БІЛОЦЕРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

сЄГОДІН ОЛЕКСАНДР БОрисович

УДК 619:616.72 – 07:615:636.028

ПАТОГЕНЕТИЧНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ РОЛІ ГЛІКОЗАМІНОГЛІКАНІВ У ДІАГНОСТИЦІ ТА ЛІКУВАННІ ОСТЕОАРТРОЗУ В СОБАК

16.00.05 – ветеринарна хірургія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Біла Церква – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківській державній зооветеринарній академії

Міністерства аграрної політики України

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор

Тимошенко Ольга Павлівна,

Харківська державна зооветеринарна академія,

кафедра клінічної діагностики

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор

Іздепський Віталій Йосипович,

Луганський національний аграрний університет,

завідувач кафедри хірургії та

хвороб дрібних тварин

кандидат ветеринарних наук, доцент

Крупник Ярослав Григорович,

Львівський національний університет ветеринарної

медицини і біотехнологій ім. С.З. Ґжицького,

кафедра хірургії

Захист дисертації відбудеться “19” грудня 2007 р. о 12.30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 27.821.02 при Білоцерківському державному аграрному університеті за адресою: 09111, м. Біла Церква, вул. Ставищанська, 126; навчальний корпус №8, ауд. №1.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Білоцерківського державного аграрного університету за адресою: м. Біла Церква, Соборна площа, 8/1.

Автореферат розісланий “ 15 ” листопада 2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, доцент ___________________ Чорнозуб М.П.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Остеоартроз – хвороба, зумовлена дистрофічно-деструктивним процесом у кістковій та хрящовій тканинах суглобів, які часто вражають тварин і людей. Описані спонтанні захворювання на остеоартроз суглобів великої рогатої худоби (Тихонюк Л.А., 1983; Панько І.С, 1984; Петренко О.Ф., 1988; Рубленко С.В., 1997 та ін.), коней (Іздепський В.Й., Стоцький О.Г., 1998; Передера Р.В., 2004; King M., 2000 та ін.), свиней, собак, кішок (Давыдов В.Б., 2000; MacFail C.M., 2000; Сухонос В.П., 2006 та ін.), верблюдів, овець, а також лабораторних тварин – білих щурів, мишей, кролів, хом’яків (Тимошенко О.П., 1995).

Патогенетичною основою остеоартрозу є порушення метаболізму та структури хряща – передусім його протеогліканового компонента у відповідь на дію різних пошкоджувальних факторів. Деполімеризація протеогліканових агрегатів, що розвивається, призводить до дегенерації суглобового хряща, утворення ерозій і тріщин, навіть до втрати його частини (Коваленко В.Н., Борткевич О.П., 2003).

Існуючі методи діагностики захворювань суглобів часто не дозволяють виявити на ранній стадії пошкодження саме суглобового хряща, який руйнується у більшості випадків раніше, ніж кістка, окрім комп’ютерної томографії та магніто-резонансних досліджень. Разом з тим, високоінформатив-ними є клініко-біохімічні методи, які дозволяють оцінити форму і стадії ушкоджень суглобів. У ветеринарній медицині це питання вивчено недостатньо (Черняк С.В, 1999; Стоцький О.Г., 1999; Чорнозуб М.П., 1999).

У медикаментозному лікуванні остеоартрозу одне з перших місць належить речовинам, що мають хондропротекторні та хондромодулювальні властивості. У ветеринарії немає об’єктивних і високочутливих критеріїв оцінки їх впливу на процес відновлення структури тканин та функцій суглоба, не вивчені стадії захворювання, на яких доцільно їх застосовувати.

Низький репаративний потенціал хрящової тканини утруднює проблему хірургічного лікування остеоартрозу і стимулює розробку методів, спрямованих на оптимізацію регенерації та відновлення повноцінного гіалінового суглобового хряща. Серед них – пластика дефектів кістково-хрящовими трансплантатами.

Вивчення провідних ланок патогенезу остеоартрозу, зокрема порушень обміну протеогліканів на експериментальних тваринах, обстеження хворих на спонтанний остеоартроз собак, розробка та удосконалення методів його діагностики і лікування є актуальними науковими проблемами, які потребують подальших досліджень.

Зв’язок дисертаційної роботи з науковими програмами. Дисертаційна робота є фрагментом наукової теми кафедри клінічної діагностики Харківської державної зооветеринарної академії “Розробка і впровадження нових та вдосконалення існуючих методів лабораторної діагностики для оцінки стану здоров’я тварин”, номер державної реєстрації 0102U003546.

Мета роботи – обґрунтування в експерименті і клініці інформативності сироваткових глікозаміногліканів у діагностиці остеоартрозу в собак, удоско-налення методів його консервативного та оперативного лікування.

Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні завдання:

- вивчити в експерименті на білих щурах структурні і метаболічні показники перебігу посттравматичного запального процесу в кістково-хрящовому дефекті колінного та кульшового суглобів;

- дослідити морфологічні особливості перебігу посттравматичного деструктивно-дистрофічного процесу в суглобах та динаміку біохімічних показників у сироватці крові білих щурів на тлі застосування глюкозаміногідрохлориду;

- встановити клініко-біохімічні критерії стану суглобів собак ахондро- та хондродистрофоїдних порід на основі визначення сироваткових глікозаміногліканів;

- обґрунтувати і удосконалити методи консервативного лікування спонтанних остеоартрозів собак шляхом застосуванням препаратів, що містять глікозаміноглікани;

- розробити в експерименті на білих щурах і собаках та об’єктивізувати за допомогою біохімічних досліджень метод аутопластики повношарового дефекту суглобової поверхні кульшового суглоба.

