МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВЯ УКРАЇНИ

ХАРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ

УНІВЕРСИТЕТ

СТКЛЯНІНА Любов Валеріївна

УДК: 611.71:615.35:616-092.9

РІСТ, БУДОВА ТА ФОРМОУТВОРЕННЯ КІСТОК

СКЕЛЕТУ ПІД ВПЛИВОМ ПІДВИЩЕНОГО

РІВНЯ ГЛЮКОКОРТИКОЇДІВ ТА ЇХ ІНГІБІТОРА

НА РІЗНИХ ЕТАПАХ ПОСТНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗУ

(анатомо-експериментальне дослідження)

14.03.01 - нормальна анатомія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків -2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Луганському державному медичному університеті МОЗ України.

Науковий керівник – доктор медичних наук, професор Лузін Владислав Ігоревич, Луганський державний медичний університет, професор кафедри анатомії людини

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Сак Ніна Миколаївна, Харківська державна академія фізичної культури Держкомітету України з питань фізичної культури і спорту, керівник курсу анатомії та спортивної морфології;

доктор медичних наук, професор Сікора Віталій Зіновєвич, Медичний інститут Сумського державного університету МОН України, завідувач кафедри анатомії людини, оперативної хірургії та топографічної анатомії і гістології.

Провідна установа - Івано-Франківський державний медичний університет МОЗ України, кафедра анатомії людини.

Захист відбудеться „ 22 „ лютого 2007 р. о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.600.03 при Харківському державному медичному університеті МОЗ України (61022, м. Харків, пр. Леніна, 4).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Харківського державного медичного університету МОЗ України (61022, м. Харків, пр. Леніна, 4).

Автореферат розісланий „ 22 „ січня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат медичних наук, професор А.О.Терещенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Кісткова система виконує роль посередника між зовнішнім оточуючим середовищем та внутрішніми біологічними рідинами та органами, через що кістки є структурами, що здатні динамічно змінювати свою морфологію згідно з отриманими екзогенними та ендогенними сигналами (В.М. Волошин, 2002; В.Г. Ковешніков, 1978-2006; В.В. Маврич, 1999), проте така лабільність часто викликало порушення тих чи інших процесів у кістковій системі. Зокрема, функції кісткової системи можуть бути порушені несприятливими умовами екологічного середовища (Д.П. Березовський, С.О. Петричко, 1994; В.С. Пікалюк, 1991; В.З. Сікора, 2000), дисбалансом нутрієнтів в добовому раціоні харчування (В.В. Поворознюк, Н.В. Григор?єва, 2001), призначенням різноманітних фармакологічних засобів (С.А. Кутя, 2002; Г.В. Мякоткіна, 2000; О.М. Скрябіна, 1998), погіршенням соціальо-побутових умов та підвищенням щоденних стресогенних ситуацій (P.M. Crofton, 1999). Усі ці чинники є актуальними для сучасності.

Давно доведено, що глюкокортикоїди чинять різноплановий вплив на кісткову систему ( F. Buttgreit; 2002, Е. Erikson, 2000). Окремі наукові дослідження демонструють дозозалежний негативний ефект (R. Gennari, 1993, D. Reid , 1994), а деякі – заперечують (Р. Sambrook, J. Birmingem, 1993), оскільки зараз дискутується важливість фізіологічно достатнього рівня кортизолу для підтримання нормальної мінеральної щільності кісток (G. Jones, 1996). Незважаючи на встановлений негативний ефект глюкокортикоїдів відносно кісткової системи, висока терапевтична активність препаратів кори надниркових залоз при запальних захворюваннях та багатьох невідкладних станах робить глюкокортикоїди одними з найпоширеніших засобів призначення у щоденної клінічної практиці (R. Weinstein, 1998). У той самий час з метою коригування негативного впливу глюкокортикоїдів та інших препаратів, що так чи інакше впливають на опірно-руховий апарат, високою терапевтичною активністю володіє така сучасна фармакологічна група остеопротекторів – антирезорбентів, як бісфосфонати (A. Hodsman, 2002; H. Fleish, 1997) Зясовано головний механізм дії бісфосфонатів – інгібіція остеокластів, через що бісфосфонати здатні пригнічувати резорбцію кісткової речовини (R. Felix, 1995), проте морфологічні зміни, що відбуваються в кістковій системі, в літературі не висвітлені. Окрім того, чи то бісфосфонат, чи інший остеопротектор, такий препарат, як правило, пропонується пацієнтові тільки після того, як організм вже зазнав глюкокортикоїдного впливу, і коли факт порушень в кістковій системі вже клінічно встановлений; тоді як можливість одночасного призначення і глюкокортикоїду, і препарату-коректору, залишається відкритою для вивчення. Вищенаведені факти стали визначальними у виборі об’єкта, мети та задач нашого дослідження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана відповідно до плану наукових досліджень Луганського державного медичного університету і є складовою частиною науково-дослідної теми кафедри нормальної анатомії “Особливості росту, будови і формоутворення кісток скелета під впливом деяких зовнішньосередовищних і ендогенних чинників при різних фізіологічних станах організму”, номер державної реєстрації 019911001811, у межах якої автор виконувала розділ стосовно теми дисертації.

Мета і задачі дослідження. Метою дослідження стало вивчення на експериментальному матеріалі особливостей росту та морфологічних перебудов у кістковій системі після призначення екзогенного глюкокортикоїду гідрокортизону ацетату, дексаметазону, та шляхів впливу на кістки препарату-коректора - бісфосфонату "Зомета".

