МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ХАРКІВСЬКА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ ПІСЛЯДИПЛОМНОЇ ОСВІТИ

СОЛОВЙОВА АНГЕЛІНА ГЕОРГІЇВНА

УДК:616.248-053:612.112.94.015.2

СИСТЕМНІ ПОРУШЕННЯ ІМУНІТЕТУ ТА ЦИТОКІНІВ

ПРИ БРОНХІАЛЬНІЙ АСТМІ У ДІТЕЙ

14.01.10

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків — 2007

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в Харківському державному медичному університеті МОЗ України

Науковий керівник – доктор медичних наук, професор

Одинець Юрій Васильович,

Харківський державний медичний університет МОЗ України,

завідувач кафедри факультетської педіатрії

Офіційні опоненти – доктор медичних наук, професор

Коренєв Микола Михайлович,

Інститут охорони здоров’я дітей та підлітків АМН України,

директор, керівник відділу педіатрії та реабілітації

доктор медичних наук, професор

Юліш Євген Ісаакович,

Донецький державний медичний університет ім. М.Горького МОЗ України,

завідувач кафедри пропедевтичної педіатрії

Провідна установа – Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України

Захист відбудеться “_2__”__липня___________ 2007 р. о _10____ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.609.02 при Харківській медичній академії післядипломної освіти МОЗ України (61176, м. Харків, вул. Корчагінців, 58)

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Харківської медичної академії післядипломної освіти МОЗ України (61176, м. Харків, вул. Корчагінців, 58)

Автореферат розісланий “_1____” _червня____________ 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат медичних наук, доцент В.М. Савво

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Бронхіальна астма (БА) є однією з актуальніших проблем сучасної педіатрії та алергології дитячого віку (И.И.Балаболкин, 1997). Згідно даним міжнародних досліджень за останній час відмічено зростання захворюваності на бронхіальну астму (В.В.Лейкина, 2000). За останнім часом зросло число випадків важкого плину БА, що привело до підвищення інвалідизації дитячого населення (А.Г.Чучалин, 2000).

Згідно сучасної концепції, важкість запальної реакції визначається сумарним впливом багатьох взаємодіючих факторів. Міжклітинна цитокінопосередована кооперація може бути прикладом таких взаємодій. Скомпрометовані система імунітету та процеси секреції цитокінів під впливом різних чинників можуть змінювати свої властивості й тим формувати важкість перебігу захворювання, оскільки імунна система за допомогою каскаду цитокінів здійснює імунну відповідь (Н.Н. Носик, 2000). Синтезуємі та секретуємі тучними клітинами й базофілами цитокіни сприяють розвитку пізньої фази алергійної відповіді, що виявляється хронічним запаленням (Р.М.Хаитов, 2002). Міграція прозапальних клітин із судинного русла в міжклітинний простір здійснюється під впливом молекул міжклітинної адгезії (Meerschaert J., Furie M.B., 1995). Оксид азоту (NO), що є одним з найважливіших медіаторів в організмі людини, привертає особливу увагу при розгляді питань механізмів розвитку, прогнозування плину, діагностики й лікування БА. Синтезуючись практично у всіх клітинах органів дихання, NO бере участь у регуляції легеневого кровообігу, легеневої вентиляції й газообміну, а збільшення цього синтезу при запальних процесах у багато разів збільшує алергійне запалення, бронхіальну обструкцію, що дозволяє охарактеризувати NO як цитотоксичну молекулу. Варто вказати, що стан медіаторів запалення при БА в дітей давно привертав увагу дослідників. Проте, на сьогоднішній день недостатньо вивчений ланцюг імунітет – цитокіни – оксид азоту – молекули міжклітинної адгезії у взаємозв'язку з порушеннями функції зовнішнього дихання в періоді загострення й у динаміці перебігу БА в дітей.

Таким чином, актуальність дисертаційного дослідження обумовлюється необхідністю глибокого вивчення ролі цитокінів, молекул міжклітинної адгезії й NO у патогенетичних механізмах виникнення й розвитку алергійного запалення в бронхах, а також їхнього зв'язку з імунними порушеннями й формуванням вентиляційних порушень обструктивного характеру. Опираючись на отримані дані стає актуальним перспективний підхід до терапії хворих БА з використанням цитокінових препаратів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана згідно з комплексною НДР кафедр педіатрії Харківського державного медичного університету: “Медико-біологічна адаптація дітей із соматичною патологією в сучасних екологічних умовах” (№ державної реєстрації 0104U001767). Автор проводив клінічне та біохімічне обстеження хворих на бронхіальну астму, опрацювання та аналіз одержаних результатів.

Мета і задачі дослідження. Підвищення ефективності лікування бронхіальної астми в дітей на основі вивчення патогенетичного значення цитокінів, фактору адгезії й системних змін імунітету в формуванні, плину та тяжкості її.

Для досягнення мети були сформульовані наступні задачі:

1. Вивчити особливості концентрації в сироватці крові інтерлейкіну-1-в, інтерлейкіну-6, фактору некрозу пухлин-б, інтерлейкіну-4, інтерлейкіну-10, інтерлейкіну-13, молекул міжклітинної адгезії sICAM-1 у дітей, хворих на бронхіальну астму, в залежності від статі, віку, форми, тривалості й тяжкості захворювання;

2. Дослідити залежність рівня оксиду азоту в периферичній крові дітей із бронхіальною астмою від статі, віку, тривалості й тяжкості захворювання у взаємозв'язку з іншими медіаторами (зокрема, цитокінами) алергійного запалення;

3. Визначити взаємозв'язки рівня цитокінів крові з показниками імунітету, функції зовнішнього дихання та вплив їх на перебіг та тяжкість бронхіальної астми;

4. Оцінити вплив деяких методів сучасної патогенетичної терапії на стан вивчаємих показників та перебіг захворювання з метою оптимізації терапії.

Об’єкт дослідження – бронхіальна астма.

