НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

Сторожук Максим Вікторович

УДК 612.82:576.54:577.3

Модуляція, пластичність та гетерогенність властивостей синаптичних зв’язків в простих нейронних мережах

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

КИЇВ - 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі загальної фізіології нервової системи

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий

консультант: академік НАН України, доктор біологічних наук,

професор

Костюк Платон Григорович,

завідувач відділом загальної фізіології нервової

системи, директор Інституту фізіології ім. О.О.

Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор

Веселовський Микола Сергійович,
завідувач відділом фізіології нейронних мереж
Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України.

член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор

Костерін Сергій Олексійович

заступник директора з наукової роботи та завідувач відділом біохімії мязів Інститутту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

доктор біологічних наук, професор

Макарчук Микола Юхимович,

завідувач кафедри фізіології людини і тварин
Київського Національного університету ім.

Т.Г. Шевченка.

Захист дисертації відбудеться 18.09.2007 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.198.01 при Інституті фізіології

ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ,

вул. акад. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розіслано 15.08. 2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Зміни ефективності синаптичної передачі внаслідок попередньої активності нейронів (синаптична пластичність) та впливу нейромодуляторів лежать в основі таких фундаментальних явищ як навчання та пам’ять. Порушення синаптичної пластичності та модуляції синаптичної передачі супроводжують практично всі захворювання головного мозку; більш того, такі порушення є причиною щонайменше значної частини цих захворювань. Тому розуміння принципів і механізмів пластичності та модуляції синаптичної передачі має також важливе прикладне значення. Для функціонування нервової системи є дуже важливою так звана гетерогенність (Craig, Boudin, 2001), або різноманітність (Cherubini, Conti, 2001) синаптичних зв’язків. Слід зазначити, що гетерогенність характерна, зокрема, для синаптичних зв’язків однакової ергічності.

Вивчення модуляції та пластичності на рівні окремих синаптичних зв’язків в центральній нервовій системі (ЦНС) високоорганізованих хребетних тварин пов’язано зі значними методичними та принциповими труднощами. Серед останніх слід зазначити велику кількість нейронних елементів та взаємодію чисельних модуляторних систем у складних нейронних мережах. Тому аналіз модуляції та пластичності синаптичної передачі доцільно проводити з використанням простих нейронних мереж таких як ЦНС безхребетних та культури нейронів мозку хребетних.

У даній роботі для вивчення раніше не досліджених аспектів питань щодо гетерогенності, модуляції та пластичності синаптичної передачі ми використовували нейрони інтактної ЦНС двох представників безхребетних тварин, а також культуру нейронів головного мозку одного із представників ссавців (щура).

Для вивчення синаптичної пластичності, що лежить в основі модифікацій поведінки тварин, ЦНС безхребетних, зокрема молюсків, надає унікальну можливість, не тільки досліджувати синаптичні зв’язки нейронів із популяцій клітин зі схожими властивостями (кластерів), але й зв’язки функціонально ідентифікованих індивідуальних нейронів. Використовуючи цю можливість, було показано, що важливу роль у здійсненні рефлексів втягування зябри та сифона у аплізії відіграють сенсорні нейрони (з кластера LE) та мотонейрони. Модуляція ефективності синаптичних зв’язків цих нейронів ендогенними модуляторами рефлексів втягування (зокрема, серотоніном) адекватно пояснює сенситизацію рефлексів, що спостерігається на рівні поведінки.

Проте дослідження окремих явищ, які спостерігаються на рівні поведінки, вказують на важливу роль інтернейронів як в опосередкуванні, так і в пластичних змінах рефлексів втягування зябри та сифона. Незважаючи на успіхи, досягнуті при дослідженні ролі інтернейронів, на момент початку даної роботи мало дослідженими або недослідженими залишались питання про роль: 1) модуляції ефективності синаптичних зв’язків гальмівних інтернейронів із сенсорними нейронами; 2) посттетанічної потенціації синаптичних зв’язків збуджуючих інтернейронів. Крім того, оскільки в ряді досліджень було переконливо показано полегшуючий вплив серотоніну на синаптичні зв’язки сенсорних нейронів з LE-кластера з мотонейронами, вважалося, що подібний ефект є характерним і для синаптичних зв’язків сенсорних нейронів усіх інших кластерів сенсорних нейронів абдомінального ганглія аплізії (в тому числі і з кластера RF). Проте безпосередньо це припущення не досліджувалось. Тому саме на цих питаннях була зосереджена наша увага при досліджені модуляції та пластичності синаптичної передачі в ЦНС молюсків.

На протязі тривалого часу основна увага в більшості досліджень, проведених на нейронах головного мозку ссавців, була спрямована на вивчення пластичності та модуляції збуджуючої глутаматергічної передачі. Безсумнівно, що глутаматергічна передача та її пластичність відіграють дуже важливу роль у функціонуванні ЦНС. Тим не менш, слід зазначити, що саме баланс між процесами збудження і гальмування є ключовим фактором нормального функціонування ЦНС. Тому зміни ефективності ГАМК-ергічної синаптичної передачі є не менш важливими. Наприклад, зміни ефективності ГАМК-ергічної передачі внаслідок попередньої нейронної активності можуть бути необхідними для індукції довготривалої потенціації глутаматергічної передачі. З іншого боку, надмірне зменшення гальмування може призвести до виникнення й розповсюдження епілептиформної активності. Тому пластичність ГАМК-ергічної синаптичної передачі відіграє важливу роль як у нормальному функціонуванні ЦНС, так і у розвитку певних патологій.