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:

1. Уточнити особливості росту та формоутворення кісток під впливом мінімальних доз гідрокортизону залежно від етапу онтогенезу піддослідних тварин.

2. З'ясувати можливість реадаптації після нетривалого впливу гідрокортизону.

3. Зробити порівняльну характеристику ефектів на кістки між гідрокортизоном та глюкокортикоїдом з іншою фармакодинамічною властивістю та хімічною структурою –дексаметазоном.

4. Вивчити морфологічні основи механізмів дії бісфосфонату "Зомета" на скелет щурів різного віку.

5. Протестувати можливості бісфосфонату "Зомета" виступати у якості коректора змін у кістках, спричинених гідрокортизоном, та надати комплексне морфологічне обґрунтування можливості призначення комбінації обох препаратів.

6. Встановити ефекти від застосування комбінації препаратів у нетривалому режимі (30 діб + 60 діб інтактного спостереження).

7. Визначити стан гуморальних середовищ (кров та сеча) контрольних щурів та тварин, що зазнавали дії глюкокортикоїдів, бісфосфонату "Зомета" та комбінованого впливу гідрокортизону з бісфосфонатом.

Об'єкт дослідження – особливості кісткової системи та гуморальні середовища під впливом різноманітних екзогенних чинників.

Предмет дослідження - Ріст, будова і формоутворення трубчастих, плоских і змішаних кісток скелета (великогомілкової, плечової, кульшової кісток та третього поперекового хребця) і біохімічний стан крові та сечі щурів статевонезрілого, репродуктивного віків та щурів іновлютивного віку при дії гідрокортизону, бісфосфонату "Зомета" та комбінованого введення обох препаратів.

Методи дослідження: остеометричний – для оцінки темпів росту і формоутворення кісток; гістоморфометричний – для дослідження структури компактної речовини діафізів та епіфізного хряща довгих трубчастих кісток; метод рентгеноструктурного аналізу – для дослідження ультраструктури кісток та фазового складу їх мінерального матриксу; біомеханічне дослідження – для оцінки міцності кісток; біохімічний аналіз кісткових складових і дослідження крові та сечі) для комплексної оцінки мінерального, макро- і мікроелементного складу кістки та його зв'язку з гуморальними середовищами організму. Параметричні методи статистики використовувалися для визначення достовірності одержаних результатів; непараметричні (кореляційний та регресійний аналізи) - з метою встановлення законів взаємообумовленості отриманих показників.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше одночасно були використані два препарати з протилежними механізмами дії на кісткову систему. На статистично достатньому експериментальному матеріалі вперше було вивчено морфологічні зміни, що відбувалися після впливу бісфосфонату "Зомета", та після одночасного впливу бісфосфонату "Зомета" з гідрокортизоном. Створена модель хронічного впливу мінімальними дозами гідрокортизону, що не призводило до розвитку патологічного стану остеопорозу та пригнічення ендогенної активності діяльності надниркових залоз. Встановлені абсолютно нові зв’язки між різними показниками кісткової системи, що розкриває механізми підпорядкованості та взаємообумовленості фізіологічних та морфологічних якостей кісток та гуморальних середовищ. Показано, що гідрокортизон у використаних дозах підсилює темпи кісткової перебудови та рарефікації, пригнічує темпи росту кісток; бісфосфонат "Зомета" – навпроти, уповільнює ростові процеси в кістковій системи. Одночасне застосування обох препаратів призводило до корекції за допомогою ”Зомети” змін, що були викликані гідрокортизоном, проте це відбувалося на пізніх термінах спостереження. Рекомендовано тривало призначати бісфосфонат "Зомета" у віці інволютивних змін у якості кісткового анаболичного та остеопротективного засобу, проте запобігати призначенню бісфосфонату "Зомета" у статевонезрілому віці, коли йде активне подовження кісток, або призначати бісфосфонат одночасно з коротким курсом низьких доз гідрокортизону.

Практичне значення одержаних результатів. У процесі виконання роботи отримані дані дозволили підтвердити можливість використовувати мінімальні терапевтичні дози гідрокортизону коротким курсом у молодому та статевозрілому віці з метою стимуляції кісткової перебудови, а також рекомендувати бісфосфонат одночасно з гідрокортизоном у якості остеопротектора. Самостійне призначення бісфосфонату сприятливо впливає на кісткову систему у похилому віці, проте слід уникати призначення цього препарату у молодому віці через його здатність гальмувати поздовжній ріст кісток. Основні положення і висновки дисертаційної роботи впроваджені в навчальний процес і науково-дослідну роботу на кафедрах анатомії людини Луганського, Дніпропетровського, Донецького, Харківського, Буковинського державних медичних університетів, Вінницького та Ужгородського національних медичних університетів.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведені постановка експерименту, забір матеріалу та морфофункціональні дослідження (остеометрія, гістоморфометрія, розрахунок кількісних результатів рентгеноструктурного аналізу, проведено хімічний аналіз та інтерпретацію біохімічних досліджень, власноруч виконано біомеханічні дослідження, статистичну обробку одержаних результатів). Інтерпретація одержаних результатів, основні положення, що виносяться на захист, і висновки дисертації належать авторові.