Предмет дослідження – рівень прозапальних (ІЛ-1-в; ФНП-б; ІЛ-6) та протизапальних (ІЛ-4; ІЛ-10; ІЛ-13) цитокінів, фактору адгезії sICAM-1 та NO у сироватці крові, імунологічні показники, показники функції зовнішнього дихання та їх взаємозв’язок у дітей, хворих на БА, у динаміці лікування.

Методи дослідження. Загальноклінічні та біохімічні методи дослідження необхідні для верифікації захворювання; пікфлоуметрія та спірографія; стан клітинного, гуморального ланцюгів імунітету та неспецифічних факторів захисту; визначення рівнів прозапальних (ІЛ-1-в; ФНП-б; ІЛ-6) та протизапальних (ІЛ-4; ІЛ-10; ІЛ-13) цитокінів, фактору адгезії sICAM-1 та NO у сироватці крові.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше встановлений характер зв'язку між синтезом цитокінів, молекул адгезії й оксиду азоту, статтю, віком, тяжкістю бронхіальної астми й періодом захворювання, характером годування дитини на першому році життя, наявністю супутньої патології та обтяженою спадковістю.

У хворих на легкий ступень бронхіальної астми старше 12 років функціональні зміни системи цитокінів незначні, у хворих на легкий ступень бронхіальної астми до 12 років система цитокінів і фактор адгезії в періоді загострення функціонують у гіперреактивному (гіперкомпенсаторному) режимі.

У хворих на бронхіальну астму середнього ступеня посилення взаємодій поміж цитокінами дозволяє поліпшити гомеостатичне регулювання системи цитокінів, а значне домінування внутрисистемних над міжсистемними взаємодіями доводить, що система цитокінів та фактор адгезії функціонують в режимі гіперкомпенсації без проявів виснаження.

У хворих на тяжкий ступень бронхіальної астми вичерпуються компенсаторні резерви цитокінового обміну, максимум включення яких має місто при середньотяжкому ступені бронхіальної астми.

Встановлено, що порушення обміну NO2 грає важливу роль як в патогенезі розвитку захворювання, так і в трансформації його в більш тяжкі форми, в зв’язку з чим можуть використовуватися для прогнозування перебігу астми, а також контролю за ефективністю терапії.

Патогенетично обґрунтоване включення в комплекс базисної терапії бронхіальної астми рекомбінантних (генно-інженерних) препаратів, які відтворюють основні властивості ендогенних цитокінів та є активними імунокоректорами, зокрема, препарат ронколейкін. Визначено клініко-імунологічні критерії для призначення цього препарату.

Практичне значення одержаних результатів. Інформація про механізми розвитку та прогресування бронхіальної астми, якісні і кількісні зміни показників імунітету, медіаторів і маркерів алергійного запалення повинна ураховуватися при оптимізації схем базисної терапії захворювання.

При проведенні зрівняльної оцінки ефективності вибраного варіанту терапевтичного підходу в лікуванні бронхіальної астми показана доцільність використання моніторингу пікової швидкості видиху за допомогою пікфлоуметру.

Результати роботи впроваджені в практику пульмонологічних відділень Харківських обласної дитячої клінічної лікарні, обласної дитячої клінічної лікарні №1, міської дитячої клінічної лікарні № 16 м. Харкова, міської дитячої клінічної лікарні м. Івано-Франківська, центральної міської клінічної лікарні №3 м. та міської дитячої лікарні №2 м. Донецька, дитячих міських клінічних лікарень №5 та №6 м. Дніпропетровська, клінічного санаторію ім. Чкалова м. Одеси, університетської клініки м. Одеси, обласної дитячої клінічної лікарні м. Чернівців, 1-міського дитячого клінічного об’єднання м. Сімферополя, дитячої лікарні №1 м. Запоріжжя.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено патентно-інформаційний пошук та написано огляд літератури, здійснювались підбір тематичних хворих на БА, обстеження та стаціонарне лікування їх. Проведено формування контингенту обстежених дітей по групам, дослідження вмісту рівнів цитокінів, фактору адгезії, оксиду азоту, деяких показників гуморальної й клітинної ланок імунітету, загального Ig Е у сироватці крові у дітей основної та контрольної груп. Запропонована та розроблена програма лікування БА з використанням цитокінових препаратів та інгаляційних глюкокортикостероїдів. Робота над дисертацією, критичний аналіз літератури, статистична обробка результатів клініко-функціонального й імунохімічного обстеження дітей, системний аналіз, визначення порівняльної ефективності базисної терапії БА в дітей, основні положення та висновки дисертації автор здійснив самостійно.

Апробація результатів роботи. Основні положення роботи обговорювалися на засіданнях кафедри факультетської педіатрії ХДМУ (2001-2005), на науково-практичних конференціях молодих вчених “Медицина третього тисячоріччя” (Харків, 2002, 2003), обласній науково-практичній конференції дитячих пульмонологів (Харків, 2004), ХІІ та XIV міських науково-практичних конференціях педіатрів (Харків, 2003, 2005), IV Всеукраїнській науково-практичній конференції “Питання імунології в педіатрії” (Львів, 2005), науково-практичній конференції з міжнародною участю “Від фундаментальних досліджень – до прогресу в медицині” (Харків, 2005), розширеному Пленумі обласної асоціації дитячих лікарів (Харків, 2005), Всеукраїнській науково-практичній конференції “Актуальні питання дитячої алергології” (Запоріжжя, 2005), VІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції “Актуальні питання педіатрії” (Київ, 2005), Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів “Від фундаментальних досліджень до медичної практики” (Харків, 2005).

Публікації за темою дисертації. Опубліковано 10 наукових робіт, з них 3 - статті у фахових виданнях, що рекомендовані ВАК України, 7 – матеріали та тези доповіді у збірниках конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Матеріали дисертації представлені на 162 сторінках машинописного тексту й складаються із вступу, аналітичного огляду літератури, чотирьох розділів власних досліджень, обговорення й узагальнення отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій, переліку використаних джерел літератури, що містить 231 джерело (з них 101 – на латиниці, 130 – на кирилиці), які займають 24 сторінки. Робота ілюстрована 41 таблицею, 30 рисунками.

ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Під спостереженням перебувало 136 дітей у віці 2-16 років, з них 110 хворих на бронхіальну астму й 26 здорових однолітків, які склали групу контролю.

Діагноз формулювали відповідно до критеріїв, запропонованих Міжнародним Консенсусом по бронхіальній астмі й схваленим на Конгресі пульмонологів і фтизіатрів України (Київ, 1998).

Обстеження хворих проводили в пульмонологічному відділенні міської дитячої клінічної лікарні № 16 м. Харкова й пульмонологічних відділеннях Харківської обласної дитячої клінічної лікарні й Харківської обласної дитячої клінічної лікарні № 1.

Програма досліджень містила в собі ретельне комплексне клінічне, функціональне обстеження пацієнтів з оцінкою фізичного розвитку, аналізу даних анте-, інтра- і постнатального періодів; лабораторні (клінічні аналізи крові й сечі, біохімічні й імунологічні показники крові) і інструментальні (спірографія за допомогою пневмотахографу “Custo-Vit” (Німеччина), пікфлоуметрія за допомогою пікфлоуметра “Ферарис”) методи досліджень. Клінічні дослідження крові, сечі й мазків-відбитків слизової оболонки носа проводили загальноприйнятими методами (В.Е.Предтеченский, 1960); фракціонування білків – методом горизонтального електрофорезу, вміст загального білка в сироватці крові – уніфікованим біуретовим методом (В.Г.Колб, В.С.Камышников, 1982); глікопротеїди й серомукоїд у сироватці крові – уніфікованим орциновим методом після гідролізу сірчаною кислотою (В.В.Меньшиков, 1987). Вміст електролітів (калію й натрію) у плазмі вимірювали по В.М.Бриккер (1961) методом полум'яної фотометрії, кальцію в сироватці крові – комплексонометричним титруванням, неорганічного фосфору – молібденово-кислим способом (А.А.Покровський, 1974). Імунологічні методи включали визначення рівнів основних класів імуноглобулінів (А, М, G) у сироватці крові методом радіальної імунодифузії в агарі Difko по G.Mancini et al. (1965); рівня загального IgЕ у сироватці крові – за допомогою імуноферментного аналізатора з використанням тест-системи фірми “Labodia” (Швейцарія); рівня IgЕ у слині – за допомогою імуноферментного аналізатора з використанням тест-системи “Тема” (Москва); ЦІК – по V.Haskova et al. у модифікації Ю. А. Гриневича й А. Н. Алфьорова (1978); клітинної ланки імунітету – шляхом визначення в крові В-лімфоцитів (CD19) і субпопуляцій Т-лімфоцитів (CD3, CD4, CD8) – методом імунофлюоресценції, за допомогою моноклональних антитіл, використовуючи комерційні набори “Протеїновий контур” (Санкт-Петербург), а Т0 і Так-лімфоцити – методом H. Fudenberg et al. (1975); фагоцитарну активність нейтрофілів – за допомогою тесту спонтанного поглинання й відновлення нітросинього тетразолію (НСТ-тест) за методом J.Stuart et al. у модифікації Б.С.Нагоєва (1987). Стан інтралейкоцитарних мікробіоцидних систем поліморфноядерних нейтрофілів периферичної крові оцінювали по вмісту гранулоцитарних факторів – мієлопероксидази (МП) і лізосомально-катіонних білків (ЛКБ). Визначали середній цитохімічний коефіцієнт (СЦК) вмісту МП у нейтрофілах по методу Грехема-Кноля й СЦК вмісту ЛКБ по методу М.Г. Шубича (1974); рівень цитокінів ІЛ-1-в, ІЛ-4, ФНП-б в сироватці крові – імуноферментним методом за стандартному протоколом тест-системи “Протеїновий контур” (Санки-Петербург), цитокінів ІЛ-6, ІЛ-10, ІЛ-13 - імуноферментним методом за стандартним протоколом тест-системи “Diaclone” (Франція), адгезивних молекул sICAM-1 - імуноферментним методом за стандартним протоколом тест-системи “human sICAM-1 BMS201” (Австрія), а рівень оксиду азоту в сироватціі крові – по його стабільному метаболіту NO2 спектрофотометричним методом Гріса-Ілосвая (1983) із сульфаніловою кислотою й 1-нафтоламіном.

Обстеження проводилося двічі: у періоді нападу й при досягненні ремісії.

Отримані дані піддані статистичному опрацюванню відповідно до вимог опрацювання медикобіологічної інформації з використанням прикладної програми Microsoft Excel 2003 для ПЕОМ. З метою опису функціонального стану досліджуваної системи використовувався системний аналіз методом кореляційних структур (Зосимов А.М., 1982, 1993).

Результати досліджень та їх аналіз. Із 110 дітей основної групи 23 дітей спостерігалися із приводу легкого ступеня, 45 – середньотяжкого й 42 – тяжкого ступеня БА. Переважну більшість хворих із БА становили діти старшого віку (53). Хлопчиків було 67, дівчинок – 43.

У значного числа хворих відзначений несприятливий преморбідний фон: обтяжена спадковість – в 28,2%, патологія плину вагітності в матерів 35,5% хворих. Як супутні захворювання реєстрували сезонний алергійний риніт (46 дітей), гостру вогнищеву пневмонію (14), хронічний тонзиліт (16), захворювання ШКТ (8), гострі респіраторні захворювання (11 дітей) і ін. 27,3% дітей перебувало на ранньому штучному, а 3,6% – на штучному вигодовуванні з народження.