Слід зазначити, що останнім часом була запропонована концепція, згідно з якою розглядають дві основні форми пластичності в нейронних мережах (Turrigiano & Nelson, 2000), а саме: дієзалежну пластичність, пов’язану з попередньою активністю синапсів, та гомеостатичну пластичність, яка протидіє дієзалежній пластичності, забезпечуючи стабільність роботи нейронної мережі. Синаптична пластичність глутаматергічної передачі (як короткотривала, так і гомеостатична) досить добре досліджена, а про пластичність ГАМК-ергічної синаптичної передачі відомо значно менше. Зважаючи на вищезгадане, дослідження короткотривалої та гомеостатичної пластичності ГАМК-ергічної передачі представляють науковий інтерес і мають практичне значення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках наукових програм відділу загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України: "Механізми пластичності функцій нервових клітин. З’ясування ролі трансмембранної та внутрішньоклітинної сигналізації" (№ держреєстрації 199024188), "Молекулярні механізми інтегративної функції нервових клітин в нормі та при мозковій патології" (№ держреєстрації 197U0009158), "Молекулярні механізми, відповідальні за специфіку функцій різних мозкових структур" (№ держреєстрації 0100U002062).

Мета і завдання дослідження. Мета даної роботи полягала у дослідженні модуляції, пластичності та гетерогенності електрофізіологічних властивостей синаптичних зв'язків нейронів ЦНС.

Для досягнення даної мети були поставлені наступні основні завдання.

1. Дослідити вплив двох ендогенних модуляторів рефлексів втягування зябри та сифона у аплізії: нейропептида SCP та серотоніну на синаптичні зв'язки між гальмівним інтернейроном L16 та сенсорними нейронами.

2. Дослідити вплив серотоніну на ефективність синаптичних зв'язків сенсорних нейронів із RF кластера.

3. Дослідити посттетанічну потенціацію синаптичних зв'язків між збуджуючими інтернейронами та мотонейронами.

4. Дослідити вплив тривалої тетанічної стимуляції (30 Гц, 4 секунди) на ефективність ГАМК-ергічної синаптичної передачі, зосереджуючи увагу на можливій гетерогенності властивостей синаптичних зв'язків та з'ясувати, пре- чи постсинаптичні механізми залучені до відповідних пластичних змін.

5. Дослідити можливе залучення мітохондрій в посттетанічну потенціацію ГАМК-ергічної синаптичної передачі.

6. З'ясувати, чи притаманне явище "пригнічення гальмування, зумовленого деполяризацією" для ГАМК-ергічних синаптичних зв'язків нейронів неокортекса та чи характерне це явище для всіх (або частини) синаптичних зв'язків.

7. Дослідити можливе залучення постсинаптичних механізмів в модулюючий вплив ацетилхоліну на ГАМК-ергічну синаптичну передачу

8. Дослідити, чи характерні гомеостатичні зміни ГАМК-ергічної синаптичної передачі для нейронних мереж гіпокампа.

Об’єкт дослідження: препарати ізольованих гангліїв молюсків, культура нейронів гіпокампа та культура нейронів неокортекса щурів.

Предмет дослідження: модуляція, пластичність і гетерогенність властивостей синаптичних зв'язків.

Методи дослідження: петч-клемп реєстрація трансмембранних іонних струмів; мікроелектродна реєстрація мембранного потенціалу та його фіксація; одночасна реєстрація активності декількох синаптично пов’язаних нейронів, методи фокальної та локальної аплікації фармакологічноактивних речовин.

Наукова новизна отриманих результатів.

В ЦНС молюска аплізії вперше показано, що:

1) нейропептид SCP та серотонін (ендогенні модулятори рефлексів втягування зябри та сифона у аплізії) протилежним чином впливають на ефективність синаптичних зв’язків між гальмівним холінергічним інтернейроном L16 та сенсорними нейронами; пригнічуюча дія серотоніну на ефективність цих синаптичних зв’язків частково зумовлена постсинаптичними механізмами.

2) серотонін протилежним чином впливає на ефективність синаптичних зв’язків сенсорних нейронів з кластерів LE та RF. Таким чином, незважаючи на однакову ергічність, локалізацію в одному ганглії ЦНС аплізії та схожу функціональну роль, вищезгадані синаптичні зв’язки гетерогенні за своїми властивостями.

3) тетанічна стимуляція збуджуючого інтернейрона L29 в абдомінальному ганглії аплізії призводить до посттетанічної потенціації (ПТП) тривалістю більше, ніж 25 хвилин; ПТП ефективності синаптичних зв’язків збуджуючих інтернейронів в церебральних гангліях аплізії зумовлена пресинаптичними механізмами; збільшення ймовірності вивільнення медіатора відіграє важливу роль у цьому явищі. Крім того, вперше отримані фармакологічні дані щодо залучення кальцієвих каналів L- типу в ПТП.

В ЦНС молюска Helix pomatia.

1) Вперше виявлено, що дофамін зменшує ефективність пептидергічної синаптичної передачі між інтернейроном, що ініціює пачкову активність, та нейроном ППА1. Ці наші результати є підтвердженням гіпотези про екзогенну природу пачкової активності нейрона ППА1.

2) Вперше проведено оцінку провідності поодиноких цАМФ-керованих каналів, каналів, що опосередкують вплив пептиду, вивільняємого інтернейроном, ініціюючим пачкову активність в нейроні ППА1.

В культурі нейронів гіпокампа та неокортекса вперше показано наступне.

1) Тривала тетанічна стимуляція пресинаптичного нейрона (в культурі нейронів гіпокампа та в культурі нейронів неокортекса) протилежним чином впливає на ефективність ГАМК-ергічної синаптичної передачі в різних парах нейронів, що свідчить про гетерогенність електрофізіологічних властивостей ГАМК-ергічних синаптичних зв'язків.

2) Істотний внесок в модулюючий ефект ацетилхоліну на ГАМК-ергічну синаптичну передачу можуть вносити постсинаптичні механізми.