Апробація результатів дослідження. Основні матеріали дисертаційної роботи апробовано на ІІ міжрегіональній конференції молодих вчених „Актуальные вопросы биологии и медицины” (Луганськ, 2001року); на IV-V міжрегіональних науково-практичних конференціях „Морфогенез та патологія кісткової системи в умовах промислового регіону Донбасу” (Луганськ, 3-5 квітня 2003 року); на V науково-практичній конференції „Морфогенез та патологія кісткової системи в умовах промислового регіону Донбасу” (Луганськ, 11-13 квітня 2005 року), на міжнародній конференції Baltic Bone and Cartilage Conference 5 (Наанталі, Фінляндія, 1-3 вересня 2005 року), міжнародній конференції “Актуальные проблемы морфологии” (Мінськ, Бєларусь, 23-24 листопада 2006 року), науково-практичній конференції „Морфологічний стан тканин і органів у нормі та при моделюванні патологічних процесів” (Тернопіль, 30-31 травня 2006 року).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 11 робіт, з яких 8 наукових праць у фахових виданнях, ліцензованих ВАК України (2 самостійні), 3 у вигляді тез у матеріалах конференцій.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена українською мовою на 241 сторінці друкованого тексту, з котрих власне тексту 152 сторінки. Робота включає такі розділи: вступ, огляд літератури (2 підрозділи), матеріал та методи дослідження, власні дослідження (4 підрозділи), дані кореляційного та регресійного аналізів отриманих результатів, аналіз та узагальнення отриманих даних, висновки, список використаних джерел, що складається з 178 найменувань, з них 87 кирилицею, 81 – латиницею, та два додатки (А, Б). Робота ілюстрована 61 мікрофотографією, 23 діаграмами, 34 таблицями (обсягом 82 сторінки).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Представлене дослідження проведене на 362 білих лабораторних щурах-самцях різних вікових груп, які були узяті з віварію ЛугДМУ у єдиний сезонний період. Проведено три серії дослідів відповідно до трьох вікових категорій тварин – статевонезрілих (далі - перша серія, I), статевозрілих (друга серія, ІІ) і щурів іновлютивного віку (третя серія, ІІІ). Вік кожної експериментальної тварини визначався двома умовами: кількістю діб від народження та масою. Так, до І серії тварин були віднесені щури у віці 34-35 діб з масою 5212,03 г; до ІІ - у віці 60-65 діб з масою 136,2510,11 г; до ІІІ- 18 міс. і масою 3109,49 г. Утримання і догляд за тваринами здійснювали відповідно до існуючих наказів, які регламентують організацію роботи з використанням експериментальних тварин і дотримання принципів „Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та інших наукових цілях (Страсбург, 1985 р.), а також рішення Першого національного конгресу про біоетику (Київ, 2001 р.). У межах кожної вікової серії щури були розподілені на чотири групи по 7 тварин у кожній: групи, що знаходилися під впливом щоденних ін?єкцій 21 мг гідрокортизону; групи, що отримували інекції бісфосфонату "Зомета" у дозі 0,362 мг/кг; групи, яким на фоні впливу гідрокортизоном були призначені інєкції бісфосфонату "Зомета", а також у І серії існувала група щурів, яким вводили 1,07 мг/кг дексаметазону. Кожній піддослідній групі призначалася група контрольних щурів, тотожна за віком та кількістю тварин, що отримували щоденні інєкції фізіологічного розчину хлориду натрію і слугували контролем для піддослідних груп.

Особливість даного експерименту у тому, що в організмі тварини шляхом призначених ін'єкцій гідрокортизону та дексаметазону створювалася саме така концентрація глюкокортикоїдів, яка відповідає ендогенному фізіологічному піку секреції цих гормонів вранці або у моменти стресу, а фармакологічне дозування базувалося на мінімальній дозі, здатній надати терапевтичний ефект, і яка призначається у клінічній практиці підчас хронічних процесів, тобто націлена на тривалу підтримуючу терапію. Така доза для гідрокортизону коливається від 25 до 50 мг, проте оскільки в клінічній практиці найчастіше призначається преднізолон, то перехід від лікарської форми гідрокортизону до преднізолонового стандарту проведено за рекомендацією Європейського симпозіуму по глюкортикоїдній терапії, що затвердила “преднізоновий еквівалент”: 7,5 міліграмів преднізолону (преднізону) за хімічною активністю відповідає 21 мг гідрокортизону та 1,07 мг дексаметазону. Дозування бісфосфонату було відповідним до рекомендацій виробника Novartis Pharma AG (Switzerland). По закінченню термінів досліду - 7, 15, 30 та 90 доби – у тварин збирали проби добової сечі, проби крові, а потім декапітували згідно з „Методичними рекомендаціями по виведенню тварин з експерименту” (1985), після чого проводили комплексне дослідження кісткової системи.

Результати дослідження та їх аналіз. На підставі отриманих даних було встановлено, що вплив гідрокортизону погіршував темпи росту кісток та викликав зменшення тих габаритів, розмір яких обумовлюється високим рівнем кісткової перебудови. Так, протягом експерименту незалежно від терміну наявне зниження розмірів проксимального епіфіза великогомілкової кістки, тіла поперекового хребця, зниження маси кісток на 12,86% - 15,00% (p<0,05). Темпи поздовжнього росту гідрокортизон уповільнив вже через 15 діб свого впливу, проте це стосується переважно великогомілкової кістки, у якої на гістологічному рівні відбулася передчасна морфологічна інволюція у епіфізному хрящі: зона проліферації там звужується на 18,78% - 37,53% через експансію зони дефінітивного хряща. Крім того, вплив гідрокортизону погіршив утворення трабекул зони первинного остеогенезу (відсоток первинної спонгіози наприкінці експерименту нижчий за контрольний на 23,81%, 10,94% та 19,57% (p<0,05), а саме цей показник, згідно проведеному кореляційному аналізові, обумовлює остеометричну довжину великогомілкової кістки (rx/y 0,85). Крім наявно негативного впливу на губчасті структури кісток, вплив гідрокортизону вражав й компактну речовину кісток, спричиняючи ендостальні резорбційні втрати кісткового матеріалу стінок діафізів великогомілкової кістки та ерозивне розширення діаметру каналів остеонів на 6,69% - 52,86% (90 доба, p<0,05), що прогресувало пропорційно до встановлених термінів.