Проведений порівняльний аналіз рівнів цитокінів сироватки крові у хворих на БА в період загострення залежно від віку говорить о статистично значимому (Р>0,05) більш високому рівні цитокінів, більше прозапальних (ІЛ-1-в, ФНП-б), у дітей молодшого віку (2-6 років) в порівнянні з більш дорослими при всіх ступенях тяжкості захворювання. Також виявлена статистично значима різниця рівнів цитокінів у сироватці крові, також більше прозапальних (ІЛ-1-в, ФНП-б), в приступний період БА в дітей залежно від статі, відзначаючи тенденцію до більш високих їх значень у дівчаток при легкому та тяжкому ступеню бронхіальної астми. При астмі середнього ступеню рівень прозапальних цитокінів більш підвищений у хлопчиків (Р>0,05).

Порівняння рівнів цитокінів у хворих з обтяженою спадковістю визначило, що рівні прозапальних (ІЛ-1-в, ФНП-б) та протизапального (ІЛ-4) цитокінів в сироватці крові у таких хворих значно нижчі, ніж у хворих, чия спадковість необтяжена. Характер годування на першому році життя теж відображається на рівні цитокінів. Так, у хворих, які знаходились на першому році життя на природному та змішаному годуванні, рівні прозапальних (ІЛ-1-в, ФНП-б) та протизапального (ІЛ-4) цитокінів значно вище, ніж у хворих, які знаходилися на штучному годуванні.

Встановлена залежність рівнів прозапальних (ІЛ-1-в, ФНП-б) та протизапального (ІЛ-4) цитокінів в сироватці крові й від давнини захворювання. Найбільш високий їх рівень реєструється у дітей, які хворіють на бронхіальну астму впродовж 3-6 років. При супутній патології найбільш високі рівні, особливо прозапальних цитокінів (ІЛ-1-в, ФНП-б), реєструвались при вогнищевій пневмонії.

Оцінка рівня цитокінів (табл. 1) у сироватці крові і їхній взаємозв'язок з іншими показниками залежно від ваги (ступеня) БА у дітей до 12 років показала, що рівень протизапального цитокіну ІЛ-4 підвищується незначно при всіх ступенях тяжкості бронхіальної астми, а рівні прозапальних цитокінів (ІЛ-1-в, ФНП-б) підвищуються при всіх ступенях захворювання. Рівень фактору адгезії sICAM навпаки знижується, найбільш при тяжкому ступені бронхіальної астми.

Оцінка рівня цитокінів (табл. 2) у сироватці крові і їхній взаємозв'язок з іншими показниками залежно від ваги (ступеня) БА у дітей старше 12 років показала, що рівень протизапального цитокіну ІЛ-4 підвищується лише при середньотяжкому та тяжкому ступенях бронхіальної астми, а при легкому залишається на рівні нормативних показників. Рівень же протизапальних цитокінв ІЛ-10, ІЛ-13 підвищується лише при тяжкому ступеню бронхіальної астми, а при легкому та середньотяжкому залишається на рівні нормативних показників. Рівень прозапального цитокіну ІЛ-1-в підвищуються при середньотяжкому та тяжкому ступенях бронхіальної астми, а при легкому залишається на рівні нормативних показників. Рівень прозапального цитокіну ФНП-б підвищується при всіх ступенях тяжкості бронхіальної астми. Рівень же прозапального ІЛ-6 навпаки знижується, найбільш при тяжкому ступеню бронхіальної астми. Рівень фактору адгезії sICAM також знижується, найбільш при тяжкому ступеню бронхіальної астми.

Таблиця 1

Рівні цитокінів та sICAM в сироватці крові у дітей до 12 років, хворих на бронхіальну астму

(M±m)

Показник | Легкий ступень | Середньотяжкий ступень |

Тяжкий

ступень | Здорові

діти

(n=26)

ІЛ-1-в, пг/мл | 392,07±73,26*

(n=12) | 398,10±40,40*

(n=30) | 270,25±33,64*

(n=20) | 62,93±6,84

ІЛ-4, пг/мл | 161,21±34,96*

(n=12) | 144,52±23,68*

(n=30) | 121,82±26,80*

(n=20) | 57,16±8,04

ФНП-б, пг/мл | 353,48±55,78*

(n=12) | 223,74±42,78*

(n=30) | 228,28±32,54*

(n=20) | 49,40±2,91

sICAM, пг/мл | 447,96±79,34

(n=5) | 464,31±29,33

(n=13) | 307,29±32,79

(n=9) | 520,25±14,88

Примітка. * - вірогідні відмінності у порівнянні з нормативними показниками (P<0,05).

На наявність взаємозв'язку між рівнями цитокінів, фактору адгезії та тяжкістю бронхіальної астми вказують, уявляється, виявлені середньої сили коефіцієнти кореляції рівня sICAM і показників ШОЕ (r=+0,5, P<0,05), рівня ФНП-б та рівня глікопротеідів (r=+0, 6, P<0,05), рівня ІЛ-1-в та рівня ЛКБ (r=+0,5, P<0,05).

Як відомо, ФНП-б підвищує фагоцитарну активність макрофагів, чим, очевидно, і слід пояснити установлений кореляційний зв'язок рівня ФНП-б з показником НСТ-теста (r=+0,56).

Активність еозинофілів, тучних клітин прямо залежить від рівня кальція, що підтверджує прямий кореляційний зв'язок його з рівнем ІЛ-4 (r=+0,5). Активовані під впливом імунної стимуляції лейкоцити мігрують у вогнище запалення, виділяючи там велику кількість медіаторів, в тому числі й цитокінів, що формує розвиток хибного кола, оскільки імунна система за допомогою “цитокінового каскаду” здійснює імунну відповідь.

