Київський університет імені Тараса Шевченка

МАТИШЕВСЬКА ОЛЬГА ПАВЛІВНА

УДК: 577.125: 591: 144: 612.014

ЗАКОНОМІРНОСТІ РОЗВИТКУ ІНТЕРФАЗНОЇ ЗАГИБЕЛІ ЛІМФОЦИТІВ СЕЛЕЗІНКИ ЩУРІВ ЗА УЧАСТІ Са2+ - ЗАЛЕЖНИХ ФОСФОЛІПІДНИХ СИГНАЛЬНИХ СИСТЕМ ПІСЛЯ РАДІАЦІЙНОГО УРАЖЕННЯ

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеню

доктора біологічних наук

Київ - 1999

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біохімії Київського університету імені Тараса Шевченка

Науковий консультант: член-кор. НАН України, професор

Кучеренко Микола Євдокимови, Київський

університет імені Тараса Шевченка, завідувач

кафедри біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Костерін Сергій Олексійович, Інститут

біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України

завідувач відділу біохімії мязів

доктор біологічних наук

Дмитренко Микола Петрович, Інститут

екогігієни і токсиколоагії ім.Л.І.Медведя

МОЗ України, завідувач лабораторії біохімії

доктор біологічних наук

Дружин Микола Олександрович, Інститут

експериментальної патології, онкології і радіобіології

ім.Р.Є.Кавецького НАН України, провідний

науковий співробітник

Провідна установа: Національни медичний університет імені

О.О.Богомольця, м.Київ

Захист відбудеться 25 листопада 1999 р. о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 у Київському університеті ім.Т.Шевченка за адресою: просп.акадюГлушкова 2, біологічний факультет, ауд.215.

Поштова адреса: 01033, Київ - 33, вул.Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського університету імені Тараса Шевченка за адресою: вул.Володимирська, 58.

Автореферат розіслани 25 жовтня 1999 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Брайон О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. Протягом останніх років особливої актуальності набули дослідження біохімічних механізмів формування клітинної відповіді на дію генотоксичних факторів різної природи, у тому числі такого, як іонізуюча радіація. Одним з варіантів клітинної відповіді багатоклітинних систем, направленої на підтримання клітинного гомеостазу та на запобігання переродження клітин внаслідок дії пошкоджуючого фактора є апоптоз, або програмована загибель клітин у інтерфазі (Kerr J.,1980.; Wyllie А.,1987).

Значного успіху у з’ясуванні біохімічних закономірностей розвитку апоптозу було досягнуто завдяки дослідженню радіаційної загибелі лімфоїдних клітин. Лімфоцити - єдині з клітин імунної системи, які гинуть пропорційно до дози ( у діапазоні до 3 Гр ) до вступу у мітоз протягом першої доби після дії радіації. Експериментальне моделювання відповіді лімфоцитів in vitro на дію іонізуючої радіації за умови опромінення клітинної суспензії тимоцитів та ліній лімфоїдних клітин дозволило встановити причинний зв’язок між такою морфологічною ознакою загибелі клітин, як пікноз ядер та міжнуклеосомною деградацією хроматину (Cohen J., 1992; Zhivotovsky B. et al., 1981), виявити залежність загибелі клітин від експресії генів ( Hallahan D., 1992; Wilson L. et al.,1993) та довести, що радіаційна загибель лімфоцитів у інтерфазі є різновидністю апоптозу. Було висунуто гіпотезу, згідно якої безпосередньою мішенню дії радіації є ДНК, а вирішальну роль у ініціації апоптозу відіграє ушкодження генетичного матеріалу, внаслідок чого деблокується генетично детермінована програма загибелі (Duke R. et al., 1983; Wyllie A., 1985). З іншого боку, дослідження широкого спектру індукторів апоптозу виявили залежність інтерфазної загибелі клітин від внутрішньоклітинного балансу іонів кальція ( Nicotera P.et al, 1994, Габай В. и др., 1990) та від систем клітинної сигналізації, які здатні посилювати отриманий сигнал та передавати його транскрипційним факторам – регуляторам експресії генів, що дозволяє визначати апоптоз як загибель від слабких сигнальних взаємодій (Uckun F. et al., 1993; Ейдус Л.,1997; Корыстов В. и др., 1998).

Серед систем, які забезпечують рецепцію сигналу на рівні плазматичної мембрани лімфоцитів та його передачу у внутрішньоклітинний простір, слід насамперед виділити такі Са2+- залежні фосфоліпідні трансдукційні системи, як поліфосфоінозитидна та цикл арахідонової кислоти. Ключові ферменти цих систем - сигнальні фосфоліпази С та А2 використовують мембранні фосфоліпіди як джерело для синтезу універсальних внутрішньоклітинних посередників – інозитол-1,4,5-трифосфату, диацилгліцеролу, арахідонової кислоти та її метаболітів. Внутрішньоклітинні шляхи передачі сигналу за участі цих посередників, що активуються у лімфоцитах у випадку індукованої радіацією інтерфазної загибелі, значною мірою співпадають з тими, які контролюють активацію та диференціацію лімфоцитів у нормі. В обох випадках мають місце підвищення концентрації йонів кальцію у цитоплазмі, посилення гідролізу поліфосфоінозитидів, інтенсифікація обміну арахідонової кислоти, експресія генів с-fos та c-jun та інш.(Будницкая Е., 1986; Uckun F. et al.,1992; Шапошникова В. и др.,1998). Залишається відкритим питання про те, яким чином активація у лімфоцитах однакових регуляторних механізмів може приводити до протилежних наслідків. Важливого значення для вирішення цієї проблеми набуває пошук можливих шляхів перехрещення різних сигнальних шляхів та активації механізмів, що є специфічними тригерами апоптозу, таких, як активація сфінгомієлінази, активація цистеїнових протеїназ сімейства ІСЕ та інш. (Kolesnick R. & Kronke M, 1994; Kidd V., 1998).