Хімічний склад кісток змінюється у бік демінералізації вже через 7 діб введення гідрокортизону, проте відмінність від контролю набуває піку на 15 добу, коли на частку мінералів у золів великогомілкової кістки приходиться на 33,80% (І вікова серія, p<0,05), 10,15% (ІІ вікова серія) та 19,13% (ІІІ серія, p<0,05) менше за контроль. Для кульшової кістки відмінності складають 5,09% - 6,07%, для ІІІ поперекового хребця стан є гіршим, бо відносна демінералізція сягає 7,03% - 8,96% (p<0,05). Втрати мінерального компоненту спричиняє відносна гіпергідратації та прогресуюче зменшення вмісту кальцію в кістках.

Проте замість кальцію у кістковій золі підвищений вміст фосфору, що має компенсаторне значення, бо фосфорна насиченість кісток підчас дії гідрокортизону тісно пов’язана із показниками, що обумовлюють кісткову механічну міцність (rx/y 0,91). В мінеральному матриксі переважають аморфні фази карбонатів та витлокитів, які не переходять до кристалічної фази, через що вміст гідроксиапатитів прогресуюче зменшується, а серед залишку кристалів знаходяться конгломерати завеликого розміру блоків когерентного розсіювання, які на 90 добу більші за контрольні на 6,52% - 17,93% (p<0,05) у щурів І-ІІІ серій. Це може бути пояснено пригніченням через дію гідрокортизону активності ферментів нуклеації (Н. Fleish, 1997), й створеним дефіцитом енергозабезпечення процесів кристалізації. Те, що під впливом гідрокортизону мінералізація кількісно та якісно порушена, є причиною різкого погіршення як біомеханічних показників міцності, так й еластичності кісток, оскільки з початком демінералізації та деформації кристалів (15 доба спостереження) відбувається різке зниження значень межі міцності, питомої стріли вигину та роботи руйнування, максимальне у щурів І вікової серії.

У крові та сечі введення гідрокортизону проявлялося ознаками посилення кісткової резорбції у вигляді відносного підвищення з 15 доби на 6,11% (І серія), 56,15% (ІІ серія) та 28,32% (ІІІ серія, p<0,05) уринарної екскреції кортизолу; гіперкальциємією та гіперкальциурією із підвищенням рівню лужної фосфатази у крові та сечі. Зазнані зміни супроводжуються гіпермагніємією, яка розвинута наприкінці експерименту та сягає 9,76%, 15,28% та 6,88% відповідно до трьох вікових серій. Це відбувається на фоні зменшення уринарних втрат цього мікроелементу. На фоні впливу гідрокортизону магній в гуморальних середовищах наділений проективною функцією, стримуючи активність резорбційних процесів (H. Samechina, A. Ota ,1999).

У разі припинення впливу гідрокортизону з 30 доби, у щурів І та ІІІ серій через 60 діб інтактного перебування в експерименті можлива реадаптація у вигляді відновлення поздовжнього росту кісток, оскільки формування трабекул в зоні первинного остеогенезу наздоганяє та навіть перевищує контрольне на 2,39% та 0,49%, що вказує на стимулюючий вплив обраних доз гідрокортизону на остеогенез у разі нетривалого його призначення. Проте такі ефекти гідрокортизону, як зменшення розмірів поперекового хребця, розширення каналів остеонів в діафізі великогомілкової кістки, демінералізація кісток зі зниженням вмісту кальцію, який у підвищеному рівні перебуває у крові та сечі, наявні навіть після 60 діб поспіль зазнаного впливу гідрокортизону.

Вплив дексаметазону у щурів І серії вже з 7 доби спричиняє глибокі та незворотні порушення у вигляді зупинки поздовжнього та поперечного росту кісток усіх типів, різкої демінералізації, морфологічній неповноцінності остеогенних зон епіфізного хряща, ознаками зупинки кісткового обміну в гуморальних середовищах та пригнічення ендогенної глюкокортикоїд-синтезуючої активності надниркових залоз, що загрожує виникненням „синдрому відміни”. Через наявний край негативний вплив, з біоетичних цілей подальше призначення дексаметазону щурам інших серій не продовжували.

