8. Рзаєва О.М. Виділення та очистка позаклітинної б-L-рамнозидази // Матеріали ІІІ Міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів “Молодь та поступ біології” (Львів, 23-27 квітня, 2007). – С.363.

9. Rzaeva O.N. Penicillium commune б-L-rhamnosidases // Modern problems of microbiology and biotechnology (Odessa, 28-31, May 2007). – Odessa, 2007. - P. .

АНОТАЦІЯ

Рзаєва О.М. б-L-Рамнозидаза Penicillium commune 266. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології і вірусології ім.Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2007.

Дисертація присвячена одержанню та дослідженню гідролітичного ферменту б-L-рамнозидази грибного походження. Штам-продуцент P.  commune 266 було відібрано в результаті поетапного скринінгу серед 692 культур грибів та бактерій. Було вивчено трофічні потреби продуценту та оптимізовано умови культивування позаклітинної б-L-рамнозидази. Розроблено схему очистки та отримано два ферментні препарати з б-L-рамнозидазною активністю 157 та 51 од/мг білка, відповідно. Встановлено, що деякі похідні порфіринів і комплекси бісцитратогерманієвої кислоти з амінокислотами можуть бути використані як індуктори біосинтезу (180-430 %), а також стимулятори активності (до 45,6 %) -L-рамнозидази P. commune 266. Досліджено фізико-хімічні та каталітичні властивості ферментів, специфічність дії. Встановлено, що препарати характеризуються високим вмістом гідрофобних (25 та 36 %) та основних амінокислот (29 та 24%), відповідно для препаратів 1 і 2, а також присутністю в їх вуглеводному компоненті у препараті 1 - галактози, манози, рамнози та глюкозаміну, та галактози і рамнози – у препараті 2. Ферментний препарат 2 проявляє вузьку специфічність щодо глікону, а препарат 1 – широку. б-L-Рамнозидази 1 та 2 P. commune 266 інгібуються значними концентраціями синтетичного субстрату та продуктом реакції L-рамнозою. Молекули ферментів не містять атомів металу. Показано, що в активному центрі б-L-рамнозидази 1 та 2 присутні карбоксильна група С-кінцевої амінокислоти та імідазольна група гістидину. Сульфгідрильні групи не беруть участі у каталізі, але можливо відіграють важливу роль у підтриманні активної конформації білкової молекули.

Ключові слова: б-L-рамнозидаза, Penicillium commune, очистка, фізико-хімічні властивості, каталітична активність, специфічність дії.

АННОТАЦИЯ

Рзаева О.Н. б-L-Рамнозидаза Penicillium commune 266. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2007.