Об’єкт дослідження – остеоартроз собак.

Предмет дослідження. Сироваткові глікозаміноглікани як діагностичні тести для оцінки стану суглобового хряща за остеоартрозу собак, удосконалені методи його консервативного і оперативного лікування.

Методи дослідження – загальноклінічні; рентгенологічні; комп’ютерна томографія; експериментальне моделювання (посттравматичний остеоартроз колінного та кульшового суглобів білих щурів, повношаровий дефект головки стегнової кістки білих щурів та собак); біохімічні дослідження сироватки крові: вміст загального кальцію, неорганічного фосфору, загального білка та білкових фракцій, сіалових кислот, сечовини; активність лужної фосфатази (ЛФ), аланінамінотрансферази (АлАТ), аспартатамінотрансферази (АсАТ); визначення концентрації глікопротеїнів (ГП), загальних хондроїтинсульфатів (ХСТ), фракцій глікозаміногліканів (ГАГ); гістологічні методи; методи статистичного аналізу.

Наукова новизна роботи полягає в тому, що вперше у ветеринарній хірургії за допомогою клінічних та експериментальних досліджень вивчені важливі патогенетичні ланки перебігу остеоартрозу в собак – роль різних глікозаміногліканів у розвитку запального та деструктивно-дистрофічного процесів у суглобах. Уперше доведено діагностичну інформативність визначення загальних глікозаміногліканів та їх фракційного складу, глікопротеїнів, хондроїтинсульфатів, активності лужної фосфатази та протеїнограми сироватки крові собак для оцінки різних стадій дистрофічно-деструктивного процесу в кульшовому суглобі. Уперше теоретично обгрунтовані клініко-біохімічні критерії різних, у тому числі ранніх, стадій остеоартрозу в умовах експерименту на білих щурах, що було апробовано за спонтанного остеоартрозу в собак. Визначення сироваткових глікозаміногліканів та їх фракційного складу використано для оцінки ефективності консервативного лікування остеоартрозу в собак із застосуванням ГАГ-містких препаратів. Уперше розроблено в експерименті спосіб аутопластики повношарового дефекту головки стегнової кістки білих щурів та собак, що дозволяє швидко відновити функцію суглоба шляхом використання як аутотрансплантат проксимального відділу ребра. На основі визначення сироваткових глікопротеїнів, хондроїтинсульфатів, глікозаміно-гліканів та їх фракцій запропоновано комплекс клініко-біохімічних показників для контролю за приживленням та перебудовою аутотрансплантата.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено, експериментально та теоретично обґрунтовано і апробовано діагностичний комплекс біохімічних показників сироватки крові собак, хворих на остеоартроз великих суглобів, на підставі тестів, що характеризують стан сполучної тканини – глікопротеїнів, хондроїтинсульфатів, фракцій глікозаміногліканів, а також активності лужної фосфатази та складу протеїнограми. Визначені межі значень показників для здорових тварин та хворих на різних стадіях спонтанного остеоартрозу. Були встановлені клініко-біохімічні критерії стану суглобів у собак ахондро- та хондродистрофоїдних порід і визначені ліміти їх значень.

Одержано патент на корисну модель “Спосіб здійснення кістково-хрящової аутопластики дефекту суглобового хряща”, що дозволяє повністю відновити анатомічні, морфологічні та функціональні характеристики кульшового суглоба собак під контролем комплексу біохімічних показників, основу якого складає визначення сироваткових глікопротеїнів, хондроїтинсульфатів, глікозаміногліканів та їх фракційного складу.

Одержані результати використовуються в науково-дослідній роботі та під час викладання предметів “Ветеринарна хірургія”, “Клінічна біохімія” у Харківській державній зооветеринарній академії, “Клінічна біохімія” – Національному фармацевтичному університеті, “Ветеринарна хірургія” – Білоцерківському державному і Луганському національному аграрних університетах.

Особистий внесок здобувача. Здобувач самостійно виконав всі експерименти і досліди на тваринах, провів клінічні та біохімічні дослідження, здійснив розрахунки, проаналізував одержані дані, провів статистичну обробку. Гістологічні дослідження тканин суглобів виконувалися в Державній установі “Інститут медичної радіології ім. С.П. Григор’єва Академії медичних наук України” за консультативної допомоги кандидата біологічних наук В.А. Гусакової. Комп’ютерна томографія виконувалася в 5-й центральній клінічній лікарні м. Харків у відділі комп’ютерної томографії на приладі “SeleCT SP” (Marconi) у черевному положенні тварини із застосуванням міорелаксантів за консультативної допомоги лікаря-рентгенолога В.Л. Мощенка.

Апробація дисертації. Матеріали дисертації доповідалися на міжнародних науково-практичних конференціях: присвяченій 150-річчю з дня заснування Харківського зооветеринарного інституту (Харків, 2001 р.), “Проблеми неінфекційної патології тварин” (Біла Церква, 2005 р.), “Сучасність і майбутнє аграрної науки та виробництва” (Львів, 2006 р.), науково-практичній конференції хірургів “Сучасні проблеми ветеринарної хірургії” (Харків, 2004 р.), звітних наукових конференціях з підсумків науково-дослідної роботи за 2001–2002 роки (Харків, 2002 р.) та за результатами наукової діяльності вчених факультету ветеринарної медицини ХДЗВА з міжнародною участю “Актуальні проблеми ветеринарної медицини” (Харків, 2007).