3) Залучення мітохондрій в посттетанічну потенціацію в центральних синапсах ссавців, а саме ГАМК-ергічних синапсах нейронів неокортекса.

4) Явище "пригнічення гальмування, зумовленого деполяризацією" притаманне ГАМК-ергічним синаптичним зв'язкам нейронів неокортекса, проте воно характерне лише для частини цих синаптичних зв'язків.

5) Вперше в нейронних мережах гіпокампа виявлені гомеостатичні зміни ГАМК-ергічної синаптичної передачі. Встановлено, що тривала блокада імпульсної нейронної активності за допомогою тетродотоксина призводить до зменшення ефективності ГАМК-ергічної синаптичної передачі, а тривале зменшення нейронної активності за допомогою блокатора іонотропних глутаматних рецепторів кінуренату призводить до змін короткочасної пластичності ГАМК-ергічної синаптичної передачі.

Теоретичне та практичне значення роботи.

Отримані результати мають теоретичне значення для розуміння механізмів, що забезпечують: пластичність синаптичної передачі, гетерогенність властивостей ГАМК-ергічної синаптичної передачі та рівновагу між процесами збудження та гальмування в нейронних мережах.

Оскільки рівновага між процесами збудження і гальмування є необхідною передумовою нормального функціонування головного мозку, отримані результати щодо гетерогенності властивостей ГАМК-ергічної синаптичної передачі можуть сприяти винайденню нових, більш специфічних фармакологічних препаратів, спрямованих на відновлення рівноваги між процесами збудження і гальмування (зокрема, антиепілептичних препаратів).

Особистий внесок здобувача. Автором проведено аналіз літературних джерел, поставлено задачі дослідження. Автор самостійно провів основну частину експериментів, аналіз, статистичну обробку й узагальнення результатів. Зокрема, особисто здобувачем були виконані практично всі представлені в роботі експерименти на нейронах молюсків та нейронах неокортекса. Деякі експерименти були проведені разом з іншими співавторами опублікованих робіт, співробітниками Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України: завідувачем відділом клітинної біології Університета Монреаля (Канада) професором В. Кастеллуччі, завідувачем лабораторією клітинних механізмів пластичності Медицинського коледжу Мехаррі (США) доктором С.М. Фредманом, кандидатами біологічних наук співробітниками Центру молекулярної фізіології та Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України С.Ю. Івановою, І.В. Мельником. Приготування культур нейронів гіпокампа здійснювалось С.Ю. Івановою, І.В. Мельником, Т.А. Півнєвою та І. В. Лушніковою; культур нейронів неокортекса С.Ю. Івановою.

Апробація результатів дисертації. Усі матеріали дисертації доповідались на семінарах Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, а також на наукових симпозіумах і з’їздах: щорічних конференціях Американського товариства нейронаук, США (1993, 1994; 1997; 1998); на V коференціії нейробіологічних наук (Монреаль 1997), на міжнародній школі - семінарі “Pharmacology of synaptic transmission in nervous system” (Київ, 16-17 червня 2002 р.), на ІІІ З’їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2000 р.), на Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 25-28 квітня 2004 р.), нейробіологічній конференції “The World of the Synapse “, Жіф-Сюр-Івет (Франція 2004), VIII Міжнародній конференції товариства нейробіології безхребетних тварин (Казань, Росія, 2006), а також на засіданнях сектора молекулярної фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 37 робіт, у тому числі 22 статті в фахових наукових журналах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел (391) найменувань. Робота викладена на 318 сторінках, містить 6 таблиць та ілюстрована 110 рисунками.

Основний зміст

У вступі обґрунтована актуальність дослідження модуляції та пластичності синаптичної передачі, сформульовано мету та задачі дослідження, наведені відомості про наукову новизну, практичне значення та апробацію отриманих результатів, а також про публікацію матеріалів дисертації.

Розділ “Огляд літератури” присвячений висвітленню: 1) сучасних уявлень про синаптичну передачу, зокрема про гальмівну синаптичну передачу в головному мозку та різноманітність ГАМКА-рецепторів 2) даних про модуляцію та короткотривалу пластичність синаптичної передачі в центральних синапсах 3) концепції гомеостатичної пластичності синаптичної передачі.

У розділі “Матеріали та методи дослідження” описано використані методичні підходи, а саме методи:

мікроелектродної реєстрації мембранного потенціалу та його фіксації;

фіксації потенціалу в режимі “ціла клітина”;

локальної аплікації фармакологічноактивних речовин (іонофоретичної аплікації, аплікації під тиском);

приготування культури нейронів гіпокампа та культури нейронів неокортекса, а також прийоми статистичної обробки отриманих результатів із використанням стандартних методів.

Дослідження синаптичної передачі в ЦНС молюсків Aplysia californica та Helix pomatia. Переважна більшість експериментів виконана на препаратах ізольованих гангліїв з використанням методу мікроелектродної реєстрації мембранного потенціалу, в режимі фіксації струму. Деякі експерименти були проведені в режимі фіксації потенціалу. Досліджувалася модуляція та пластичність синаптичних звязків ідентифікованих нейронів, зокрема, нейронів з відомим функціональним значенням у поведінці аплізії. Локалізація цих нейронів в абдомінальному ганглії аплізії показана на рис. 1.

Склад стандартного розчину в експериментах на нейронах абдомінального ганглія аплізії був наступним ( мМ): NaCl 460, KCl 10, CaCl2 11, MgCl2 55, Tris buffer 10 (pН 7.6). Склад стандартного розчину в експериментах на нейронах Helix pomatia (у мМ): NaCl 100, KCl 5 , CaCl2 10, MgCl2 10, Tris-HCl (pН 7.5).

Дослідження ГАМК-ергічної синаптичної передачі в культурі нейронів гіпокампа та культурі нейронів неокортекса.