Недостатньо досліджені особливості інтерфазної загибелі лімфоцитів за опромінення цілого організму, хоча саме цей тип загибелі визначає такий специфічний прояв променевої хвороби ссавців, як лімфопенія (Ярилин А., 1988; Howie S. et al., 1994). Вважається встановленим, що пригнічення імунної відповіді організму після дії радіації зумовлене вибірковою інтерфазною загибеллю лімфоцитів внаслідок порушенням регуляторної взаємодії між різними субпопуляціями лімфоцитів у органах лімфопоезу – кістковому мозку, тимусі та селезінці (Горизонтов П. и др.,1983; Meyn R.et al., 1993). Тому важливу роль у механізмах генотоксичної дії радіації надають паракринним месенджерам –лейкотрієнам, цитокінінам, факторам росту, які регулюють тривалу у часі міжклітинну взаємодію лімфоцитів різних субпопуляцій та зумовлюють уповільнену кінетику індукції генів - регуляторів апоптозу ( Эйдус Л.1996; Wilson R. et al., 1993; Wu X.et al., 1995).

У зв’язку з цим особливої актуальності набуває дослідження участі різних вторинних посередників та взаємодії сигнальних систем за розвитку індукованої в умовах in vivo радіаційної інтерфазної загибелі клітин у популяції лімфоцитів такого важливого лімфоїдного органу, як селезінка.

Мета та задачі дослідження. Метою роботи було з’ясувати роль компонентів Са2+ – залежних фосфоліпідних трансдукційних систем у ініціації та проведенні індукованого іонізуючою радіацією апоптогенного сигналу у лімфоцитах селезінки щурів.

Були поставлені такі задачі:

- на основі кількісного аналізу та порівняння морфологічних і біохімічних показників стану клітин у популяції лімфоцитів селезінки контрольних та опромінених рентгенівськими променями щурів визначити дозу іонізуючої радіації та термін після впливу, за яких ініціюється інтерфазна загибель лімфоцитів;

- визначити концентрацію вільного цитозольного Са2+ у лімфоцитах селезінки та проникність плазматичної мембрани для Са2+ за розвитку інтерфазної загибелі клітин;

-

-

-

- дослідити активність фосфоліпази А2 та вивільнення арахідонової кислоти з мембранних фосфоліпідів у лімфоцитах селезінки у контролі та після обробки клітин кальцієвим іонофором;

-

-

- дослідити зв’язок між ферментативним переокисленням ліпідів по ліпоксигеназному шляху та деградацією ДНК за розвитку інтерфазної загибелі лімфоцитів селезінки з використанням специфічного інгібітора ліпоксигенази ;

-

Наукова новизна і практичне значення роботи. У результаті проведених досліджень вперше з’ясована роль Са2+- залежних фосфоліпідних трансдукційних систем у розвитку інтерфазної загибелі лімфоцитів селезінки за радіаційного ураження організму. Проведений порівняльний аналіз параметрів функціонування поліфосфоінозитидної системи та метаболізму арахідонової кислоти та динаміки розвитку in vivo морфологічних та біохімічних ознак розвитку інтерфазної загибелі лімфоцитів селезінки опромінених тварин.

Вперше виявлено раннє зростання концентрації вільного цитозольного Са2+ у лімфоцитах селезінки опромінених тварин за розвитку інтерфазної загибелі. Показано, що підвищення концентрації цитозольного Са2+ у клітинах передує міжнуклеосомній фрагментації хроматину, а подовжене утримання підвищеного рівня [Ca2+]i внаслідок зростання кальцієвої проникності плазматичної мембрани прискорює фрагментацію ДНК.

Показано, що на початковій стадії розвитку інтерфазної загибелі лімфоцитів селезінки опромінених тварин відбувається активація фосфоліпази С та модифікація взаємодії компонентів у системі поверхневий рецептор-мембранозв’язані регуляторні білки – фосфоліпаза С. Вперше встановлено, що на ранньому етапі розвитку інтерфазної загибелі у лімфоцитах селезінки посилюється синтез основного Са2+-мобілізуючого посередника - інозитол-1,4,5-трифосфату.

Досліджені властивості фосфоліпази А2 лімфоцитів селезінки, що гідролізує арахідоноїлвмісні фосфоліпіди та ідентифіковані ендогенні субстрати ферменту. Показано, що у процесі індукованої радіацією інтерфазної загибелі лімфоцитів селезінки відбувається вивільнення арахідонової кислоти зі складу мембранних фосфоліпідів та одночасне підвищення у мембранній фракції клітин активності фосфоліпази А2, що гідролізує фосфатидилхолін та фосфатидилетаноламін.

Встановлено, що лімфоцити селезінки проявляють ліпоксигеназну активність та ідентифіковано ендогенні продукти ліпоксигеназного перетворення арахідонової кислоти. Знайдено, що у процесі розвитку радіаційної загибелі лімфоцитів селезінки у інтерфазі відбувається інтенсифікація ферментативного переокислення субстратів ліпоксигеназою та підвищення вмісту 15-гідроксиейкозатетраєнової кислоти та лейкотрієну В4. Доведено, що специфічне пригнічення ліпоксигеназного шляху переокислення арахідонової кислоти призводить до значного зниження міжнуклеосомної фрагментації ДНК у лімфоцитах селезінки опромінених тварин.