Таблиця 2

Рівні цитокінів та sICAM в сироватці крові у дітей старше 12 років, хворих на бронхіальну астму

(M±m)

Показник | Легкий

ступень | Середньотяжкий

ступень

|

Тяжкий

ступень | Здорові

діти

(n=26)

ІЛ-1-в, пг/мл | 68,09±7,51

(n=11) | 286,51±40,40*

(n=15) | 253,17±24,32*

(n=22) | 62,93±6,84

ІЛ-4, пг/мл | 46,47±7,21

(n=11) | 123,26±43,89*

(n=15) | 161,36±43,37*

(n=22) | 57,16±8,04

ФНП-б, пг/мл | 109,19±31,42*

(n=11) | 111,86±54,44*

(n=15) | 158,41±14,41*

(n=22) | 49,40±2,91

ІЛ-6, пг/мл | 256,99±24,18

(n=8) | 285,29±7,74

(n=9) | 178,96±40,13*

(n=7) | 299,78±26,85

ІЛ-10, пг/мл | 5,67±0,5

(n=8) | 5,55±0,51

(n=9) | 13,56±2,88*

(n=7) | 5,79±1, 29

ІЛ-13, пг/мл | 1,28±0,29

(n=8) | 2,08±0,58

(n=9) | 6,82±1,19*

(n=7) | 2,70±0,69

sICAM, пг/мл | ____ | 511,06±80,35

(n=11) | 397,74±85,25

(n=10) | 520,25±14,88

Примітка. * - вірогідні відмінності у порівнянні з нормативними показниками (P<0,05).

Цитокіни, як медіатори запалення, утворюють багату кількість зв’язків з показниками імунної системи. Прозапальний ФНП-б виявив зворотній кореляційний зв'язок з Іg E (r=-0,6), в той час, як ІЛ-4 виявив прямий кореляційний зв'язок з Іg E (r=+0,8). Характер цих зв’язків підтверджує, що чим суттєвіші прояви реагінового типу бронхіальної астми, тим більше в крові ІЛ-4 й тим менше прозапальних цитокінів, зокрема ФНП-б. Й, навпаки, домінування в патогенезі імунокомплексної гіперреактивністі (підвищення рівня ЦІК) супроводжується підвищенням рівнів прозапальних цитокінів, про що свідчать прямі кореляційни зв’язки рівнів ЦІК та ІЛ-1-в (r=+0,6), рівнів ЦІК та sICAM (r=+0,55).

Як показали результати системного аналізу, цитокіни, як маркери алергійного запалення, утворюють множинні зв'язки з показниками імунної системи. При цьому більшу інтеграцію проявляють вони у дітей до 12 років з легким та тяжким степенями астми (коефіцієнт лабілізації (КЛ) зв'язків становив 50% проти КЛ=44,4% при середньотяжкому). Оцінка корелятивних взаємин показників функції зовнішнього подиху з цитокінами й іншими учасниками формування запального процесу показала виразну негативну кореляційну залежність показників обсягу форсованого видиху та прозапального цитокіну ІЛ-1-в (r=-0,70), зворотній кореляційний зв'язок пікової об’ємної швидкості видиху та рівня прозапального цитокіну ІЛ-4 (r=-0,50), чим підтверджується істотна роль останніх у формуванні бронхіальної обструкції. Паралельно виявляється прямий корелятивний зв'язок (r=+0,9) рівня ФНП-б у сироватціі крові й добової лабільності бронхів, що вказує на наявність залежності гіперреактивності бронхів від рівня цитокінів у сироватці крові. І, нарешті, розгляд залежності від рівня прозапального цитокіна сироватки крові ФНП-б миттєвої об'ємної швидкості (МОШ) після видиху 50% (r=-0,6) і, особливо, залежності від рівня прозапального цитокіна сироватки крові ІЛ-1-в миттєвої об'ємної швидкості після видиху 75% (r=-0,9) надають право вважати, що прозапальні цитокіни сироватки крові (ІЛ-1-в, ФНП-б) мають виражену причетність до реалізації гіперреактивності бронхів і формування периферичної обструкції при загостренні бронхіальної астми в дітей.

В динаміці, у період формування ремісії, при легкому ступені БА у хворих до 12 років реєструвалося зниження рівнів всіх вивчаємих прозапальних (ІЛ-1-в, ФНП-б) та протизапального (ІЛ-4) цитокінів у сироватці крові, при цьому не досягаючи нормативних показників. При середньотяжкому ступені бронхіальної астми рівні протизапального цитокіну ІЛ-4 та прозапального цитокіну ІЛ-1-в зберігалися на попередньому рівні, рівень же прозапального цитокіну ФНП-б знижувався, однак не до рівня нормативного показнику. При тяжкому ступені бронхіальної астми рівні прозапальних цитокінів (ІЛ-1-в, ФНП-б), протизапального цитокіну ІЛ-4 та фактору адгезії зберігався на попередньому рівні. При легкому ступені БА у хворих старше 12 років реєструвалося підвищення рівня прозапальних цитокінів (ІЛ-1-в, ІЛ-6, ФНП-б) у сироватці крові ще більш, ніж при загостренні. При середньотяжкому ступені БА реєструвалося зниження рівнів всіх прозапальних та протизапальних цитокінів у сироватці крові до рівнів нормативних показників, при цьому рівні ІЛ-1-в, ІЛ-6, ІЛ-10, ІЛ-13 були нижче рівнів нормативних показників. При тяжкому ступені БА відмічалось підвищення рівня деяких про- та протизапальних цитокінів (ІЛ-1-в, ФНП-б, ІЛ-4) в періоді ремісії, а деякі знижались до майже нормативних (ІЛ-10, ІЛ-13) показників та нижче них (ІЛ-6), що указує на незбалансованість системи цитокінів на тлі дефіциту компенсації.

Таким чином, отримані дані свідчать про підвищення рівнів цитокінів сироватки крові, особливо прозапальних, при БА в дітей. Характер й особливості кореляції рівнів цитокінів сироватки крові з деякими параметрами гомеостазу, показниками клітинного й гуморального імунітету, фагоцитозу, інших медіаторів запалення свідчать про причетність цитокінів до механізмів розвитку запальної алергійної реакції й реалізації симптомокомплексу БА, що документується, зокрема, порушеннями вентиляції по обструктивному типу. Патофізіологічні ефекти цитокінів здійснюються, мабуть, в сполученому численному ансамблі клітин-ефекторів запалення й медіаторами запалення, що ними продукуються.