Дія "Зомети" на кісткову систему позначається у стимуляції апозиційного остеогенезу переважно компактної речовини, що підвищує масу кісток будь-якого типу, максимально – кульшової кістки, причому тим ефективніше, чим молодший вік піддослідних тварин. Водночас триває прогресуюче потовщення компактної речовини діафіза великогомілкової кістки, яка на 90 добу більша за контрольну на 8,65%, 12,05% та 5,23% (p<0,05) відповідно у І, ІІ та ІІІ вікових серій. Активне формування компактних структур спричиняє відносне звуження діаметру каналів остеонів, які менші за контрольні, починаючи з 30 доби і до кінця спостереження, на 3,32%, 9,04% та 12,75% (p<0,05) відповідно до трьох вікових серій. Проте, окрім позитивного впливу на кістки, "Зомета" має небажану властивість уповільнювати темпи поздовжнього росту довгих трубчастих кісток: у щурів І вікової серій – на 15 добу своєї дії та на 30 добу – у тварин ІІ серії, що спричиняє відносне вкорочення великогомілкової кістки на 1,76% - 4,11% (p<0,05). Це знаходить пояснення на гістологічному рівні: епіфізний хрящ великогомілкової кістки вужче за контроль через вкорочення зон зрілого хряща на 18,31% (І вікова серія), 11,57% (ІІ серія) та 15,55% (ІІІ серія, p<0,05), а також пригнічення „Зометою” деструкції хряща, оскільки зона гинучих хондроцитів в групах дії „Зомети” упродовж експерименту вужча за контроль на 23,00% - 15,67%. Це є морфологічним роз’ясненням можливості „Зомети” стримувати кісткову деградацію (H. Fleish, 2003). Проте формування трабекул у зоні первинного остеогенезу також уповільнюється, оскільки у щурів І-ІІ серій частка первинної спонгіози відстає від контрольної, хоча для щурів старечого віку (ІІІ серія) ефект є зворотним, з відносним підвищенням відсотку спонгіози на 3,27%. Для пояснення такої реакції треба компілювати два факти: з одного боку, бісфосфонатові "Зомета" притаманне інгібувати остеокластичну резорбцію (M. Francis, 1999), однак, з другого боку, звісно, що фізіологічний рівень резорбції в кістках служить стимулом для підтримки адекватних темпів остеогенезу (S. Manolagas, 2000). Тобто, „Зомета”, стримуючи резорбцію, уповільнює й остеогенез, проте щодо щурів старечого віку, у яких переважає вікова інволюція, остеопротективний ефект „Зомети” домінує над розвитком сенільного остеопорозу. На хімічному рівні „Зометі” властиве активація формування органічного компоненту з 15 по 90 доби, особливо – в кульшовій кістці, оскільки вміст органіки в неї перевищує контрольний на 12,10%, 15,74% та 14,24% (p<0,050.

Відносно високий вміст органічної речовини витісняє мінеральну складову у кістках будь-якого типу через зниження вмісту кальцію в їх золі на 11,60% - 18,46% протягом спостереження. Проте вміст магнію, навпроти, відносно підвищується, причому – синхронно із початком збільшення маси кісток та накопиченням в них органічної речовини. Так, магній для кісток за умов впливу „Зометою” є каталізатором, що активує формування кісткової речовини.

Органічна речовина кісток, яка формується під впливом „Зомети” в умовах затримки мінералізації, на ранніх термінах погіршувала міцність кісток, оскільки показники роботи руйнування були нижчими за контрольні протягом перших 15 діб дії „Зомети” у щурів І та ІІІ серій на 37,23% та 24,53% відповідно. Проте наприкінці експерименту відповідно до збільшення вмісту органічного матриксу наростала опірність кістки до згинаючої деформації через зниження значень питомої стріли вигину, що фактично відображує посилення меж- та надмолекулярних зв’язків у колагенових структурах остеоїду.

Активне формування кісткової речовини з перевагою органічного компоненту служить тлом для відкладання на її основі завеликих за розміром кристалів гідроксиапатиту з порушенням їх просторової орієнтації, проте сам вміст гідроксиапатитів збільшується пропорційно тривалості впливу „Зометою”, та перевищила контроль наприкінці експерименту на 2,74%, 13,85% та 3,87% відповідно до трьох вікових серій.

Декальцинація кісток під впливом „Зомети” знайшла відображення у гуморальних середовищах: з 15 по 90 доби експерименту рівні кальцію у крові та сечі знижені пропорційно вікові тварин на 16,31% - 41,21%, що на фоні відносного зниження лужної фосфатази крові та сечі можна трактувати як ознаки уповільнення загального темпу кісткового обміну та перебудови.

У разі введення бісфосфонату "Зомета" тільки двічі, тобто до 30 доби експерименту, 60 діб поспіль продовжує спостерігатися відносно висока маса кісток, формування компактної речовини діафіза та кісткових пластин остеонів є навіть більш ефективним у щурів І та ІІ серій, якщо бісфосфонат призначався тільки двічі, тоді як для щурів старечого віку (ІІІ серія) більш тривалий вплив „Зометою” є сприятливішим для досягнення вищевказаних ефектів. Проте навіть після припинення ін’єкцій „Зомети” у щурів І-ІІ серій має місце відносне вкорочення великогомілкової кістки та її демінералізація, тоді як у щурів ІІІ серії такі зміни не властиві, що вказує на доцільність призначення бісфосфонату "Зомета" для досягнення остеопротективного ефекту у віці, коли бурхливі ростові процеси закінчуються, та наступає перевага кісткової інволюції та резорбції.