На основі отриманих даних та даних літератури розроблена схема шляхів передачі та посилення індукованого радіацією апоптогенного сигналу у лімфоцитах селезінки за участі іонів кальцію, окремих компонентів Са2+- залежних фосфоліпідних трансдукційних систем та факторів, що є специфічними тригерами апоптозу.

Результати проведених досліджень мають загальнотеоретичне значення для адекватної біохімічної оцінки плейотропних ефектів екстремальних нефізіологічних та цитотоксичних факторів. Дослідження шляхів передачі сигналу до розвитку інтерфазної загибелі лімфоцитів є необхідним етапом для встановлення конкретних біохімічних механізмів реалізації апоптозу клітин різних типів. Ідентифікація окремих сигнальних шляхів апоптозу має важливе практичне значення, оскільки забезпечує можливість розробки підходів до контролю над цим процесом, зокрема, до направленого пошуку препаратів, здатних ініціювати інтерфазну загибель перероджених злоякісних клітин або ж попереджати загибель нормальних клітин у випадку променевої терапії або дії інших нефізіологічних факторів.

Особистий внесок автора. Дисертантом особисто здійснений інформаційний пошук та оцінка літературних даних, розроблена схема та обгрунтована методологія постановки експериментів, виконані експериментальні дослідження, проведений аналіз отриманих результатів, підготовлені друковані праці. Результати деяких підрозділів отримані безпосередньо автором та за участі аспірантів кафедри біохімії (Сировець Т.О. - підрозділ 3.2.1., Слатвінської О.В.- підрозділ 3.3.3, Пастуха В.М.- підрозділ 3.3.4., Солодушко В.О – підрозділ 3.1.1). Отримані результати викладені у спільних публікаціях. Електронно-мікроскопічний аналіз препаратів лімфоцитів селезінки здійснений у співробітництві зі с.н.с. Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна Чернишовим В.І.

Зв’язок з науковою тематикою організації. Робота відповідає плану науково-дослідної роботи кафедри біохімії біологічного факультету Київського університету імені Тараса Шевченка та виконана у рамках теми N 97083 " Біохімічні механізми розвитку променевого ураження після дії іонізуючої радіації " комплексної наукової програми "Здоров’я людини", а також тем 5.3/ 34 та 5.4/483 Міністерства України у справах науки і технології.

Апробація роботи. Матеріали дисертації були представлені на VI (Київ, 1992) та VII (Київ, 1997) Українських біохімічних з’їздах, II ( Київ, 1993) та III (Москва, 1997) Радіобіологічних з’їздах, міжнарожній науковій конференції " Навколишнє середовище і здоров’я " ( Чернівці, 1993), I Українському з’їзді біофізичного товариства ( Київ, 1994), I міжнародній практичній конференції " Sustainable Development: Environmental Pollution and Ecological Safety"( Дніпропетровськ, 1995), Х Міжнародному конгресі з радіаційних досліджень ( Вюрцбург, Німеччина, 1995), конференції " Віддалені наслідки опромінення в імунній системі та гемопоетичній системах" ( Київ, 1996), конференції " Проблемы противолучевой защиты" ( Москва, 1998).

Публікації. Результати досліджень представлені у 20 статтях та 13 тезах, які опубліковані у профільних вітчизняних та зарубіжних журналах, збірниках наукових праць та матеріалах з’їздів та конференцій.

Структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на …сторінках машинописного тексту і складається із вступу, основної частини, що містить огляд літератури ( 4 розділи) та експериментальну частину (3 розділи), заключної частини (1 розділ), висновків та цитованої літератури ( …. джерел). Робота містить ….рисунків , …. таблиць та 1 схему.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури докладно розглянуті питання біохімічної регуляції протікання процесів активації, диференціації та апоптичної загибелі лімфоїдних клітин. Проведений детальний аналіз сучасних уявлень про молекулярні механізми та функціональне значення таких регуляторних систем, як Са2+-мобілізуюча поліфосфоінозитидна та цикл арахідонової кислоти. Висвітлено біохімічні аспекти розвитку інтерфазної загибелі клітин, викликаної іонізуючою радіацією.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

У роботі були використані такі реагенти та матеріали: Ficoll-Paque ( Pharmacia, Швеція), нордигідрогуайаретикова кислота (Serva, Німеччина), квіна-2 ацетоксиметиловий ефір(Amersham, Велика Британія), НЕРЕS, іонофор А23187, фітогемаглютинін та ліпополісахарид E. coli, луброл РХ, лінолева кислота, тритон Х-100 (Ferak, Німеччина), 14С-арахідонова кислота, 14С-2- арахідоноїлфосфоліпіди, 14С-2- лінолеїлфосфатидилетаноламін, фосфатидил-2-3Н-інозитол, 3Н-2-міоінозитол, (Amersham, Англія), набори для визначення вмісту 15-НЕТЕ ( Advanced Magnetic Inc, CША), лейкотрієну В4, простагландинів F2 та E2 ( Amersham, Англія); пластини для тонкошарової хроматографії, сілікагель RH 40/5, фільтри "Синпор" N6 (Хемапол, Чехія), колонки Particil 10 SAX для аніонообмінної хроматографії інозитолфосфатів (Whatman, Англія); фосфатидилсерин, фосфатидилхолін, фосфатидилетаноламін, фосфатидилінозит, фосфатидилгліцерол (завод бактеріальних препаратів, Харків); 45СаCl2 , 32Р-Н3РО4 – підприємство "Ізотоп", Київ.