Вивчення одного із таких медіаторів – вмісту оксиду азоту (по його стабільному метаболіту NO2) у сироватці крові в динаміці захворювання показало, що рівень NO2 у сироватці крові в період нападу БА істотно підвищувався у хворих всіх вікових груп, вірогідно перевищуючи його значення в здорових дітей. Найбільш високі значення відмічалися у хворих старше 12 років з середньотяжким і тяжким ступенями бронхіальної астми. Істотної різниці вмісту NO2 у сироватці крові залежно від статі не встановлено. Рівень NO2 у сироватці крові істотно підвищувався у хворих на БА в період загострення залежно від її тяжкості, перевищуючи нормативні показники в 1,07, 1,36 й 1,1 рази (Р<0,05) при I, II й III ступенях активності процесу відповідно. На певну залежність концентрації NO2 у сироватці крові від тяжкості запального процесу може указувати те, що концентрація NO2 у крові мала середньої сили кореляції з рівнями глікопротеїдів (r=+0,7) і серомукоїдів (r=+0,78), як показниками гострої фази запалення, а також з рівнями нейтрофілів периферичної крові (r=+0, 6) і НСТ-теста (r=+0,76). Оскільки НСТ-тест відображає кисеньзалежні механізми мікробіоцидної активності лейкоцитів, можна припустити, що нагромадження у вогнищі поразки токсичних радикалів кисню й оксиду азоту сприяють інтенсифікації реакції переокислювання ліпідів клітинних мембран, поширенню й збільшенню запалення респіраторного тракту, підвищенню проникності судин й, отже, ведуть до збільшення набряку й ригідності бронхіальної стінки, з одного боку, і підвищення рівнів продуктів і медіаторів запалення в периферичній крові, з іншого.

Не встановлено також істотної різниці показників NO2 у сироватці крові в періоді загострення бронхіальної астми в дітей залежно від наявності обтяженої спадковості по бронхіальній астмі. Показники NO2 у сироватці крові у хворих, які знаходились на першому році життя на природньому годуванні, вище їх при штучному та змішаному годуванні. У дітей з давниною процеса до 1 року рівень NO2 у сироватці крові значно вище, ніж у інших хворих. Виявлена також статистично значима залежність рівнів NO2 в сироватці крові від супутньої гострої або хронічної патології запального характеру – хронічного тонзиліту, сезонного алергійного риніту, гострої вогнищевої пневмонії (P<0,05).

Характер негативної кореляції рівнів NO2 крові й МОШ25-75 свідчив про причетність його до розвитку генералізованої бронхіальної обструкції з маніфестною обструкцією як центральних (МОШ25), так і середніх (МОШ50) і особливо дрібних (МОШ75) бронхів.

Такий же характер негативних кореляцій концентрації NO2 у сироватці крові й деяких показників функції зовнішнього подиху середньої сили проявлявся й у період нападу БА середньої тяжкості, свідчачи про генералізований, але помірковано виражений алергійний запальний процес у бронхіальному дереві з помірною бронхіальною обструкцією.

Що ж стосується хворих на легкий ступінь бронхіальної астми, то такі закономірності простежуються менш виражено відносно обструкції дихальних шляхів.

У період ремісії БА динаміка рівня оксиду азоту в сироватці крові носила різноспрямований характер. У хворих на БА легкого і тяжкого ступенів рівень його знижувався до нормативних значень. У хворих на середньотяжкий ступень бронхіальної астми рівень його знижувався в порівнянні з періодом загострення також суттєво, не досягаючи, однак, нормативних показників. Очевидно, у хворих зі середньотяжкий ступень БА така динаміка свідчить про зниження інтенсивності запального процесу, одночасно відображаючи пролонгований характер його, підтверджуючи, як представляється, необхідність тривалої ступеневої протизапальної терапії.

Отримані дані й характер корелятивних взаємин дозволяють думати, що NO (і його стабільний метаболіт – NO2) у сироватці крові може розглядатися, як і рівень NO в конденсаті видихуваного повітря, не тільки як маркер тяжкості алергійного процесу в бронхах, але і як активний “співучасник” (як медіатор) формування в “співавторстві” з іншими клітинними й гуморальними учасниками запалення патофізіологічних подій у бронхіальному дереві у хворих на БА, що констатовано і іншими дослідниками (М.Водолажський, 2005). На це вказує й виявлена пряма достовірна кореляція середньої сили рівнів NO й прозапальних цитокінів (ІЛ-1-в та ФНП-б) у сироватці крові (r=+0,52 та =+0,61 відповідно).

Виходячи з того, що на цей час немає “золотих стандартів” протизапальної терапії при бронхіальній астмі, зрозумілий інтерес до імуномоделюючої терапії. У цьому плані головну роль можуть грати цитокінові препарати, до яких причетний ронколейкін. Саме на ньому й зупинився наш вибір у цьому дослідженні.

Започаткована порівняльна оцінка клінічної ефективності ронколейкіну в якості можливої “терапії посилення” (інгаляційні кортикостероїди + цитокіновий препарат) у період загострення тяжкого перебігу БА в дітей.

Для рішення поставлених питань було відібрано 29 хворих у віці від 6 до 15 років з верифікованим діагнозом БА за загальноприйнятими критеріями відповідно до міжнародного Консенсусу. Хворі були розподілені на 2 групи. Процедура рандомизації й стратифікації передбачала виділення груп хворих, порівнянних по тяжкості, фоновим станам, давнині, виразності захворювання, статтю й віку, а також контролюємість дослідження в паралельних групах (табл. 3).