Приготування культур нейронів гіпокампа та неокортекса. Для отримання клітин у новонароджених щурів лінії Вістар виділяли гіпокамп (або сесомоторну область неокортекса), розрізали зразок на п’ять частин, які переносили до сольового розчину, що містив 0,05 % пронази Е (Serva). Після ферментативної обробки протягом 18 хвилин при 32оС проводилося відмивання шматочків тканини гіпокампа або кори від фермента з подальшим диспергуванням до окремих клітин. Суспензію клітин щільністю 60 тис. на 200 мкл живильного середовища наносили на покриті полі-L-орнітином покривні скельця. Через 2 год інкубування при 36°С в атмосфері повітря, збагаченого з 5% СО2, у кожну чашку Петрі додавали 2 мл живильного середовища, яке містило 90% мінімального середовища Ігла (МЕМ), 10% кінської сироватки, 10 мкг/мл інсуліну та антибіотики. Середовище змінювали кожні чотири доби. Після 5 - 6 діб in vitro культури обробляли фторурацилом (1 мкМ) протягом 36 год для пригнічення проліферації гліальних клітин, після чого повністю заміняли живильне середовище. Дослідження гомеостатичної пластичності проводилося на нейронах гіпокампа. В цій серії експериментів здійснювали тривалу блокаду : 1) іонотропних глутаматних рецепторів за допомогою кінуренової кислоти (1 мМ); 2) імпульсної активності нейронів з використанням тетродотоксина (ТТХ , 1 мкМ). Контрольні і дослідні (вирощені в присутності блокаторів) культури інкубували паралельно. Безпосередньо перед експериментом контрольні та дослідні культури інкубували протягом однієї години у зовнішньоклітинному розчині без блокаторів.

Електрофізіологічні методи. Електрофізіологічні дослідження проводили з 14 по 26 день in vitro. Для реєстрації трансмембранних струмів використовувався метод фіксації потенціалу в режимі "ціла клітина" (Hamill et al., 1981). Опір петч-піпетки становив 4-6 МОм. В експериментах використовували ділянки покривних скелець із відносно низькою щільністю клітин (2 - 5 нейронів у полі зору діаметром 400 мкм). Збудження пресинаптичного нейрона здійснювали за допомогою зовнішньоклітинного електрода, розташованого поблизу соми або аксона цієї клітини. В експериментах, в яких досліджувалась депресія гальмівних постсинаптичних струмів (ГПСС) при парній стимуляції, пресинаптичну клітину стимулювали парою стимулів кожні 2 секунди з міжімпульсним інтервалом 100 мсек. Для вивчення впливу тривалої тетанізації на викликані ГАМК-ергічні постсинаптичні струми пресинаптичну клітину подразнювали серією стимулів із частотою 30 Гц протягом 4-х секунд. Склад розчинів, що використовувались у більшості експериментів, був наступним. Позаклітинний розчин (мМ): NaCl 140, KCl 4, CaCl2 2, MgCl2 1, HEPES 10, глюкоза 10 (pН 7,4). Електрофізіологічні вимірювання, як правило, проводились в присутності в позаклітинному розчині APV (20 мкМ) та CNQX (10 мкМ), щоб заблокувати синаптичні струми, опосередковані іонотропними глутаматними рецепторами.

Внутрішньоклітинний розчин (мМ): Cs-глюконат 100, CsCl 30, MgCl2 4, Na2ATP 4, EGTA 10, HEPES 10 ( pН 7,4). У серії експериментів з дослідження явища пригнічення гальмування, зумовленого деполяризацією” було використано подібний внутрішньоклітинний розчин, але з меншою концентрацією EGTA (5 мМ). У серії експериментів з дослідження впливу хронічної блокади іонотропних глутаматних рецепторів на властивості ГАМК-ергічної передачі використовували внутрішньоклітинний розчин такого складу (мМ): Cs-глюконат 118, CsCl 11, MgCl2 4, Na2ATP 4, CaCl2 0.5, EGTA 10, HEPES 10 (pН – 7,4). Експерименти проводили при кімнатній температурі (20–22 °С).

Струми аналізували за допомогою програми ANDATRA (Я. Бойчук, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця). Числові дані представлені як середня величина ± похибка середнього. Для статистичних порівнянь використовувався t-тест Стюдента.

У розділі “Результати досліджень” описані результати детального аналізу модуляції та пластичності синаптичної передачі, зокрема: 1) модуляції синаптичної передачі між гальмівним холінергічним інтернейроном L16 та сенсорними нейронами серотоніном та нейропептидом SCP; 2) модуляції збуджуючих синаптичних зв’язків сенсорних нейронів з LE та RF кластерів серотоніном; 3) посттетанічної потенціації (ПТП) синаптичних зв’язків збуджуючих інтернейронів; 4) модуляції ГАМК-ергічної синаптичної передачі ацетилхоліном; 5) пре- та постсинаптично-індукованої пластичності ГАМК-ергічної синаптичної передачі, а також 6) гомеостатичної пластичності ГАМК-ергічної передачі.

Модуляція ефективності синаптичних зв'язків гальмівного інтернейрона L16 в абдомінальному ганглії молюска аплізії нейропептидом SCP та серотоніном.

Гальмівний холінергічний інтернейрон L16 відіграє важливу роль в опосередкуванні та модуляції рефлексів втягування зябри і сифона аплізії. При дослідженні впливу ендогенних модуляторів цих рефлексів на ефективність синаптичних зв’язків між інтернейроном L16 та сенсорними нейронами встановлено наступне.

Нейропептид SCP (10 мкМ) викликав деполяризацію нейрона L16 (4.19 ± 0.45 мВ, n=8) і збільшення амплітуди повільних гальмівних постсинаптичних потенціалів (ГПСП) у сенсорних нейронах (Рис.2). В середньому, в присутності SCP збільшення амплітуди ГПСП складало 139 ± 46% і було статистично достовірним (Р<0.05, n=8).