Досліди проводили на щурах лінії Вістар обох статей масою 130 –150 г. Тварин піддавали тотальному одноразовому опроміненню на рентгенівській установці РУМ-17 за таких експозиційних доз – 1,29 10-2 Кл/кг ( поглинута доза – 0,5 Гр) та 2,58 10-2 Кл/кг ( поглинута доза – 1 Гр). Умови опромінення: потужність дози– 0, 2 Гр/хв, фільтри 0,5 мм ( Cu + Al), напруга 180 кВ, сила струму 5 мА, фокусна відстань – 50 см.

Лімфоцити отримували методом градієнтного центрифугування суспензії клітин селезінки у розчині Ficoll-Paque або фікол-верографіну ( = 1,077) (Boyum A., 1968). Після руйнування клітин у гіпоосмотичному буфері та центрифугування отримували фракції без’ядерного гомогенату ( супернатант 1000g, 5 хв), цитозольну та мембранну ( 100000g, 60 хв).

Концентрацію вільного Са2+ у клітинах визначали з застосуванням флуоресцентного зонду квін-2 (Tsien R.et al.,1982). Флуоресценцію суспензії клітин вимірювали на спектрофлюориметрі Shimadzu RF-510 ( Японія), збудження - 339 нм, емісії – 490 нм.

Вміст малонового диальдегіду визначали за реакцією з тіобарбітуровою кислотою ( Стальная И. и Гаришвили Т., 1977). Антиокислювальну активність визначали за константою пригнічення реакції окислення 2,4- дихлорфеноліндофенолу біологічним матеріалом (Семенов В.,1985).

Оцінку фрагментації ДНК проводили після лізису клітин розчином з 2 мМ ЕДТА та 0,5 % тритоном Х-100. Проби центрифугували ( 15000 g, 20 хв) для розділення інтактного хроматину (осад) від відщеплених фрагментів ДНК (супернатант). Вміст ДНК у зразках визначали із застосуванням дифеніламінового реактиву ( Burton K.,1956).

ДНК екстрагували сумішшю хлороформ : ізоаміловий спирт (24:1) після депротеїнізації проб (Skalka M. et al., 1976). Електрофорез ДНК проводили у 1% агарозному гелі за напруги поля 2 мВ/сек протягом 15 год (200 С). У якості маркерних використовували фрагменти ДНК фага ., утворені рестриктазою Pst I. Гелі фарбували розчином броміду етидію (1 мкг/мл) і після збудження флуоресценції ультрафіолетом фотографували на плівку Мікрат-300. Негативи денситометрували на мікроденситометрі MD-100 ( Німеччина).

Вхід кальцію у лімфоцити визначали за інкубування суспензії лімфоцитів у стандартному сольовому середовищі, що містило 1 мкКі 45СаCl2. Реакцію зупиняли швидкою фільтрацією проб через фільтри Синпор N 6.

Оцінку утворення інозитолфосфатів проводили з використанням клітин, інкубуваних протягом 1 год у середовищі 199, що містило 5 мкКі /мл 3H-2-міо-інозитолу. У середовище інкубації попередньо мічених клітин додавали 0,1% БСА та 10 мМ LiCl для пригнічення активності фосфомоноестераз. Реакцію зупиняли додаванням суміші хлороформ:метанол (1:2). Водну фазу використовували для розділу інозитолфосфатів на колонках Partisil 10 SAX. Елюцію інозитол-1-фосфату, інозитол-1,4-дифосфату та інозитол-1,4,5-трифосфату проводили послідовно, використовуючи по 2 мл 0,2М, 0,4М та 0,8М КН2 РО4 (рН 3,35) відповідно (Sugiya Н. et al., 1987).

Активність фосфоліпази С визначали у середовищі, що містило 0,02 мкКі фосфатидил-2- 3H- інозитолу ( 19,9 Кі/ммоль) (Carter Н. et al., 1987). Реакцію зупиняли додаванням суміші хлороформ : метанол : HCl ( 100 : 200 : 0,3 ), 0,6 мл хлороформу та 0,6 мл води. Кількість відщепленого інозитолу визначали за радіоактивністю верхньої фази.

Для включення арахідонової кислоти лімфоцити інкубували у середовищі 199, що містило 0,5 мкКі 14С- арахідонової кислоти ( 56 мКі/ммоль) протягом 1 год при 370С. Ліпіди екстрагували сумішшю хлороформ : метанол : НCl (1 : 2 : 0,06). Тонкошарову хроматографію ліпідів проводили на пластинах “Хемапол” у системі хлороформ : метанол : аміак ( 68 : 28 : 4) ( Hirata F. et al.,1978). Розподіл 14С- арахідонату поміж фосфоліпідів оцінювали за радіоактивністю плям.

Для оцінки вивільнення арахідонової кислоти попередньо мічені за 14С - арахідонатом лімфоцити інкубували у стандартному сольовому розчині, що містив деліпідизований 0,2 % БСА для зв’язування вивільненої жирної кислоти. Реакцію зупиняли, додаючи холодний розчин 10 мМ КН2РО4 (рН 7,4). Після центрифугування проб ( 1000g, 5 хв) визначали радіактивність надосадової рідини.

Активність фосфоліпази А2 визначали у середовищі, що містило 0,05 мкКі 1-стеароїл-2-14С-арахідоноїл-ФХ або 1-ацил-2-14С-арахідоноїл – ФЕ (56 мКі/ммоль) (Katsumata M. et al.,1986). Реакцію зупиняли, додаючи 5% розчин тритону - Х-100 та 40 мМ ЕДТА. Арахідонову кислоту екстрагували, додаючи 150 мг сульфату натрію та 2,5 мл гексану. Рівень вивільненого арахідонату розраховували за радіоактивністю аліквоти гексану після розділення фаз.