Публікації за темою дисертації. Результати досліджень представлені у 10 статтях, опублікованих у фахових збірниках наукових праць: Харківського зооветеринарного інституту (1), Харківської державної зооветеринарної акаде-мії (4), „Вісник Білоцерківського державного аграрного університету” (3), „Нау-ковий вісник Національного аграрного університету” (1), „Науковий вісник Львівської національної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького” (1), а також у тезах першого Міжнародного симпозіуму „Методи хімічного аналізу” (Севастополь, 1–3 жовтня 2002 р.) (1), деклараційному патенті на корисну модель №5599 “Спосіб здійснення кістково-хрящової аутопластики дефекту суглобового хряща”.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, 3-х розділів власних досліджень, їх узагальнення та аналізу, висновків і практичних рекомендацій, які викладені на 133 сторінках комп’ютерного тексту; списку використаної літератури, що містить 182 джерела, у тому числі 99 – з далекого зарубіжжя. Робота містить 10 таблиць та 21 рисунок.

Вибір напрямів досліджень, матеріал та методи виконання роботи

Механізми виникнення та розвитку остеоартрозу дотепер залишаються не до кінця з’ясованими, а лікувальна тактика чітко не визначена. Встановлено, що це захворювання вражає біля 20 % собак у популяції тварин віком більше одного року (MacFail C.M., 2000). З даних літератури відомо, що патогенетич-ною основою остеоартрозу є порушення метаболізму хряща, передусім, його протеогліканового комплексу. Методика моделювання остеоартрозу на експериментальних тваринах дає можливість визначити в динаміці клініко-біохімічні критерії дегенеративно-деструктивного процесу. У той же час існую-чі методи діагностики захворювань суглобів свійських тварин не завжди дозволяють виявляти ранні ознаки ушкоджень суглобового хряща. Разом з тим, за даними гуманної медицини, існують високоінформативні клініко-біохімічні показники стану сполучної тканини, які визначаються за рівнем вуглеводно-білкових компонентів у рідких біологічних середовищах організму, що дозво-ляє оцінити різні стадії патологічного процесу в суглобах (Лєонтьєва Ф.С., 2003). Ці питання у ветеринарній медицині вивчені недостатньо (Чорнозуб Н.П., 1999). У консервативному лікуванні такої патології одне з перших місць посідають створені на основі глікозаміногліканів препарати, які містять, головним чином, глюкозамін та хондроїтинсульфати і здатні уповільнювати прогресування остеоартрозу. Для лікування тяжких її проявів у собак існують хірургічні методи, але вони потребують подальшого удосконалення. У практиці ветеринарних лікарів відсутні об’єктивні високочутливі критерії оцінки ефективності як консервативних, так і оперативних методів лікування ушкод-жень хрящової тканини та відновлення функцій суглобів собак. Всі ці відомості й визначили напрям наших досліджень.

Роботу виконували упродовж 2001–2006 рр. на базі ветеринарних клінік м. Харків, на кафедрах хірургії і клінічної діагностики Харківської державної зооветеринарної академії, в акредитованому відділі лабораторної діагности- ки і імунології Інституту патології хребта та суглобів ім. проф. М.І. Ситенка (атестат акредитації 100 – 0623/2001 від 20.06.2001), згідно з договором про наукове співробітництво. Проведено клінічне обстеження і лабораторний аналіз крові 172 білих щурів та 78 собак. Експерименти виконані відповідно до концепції 3R згідно із загальними принципами експериментів на тваринах, що ухвалені на першому національному конгресі з біоетики (Київ, 2001) й узгоджені з положеннями Європейської конвенції про захист хребетних тварин, яких використовують для експериментальних та інших наукових цілей (Страсбург, 1985).

Дослідження проводили у три етапи. На першому – щурів 6–11-місячного віку (122 особини, маса тіла 300–350 г) використовували для вивчення в експерименті структурних і метаболічних показників за посттравматичного остеоартрозу колінних та кульшових суглобів з метою встановлення інформативності біохімічних показників і визначення ефективності застосування глюкозаміногідрохлориду.

У першій серії досліду посттравматичний остеоартроз моделювали шляхом пошкодження колінного суглоба білих щурів 6-місячного віку оперативним шляхом (із застосуванням стандартного зуболікувального бора) у вигляді міжвиросткового дефекту в дистальному відділі стегнової кістки; це дозволило одержати ідентичні пошкодження суглобової поверхні (Тимошен- ко О.П., 2000). З наступного дня після операції 32-м тваринам дослідної групи через добу внутрішньом’язово (у задньостегнову групу м’язів інтактної кінцівки) вводили 0,2 мл ампульованого розчину глюкозаміногідрохлориду в дозі 50 мг на 1 кг маси тіла тварин. Їх виводили з експерименту на 7, 14, 28 і 42-гу доби після операції. В кожний термін за допомогою гістологічних методів виконували дослідження зразків, одержаних з дистальних відділів стегнових кісток з міжвиростковим дефектом, а також вивчали динаміку біохімічних компонентів сироватки крові за методичними рекомендаціями з експеримен-тального дослідження та клінічного вивчення протиартрозних (хондромодулю-вальних) лікарських засобів (Зупанец І.А. та ін., 1999). Як контроль викорис-товували результати дослідження сироватки крові 10-ти інтактних тварин 6-місячного віку. З досліду щурів виводили методом декапітації під тіопенталовим наркозом; у цей момент відбирали проби крові; під час розтину одержували зразки колінних суглобів.