1 група (20 хворих на тяжкий ступень БА) одержувала у якості протизапальної терапії фліксотид (фірми “GlaxoSmithKline”) у дозі 400 мкг/добу й склала групу зрівняння; 2 групу (випробування) склали 9 хворих на тяжкий ступень БА в період загострення, які одержали комплексну протизапальну терапію – фліксотид у дозі 1/2 від дози хворих 1 групи – 200 мкг/добу плюс ронколейкін 10000 ОД/кг/доб на 5% розчині альбуміну через день тричі. Вони склали групу випробувану (основну) комплексного застосування інгаляційних кортикостероїдів і ронколейкіну (“терапії посилення”). Всім хворим призначався загальноприйнятий у період загострення режим, вони одержували гіпоалергенну дієту в межах 5 столу по Певзнеру, в2-агоністи (сальбутамол) за потребою.

Таблиця 3

Характеристика хворих у групах, включених у дослідження

Показники | 1 група, зрівняння.

Базисна терапія (інгаляційний фліксотид

400 мкг/доб) | 2 група, випробування.

Базисна терапія (інгаляційний фліксотид200мкг/доб+ ронколейкін 10000ОД/кг/доб)

Кількість хворих | 20 | 9

Стать | м-10 | д-10 | м-4 | д-5

Тривалість захворювання, роки | 5,3±0,9 | 5,6±0,3

Кількість нападів протягом тижня | 6,1±0,9 | 6,3±0,7

Кількість нічних нападів, разів на протязі тижня | 5,4±0,2 | 5,1±0,1

ОФВ1, % | 70,3±6,2 | 71,4±10,8

ПОШвид, % | 63,3±9,2 | 62,8±6,7

МОШ25, % | 52,3±9,0 | 50,3±6,2

МОШ50, % | 45,0±5,0 | 46,0±8,5

МОШ75, % | 40,0±3,8 | 40,0±0,7

ПОШ, % | 77,8±5,4 | 72,9±4,8

Добова вариабельність ПОШ, % | 20,8±3,9 | 26,5±4,1

Призначену терапію хворі одержували на протязі 5 днів. Перед призначенням препаратів, а також на 6 день проводилося обстеження, що включало оцінку клінічних проявів астми, пікфлоуметрію, лабораторні дослідження (імунологічні, рівень цитокінів у крові), функцію зовнішнього дихання.

Аналіз отриманих даних свідчить, що вже на 6 день терапії у хворих обох груп при значному поліпшенні загального стану, самопочуття, ліквідація задишки й майже повністю фізикальних змін в легенях достовірно зменшилася загальна кількість приступів, а вже через два тижні у хворих обох груп реєструвалися одиничні епізоди приступів БА, що дозволяло констатувати формування неповної, нестійкої ремісії БА тяжкого ступеню (табл. 4).

Таким чином, протизапальна терапія періоду загострення тяжкого перебігу БА інгаляційним кортикостероїдом фліксотидом в дозі 400 мкг/добу та комбінована протизапальна та цитокінова терапія фліксотидом 200мкг/добу+ронколейкін 10000 ОД/кг/сут виявляють виразний протизапальний ефект, який дозволяє купіровати загострення БА тяжкого перебігу. Справді, протизапальний ефект, реєструємий у хворих обох груп, не рівнозначний, він більш виражений у хворих, які отримували фліксотид 200мкг/добу+ронколейкін 10000 ОД/кг/сут, в порівнянні з хворими, які отримували фліксотид в дозі 400 мкг/добу. Так, у хворих групи випробування на 6 день кількість нападів зменшилась в 2,9 рази в порівнянні з вихідним періодом. У хворих групи зрівняння ця кількість зменшилася в 1,7 рази. Ще більш значима різниця у хворих випробуваної групи й групи зрівняння у кількості нічних нападів через тиждень після початку базисної терапії в порівнянні з вихідним станом (в 4,6 й 2,3 разів, відповідно; Р<0,05).

Таблиця 4

Динаміка деяких клінічних і функціональних показників у дітей з тяжким перебігом бронхіальної астми на фоні терапії ронколейкіном у поєднанні з фліксотидом(М±m)

Показатели |

Початковий стан |

На 6-й день терапії

1 група

(n=20) | 2 група

(n=9) | 1 група

(n=20) | 2 група

(n=9)

Кількість нападів протягом тижня | 6,1±0,9 | 6,3±0,7 | 3,6±0,8* | 2,15±0,9*

Кількість нічних нападів,

разів на протязі тижня | 5,4±0,2 | 5,1±0,4 | 2,4±0,5* | 1,1±0,7*,**

ПОШвид, % | 77,8±5,4 | 72,9±4,8 | 93,3±1,2* | 94,6±0,9*

Добова варіабельність

ПОШвид, % | 20,8±3,9 | 26,5±4,1 | 8,5±1,9* | 9,9±2,4*

Примітки: 1. групи хворих (тут та далі) – 1група (зрівняння) хворих БА тяжкого ступеню, базисна терапія – фліксотид 400 мкг/добу; 2 група (випробуванння) хворих БА тяжкого ступеню, базисна терапія – фліксотид 200 мкг/добу + ронколейкін 10000 ОД/кг/добу; 2. * - вірогідні відмінності у порівнянні з вихідним періодом усередині групи (P<0,05); ** - вірогідні відмінності поміж групами, що порівнюються (1 – 2) (P<0,05).

Аналіз впливу ронколейкіну на бронхіальну прохідність у хворих на БА тяжкого ступеню показав, що вже на 6 день його прийому реєструвалося збільшення, по даним пікфлоуметрії, пікової об'ємної швидкості видиху в середньому на 21,64 % у порівнянні з вихідними показниками. Показники добової варіабельності ПОШвид значно поліпшились вже на 6 день терапії, про що свідчать зменшення добової лабільності до 8,5% у хворих, які отримували й фліксотид, й ронколейкін, а у хворих, отримувавших лише фліксотид, добова лабільність зменшилась до 9,98%, що свідчить про позитивний протизапальний ефект обраних протизапальних препаратів (інгаляційні кортикостероїди та цитокіни) при ізольованому та сполученому їх отриманні. При цьому, отримання цитокінів дозволює зменшити отримання фліксотида в інгаляціях на 50% з досягненням навіть кращого ефекту, ніж при отриманні фліксотиду в оптимальних терапевтичних дозах.