Активність ліпоксигенази визначали спектрофотометричним способом з використанням лінолевої кислоти (Бутович И. и Кухарь В.,1989). Реакцію проводили у термостатованих кюветах спектрофотометра Specord M-40 при 35 0С, реєструючи приріст оптичного поглинання при 234нм, зв’язаного з утворенням гідропероксидних похідних лінолевої кислоти.

Визначення вмісту метаболітів арахідонової кислоти у клітинах проводили радіоімунним методом після екстрагування ейкозаноїдів холодним етилацетатом з використанням наборів для визначення лейкотрієну В4 (Аmersham, Англія) та 15 -НЕТЕ (Advanced Magnetic Inc, США) згідно рекомендацій фірми – виробника.

Статистичну обробку даних проводили загальноприйнятими методами варіаційної статистики (Плохинский М.,1981) Розрахунки та побудова графіків проводились на IBM PC-486 з використанням прикладних програм.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ

Морфологічна та біохімічна оцінка стану лімфоцитів селезінки після рентгенівського опромінення тварин. Першочерговим пунктом дослідження формування in vivo відповіді лімфоцитів селезінки на дію іонізуючої радіації було отримання популяції радіочутливих клітин селезінки та морфологічна оцінка їх стану у динаміці після рентгенівського опромінення тварин. Згідно даних електронно-мікроскопічного аналізу, отримуваний препарат лімфоцитів селезінки представлений малими та середніми лімфоцитами з рівномірним розміщенням еухроматинових та гетерохроматинових зон у ядрі. Це клітини, що перебувають у стадіях G0 та G1 клітинного циклу і характеризуються нестабільністю геному та значною чутливістю до дії радіації.

Для з’ясування залежності ураження лімфоцитів селезінки щурів від дози радіації тварин піддавали тотальному рентгенівському опроміненню у дозах 0,5 та 1 Гр та визначали вміст клітин у препараті лімфоцитів селезінки у термін до 6 діб. Звязок, який спостерігається між дозою опромінення тварин, кількістю загиблих клітин та початком їх регенерації у селезінці дозволив використати величину загальної кількості лімфоцитів у одиниці обєму тканини як кількісний критерій оцінки їх променевого ураження. Після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр кількість лімфоцитів у досліджуваній популяції не змінювалась протягом 2 год, знижувалась через 1 добу на 27,8%, а через 3 доби повністю відновлювалась. Після опромінення тварин у дозі 1 Гр зниження кількості лімфоцитів селезінки спостерігалось у більш ранній термін і було більш значним – на 31,9 % через 12 год і на 53,2 % через 1 добу, часткове відновлення мало місце через 6 діб. Отже, тотальне рентгенівське опромінення тварин у дозах 0,5 та 1 Гр призводить до різного за швидкістю та величиною зниження кількості малих та середніх лімфоцитів селезінки протягом першої доби. Процес спустошення популяції лімфоцитів після дії радіації визначається двома показниками: інтерфазною загибеллю клітин у ранній період після дії чинника та подальшою реалізацією ураження у ході репродуктивної загибелі клітин ( Белоусова О. и др., 1979; Ярилин А. и др., 1982). Для визначення характеру радіаційної загибелі клітин досліджували морфологічні та біохімічні показники стану лімфоцитів у термін, який передує максимальному зниженню їх кількості у популяції.

У препаратах лімфоцитів, отриманих через 3 год після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр, морфологічних відмінностей порівняно з контролем не виявлено. Через 12 год у популяції лімфоцитів виявляються окремі клітини з нерівномірним розміщенням хроматину та зоною перинуклеарного просвітлення, що розцінюють як ознаку активації лімфоцитів та проходження S – G2 фаз клітинного циклу ( Петров Р. и др., 1983).

Більш значні морфологічні зміни виявляються у препаратах лімфоцитів селезінки тварин, опромінених у дозі 1 Гр – через 3 год у популяції лімфоцитів присутні клітини з осмофільними скупченнями гранулярного гетерохроматину, зосередженими біля одного з полюсів ядерної мембрани, а також клітини з ядром зменшених розмірів, заповненим конденсованим гетерохроматином. Такі морфологічні зміни відповідають раннім ознакам розвитку інтерфазної загибелі клітин, коли має місце утворення крупних (50 – 300 тисяч пар основ) фрагментів ДНК (Sun X. & Cohen G., 1994). Через 12 год після опромінення тварин у дозі 1 Гр у популяції лімфоцитів селезінки, окрім клітин з пікнотичним ядром, виявлено вакуолізовані клітини та оточені мембраною фрагменти, що містять хроматин та інтактні органели. Такі ознаки є показником пізньої стадії апоптозу та розвитку некротичних процесів у клітинах (Columbano A., 1995; Kroemer G. et al., 1998).

Для біохімічної оцінки структурного стану хроматину у лімфоцитах досліджували вміст продуктів деградації хроматину – низькомолекулярних фрагментів ДНК полідезиксирибонуклеотидів (ПДН), які екстрагуються з ядер у розчин з низькою іонною силою (рис.1). У лімфоцитах селезінки опромінених тварин виявлено підвищення частки деградованої ДНК, яке залежить від дози радіації. Після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр підвищення вмісту ПДН у клітинах виявляється через 12 год і є незначним – до 16% від загального вмісту ДНК.