У другій серії досліду посттравматичний остеоартроз кульшового суглоба моделювали шляхом пошкодження суглобової поверхні правого кульшового суглоба у 51-го білого щура-самця лінії Вістар у віці 6 міс. Загальний термін спостережень складав 3 міс. Було сформовано також дві вікові групи інтактних тварин, зважаючи на те, що вік щурів протягом експерименту збільшився на 3 міс., тобто інтактні тварини були обстежені у віці шість (n=10, тварини з попередньої серії досліду) та дев’ять (n=5) місяців. З наступного дня після операції тваринам дослідної групи через добу внутрішньом’язово вводили 0,2 мл розчину ампульованого глюкозаміногідро-хлориду в дозі 50 мг на 1 кг маси тіла упродовж одного місяця. Після одно-місячного курсу ін’єкцій розчин глюкозаміногідрохлориду вводили два рази на тиждень упродовж трьох місяців у відповідних серіях експерименту. Тварин виводили з досліду шляхом декапітації із застосуванням тіопенталового наркозу на 21, 30 та 90-у доби з моменту операції. Під час забою відбирали проби крові від усіх тварин і в сироватці крові визначали біохімічні показники, які відображають ступінь деполімеризації вуглеводно-білкових компонентів міжклітинної речовини кісткової і хрящової тканин пошкодженого суглоба. Була проведена візуальна оцінка дефекту суглобової поверхні за методом H. Mankin у модифікації Н.В. Дєдух, С.В. Малишкіної та Є.Я. Панкова (Дедух Н.В., Зупанец И.А., Черных В.Ф. та ін., 1992).

У сироватці крові щурів визначали вміст глікопротеїнів за методом О.П. Штейнберг та Я.І. Доценко (Тимошенко О.П., Вороніна Л.М., Кравченко В.М. та ін., 2003), хондроїтинсульфатів – за методом M. Nemeth–Csoka у модифікації Л.І. Слуцького (Левченко В.І., Новожицька Ю.М., Сахнюк В.В. та ін., 2004), фракцій ГАГ сироватки крові – за методом М.Р. Штерна, Ф.С. Леонтьєвої, О.П. Тимошенко та ін. (Тимошенко О.П., 1990), загального білка – за біурето-вим методом, кальцію – комплексонометричним методом (Камышников В.С., 2004), активність лужної фосфатази – за методом Боданські.

На другому етапі проводили дослідження собак для оцінки їх кістково-суглобового апарату за даними клінічних та клініко-біохімічних досліджень з використанням перерахованих біохімічних показників. Були виділені чотири групи тварин: 1) 30 клінічно здорових собак різних порід, віку і статі; 2) собаки ахондродистрофоїдної породи (на прикладі породи німецька вівчарка) без ознак ортопедичної патології (6 особин) та тварини із дисплазією кульшових суглобів (6 особин); 3) собаки хондродистрофоїдних порід без клінічних проявів та з клінічними проявами патології суглобів (13 тварин); 4) собаки різного віку, породи та статі, хворі на спонтанний остеоартроз кульшових суглобів (16 особин). В останній групі були проведені дослідження ефективності препаратів Терафлекс та Флексартрон у комплексному лікуванні остеоартрозу.

На третьому етапі об’єктом дослідження були білі щури 5–11-місячного віку (50 особин, маса тіла 300–350 г) та безпородні собаки (7 особин), вік яких на початок досліду складав 5 міс. На цих тваринах була розроблена нова методика аутопластики повношарового дефекту головки стегнової кістки трансплантатом з проксимального відділу 9 або 10-го ребра. Білих щурів з досліду виводили методом декапітації під тіопенталовим наркозом, відбирали проби крові та препарати кульшових суглобів для гістологічних досліджень. Проби крові відбирали в наступні терміни: до операції, на 4–5 доби, 7–11, 14–18, 28–39, 63–69, 97–114, 130–132 та на 142–193-у доби після операції. У сироватці крові визначали вище перераховані біохімічні показники. У разі загибелі деяких собак (з причин, що не були пов’язані з експериментом) відразу відбирали препарати оперованого та інтактного кульшових суглобів для томографічних, макроскопічних та гістологічних досліджень. У решти тварин досліджували оперований і здоровий суглоби за допомогою рентгенографії та комп’ютерної томографії.

Оцінку різниці вибірок проводили за допомогою непараметричних критеріїв U (Вілкоксона-Манна-Уітні) та Х-критерію (Ван-дер-Вардена), а також стандартного пакета “Статистика” у програмі EXEL 2000.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Структурно-метаболічні характеристики післятравматичного остеоартрозу колінних та кульшових суглобів білих щурів без та із застосуванням глюкозаміногідрохлориду

Поглиблене вивчення можливості діагностики різних стадій остеоартрозу собак, що виник спонтанно, у динаміці за результатами біохімічних досліджень є актуальною, але досить складною проблемою. Тому дослідженням цього захворювання в собак передували експерименти на білих щурах, яким виконували операцію зі створення моделі післятравматичного остеоартрозу колінних та кульшових суглобів, що дало змогу більш глибоко вивчити динаміку патологічного процесу.