Аплікація SCPB також збільшувала швидкі ГПСП у збуджуючих інтернейронах, викликані поодинокими потенціалами дії нейрона L16 (n=5). Слід зазначити, що цей ефект навряд чи обумовлений зміною вхідного опору мембрани постсинаптичного інтернейрона, оскільки він в присутності SCP не збільшувався.

Вплив серотоніну на ефективність синаптичних зв'язків нейрона L16 був протилежним впливу нейропептида SCP. Після аплікації серотоніну (5-10 мкМ) у сенсорних нейронах спостерігалося зменшення амплітуди ГПСП, викликаних стимуляцією нейрона L16 (Рис. 3).

В середньому, в присутності серотоніну амплітуда ГПСП зменшувалася до 22.5 ± 9.2% контрольних значень (Р<0.01, n=6). Слід зазначити, що в присутності серотоніну спостерігалось не тільки зменшення амплітуди повільних ГПСП у сенсорних нейронах, але і зменшення кількості потенціалів дії в нейроні L16, викликаних внутрішньоклітинною стимуляцією. Проте зменшення амплітуди ГПСП у сенсорному нейроні, очевидно, обумовлено не тільки зменшенням кількості потенціалів дії в нейроні L16. Відновлення кількості потенціалів дії у нейроні L16 в результаті збільшення інтенсивності внутрішньоклітинної стимуляції не відновлювало амплітуду ГПСП в сенсорних нейронів до контрольної величини. І в цих умовах амплітуда ГПСП була значно нижчою від контрольної (32.7 ± 6.8% ; Р<0.01, n=4).

Для виявлення можливого залучення постсинаптичних механізмів у пригнічуючий вплив серотоніну на ефективність синаптичних зв'язків між нейроном L16 і сенсорними нейронами були проведені експерименти, в яких досліджувалась дія серотоніну на відповіді, викликані прикладанням екзогенного ацетилхоліну (АХ-індуковані відповіді). Встановлено, що прикладання серотоніну (10 мкМ) призводить до зменшення амплітуди АХ-індукованих відповідей в сенсорних нейронах. Цей ефект спостерігався і в сенсорних нейронах інтактного абдомінального ганглія (зменшення до 64.5 ±11.8% контрольної величини, Р<0.05, n=6), і в ізольованих сенсорних нейронах (зменшення до 72.7± 4.89%; Р<0.05, n=9). Приклад результатів, отриманих на ізольованих сенсорних нейронах в режимі фіксації потенціалу, показано на Рис. 4.

Модулючий вплив серотоніну на ефективність синаптичних зв’язків сенсорних нейронів з кластерів LE та RF.

У ряді робіт було показано, що серотонін збільшує ефективність збуджуючих синаптичних зв’язків сенсорних нейронів із LE-кластера абдомінального ганглія аплізії. Це призводить до сенситізації захисних рефлексів. Зважаючи на те, що для реакції викиду чорнильної рідини, у яку переважно залучені сенсорні нейрони з RF-кластера, сенситізація не є характерною, ми досліджували модулюючий вплив серотоніну на синаптичні зв’язки цих нейронів

Для порівняння впливу серотоніну на ефективність синаптичних зв'язків, утворених сенсорними нейронами з кластерів LE та RF, використовувалася одночасна реєстрація від двох пар нейронів. А саме, досліджували синаптичні зв’язки LE-LFS і RF-L14 (Рис. 5).

Встановлено, що амплітуда ЗПСП, викликаних стимуляцією LE-нейронів, у присутності серотоніну збільшується на 64±24 % у порівнянні з контролем (P<0.05, t=2.64, N=6). На відміну від цього, амплітуда ЗПСП, викликаних стимуляцією RF-нейронів, у присутності серотоніну зменшувалася на 47.8±4.3% (P<0.01, t=11.1, N=6). Приймаючи до уваги те, що для синаптичних зв'язків сенсорних нейронів (з усіх кластерів) характерне явище гомосинаптичної депресії (наприклад, Рис. 5 Б), зменшення амплітуди ЗПСП після аплікації серотоніну в нейронах L14, яке спостерігалося в наших експериментах, могло б бути обумовленим не впливом речовини, а результатом синаптичної депресії. Для того, щоб розрізнити ці можливості, була проведена окрема серія експериментів. У частині з них (експериментальна група), як і в вищеописаних дослідах, аплікація серотоніну здійснювалася після п'яти контрольних реєстрацій, а в іншій (контрольній групі) аплікація серотоніну не здійснювалась.

В обох групах були досліджені не тільки зв'язки RF-нейронів з нейронами L14, але і з мотонейронами L7. Результати цих експериментів представлені на Рис. 6.

Посттетанічна потенціація в синапсах, утворених збуджуючими інтернейронами аплізії.

Крім модуляції синаптичної передачі, важливу роль в пластичності поведінки аплізії може відігравати дієзалежна синаптична пластичність, зокрема, явище посттетанічної потенціації. Тетанічна стимуляція збуджуючого інтернейрона L29 в абдомінальному ганглії аплізії, залученого в рефлекси втягування зябри та сифона, призводить до посттетанічної потенціації (ПТП) з тривалістю більше, ніж 25 хвилин (Рис.7).

Детальніше дослідження ПТП у синаптичних зв’язках збуджуючих інтернейронів проводилося на церебральних гангліях аплізії. Встановлено, що збільшення амплітуди ЗПСП під час ПТП супроводжується зменшенням їхнього коефіцієнта варіації (CV). Між збільшенням амплітуди ЗПСП та зменшенням CV спостерігалася достовірна кореляція ( Р < 0,008). Такі дані свідчать про залучення пресинаптичних механізмів до посттетанічної потенціації. На користь залучення саме пресинаптичних механізмів до ПТП свідчать також результати квантового аналізу, за допомогою якого встановлено, що ПТП у синаптичних зв’язках збуджуючих інтернейронів в церебральних гангліях зумовлена збільшенням імовірності вивільнення медіатора (рис. 8).