Після дії радіації у дозі 1 Гр підвищення вмісту ПДН у клітинах виявляється через 6 год, через 12 год воно становить 31 % від загального вмісту ДНК. Як показало електрофоретичне розділення ДНК у агарозному гелі, фрагменти ДНК лімфоцитів селезінки опромінених тварин розподілялись у вигляді смуг, інтенсивність яких була значно більшою у випадку розділення ДНК лімфоцитів тварин, опромінених у дозі 1 Гр (рис. 2). Згідно маркерного аналізу, довжина фрагментів у смугах складала 400, 600 та 800 пар нуклеотидів, тобто була кратною довжині ДНК нуклеосом. Отже, у лімфоцитах селезінки тварин, опромінених у дозі 1 Гр, відбувається значне впорядковане міжнуклеосомне розщеплення хроматину за участі ферментів, які атакують лінкерні ділянки ДНК. Одним з таких ферментів є Mg2+, Ca2+ - залежна ендонуклеаза, що конститутивно експресується у лімфоцитах та активується за розвитку інтерфазної загибелі клітин (Zhivotovsky B. et al., 1993; Никонова Л. и др., 1998).

Порушення у системі підтримання стабільності хроматину значною мірою визначається зміною таких параметрів метаболічного стану клітини, як окисно-антиоксидантна рівновага та кальцієвий гомеостаз. Як показало дослідження антиоксидантної активності та вмісту малонового диальдегіду, упродовж 6 год після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр процеси вільнорадикального окислення у лімфоцитах селезінки утримуються на мінімальному стаціонарному рівні. Після дії радіації у дозі 1 Гр спостерігається підвищення вмісту МДА порівняно з контролем у термін 3 - 6 год та зниження антиоксидантної активності через 12 год. Отже, опромінення тварин у дозі 1 Гр призводить до раннього зсуву окисно-антиоксидантної рівноваги у лімфоцитах у бік надмірної інтенсифікації реакцій вільнорадикального переокислення. На нашу думку, активація процесів перекисного окислення мембранних ліпідів, яка значною мірою позначається на структурному стані мембран, може призводити також до порушення компартменталізації такого важливого вторинного месенджера, як кальцій.

Згідно результатів, отриманих нами у експериментах з використанням флюоресцентного зонду квін-2, опромінення тварин у дозах 0,5 та 1 Гр призводить до порушення кальцієвого гомеостазу у лімфоцитах селезінки (табл.1). Концентрація вільного цитозольного Ca2+ у лімфоцитах контрольних тварин становила 117 10 нМ. Після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр значення [Са2+]i у лімфоцитах не змінюється протягом 3-6 год і зростає через 12 год. Після опромінення тварин у дозі 1 Гр концентрація катіону у цитозолі клітин зростає через 3 год і утримується на підвищеному рівні упродовж 12 год.

Таблиця 1

Концентрація вільного цитозольного Са2+ ( нМ) у лімфоцитах селезінки після опромінення тварин (n = 6-8)

Доза опромінення | 3 год | 6 год | 12 год

0,5 Гр | 112 18 | 110 15 | 238 31 *

1 Гр | 167 21 * | 245 32 * | 195 25 *

* р 0,05 порівняно з контролем

Критеріями порушення кальцієвого гомеостазу у клітинах є не лише підвищення концентрації Са2+ у цитоплазмі, але й зміна мембранної проникності для катіону. Для оцінки кальцієвої проникності плазматичної мембрани лімфоцитів досліджували вхід Са2+ у клітини (рис.3) та розраховували кінетичні параметри процесу – початкову швидкість надходження (Vо) та максимальний вхід (Рmax) катіона. Аналіз кінетичних параметрів дозволив проаналізувати можливі причини виявленого нами підвищення концентрації йонів вільного цитозольного кальція у лімфоцитах опромінених тварин.

Через 3-6 год після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр кінетичні параметри входу Са2+ у лімфоцити не змінюються. Посилення входу катіону внаслідок зростання початкової швидкості його надходження у клітини виявляється через 12 год ( рис. 3А). Отже, підвищення рівня [Ca2+]i у лімфоцитах після дії радіації у дозі 0,5 Гр співпадає з підвищенням кальцієвої проникності плазматичної мембрани клітин і зумовлене посиленням входу катіону із позаклітинного середовища.

Через 3 год після опромінення тварин у дозі 1 Гр кінетичні параметри входу Са2+ у лімфоцити також не змінюються ( рис. 3Б). Це означає, що підвищення рівня [Ca2+]i на ранньому етапі ініціації інтерфазної загибелі клітин відбувається внаслідок виходу катіону з внутрішньоклітинних депо. Через 6 год відмічено двократне підвищення початкової швидкості надходження Са2+ у лімфоцити, а через 12 год має місце зростання не лише Vо, але й інтесивності потоку кальцію через плазматичну мембрану, про що свідчить підвищення величини Рmax. Таким чином, раннє підвищення рівня вільного Са2+ у цитозолі лімфоцитів та подовжене його утримання після опромінення тварин у дозі 1 Гр є показником надлишкового накопичення Са2+ у лімфоцитах внаслідок незбалансованості процесів буферування катіона у внутрішньоклітинних депо та його входу через плазматичну мембрану.

Виявлене нами підвищення кальцієвої проникності плазматичної мембрани лімфоцитів у термін 3-6 год після опромінення тварин у дозі 1 Гр дозволило дослідити вплив Са2+ на процес міжнуклеосомної деградації хроматину у клітинах. Для цього вивчали динаміку накопичення фрагментів ДНК (ПДН) у контрольних лімфоцитах та лімфоцитах, виділених через 3 год після дії радіації протягом 90-хвилинної інкубації клітин у середовищі без додавання кальцію та у середовищі, що містило 2 мМ СаCl2 (рис.4).

