім. журн. – 2007. – Т. , № 4. – С. . (Здобувачем особисто досліджено вплив комплексів бісцитратогерманієвої кислоти з амінокислотами, синтетичних похідних порфіринів та флуорену, а також поверхнево-активних речовин на біосинтез та активність препаратів б-L-рамнозидази, розроблено схему виділення та очистки ферментів).

6. Рзаєва О.М. Позаклітинна б-L-рамнозидаза мікроміцетів // Материалы ІX Українського біохімічного з’їзду (Харків, 24-27 жовтня 2006 р.). Стенд. доп.: Харків, - 2006. – С. 62.

7. Рзаєва О.М., Мишак К.В., Варбанець Л.Д., Сейфуллина І.Й., Марцинко О.Є. Вплив координаційних сполук германію на активність б-L-рамнозидази Penicillium