Слід зазначити, що посттетанічна потенціація значно зменшується в присутності блокаторів кальцієвих каналів L- типу (Рис. 9). Разом з нашими даними про те, що деполяризація постсинаптичного нейрона не є необхідним фактором для індукції ПТП, ці результати також свідчать про важливість саме пресинаптичних механізмів в цій формі пластичності синаптичної передачі в збуджуючих синапсах аплізії.

Короткочасна пластичність ГАМК-ергічної передачі, спричинена тетанічною стимуляцією.

При дослідженні впливу тривалої тетанізації (30 Гц, 4 с) встановлено, що в різних парах нейронів тетанічна стимуляція призводить до збільшення або до зменшення амплітуди викликаних гальмівних постсинаптичних струмів, тобто до посттетанічної потенціації чи до посттетанічної депресії ГПСС (рис. 10).

В культурах нейронів гіпокампа посттетанічна потенціація (ПТП) спостерігалася в 45% досліджених пар клітин, а посттетанічна депресія (ПТД) - в 55% .

Посттетанічна депресія супроводжувалася збільшенням коефіцієнтів варіації (CV) амплітуд ГПСС і зменшенням коефіцієнта парної стимуляції (КПС =I2/I1 де I2 та I1 - амплітуди ГПСС, викликаних, відповідно, першим і другим стимулами в парі). Під час посттетанічної потенціації спостерігалися протилежні зміни CV амплітуд ГПСС та коефіцієнта парної стимуляції. Такі результати свідчать про те, що пресинаптичні механізми залучені і до ПТП, і до ПТД.

Приймаючи до уваги дані літератури про наявність різних типів ГАМК-ергічних нейронів, ми припустили, що протилежні ефекти тетанізації, а саме ПТП і ПТД, можуть бути зумовлені відмінностями властивостей (гетерогенністю) саме пресинаптичних нейронів. На користь цього припущення свідчить можливість індукції ПТП та ПТД у тому самому постсинаптичному нейроні при тетанізації різних пресинаптичних нейронів (Рис 11).

Для подальшої перевірки цього припущення досліджувалося, чи є ще якісь відмінності між синаптичними зв'язками, у яких спостерігається потенціація і депресія після тетанічної стимуляції. Загалом в цій серії експериментів досліджено 29 пар нейронів (“ПТП пари” - n=13, “ПТД” пари - n=16). Виявлено достовірні відмінності коефіцієнтів варіації (CV) амплітуд викликаних ГПСС та величин I·CV2. Різниця амплітуд ГПСС була на межі вірогідності (P=0,05), а відмінності потенціалів реверсії ПСС і депресії при парній стимуляції, не були виявлені. В частині вищезгаданих експериментів (n=10), після вивчення впливу тетанізації, у позаклітинний розчин додавали тетродотоксин (1 мкМ), щоб заблокувати ГПСС, пов'язані з потенціалами дії, і реєстрували спонтанні ГПСС. Такий підхід дозволив розрахувати квантові параметри для синаптичних зв'язків, у яких спостерігалася посттетанічна потенціація й посттетанічна депресія. Розмір кванта (q) визначали як середню амплітуду спонтанних ГПСС у присутності ТТХ, квантовий вміст розраховували як Iсер/q, де Iсер середня амплітуда викликаних постсинаптичних струмів. Потім розраховували середню ймовірність вивільнення медіатора (P), використовуючи рівняння: m=(1+ CVq2-P)/CVГПСС2, та біноміальний параметр N (ймовірно відповідає числу місць вивільнення медіатора) розраховувався як N = m/P. Хоча розмір кванта дещо відрізнявся (рис. 12 А) для “ПТП” (-15,95±1,98 пА) та “ПТД” пар (-17,76±2,03 пА), ця відміна не була достовірною (P>0,5). Середня величина квантового вмісту m становила 37,85±15,73 для “ПТП-пар” і 61,52±15,98 для “ПТД-пар” (рис. 12 Б). Незважаючи на те, що величина m (квантовий вміст) значно відрізнялась в “ПТП” і “ПТД” парах, ця відмінність не була статистично достовірною (P>0,3). Проте спостерігалася значна і достовірна відмінність розрахованих величин P. Розрахована ймовірність вивільнення медіатора в “ПТП-парах” 0,52±0,13 була значно меншою, ніж в “ПТД-парах” 0,89±0,04 (рис. 12 В). Ця відмінність була достовірною (P<0,02). Величини N складали 94,4±35 та 70,0±16,8 для “ПТП-” і “ПТД-” пар відповідно (рис. 12 Г) і статистично достовірно не відрізнялись (P=0,5).

Тому можливим поясненням протилежного впливу тетанізації на ефективність ГАМК-ергічних зв'язків є різниця в імовірності вивільнення медіатора: нижча ймовірність вивільнення в “ПТП- парах” і більш висока в “ПТД-парах”.

На користь цього припущення свідчить кореляція між імовірністю вивільнення медіатора та впливом тетанізації на амплітуду ГПСС (рис. 13). Ця кореляція була досить вираженою і статистично достовірною (R=-0,84; P<0,05). Дійсно, за винятком однієї пари (з незначною ПТП), в синаптичних зв’язках з імовірністю вивільнення медіатора < 0,6 спостерігалась посттетанічна потенціація, у той час як у синаптичних зв'язках з більш високою ймовірністю вивільнення медіатора спостерігалась посттетанічна депресія.