Інкубація клітин, виділених з контрольних тварин, супроводжується незначним, незалежним від наявності кальцію у середовищі інкубації, зростанням вмісту ПДН. На початковому етапі інкубації лімфоцитів селезінки опромінених тварин у середовищі без додавання кальцію має місце підвищення швидкості фрагментації ДНК порівняно з контролем, однак, на більш пізніх етапах інкубації швидкість накопичення ПДН у клітинах знижується. Додавання кальцію у середовище інкубації призводить до значного зростання швидкості розщеплення ДНК та до підвищення вмісту ПДН, накопичених протягом 90 хв. Отже, накопичення Са2+ у лімфоцитах селезінки внаслідок підвищення кальцієвої проникності плазматичної мембрани може бути однією з причин опосередкованих через кальцій незворотніх порушень структури та цілісності хроматину за розвитку інтерфазної загибелі лімфоцитів селезінки після опромінення тварин у дозі 1 Гр.

Проведений нами аналіз морфологічних та біохімічних показників стану клітин у популяції малих та середніх лімфоцитів селезінки свідчить, що формування відповіді клітин in vivo на дію іонізуючої радіації у дозах 0,5 та 1 Гр відбувається різними шляхами. Наявність морфологічних ознак активації клітин, незначна кількість загиблих клітин, підвищення [Ca]i та вмісту МДА у клітинах у термін, віддалений від дії променевого фактора вказують, що опромінення тварин у дозі 0,5 Гр не викликає метаболічних порушень, достатніх для активації тригерного механізму розвитку ураження лімфоцитів і у популяції лімфоцитів селезінки переважають процеси адаптивної проліферації, у ході якої гинуть найбільш радіочутливі клітини.

Опромінення тварин у дозі 1 Гр супроводжується значним зниженням кількості клітин у популяції малих та середніх лімфоцитів селезінки та проявленням морфологічних та біохімічних ознак інтерфазної загибелі клітин. Уповільнена динаміка розвитку радіаційної загибелі лімфоцитів, а також той факт, що зростання концентрації вільного цитозольного Ca2+ у лімфоцитах передує розвитку міжнуклеосомної деградації хроматину дозволяють припустити важливу роль Са2+-залежних мембранних систем клітинної сигналізації у посиленні викликаного дією іонізуючої радіації апоптогенного сигналу.

Таким чином, популяція малих та середніх лімфоцитів селезінки опромінених щурів може бути використана як модель для дослідження розвитку in vivo індукованої радіацією інтерфазної загибелі лімфоцитів, а порівняльне дослідження функціонування Са2+-залежних регуляторних систем гідролізу мембранних фосфоліпідів у клітинах після дії in vivo іонізуючої радіації у дозах 0,5 та 1 Гр – як експериментальний прийом для з’ясування пускових механізмів інтерфазної загибелі лімфоцитів.

Дослідження активності поліфосфоінозитидної месенджерної системи у лімфоцитах селезінки у ранній період після опромінення тварин. Фосфоліпаза С, ключовий фермент поліфосфоінозитидної системи, здійснює гідроліз фосфоефірного зв’язку усіх трьох типів фосфоінозитидів з утворенням вторинних месенджерів - внаслідок розщеплення фосфатидилінозитолу та фосфатидилінозитол-4-фосфату у клітинах підвищується вміст диацилгліцерола, а внаслідок розщеплення фосфатидилінозитол-4,5-дифосфату – диацилгліцерола та інозитол-1,4,5-трифосфата (Rhee S. et al, 1989; Cockroft S, 1992). Вивчення активності фосфоліпази С у лімфоцитах з використанням екзогенного субстрату фосфатидилінозитолу показало, що ферментативна активність виявляється як у мембранній, так і цитозольній фракціях, досягає оптимального рівня у області рН 6,5 та за 80мкМ концентрації субстрату. Достатньо високий рівень ферментативної активності обох фракцій проявляється у середовищі без додавання кальцію, однак максимальна швидкість ферментативного розщеплення фосфатидилінозитолу, як і інших екзогенних фосфоліпідів ( Carter H. & Smith A., 1987 ) розвивається у присутності кальцію у субмілімолярній концентрації у середовищі інкубації

Для оцінки активності фосфоліпази С у наближених до in vivo умовах, тобто за фізіологічної концентрації субстрата у клітинній мембрані та йонів кальцію у цитозолі клітин, були використані лімфоцити, попередньо мічені за 3Н-інозитолом. Оскільки фосфоліпаза С забезпечує трансмембранний етап проведення активаційного сигналу у внутрішньоклітинний простір, насамперед досліджували ферментативну активність лімфоцитів за умови активації антигенспецифічних рецепторних комплексів плазматичної мембрани. Для цього використовували поліклональні мітогенні ліганди фітогемаглютинін (ФГА) та ліпополісахарид E. coli (ЛПС), які здатні перехресно зшиватися з поверхневими рецепторами клітин. Отримані криві залежності ефекту ліганда від часу інкубації з лімфоцитами відображають ефективність їх зв’язування з клітинною мембраною, необхідного для індукції активності фосфоліпази С (рис.5). Хроматографічне розділення сумарної фракції утворених у ході інкубації клітин інозитолфосфатів показало, що як ЛПС, так і ФГА посилюють синтез усіх трьох типів інозитолфосфатів, однак найбільшою мірою - інозитол-1,4,5-трифосфату (ІФ3). Отже, у досліджуваній нами модельній системі функціонує механізм передачі сигналу від рецептора зовнішньої мембрани всередину клітини за участі поліфосфоінозитидної системи. Вплив ФГА та ЛПС на активність фосфоліпази С порівнювали з дією кальцієвого іонофора А23187, також здатного проявляти мітогенний ефект. Додавання іонофора у середовище інкубації клітин викликало незначне підвищення включення мітки у інозитолфосфат (ІФ) та інозитол-1,4-дифосфат (ІФ2) і не впливало на утворення ІФ3 ( рис. 5). Це узгоджується з літературними даними, згідно яких синтез інозитолфосфатів відбувається за фізіологічної концентрації іонів кальцію у цитозолі (Nakanishi H. et al., 1989; Conti A.et al., 1993). Отже, взаємодія фосфоліпази С з мембранними фосфоінозитидами визначається, перш за все, станом рецепторного комплексу у складі плазматичної мембрани лімфоцитів.