З метою з’ясування реакції кісткової системи на одночасне призначення гідрокортизону з бісфосфонатом "Зомета" у якості коректора, встановлювали морфологічні зміни кісток при введенні "Зомети" раз у місяць на фоні безперервних ін’єкцій гідрокортизону. Встановлено, що при зазначеному режимі на ранніх термінах першими відтворюються ефекти гідрокортизону, проте пізніше вони за більшістю нівелюються завдяки „Зометі”. Проте корекція охоплює великогомілкову та кульшову кістки, стимулюючи підвищення маси кісток та відновлення поперечних розмірів, однак третій поперековий хребець не є захищеним від негативного впливу гідрокортизону: зниження темпів росту його тіла та маси відносно контролю сягають до 90 доби 13,01% (p<0,05), 4,81% та 8,51%, відповідно, у щурів І, ІІ та ІІІ вікових серій. Поздовжній ріст трубчастих кісток також спочатку затриманий (зниження довжини великогомілкової кістки складає 2,04% - 2,06% (p<0,05) порівняльно з контролем), оскільки, зокрема, в епіфізному хрящі великогомілкової кістки наявна експансія зони дефінітивного хряща, що ширша за контроль максимально на 30 добу - на 8,21%, 0,66% та 10,04% (p<0,05) відповідно до трьох вікових серій, та відносно вузька зона деструкції, в чому є прояв „Зомети”. Гідрокортизон не погіршує формування первинної спонгіози за умови присутності ”Зомети”, за виключенням щурів ІІІ серії, у яких частка спонгіози, та, відповідно, довжина великогомілкової кістки відстає від контролю. Також не встановлено коригую чого впливу „Зомети” на компактну речовину діафіза, оскільки вона звужена за рахунок зменшення остеонного шару на 2,49%, 4,34 та 8,92% (p<0,05) відповідно до трьох вікових серій (90 доба), а остеони такого деформованого прошарку діафіза замалі за розміром та мають відносно розширені на 7,66% - 7,58% канали.

Крім зазначених морфологічних змін, в кістках вплив комбінації препаратів викликає демінералізацію за рахунок відносно низького вмісту кальцію в кістках, яка охоплює переважно великогомілкову кістку та поперековий хребець, проте на 30 добу спостерігається феномен підвищення вмісту мінерального компоненту в золі великогомілкової кістки на 6,11%, 5,75% та 7,52% відповідно, у щурів І, ІІ та ІІІ серій, при одночасному зменшенні в неї вмісту кальцію - на 4,35%, 15,83% та 11,83% (p<0,05). За таких умов підвищення вмісту мінералів відбувається завдяки накопиченню гідрофільних іонів – натрію та калію. Проте низький вміст кальцію в кістках призводить до порушень в мінеральному матриксі: вміст гідроксиапатитів упродовж експерименту незалежно від вихідного віку тварин нижчий за контроль на 2,00%, та самі кристали виглядають деформованими через великий розмір та хаотичне розташування в межах кристалічних грат, оскільки коефіцієнт мікротекстурування у них нижчий за контроль на 19,09%, 11,99% та 7,70%.

Вказані зміни відбуваються переважно на 15 добу впливу обома препаратами та співпадають із періодом найбільшої ламкості плечової кістки. Якщо дія обох препаратів триває упродовж 90 діб, наприкінці експерименту це призводить до перевищення контрольного показнику межі міцності на 17,72% (ІІІ серія), що розцінюється як позитивний ефект впливу „Зомети”.

Декальцинація, що відбулася в кістках, включає захисні механізми ретенції кальцію в організмі, через що вміст кальцію у крові та сечі піддослідних тварин протягом експерименту нижчий за контроль на 1,42% - 22,68% . Вміст кальцію у крові для щурів, що отримували гідрокортизон разом з „Зометою”, перебуває у тісному зворотному звязку із вмістом кальцію в золі великогомілкової кістки (rx/y -0,89), тобто, у разі підвищення кальцію у крові треба очікувати зниження його вмісту в великогомілковій кістці. Щоб запобігти можливої декальцинації, в організмі підтримується гіпокальциємія та гіпокальциурія. Проте, вказані зміни розвиваються на фоні відносно високого рівня лужної фосфатази крові та сечі, через що гіпокальциємію можна трактувати як ознаку повного засвоєння кальцію кістками з гуморальних середовищ.

Незважаючи на окремі негативні прояви гідрокортизону, що мають місце на фоні застосування бісфосфонату "Зомета", слід зазначити, що у разі комбінованого призначення препаратів зазначені порушення в кістках мають значно меншу амплітуду відхилень від контролю. Призначення обох препаратів упродовж лише 30 діб (група реадаптації) є більш ефективним у щурів І та ІІ серій, бо навіть після відміни препаратів триває відносне збільшення маси кісток, посилюється формування органічної речовини в великогомілковій та кульшовій кістках, посилюється мінералізація великогомілкової кістки, нормалізується вміст гідроксиапатитів та розміри кристалів в мінеральному компоненті. Однак, якщо гідрокортизон з „Зометою” вводиться щурам старечого віку (ІІІ серія), треба призначати обидва препарати протягом 90 діб, бо у разі відміни їх впливу на 30 добу, в групі реадаптації ІІІ серії погіршується ріст кісток, звужується зона первинного остеогенезу епіфізного хряща на 27,06% (p<0,05), через що довжина великогомілкової кістки менша за контрольну на 4,23%; присутні ознаки ендостальної резорбції компактної речовини діафіза зі звуженням шару внутрішніх генеральних пластин, розширенням каналів остеонів та втратою відсоткового вмісту органічної речовини в кістках.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі проведене комплексне дослідження кісткової системи та гуморальних середовищ, що дозволило виявити негативні ефекти на кісткову систему тривалого впливу гідрокортизону та дексаметазону, що може коригуватися бісфосфонатом "Зомета", а також продемонструвало стимулюючу дію гідрокортизону у разі призначення його коротким курсом. На підставі отриманих даних було зроблено наступні висновки:

1. Вплив гідрокортизону, введеного у дозі 21 мг/добу, відтворювався з максимальною амплітудою у статевонезрілих щурів з піком змін на 15 добу у вигляді відносного зниження маси на 6,73% - 12,86% та поперечних розмірів кісток усіх типів на 6,90% - 9,88%, викликав передчасну морфологічну інволюцію клітинного складу епіфізного хряща з заміщенням зони проліферації на розширену на 35,97% - 39,40% зону дефінітивного хряща, призводив до стоншення компактної речовини діафіза та ерозивного розширенню діаметру з ознаками ендостальної резорбції – у щурів І серій, та гальмування остеогенезу під окістям – у щурів ІІ-ІІІ серій. Препарат спричиняв демінералізацію за рахунок втрати кістковою речовиною кальцію, який заміщувався фосфором (r x/y 0,91). У мінеральному компоненті переважали аморфні фази, що погіршувало біомеханічні властивості кісток.