Про протизапальний ефект ронколейкіну свідчить і динаміка рівнів медіаторів алергійного запалення (цитокінів, оксиду азоту) у сироватці крові вже на 6 день від початку терапії в порівнянні з вихідним періодом (табл. 5). Ці ефекти значимі стосовно як цитокінів, так й оксиду азоту.

Таблиця 5

Динаміка рівнів цитокінів й оксиду азоту в сироватці крові в дітей з тяжким перебігом

бронхіальної астми на фоні терапії ронколейкіном у поєднанні з фліксотидом (М±m)

Показники | 1 група (зрівняння)

(n=20) | 2 група (випробування) (n=9) |

Здорові діти (n=26)

Вихідний стан | На 6-й день терапії | Вихідний стан | На 6-й день терапії

ІЛ-1-в, пк/мл | 511,93±72,14 | 275,06±32,22* | 504,84±55,79 | 253,17±28,13* | 72,85±8,73

ІЛ-4,

пг/мл | 200,40±19,53 | 176,45±20,73 | 229,67±25,29 | 161,36±16,51* | 44,53±2,86

ФНП-б, пг/мл | 370,50±52,74 | 341,47±43,41 | 390,44±41,34 | 158,42±15,34*,** | 39,20±4,96

sICAM-1, пг/мл | 437,23±50,55 | 307,29±31,59* | 400,31±79,02 | 278,58±37,35* | 419,25±39,63

NO2, мкМоль/л | 2,18±0,18 | 2,02±0,06* | 2,14±0,15 | 1,92±0,19 | 1,89±0,09

Примітки: 1. * - вірогідні відмінності у порівнянні з вихідним періодом усередині групи (P<0,05); 2.** - вірогідні відмінності поміж групами, що порівнюються (1 – 2) (P<0,05).

Таким чином, аналіз динаміки клінічних, функціональних і лабораторних показників у дітей у цих групах через 6 днів свідчить про досить виражений протизапальний ефект ронколейкіну. Це дозволяє говорити про можливості зниження дози інгаляційних кортикостероїдів при комбінованому застосуванні його в якості “терапії посилення” у хворих бронхіальною астмою з тяжким ступенем, особливо приступному періоді БА на фоні розвитку пневмонії чи іншого запалення, респіраторного хламідіозу.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведені теоретичне узагальнення й нове рішення наукового завдання – удосконалення діагностики й підвищення ефективності лікування бронхіальної астми в дітей за рахунок отриманих нових даних про формування й плин загострень її з урахуванням прозапальних (ІЛ-1-в; ФНП-б; ІЛ-6) та протизапальних (ІЛ-4; ІЛ-10; ІЛ-13) цитокінів, фактору адгезії sICAM й оксиду азоту сироватки крові, що з'явилося підставою для розробки схем і методів патогенетичної терапії із включенням цитокінових препаратів у період загострення захворювання.

2. У період загострення бронхіальної астми в дітей виявлене підвищення в сироватці крові рівней прозапальних та протизапальних цитокінів, фактору адгезії, ступінь яких перебуває в прямій залежності від тяжкості (ступеня) та давності захворювання, віку та статі дитини, характеру годування його на першому році життя, наявності обтяженої спадковості та супутньої патології.

3. Виявлені прямі кореляційні зв’язкі сильної (r= +0,9) і середньої (r= +0,6) сили рівнів цитокінів, фактору адгезії сироватки крові й добової лабільності бронхів указує на залежність гіперреактивністі бронхів від цитокінів та фактору адгезії сироватки крові.

4. Наявність сильних кореляційних зв’язків (r= -0,9) рівнів прозапальних та протизапальних цитокінів, фактору адгезії сироватки крові з показниками прохідності дрібних (МОШ75) і середніх (МОШ50) бронхів при відсутності кореляції з показниками прохідності великих (МОШ25) бронхів указує на безпосередню участь цитокінів та фактору адгезії в формуванні периферічної обструкції в період загострення бронхіальної астми.

5. У період загострення бронхіальної астми в дітей виявлене підвищення рівня стабільного метаболіту (NO2) оксиду азоту в сироватці крові, ступінь підвищення якого залежить від тяжкості загострення або супутньої патології, а встановлений взаємозв'язок підвищення рівня NO2 у сироватці крові з іншими клітинними та гуморальними учасниками запалення, імунними й неімунними механізмами його розвитку, його медіаторами, з показниками функції зовнішнього дихання свідчить, що оксид азоту може розглядатися як медіатор запального процесу в бронхах.

6. Між показниками імунітету, рівнями прозапальних та протизапальних цитокінів, фактору адгезії, NO2 у сироватці крові й функцією зовнішнього дихання встановлена кореляційна залежність, що указує на їх співучасть у патогенезі розвитку загострення бронхіальної астми в дітей.

7. Застосування ронколейкіну в комплексному лікуванні дітей із загостренням бронхіальної астми тяжкого ступеня характеризується позитивною динамікою плину захворювання через 6 днів терапії, що проявляється ліквідацією нічних і денних нападів, збільшенням кількості днів без нападів, достовірним поліпшенням функції зовнішнього дихання, зниженням рівня медіаторів запалення в сироватці крові.

8. При загостренні тяжкої бронхіальної астми в якості базисної терапії може розглядатися сполучене застосування інгаляційного кортикостероїда й ронколейкіну, що дозволяє ліквідувати загострення зі зменшенням добової дози фліксотиду в 2 рази.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Визначення рівнів прозапальних (ІЛ-1-в; ФНП-б; ІЛ-6) та протизапальних (ІЛ-4; ІЛ-10; ІЛ-13) цитокінів, фактору адгезії sICAM й NO2 у сироватці крові при бронхіальній астмі в дітей є додатковим діагностичним критерієм