Як свідчать дані макроскопічного дослідження колінного суглоба тварин з дефектом суглобової поверхні в різні терміни після операції, не було помічено істотних відмінностей у стані хрящового покриття суглобів білих щурів між тваринами дослідної та контрольної груп. Однак мікроскопічні та біохімічні дослідження підтвердили, що глюкозаміногідрохлорид, введений внутрішньом’язово білим щурам у дозі 50 мг/кг маси тіла, уповільнював прогресування остеоартрозу колінного суглоба і сприяв регенерації ушкодженої підхрящової кісткової тканини.

Уже на 7 та 14-у доби, за даними гістологічних досліджень, у дослідній групі після операції в зоні дефекту спостерігали репаративний процес у кістковій тканині. У дослідній групі на 7-у добу вміст сироваткових глікопротеїнів не відрізнявся від показника у групі інтактних тварин, тоді як у тварин контрольної групи з патологією суглобової поверхні рівень глікопротеї-нів був вірогідно вищим, що вказувало на зменшення інтенсивності запального процесу під впливом ін’єкцій глюкозаміногідрохлориду (табл. 1). На 28-у добу після ушкодження суглоба у тварин дослідної групи, на відміну від контроль-ної, збільшувалася кількість остеогенних клітин у зоні дефекту. В цей період у дослідних тварин не відмічали підвищення вмісту загальних сироваткових хондроїтинсульфатів і, зокрема, першої фракції сироваткових глікозаміногліка-нів, що містять переважно хондроїтин-6-сульфат.

Це свідчило про зниження інтенсивності деструктивного процесу в хрящовій тканині ушкодженого суглоба білих щурів під час застосування глюкозаміно-гідрохлориду. На 42-у добу спостережень у контрольній групі знову спостеріга-ли підвищення вмісту глікопротеїнів, хондроїтинсульфатів і всіх фракцій ГАГ, що вказувало на посилення деструктивного і запального процесів у суглобі. Вміст глікопротеїнів і загальних хондроїтинсульфатів у сироватці крові білих щурів дослідної групи у цей період вірогідно не перевищував значень показників у інтактних тварин (р>0,05). Так, було відсутнє зростання рівня І фракції ГАГ, а саме хондроїтин-6-сульфату, тоді як у тварин контрольної групи її рівень був вищим на 21,0 %, ніж у інтактних. Про посилення остеобластичної активності в зоні дефекту на тлі введення глюкозаміногідрохлориду свідчить також підвищення на 28-у добу рівня фракції ГАГ ІІ, що містить переважно хондроїтин-4-сульфат (на 32,9 %). Це також є підтвердженням позитивного впливу препарату на репаративні процеси в ушкодженій кістковій тканині. Спостерігали гальмування деструктивних змін у гіаліновому хрящі ушкодже-ного колінного суглоба, хоча за даними гістологічних досліджень в обох групах його повноцінна регенерація не відбувалася.

Таблиця 1 – Результати використання глюкозаміногідрохлориду за посттравматичного остеоартрозу колінного суглоба білих щурів

Група | Показники | ГП, од. | ХСТ, г/л | Фракції ГАГ сироватки крові, од. | 1 | 2 | 3 | Сума | Інтактні тварини (n=10) | 0,72±0,07 | 0,388±0,014 | 15,3±0,7 | 8,5±0,7 | 1,8±0,2 | 25,6±1,1 | Термін після операції | 7 діб | К

(n=7) | 0,920,03* | 0,3750,03214,81,97,90,91,80,3 | 24,62,1Д

(n=8) | 0,85±0,18 | 0,401±0,071 | 15,2±1,5 | 6,5±0,6 | 1,5±0,6 | 23,2±1,6 | 14 діб | К

(n=7) | 0,770,050,4230,04813,51,66,90,91,90,122,32,4 | Д

(n=8) | 0,65±0,05 | 0,382±0,032 | 15,8±1,4 | 7,1±0,7 | 1,5±0,6 | 24,4±1,7 | 28 діб | К

(n=8) | 0,780,090,4440,014** | 17,80,5* | 9,00,41,70,328,50,9*

Д

(n=8) | 0,71±0,06 | 0,354±0,024

?? | 15,1±0,9? | 11,3±0,5

*, ?? | 1,6±0,4 | 28,0±1,4 | 42 доби | К

(n=7) | 1,060,12* | 0,4620,022* | 18,50,7

** | 11,00,6* | 2,50,1* | 32,11,4** | Д

(n=8) | 0,95±0,11 | 0,411±0,022 | 17,3±1,4 | 10,8±1,2 | 2,6±0,3 | 30,7±2,0 | Примітки: 1. К – група контрольної патології, Д – дослідна група; 2. * – р<0,05; ** – p<0,01; *** – p<0,001; решта – р>0,05, порівняно з інтактної групою; 3. ? – р<0,05; ?? – p<0,01; ??? – p<0,001; решта – р>0,05, порівняно з контрольної групою.