2. Якщо гідрокортизон призначати лише протягом 30 діб, у тварин І та ІІІ серій через 2 місяці після відміни препарату відзначалася стимуляція формоутворення молодих трабекул у зоні первинного остеогенезу: частка спонгіози у цих групах перевищувала контрольну на 2,39% та 0,49%. Біомеханічні параметри кісток та будова кристалічного матриксу за умов нетривалого впливу також відновлювалася.

3. Вплив дексаметазону вже з 7 доби спричиняв глибокі незворотні порушення, зупиняючи поздовжній та поперечний ріст кісток усіх типів, різку демінералізацію, морфологічну неповноцінність остеогенних зон епіфізного хряща та пригнічення ендогенної глюкокортикоїд-синтезуючої активності надниркових залоз, що може бути загрозливим через виникнення „синдрому відміни”.

4. Вплив бісфосфонату "Зомета" у дозі 0,362 мг/кг раз у 30 днів сприяв формуванню кісток з відносно високою масою, активацією утворення компактної речовини кісток, серед хімічних складових якої на 12,10% - 15,74% переважав органічний компонент. Поліпшене формування органічної речовини синхронізувалося з кумуляцією магнію у мінеральному матриксові та ретенцією магнію в організмі через зниження його екскреції з сечею.

5. Призначення бісфосфонату "Зомета" у статевонезрілому та репродуктивному віці, коли поздовжній ріст у кістковій системі ще активний, слід уникати, оскільки препарат гальмує подовження довгих трубчастих кісток, оскільки у епіфізному хрящі відбувається вкорочення через затримку визрівання хондроцитів та формування первинної спонгіози, а також наявні процеси декальцинації.

6. Якщо бісфосфонат "Зомета" призначався на фоні введення гідрокортизону, ефекти обох препаратів поєднувалися: позитивний вплив "Зомети" розвивався на пізніх термінах та відтворювався у вигляді підвищення маси кісток з активним формуванням органічного матриксу та поліпшення біомеханічої міцності кісток через збільшення показнику межі міцності на 17,72%. Проте бісфосфонат не коригував такі ефекти гідрокортизону, як погіршення аппозиційного остеогенезу, зниження маси кісток та ознаки ендостальної резорбції остеонів

7. У разі нетривалого впливу гідрокортизону (30 діб) з одночасним призначенням "Зомети" у статевонезрілому та репродуктивному віці негативні ефекти глюкокортикоїду нівелюються, а з позитивного боку прискорюється утворення первинної спонгіози, посилюється мінералізація та формування органічної речовини кісток; а "Зомета", у свою чергу, не призводить до вкорочення кісток: помірні дози гідрокортизону для кісткової системи на цих періодах онтогенезу служать стимуляторами остеогенезу, а процеси резорбції стримуються бісфосфонатом. Проте у щурів віку інволютивних змін домінують негативні ефекти гідрокортизону, що не робить доцільним призначати комбінацію препаратів у похилому віці.

8. Гуморальні рідини були високореактивною середою до отриманого впливу препаратами. Дія гідрокортизону викликала гіперкортизолурію, підвищення рівня кальцію крові та сечі, пересичення крові лужною фосфатазою, що трактувалося як активація кісткової резорбції. У разі застосування комбінації препаратів замість гіперкальциємії отримували відносну гіпокальциємію та гіпокальциурію, що перебували у межах 6,87% - 13,77% та 1,42% - 6,71%. Це відбувалося через інверсію типової фізіологічної ролі кальцію у кістковій системі, викликаною "Зометою": будь-яке підвищення рівня кальцію у крові передбачало декальцинацію у кістках (rx/y -0,89), через що організм намагався підтримувати гіпокальциємію.

9. Безпосередній вплив бісфосфонату "Зомета" формував у гуморальних середовищах ознаки загальмованого кісткового обміну: низький вміст остеотропних макроелементів тривав на фоні зниженого рівня лужної фосфатази, що набувало максимального прояву у молодих тварин, у яких найсильніше відбулося уповільнення поздовжнього росту кісток, що підтверджує недоцільність призначення препарату у статевонезрілому віці.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Лузин В.И., Стклянина Л.В, .Афонин Д.Н, Нехорошев М.В. Биомеханические характеристики костей скелета белых крыс старческого возраста при применении препарата „Кальцемин” // Украпнський медичний альманах. – 2003. – Том 6, №2. – С. 101-102. (Особистий внесок здобувача: обробка експериментального матеріалу, біомеханічне тестування, статистичний аналіз).