Диссертация посвящена получению и исследованию гидролитического фермента -L-рамнозидазы грибного происхождения. Штамм-продуцент P. commune 266 был получен в результате поэтапного скрининга, проведенного среди 692 культур грибов и бактерий. Выделенный продуцент P.  commune 266 характеризовался наиболее высоким уровнем активности -L-рамнозидазы в культуральной жидкости, а также отсутствием протеолитической, инвертазной активностей. Для увеличения выхода фермента были исследованы трофические свойства продуцента, а также оптимизированы условия его культивирования при помощи математических методов планирования экспериментов. Разработана схема очистки, включающая фракционирование сульфатом аммония, ионообменную хроматографию на DEAE-TSK 650 M геле. В результате было получено два препарата с -L-рамнозидазной активностью 157 и 51 ед/мг белка, соответственно. Установлено, что некоторые синтетические производные порфиринов и флуорена, а также комплексы бисцитратогерманиевой кислоты с аминокислотами могут быть использованы в качестве индукторов биосинтеза (180-430), а также стимуляторов активности (до 45,6-L-рамнозидаз 1 и 2 P. commune 266. По данным гель-фильтрации на сефарозе 6В молекулярная масса ферментов составляла 120 и 105 кДа, соответственно для препаратов 1 и 2. Установлено, что молекулы ферментов характеризуются высоким содержанием гидрофобных (25 и 36и основных (29 и 24аминокислот. В препаратах также отмечено присутствие углеводного компонента (около 2 %), который в препарате 1 представлен незаряженными (галактоза, манноза, рамноза) и заряженными (глюкозамин) моносахаридами, а в препарате 2 – только незаряженными моносахаридами (галактоза, рамноза). Термо- и рН-оптимумы гидролиза ферментами п-нитрофенильного субстрата составляют 60о С и 4,0-4,2, соответственно. Препараты стабильны в диапазоне температур 0о-20о С, рН - 3,0-6,0, устойчивы при хранении. Ферментный препарат 2 проявляет узкую специфичность по отношению к терминальной -1,2-связанной L-рамнозе в природных субстратах (нарингин, неогесперидин). Препарат 1 обладает более широкой субстратной специфичностью и способен отщеплять -D-глюкозу, -D-ксилозу, -D-маннозу, -D-галактозу, -ацетил---глюкозаминид от соответствующих п-нитрофенильных производных. б-L-Рамнозидазы P. commune 266 1 и 2 ингибируются значительными концентрациями синтетического субстрата п-нитрофенилрамнопиранозида и продуктом реакции L-рамнозой. Молекулы ферментов не содержат атомов металлов. На основании анализа кинетических кривых зависимости скорости б-L-рамнозидазной реакции от величины рН, а также результатов экспериментов по фотоокислению можно предположить, что в активном центре б-L-рамнозидазы присутствуют карбоксильная группа С-концевой аминокислоты и имидазольная группа гистидина. Вблизи активного центра присутствуют сульфгидрильные группы, которые, хотя и не участвуют в катализе, однако играют важную роль в поддержании активной конформации молекул ферментов, способствуя проявлению -L-рамнозидазной активности.

Ключевые слова: -L-рамнозидаза, Penicillium commune, очистка, физико-химические свойства, каталитическая активность, специфичность действия.

ABSTRACT

Rzaeva O.N. -L-Rhamnosidase of Penicillium commune 266. – Manuscript.

The thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.07 – microbiology.- Institute of microbiology and virology named D.K. Zabolotny of National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 2007.

The thesis is focused on the production and investigation of the hydrolytic enzyme with -L-rhamnosidase activity of fungal origin. The screening among 692 cultures of fungi and bacteria permit to select strain P.  commune 266 producer of -L-rhamnosidase. Trophic characteristics and cultivation conditions of extracellular -L-rhamnosidase have been investigated. The scheme of enzyme purification have been developed. Two preparations with -L-rhamnosidase activity were isolated from culture liquid and purified about 207 and 67-times, activity of enzyme preparations 1 and 2 were 157 and 51 U/mg protein, respectively. The molecular weights of the enzymes 1 and 2 estimated by gel filtration, were 125 kDa and 105 kDa, respectively. It has been established that a number of porfirin derivatives and complexes of biscitratgermanium acid with aminoacids induce of biosynthesis (180-430and stimulate of activity (up to 45.6of P.  commune 266 -L-rhamnosidase. The physico-chemical, catalytic properties and specify of action of enzymes has been studied. Enzyme preparations included high contents of basic and hydrophobic aminoacids and carbohydrate component, represented by mannose, galactose, rhamnose, glucosamine (preparation 1) and galactose, rhamnose (preparation 2). Enzyme 2 was found to exhibit strict specificity towards the glycon at the same time enzyme 1 exerted wide specificity. -L-Rhamnosidase activity of P.  commune 266 was inhibited by high concentrations of synthetic substrate and reaction product – L-rhamnose. There are absent groups containing the atoms of metals in the enzymes molecules. -L-Rhamnosidase 1 and 2 active centers appears to contain the carboxyl group of C-terminal aminoacid and imidazole histidine group. Sulfhydrylic groups are not involved in the catalysis. However, it's possible they may play essential role in supporting the active conformation of the protein molecule.

Key words: -L-rhamnosidase, Penicillium commune, purification, physical and chemical properties, catalytic activity, specify action.