Можна припустити, що пари, для яких ми не оцінювали P, теж підкоряються подібній закономірності: нижча ймовірність вивільнення характерна для пар із ПТП, а більш висока - для пар із ПТД. На користь цього припущення свідчить відмінність співвідношення Imean/Imax (яке для однакової кількості реєстрацій залежить від P) між “ПТП-” і “ПТД-” парами й кореляцією між співвідношенням Imean/Imax і ефектом тетанізації, розрахованим для всіх 29-ти синаптичних пар, досліджених у наших експериментах. Хоча кореляція була відносно слабкою (R=-0,4), вона була статистично достовірною (P<0,03). Таким чином, порівняння властивостей “ПТП-” і “ПТД-” зв'язків не виявило достовірних відмінностей амплітуд викликаних струмів, а також квантових параметрів q, m і N, але в той же час встановлено, що коефіцієнт варіації амплітуд викликаних ГПСС і ймовірність вивільнення медіатора з пресинаптичної терміналі істотно відрізняються в “ПТП-” і “ПТД-” зв'язках. Для “ПТП-” зв'язків характерна більш низька ймовірність вивільнення медіатора (Р=0,52), а для “ПТД”- пар - висока ймовірність його вивільнення (Р=0,89).

Тривала тетанізація (30 Гц, 4 с), також протилежним чином впливала на ГАМК-ергічну синаптичну передачу в культурі нейронів неокортекса. Проте в цьому препараті посттетанічна потенціація спостерігалася в 70% досліджених пар нейронів; посттетанічна депресія - в 30% пар.

Раніше було показано важливу роль мітохондрій у синаптичній пластичності деяких збуджуючих синапсів, проте це питання не вивчалося у гальмівних (зокрема, ГАМК-ергічних) синапсах. Тому нами було досліджено можливе залучення мітохондрій у ПТП ГАМК-ергічної передачі. Для цього вивчався вплив факторів, які блокують захоплення (і подальше вивільнення) іонів кальцію мітохондріями. Встановлено, що протонофор СССР, в концентрації 1-2 мкМ істотно зменшує ПТП (Рис. 14).

Посттетанічна потенціація ГАМК-ергічної передачі також значно (до 24 % від контролю; n = 6; Р < 0.02) зменшувалась у присутності 10 мкМ ТРР+ - ліпофільних катіонів, які блокують натрій-залежний і натрій-незалежний вхід кальцію в мітохондрії, не спричинюючи істотного впливу на синтез АТФ (Tang, Zucker, 1997).

Короткочасна пластичність ГАМК-ергічної передачі, спричинена деполяризацією постсинаптичного нейрона.

Слід зазначити, що активність не тільки пресинаптичних нейронів, але і постсинаптичних нейронів, відіграє важливу роль у пластичності ГАМК-ергічної передачі. Зменшення ефективності ГАМК-ергічної синаптичної передачі спостерігається після генерації потенціалів дії постсинаптичними нейронами, або в умовах фіксації потенціалу на мембрані, після їхньої короткочасної деполяризації. Це явище, назване “пригнічення гальмування, зумовленого деполяризацією” (“depolarization-induced suppression of inhibition” (DSI), було вперше виявлено у нейронах Пуркіньє мозочка, а потім у пірамідних клітинах СА1 зони гіпокампа. В наших експериментах було досліджено, чи притаманне пригнічення гальмування, зумовлене деполяризацією (ПГЗД), ГАМК-ергічним зв’язкам нейронів неокортекса щура.

Відведення синаптичних струмів в умовах фіксації потенціалу проводилося від постсинаптичного нейрона при підтримуваних потенціалах від –75 до -70 мВ. Після реєстрації не менш ніж 20-ти контрольних відповідей, мембрану постсинаптичного нейрона деполяризовали на 5 секунд до рівня –10 мВ, після чого потенціал повертали до попереднього значення і здійснювали ще 20-40 реєстрацій. Встановлено, що така деполяризація постсинаптичного нейрона призводить до зменшення ефективності ГАМК-ергічної передачі в 6 з 26 досліджених пар нейронів (Рис 15 А). В інших парах нейронів такого ефекту не спостерігалося (Рис 15 Б).

Порівняння часового перебігу ПГЗД зі змінами в часі амплітуд ГПСС в парах нейронів, у яких ПГЗД не спостерігалося (Рис. 16), показує, що тривалість ПГЗД складає близько 70 секунд.

Пригнічення гальмування, викликане деполяризацією, супроводжувалося достовірним збільшенням коефіцієнта парної стимуляції (на 32±20%, n=6; Р<0.05) та коефіцієнта варіації амплітуд ГПСС (на 244±122 %; n =6; p < 0.05). Ці результати свідчать про залучення пресинаптичних механізмів у ПГЗД.

Модуляція ГАМК-ергічної синаптичної передачі ацетилхоліном.

При вивченні впливу іонофоретичної аплікації ацетилхоліну (АХ) на викликані ГАМК-ергічні струми встановлено, що пригнічуючий влив цієї речовини, як правило, супроводжується змінами коефіцієнта парної стимуляції (рис. 17 А). Це вказує на залучення пресинаптичних механізмів в модулюючий ефект ацетилхоліну і добре узгоджується з даними літератури, отриманими іншими авторами. Проте слід зазначити, що ефект ацетилхоліну на КПС, у порівнянні з його впливом на ГПСС, був значно більш варіабельним. Це обумовлено тим, що пригнічуючий вплив ацетилхоліну на амплітуду ГПСС не в усіх експериментах супроводжувався очевидними змінами КПС (рис. 17 В). Крім того, часовий перебіг змін КПС і зменшення амплітуди ГПСС також у деяких випадках помітно відрізнялися (рис. 17 Б). Ці результати дозволяють припускати, що ефект ацетилхоліну можуть опосередковувати декілька різних механізмів, включаючи постсинаптичні.