2. Стклянина Л.В., Грищук М.Г., .Бабанов Е.А. Биомеханические характеристики плечевой кости при травматическом повреждении большеберцовой кости у белых крыс и применении кальцемина // Украпнський морфологiчний альманах. – 2003. – Том 1, №1. – С.104. (Особистий внесок здобувача: оперативне втручання на щурах, скелетування об?єктів дослідження).

3. Лузин В.И., Стклянина Л.В. Особенности прочности костей скелета неполовозрелых крыс в условиях действия повышенного содержания глюкокортикоидов и золедроновой кислоты // Український морфологiчний альманах. – 2005. – Том 3, №1. – С.89-91. (Особистий внесок здобувача: розробка схеми експерименту, обробка отриманих результатів дослідженя).

4. Luzin V.I., Stklanina L.V., Astrakhantsev D.A. Bone strength parameters under effect of glucocorticoids and zoledronic acid in rats // Baltic Bone and Cartilage Conference, 1-3 september, Finland (Naantali). – P.100-101. (Особистий внесок здобувача: статистичний аналіз результатів дослідження, узагальнення результатів, формулювання висновків).

5. Стклянина Л.В. Фазовый состав минерала губчатого костного вещества неполовозрелых крыс при введении гидрокортизона и золедроновой кислоты // Проблеми остеологї. – 2006. – Том 9, (додаток). – С.110-111.

6. Ковешников В.Г, Лузін В.І., Сткляніна Л.В. Рентгеноструктурне дослідження мінералу губчастої кісткової речовини під впливом гідрокортизону та золедронової кислоти в експерименті // Клінічна анатомія та оперативна хірургія. – 2006. – Том 5, № 2. – С. 36-37. (Особистий внесок здобувача: виготовлення зразків кісткової золи для рентгеноструктурного аналізу, узагальнення отриманих даних.)

7. Стклянина Л.В. Особенности роста и формообразования костей скелета белых крыс различного возраста под влиянием повышенного уровня глюкокортикоидов и бисфосфоната “Зомета” // Український морфологiчний альманах. – 2005. – Том 3, №4. – С.88-89.

8. Ковешников В.Г., Лузін В.І., Сткляніна Л.В. Вплив підвищеного рівня глюкокортикоїдів та бісфосфоната "Зомета" на міцність кісток скелета білих щурів репродуктивного віку // Вісник морфології. – 2006. – № 12(2). – С. 227-228. .(Особистий внесок здобувача: проведення експерименту, остеометрія кісткових препаратів, узагальнення результатів).

9. Лузин В.И., Л.В. Стклянина Л.В. Особенности прочности костей скелета неполовозрелых крыс в условиях действия повышенного содержания люкокортикоидов и золедроновой кислоты // Український морфологiчний альманах. – 2005. – Том 3, №1. – С.89-91. (Особистий внесок здобувача: проведення біомеханічного аналізу, статистична обробка результатів).

10. Стклянина Л.В. Хімічний склад кісток у щурів різного вівку під впливом гідрокортизону та золедронової кислоти // Український морфологiчний альманах. – 2006. – Том 4, №3. – С.80-82.

11. Лузин В.И, Стклянина Л.В. Гістологічна будова епіфізного хряща та діафіза великогомілкової кістки у щурів різного віку під впливом гідрокортизону та золедронової кислоти // Український морфологiчний альманах. – 2005. – Том 4, №3. – С.38-40. (Особистий внесок здобувача: проведення гістоморфометрії, статистична обробка результатів).

АНОТАЦІЯ

Сткляніна Л.В. Ріст, будова та формоутворення кісток скелета під впливом підвищеного рівня глюкокортикоїдів та їх інібітора на різних етапах постнатального онтогенезу (анатомо-експериментальне дослідження).– Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.01 - нормальна анатомія. - Харківський державний медичний університет МОЗ України, Харків, 2007.

Дисертація присвячена морфологічним особливостям реакції кісткової системи та гуморальних рідин (кров, сеча) щурів статевонезрілого, репродуктивного та старечого віку (І, ІІ та ІІІ вікові серії) на вплив мінімальними дозами гідрокортизону, терапевтичними дозами бісфосфонату "Зомета", та на одночасне призначення обох препаратів. Використане комплексне дослідження, від остеометрії до кристалографічного та спектрального аналізів кісткової речовини, параметричних та непараметричних методів статистики. Встановлено, що вплив гідрокортизону погіршує стан та уповільнює темпи переважно губчастих структур кісток, викликає ознаки підвищеного кісткового обміну та резорбції. проте у разі нетривалого (протягом 30 діб) впливу гідрокортизону більшість показників відновлюється до контрольних. Вплив бісфосфонату "Зомета" уповільнює поздовжній ріст кісток, підвищує масу та вміст органічної речовини в кістках переважно плоского типу (кульшова кістка) та активує формування компактної речовини, викликає ознаки гальмування темпів кісткової перебудови. Призначення обох препаратів призводить до корекції більшості ефектів, що спричинені гідрокортизоном, за допомогою „Зомети” .Проте це відбувається на пізніх термінах спостереження, тоді як спочатку домінує дія гідрокортизону.

Ключові слова: кістки, гідрокортизон, бісфосфонат "Зомета"

АННОТАЦИЯ

Стклянина. Л.В. Рост, строение и формообразование костей скелета под воздействием повышенного уровня глюкокортикоидов и их ингибитора на разных этапах постнатального онтогенеза (анатомо-экспериментальное исследование).- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.01- нормальная анатомия.- Харьковский государственный медицинский университет МЗО Украины, Харьков, 2007.

Диссертация посвящена морфологическим основам реакции костей скелета разного типа (большеберцовой и