Випробування лікувального ефекту глюкозаміногідрохлориду на іншій моделі – дефекті хрящової поверхні кульшового суглоба білих щурів, виконаному за аналогічною методикою, дозволило одержати більш виражені позитивні результати. Терміни цього дослідження були подовжені, порівняно з моделлю, проведеною на колінному суглобі, і становили 21, 30 та 90 діб. Оскільки в попередньому дослідженні (на моделі дефекту колінного суглоба) спостерігалося посилене утворення остеобластичних елементів, у наступному етапі досліджень додатково визначали активність ферменту лужної фосфатази – маркера функціональної активності остеобластів. За допомогою біохімічних тестів була підтверджена позитивна дія глюкозаміногідрохлориду на регенера-цію кісткової тканини в суглобі, на що вказувала вірогідно вища, ніж у контрольній групі (р<0,05), активність лужної фосфатази в сироватці крові щурів на 30-у добу спостережень (дослід – 36,83,0 од. Бод., контроль – 26,73,2; інтакт – 25,62,4 од. Бод.). У дослідній групі на 21-у добу не був підвищений (порівняно з інтактом) уміст сироваткових глікопротеїнів, що означало відсутність у цей період запальної реакції (0,75±0,07 од.), тоді як у групі контрольної патології вона була значною (вміст глікопротеїнів – 1,21±0,05 од., р<0,01). Не був підвищеним у дослідних тварин і вміст загальних хондроїтинсульфатів через 1 і 3 міс. після операції (0,3730,022 г/л та 0,3180,024 г/л відповідно), порівняно з високим їх рівнем у контрольних тварин в усі три терміни досліду (0,4730,013 г/л, р<0,01; 0,4340,022, р<0,05 та 0,3890,021 г/л, р<0,05). Близький до показників у інтактних тварин фракційний склад сироваткових ГАГ у білих щурів дослідної групи також підтвердив позитивну дію глюкозаміногідрохлориду на формування кістково-хрящового регенерату в дефекті головки стегнової кістки. За даними макроскопічних досліджень, у дослідній групі головка стегнової кістки, на відміну від контрольної, виглядала неушкодженою, поверхня хряща була глянцевою, місце дефекту злегка шорстким, а в глибині суглобового хряща було видно зону діаметром 1–1,2 мм більш світлого забарвлення, ніж прилегла хрящова поверхня. Всі ці результати свідчать про менший ступінь деструктивного процесу в дослідній групі тварин.

Отже, введення тваринам глюкозаміногідрохлориду позитивно впливало на розвиток кістково-хрящового регенерату на моделі дефекту головки правої стегнової кістки білих щурів, що проявлялося у формуванні в зоні дефекту новоутвореної кісткової і хрящової тканин через три місяці після операції і супроводжувалося зменшенням деструкції ГАГ, елімінації їх у систему кровообігу та відновлюванням функції суглоба.

Таким чином, проведені експерименти дозволили одержати нові дані про структурно-метаболічні характеристики окремих стадій деструктивно-дистрофічного процесу в колінному та кульшовому суглобах білих щурів. Були встановлені біохімічні критерії, що відповідали структурним змінам у травмованих суглобах на різних стадіях патологічного процесу. Це дало змогу обґрунтувати ефективність застосування хондропротекторного препарату глюкозаміногідрохлориду як на стадії запалення, так і впродовж процесу розвитку дистрофічних змін у тканинах колінного та кульшового суглобів білих щурів.

Ці результати стали основою для проведення досліджень спонтанного остеоартрозу в собак, для об’єктивної оцінки лікувального ефекту ГАГ-містких препаратів під контролем біохімічних досліджень.

Глікопротеїни та глікозаміноглікани сироватки крові як діагностичні тести для оцінки стану кістково-суглобового апарату собак без видимих ознак патології і за спонтанного остеоартрозу

Обстеження собак зі спонтанними остеоартрозами із залученням клініко-біохімічних досліджень стало нашим наступним завданням. Передусім, поставлено за мету визначення меж біохімічних тестів у сироватці крові, які дозволяють оцінити стан сполучної тканини клінічно здорових собак, а також тварин з клінічно та рентгенологічно встановленими дегенеративно-деструк-тивними порушеннями в кульшових суглобах. Цей патологічний процес без відповідної корекції часто стає супутником дисплазії кульшового суглоба. В основі цієї патології лежать порушення формування кістково-суглобового апарату тварин, тобто анатомічні аномалії, які, за даними Б.І. Сименача (1999), діють як постійний руйнівний фактор, що призводить до тяжких ускладнень, зокрема остеоартрозів. Проблемам етіології, патогенезу, діагностики та лікування дисплазії суглобів кінцівок у собак присвячені дослідження В.П. Сухоноса (2006). За його даними, дисплазії окремих суглобів різної локалі-зації в собак за клінічного обстеження зустрічаються у 13 % випадків, а кількість дисплазії саме кульшових суглобів складає 2,32 %. При цьому, за даними автора, відбуваються зміни кількості та складу протеогліканів у матриксі хряща. Ми обстежили собак ахондродистрофоїдних і хондро-дистрофоїдних порід, у яких часто спостерігається остеохондродисплазія. За біохімічного дослідження сироватки крові собак ахондродистрофоїдних порід під час першого звертання до ветеринарного лікаря було виявлено, що в самок німецької вівчарки з клінічно встановленою дисплазією кульшових суглобів та в їх цуценят з такою ж вадою суглобів був вищий уміст сироваткових глікопротеїнів, порівняно зі здоровими тваринами в аналогічних за віком групах (самки: дослід – 0,45±0,01 од., контроль – 0,27±0,01 од., p<0,001; цуценята: дослід – 0,35±0,04 од., контроль – 0,29±0,01 од., p<0,05), і встановлено, що за першого обстеження рівень загальних хондроїтинсульфатів у контрольних цуценят та їх матерів становив 0,130±0,023 та 0,076±0,004 г/л відповідно. Водночас у дослідних собак обох вікових груп уміст хондроїтинсульфатів був вищим, ніж у здорових особин (у самок – 0,247±0,044 г/л, p<0,05, у цуценят – 0,237±0,010 г/л, p<0,05). У сироватці крові цуценят обох груп була вірогідно підвищена (порівняно із самками) активність лужної фосфатази: контроль – 20,41,5 од. Бод., дослід – 22,71,0 од. Бод.; самки; контроль – 11,0±0,7 од. Бод., дослід – 11,9±0,3 од. Бод. Коефіцієнт Са/Р був вірогідно нижчим у цуценят обох груп, порівняно із самками (цуценята: контроль – 1,820,04, дослід – 1,720,02; самки: контроль – 1,930,01, p<0,05 і дослід – 1,930,02, p<0,001).