Щоб перевірити припущення про участь постсинаптичних механізмів у дії ацетилхоліну на ГАМК-ергічні постсинаптичні струми, в окремій серії експериментів досліджувався вплив ацетилхоліну на відповіді, викликані іонофоретичною аплікацією екзогенної ГАМК. Встановлено, що в 4 із 10 досліджених нейронів ацетилхолін (20 мкМ) зменшує відповіді, викликані прикладанням екзогенної ГАМК (Рис 18). Для цих чотирьох клітин амплітуда постсинаптичних відповідей, зумовлених прикладанням екзогенної ГАМК, під впливом ацетилхоліну зменшувалася на 20.7 ± 4.9%. Слід зазначити, що така ж концентрація ацетилхоліну (20 мкм) у перфузуючому розчині спричиняла більш виражений вплив на амплітуду викликаних ГПСС у порівнянні з ефектом на амплітуду відповідей, викликаних прикладанням екзогенної ГАМК, та спостерігалась в усіх досліджених нейронах. В середньому амплітуда постсинаптичних відповідей зменшувалася на 52 ± 2.3% (n=5).

Гомеостатична пластичність ГАМК-ергічної синаптичної передачі.

В експериментах по дослідженню гомеостатичної пластичності були проведені дві серії експериментів, у яких вивчалися можливі ефекти тривалого впливу факторів, які зменшують або блокують імпульсну нейронну активність у культурі нейронів гіпокампа, на деякі властивості ГАМК-ергічної синаптичної передачі. А саме, було досліджено вплив: 1) тривалої блокади іонотропних гутаматных рецепторів за допомогою кінуренату (1 мм), тобто вплив що приводять до зменшення спонтанної імпульсної активності нейронів; 2) тривалої блокади нейронної активності за допомогою тетродотоксину (1 мкм) - відомого блокатора потенціалозалежних натрієвих каналів. Порівнювалися наступні властивості викликаних ГАМК-ергічних ПСС: потенціали реверсії ГПСС, амплітуди ГПСС (при градієнті потенціалу 25 мв), коефіцієнти варіації амплітуд ГПСС, депресія ГПСС при парній стимуляції (ДППС). ДППС розраховували як: (ГПСС1-ГПСС2)/ГПСС1, де ГПСС1 і ГПСС2 – амплітуда гальмівного постсинаптичного струму, у відповідь на перший і другий стимул у парі, відповідно. Перед електрофізіологічними дослідженням контрольні й дослідні культури протягом однієї години інкубували в позаклітинному розчині без блокаторів.

Вплив тривалої блокади іонотропних глутаматних рецепторів на ГАМК-ергічні ПСС. Виявлено, що тривала блокада глутаматергічної передачі кінуренатом збільшує депресію при парній стимуляції (ДППС).

Зменшення відповіді на другий стимул у парі було істотно більшим у культурах, вирощених у кінуренаті (дослідні культури), ніж у контрольних культурах (рис. 19 А). У середньому, ДППС була 0,21±0,043 (n=8) у контрольних і 0,35±0,033 (n=9) у дослідних культурах (рис. 19 Б). Таким чином, величина ДППС збільшилась на 67% (P<0,01). Як у контрольних, так і в дослідних культурах, депресія при парній стимуляції супроводжувалася збільшенням коефіцієнтів варіації (CV) амплітуд ГПСС2 у порівнянні з ГПСС1. Співвідношення CV2/CV1 складало 0,89±0,07 у контрольних і 0,7±0,06 у дослідних культурах. Відносне збільшення CV2 у дослідних культурах було статистично достовірним (P<0,02). Ці результати вказують на те, що пресинаптичні механізми беруть участь у депресії при парній стимуляції. У той же час не виявлено пливу тривалої блокади глутаматергічної синаптичної передачі на амплітуду викликаних ГАМК-ергічних ПСС (рис. 19 В), на абсолютні величини коефіцієнтів варіації (CV) ГПСС (рис. 19 Г) і на потенціал реверсії ГПСС (рис. 19 Д). Таким чином, враховуючи зміну депресії при парній стимуляції, можна припустити, що в основі даного ефекту лежать пресинаптичні процеси.

Вплив тривалої блокади спонтанної імпульсної активності нейронів.

Виявлено, що тривала блокада імпульсної активності нейронів призводить до значного зменшення амплітуд викликаних ГПСС (рис. 20 А) і збільшення коефіцієнтів варіації амплітуд ГПСС.

У середньому, амплітуда викликаних ГПСС була –694,17±153,2 пА (n=7) у контрольних парах і –184,7±27,95 пА (n=5) у парах, вирощених в присутності TTX (рис. 20 В). Статистичний аналіз цих результатів показав достовірну відмінність P< 0,02.

Середня величина коефіцієнта варіації амплітуд ГПСС для контрольних пар складала –0,078±0,012, а для дослідних культур –0,241±0,0360 (рис. 20 Г). Відмінності були статистично достовірними Р<0,01. В той же час вплив тривалої блокади імпульсної активності нейронів на депресію при парній стимуляції (рис. 20 Б) та на потенціали реверсії ГПСС (рис. 20 Д), не були виявлені. Таким чином, зменшення амплітуд викликаних ГАМК-ергічних ПСС, що супроводжується збільшенням коефіцієнтів варіації ПСС в умовах хронічної блокади спонтанної імпульсної активності нейронів дозволяє припускати, що ці зміни частково обумовлені пресинаптичними механізмами.

Аналіз та узагальнення результатів досліджень

Модуляція синаптичної передачі та пластичність синаптичних зв'язків між ідентифікованими нейронами.

Важливою перевагою дослідження модуляції та пластичності синаптичної передачі в ЦНС молюсків є можливість безпосереднього визначення ролі цих явищ в пластичних змінах поведінки тварини. Важливу роль у