Дослідження активності фосфоліпази С у лімфоцитах селезінки проводили через 1, 3, 6 та 12 год після опромінення тварин, використовуючи без’ядерний гомогенат клітин та мічений субстрат фосфатидилінозитол. Згідно представлених на рис. 6 даних, у ранній період після дії іонізуючої радіації відбувається підвищення ферментативної активності лімфоцитів селезінки, рівень якого залежить від дози радіації. Після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр ферментативна активність клітин зростає через 3 год. Опромінення тварин у дозі 1 Гр призводить до більш значної модифікації активності фосфоліпази С - ферментативна активність підвищується через 1 год, досягає максимального рівня через 3 год і пригнічується порівняно з контролем через 12 год.

Аналіз ферментативної активності субклітинних фракцій лімфоцитів показав, що через 3 год після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр фосфоліпазна активність мембранної фракції зростає на 33,5 % порівняно з контролем, а цитозольної – не змінюється. Після опромінення тварин у дозі 1 Гр ферментативна активність мембранної та цитозольної фракцій підвищується на 120 та 73 % порівняно з контролем відповідно. Отримані дані дозволяють припустити, що однією з мішеней дії іонізуючої радіації у дозі 1 Гр є компоненти поліфосфоінозитидної системи, зв’язані з плазматичною мембраною лімфоцитів селезінки.

Щоб дослідити вплив іонізуючої радіації на функціональний стан рецепторів плазматичної мембрани лімфоцитів, які спряжені з фосфоліпазою С та активуються під дією лігандів, здатних викликати їх агрегацію, вивчали вплив ліпополісахарида на активність фосфоліпази С у лімфоцитах у контролі та через 3 год після опромінення тварин. Преінкубація протягом 5 хв у присутності ліпополісахариду лімфоцитів селезінки контрольних тварин викликає підвищення активності фосфоліпази С у без’ядерному гомогенаті клітин ( табл. 2), що узгоджується з даними, отриманими нами при дослідженні впливу ЛПС на утворення інозитолфосфатів у лімфоцитах. Активуючий ефект проявляється також за преінкубації з мітогеном лімфоцитів селезінки тварин, опромінених у дозі 0,5 Гр. Однак, додавання ЛПС у середовище преінкубації лімфоцитів селезінки тварин, опромінених у дозі 1 Гр, не впливає на активність фосфоліпазну активність клітин.

Таблиця 2

Вплив ліпополісахариду на активність фосфоліпази С лімфоцитів селезінки у контролі та через 3 год після опромінення тварин (n = 4)

Умови експеримента | Активність,

нмоль інозитолфосфату ( мг білка хв)-1

Умови преінкубації

без добавки | + ЛПС

контроль | 6.1 0,6 | 19,4 1,2**

опромінення 0,5 Гр | 8,6 0,8 | 12,3 1,1**

опромінення 1 Гр | 10,2 0,9* | 9,8 0,7

* р 0,05 порівняно з контролем

** р 0,05 порівняно з преінкубацією без добавки

Очевидно, опромінення тварин у дозі 1 Гр призводить до структурних або функціональних змін у стані плазматичної мембрани лімфоцитів селезінки, які модифікують взаємодію фосфоліпази С з мембранозв’язаними білками-регуляторами та викликають активацію фермента, яка не контролюється через стимуляцію антигенспецифічних рецепторів.

Отримані дані свідчать про активацію у лімфоцитах опромінених тварин ключового компонента поліфосфоінозитидної системи – фосфоліпази С, однак не дають уявлення про природу утворюваних продуктів гідролізу поліфосфоінозитидів. Синтез інозитолфосфатів досліджували за інкубації лімфоцитів селезінки, виділених через 1, 3 та 6 год після опромінення тварин та попередньо мічених за 3Н-інозитолом. Вміст мітки у сумарній фракції інозитолфосфатів після 5-хвилинної інкубації контрольних клітин складав 490 45 імп/хв на 107 клітин. відмічене Підвищення порівняно з контролем включення мітки у сумарну фракцію інозитолфосфатів у лімфоцитах виявлене через 1 год після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр, та через 1 і 3 год після опромінення тварин у дозі 1 Гр. Ці дані підтверджують факт ранньої активації фосфоліпази С у лімфоцитах опромінених тварин.

Хроматографічне розділення сумарної фракції інозитолфосфатів дозволило провести порівняльний аналіз утворення різних типів інозитолфосфатів у лімфоцитах контрольних та опромінених тварин. У лімфоцитах контрольних тварин був виявлений такий розподіл мітки: ІФ – 240 35, ІФ2 –140 23 , ІФ3 – 120 25 імп /хв на 107 клітин. Нами знайдено, що посилення синтезу інозитолфосфатів у лімфоцитах через 1 год після опромінення тварин у дозі 0,5 Гр зумовлене утворенням інозитол-1-фосфату, вміст якого, на відміну від інших інозитолфосфатів, підвищується порівняно з контролем. На основі цих даних зроблений висновок, що основним