Через 4 місяці під час вторинного обстеження дорослих собак із рентгенологічно та клінічно встановленою дисплазією кульшових суглобів спостерігали посилення кульгавості, обмеження рухів в ураженому суглобі, швидку втомлюваність, болючість. Ці клінічні прояви супроводжувалися збільшенням у сироватці крові вмісту глікопротеїнів (0,54±0,04 од., p<0,05), б1-глобулінів (на 25,3 %; p<0,05) і відсутністю змін умісту хондроїтинсульфатів, порівняно зі здоровими самками (0,103± 0,015 г/л). У групі дослідних цуценят зростав рівень як глікопротеїнів, так і хондроїтинсульфатів (0,60±0,04 од., p<0,05 та 0,149±0,016 г/л, p<0,05 відповідно), порівняно з контрольною групою (0,46±0,02 од. та 0,086±0,003 г/л відповідно). Ці дані свідчать про наявність гострого запального процесу в суглобах дорослих самок за вторинного обстеження, що збігається з клінічними спостереженнями. У цуценят із дисплазією кульшових суглобів також спостерігали гострий запальний процес, що підтверджувалося підвищенням на 18,6 % рівня б1-глобулінів (p<0,05). Те, що на фоні погіршення клінічних ознак відбувалося підвищення на 73,3 % (p<0,05) рівня хондроїтинсульфатів, означало прогресування в суглобах цуценят дистрофічно-деструктивного процесу.

Отримані результати дали підставу для подальшого використання цих тестів у діагностиці захворювань суглобів дистрофічно-деструктивної природи в собак хондродистрофоїдних порід. Для вивчення динаміки вказаних тестів було обстежено 13 собак цих порід: без клініко-рентгенологічних ознак дисплазії кульшових суглобів (7 особин) та 6 собак з такими ознаками, як кульгавість, больовий синдром, швидка втомлюваність. Рентгенологічними дослідженнями в останніх була підтверджена наявність дисплазії суглобів.

Оскільки в літературі немає відомостей щодо значень норм вищезгаданих тестів у сироватці крові собак, ми провели клініко-біохімічні дослідження групи з 30-ти собак ахондродистрофоїдних порід без клінічних ознак патології суглобів і одержали показники, які використовували як контрольні під час аналізу результатів обстеження тварин хондродистрофоїдних порід (табл.2). Виявилося, що за відсутності клінічних і рентгенологічних ознак дисплазії кульшових суглобів у собак хондродистрофоїдних порід спостерігався вірогідно більш високий (на 27,5 %, p<0,001), ніж у тварин контрольної групи, рівень хондроїтинсульфатів.

Визначення рівня інших тестів (сіалові кислоти, глікопротеїни, лужна фосфатаза) не виявило вірогідних змін, порівняно з контрольною групою. Але за наявності в собак клінічних та рентгенологічних ознак дисплазії кульшових суглобів були виявлені значні відхилення біохімічних показників. Зокрема, вміст сіалових кислот був вищий на 33,0 % (p<0,001), глікопротеїнів – 89,4 (p<0,05), хондроїтинсульфатів – 16,1 (p<0,01), активність лужної фосфатази – на 117,9 % (p<0,05).

Таблиця 2 – Біохімічні показники сироватки крові собак контрольної групи (n=30), хондродистрофоїдних порід без порушень та з порушеннями функцій кульшового суглоба (n=13)

Група | Показники | Сіалові кислоти, ммоль/л | Глікопро-теїни, од. | Хондроїтин-сульфати, г/л | Лужна фос-фатаза, од. Боданські | Контрольна група† (n=30) | 2,200,15 | 0,350,05 | 0,1710,012 | 7,10,8 | Хондродистрофоїдні породи без клінічних ознак остеоартрозу (n=7) | 2,440,09 | 0,470,07 | 0,2180,007* | 7,31,2 | Хондродистрофоїдні породи з клінічними ознаками остеоартрозу (n=6) | 3,240,07??? | 0,890,15? | 0,2530,016?? | 16,03,2? | Примітки: 1. † – дані, одержані під час обстеження 30 клінічно здорових собак ахондродистрофоїдних порід віком від 2,5 до 6 років; 2. Різниця вірогідна проти контрольної групи при * – р<0,001; решта р>0,05. 3. Різниця вірогідна проти тварин без клінічних ознак остеоартрозу при ? -–р<0,05; ?? – p<0,01; ??? – p<0,001; решта р>0,05.

Таким чином, була підтверджена висока діагностична значущість запропонованого комплексу біохімічних тестів для оцінки ступеня ушкодження суглобів за деструктивно-дистрофічного процесу у собак ахондро- та хондродистрофоїдних порід. Були визначені ці показники також для собак контрольної групи, без клінічних проявів патології кульшових суглобів.

Використання глікозаміногліканів у діагностиці та консервативному лікуванні спонтанних остеоартрозів собак

У процесі обстеження тварин у ветеринарні клініки найчастіше надходять собаки з вираженими клінічно ознаками порушень функцій кульшових суглобів: появою або посиленням їх після підвищеного чи раптового фізичного навантаження, піднімання сходами та під час застрибуван-ня на вищерозташовані предмети (кульгавість, крепітація, обмеження рухливос-ті та болючість суглоба). Були виконані дослідження біохімічних показників у сироватці крові 16 таких тварин двічі: під час першого звертання до ветеринар-ного лікаря та через 3 міс. з початку лікування з використанням у загальній схемі лікувальних заходів ГАГ-містких препаратів Терафлекс та Флексартрон.

Аналіз результатів досліджень показав, що лікувальні заходи в контрольній групі приводили до короткотривалого клінічного поліпшення функції опорно-рухового апарату тварин (зниження кульгавості, болючості під час пальпації, підвищення рухової активності). Це підтверджувалося позитивною динамікою вмісту біохімічних показників, які характеризують стан обмінних процесів у суглобах. Той же комплекс досліджень був використаний і за обстеження тварин, у схему лікування яких входили препарати Терафлекс та Флексартрон. Активність лужної фосфатази через 3 міс. у собак дослідної групи, порівняно з результатами першого обстеження до початку лікування, знижувалася на 57,0 %, p<0,001 (у контрольній групі – на 42,3 %, p<0,05). Концентрація сироваткових глікопротеїнів знизилася на 36,0 %, p<0,001, а хондроїтинсульфатів – на 37,1 %, p<0,01 (у контрольній групі не змінювалася). Якщо в контрольній групі не спостерігали зниження вмісту ГАГ та їх фракцій у сироватці крові, порівняно з початковими даними, то під час застосування у комплексі лікування ГАГ-містких препаратів виявлено вірогідне зниження початково підвищених значень суми і І–ІІІ фракцій ГАГ на 36,2 ; 35,3; 34,8 і 42,9 % (p<0,01; p<0,01; p<0,05; p<0,05 відповідно).

Таким чином, у процесі лікування собак, хворих на спонтанний остеоартроз кульшового суглоба, введення у схему лікувальних заходів препаратів Терафлекс та Флексартрон привело до більш тривалого поліпшення функцій кульшових суглобів. На початку лікування клінічні показники були подібні в контрольній і дослідній групах. Проте через 3 міс. у контрольній групі патологічні ознаки відновлювалися в деяких собак, тоді як у дослідній вони були відсутні у всіх тварин. Це свідчить про доцільність введення у комплекс заходів під час лікування остеоартрозу кульшового суглоба собак препаратів, що містять глюкозамін та хондроїтинсульфати, під контролем клініко-біохімічних досліджень, які включають показники, що характеризують метаболізм вуглеводно-білкових біополімерів екстрацелюлярного матриксу кісткової і хрящової тканин.

Методика аутопластики повношарового дефекту головки стегнової кістки білих щурів та собак трансплантатом з проксимального відділу ребра

Нами був запропонований спосіб здійснення кістково-хрящової аутопластики дефекту суглобового хряща в експерименті на білих щурах та собаках, який виконується з використанням повношарового аутотрансплантата, одержаного із проксимального відділу 9 або 10-го ребер тварини. Результати операції на білих щурах свідчать про швидку адаптацію трансплантата в зоні дефекту, його часткову перебудову і формування повноцінного гіалінового хряща в ушкодженому суглобі, що підтверджувалося результатами гістологічних та біохімічних досліджень. Використання цього методу в собак дозволило уникнути значної травми та порушення функції донорського місця і, в цілому, опорної функції кістяка, забезпечило скорочення відновного періоду, запобігло виникненню негативних ефектів при застосуванні сторонніх матеріалів, а також дозволило замістити великий за площею дефект хряща зі збереженням конгруентності і функції суглоба (рис. 1).

Рисунок 1 – Макропрепарати кульшових суглобів собак без (а) та з артропластикою (б) дефекту аутотрансплантатом з проксимального відділу ребра: а) 1 – надлишок хрящової тканини в зоні дефекту без проведення аутопластики; б) 2 – місце дефекту після проведення аутопластики проксимальним фрагментом ребра

Після проведення аутопластики на головці стегнової кістки тварини починали навантажувати оперовану кінцівку вже на 2–3-й дні після операції, а з 5–7-го дня повноцінно нею користувалися. Довготермінове спостереження не виявило порушень функції оперованого суглоба. Для оцінки процесу приживлення аутотрансплантату в собак були виконані біохімічні дослідження у динаміці, починаючи з 4 до 193-го днів з моменту операції. У сироватці крові визначали вміст глікопротеїнів, загальних хондроїтинсульфатів і фракцій сироваткових ГАГ. Це дало можливість спостерігати за перебігом метаболічних перетворень у структурі ГАГ у процесі приживлення трансплантату. Було встановлено, що упродовж тільки перших 4–5 діб після операції в собак був одночасно вірогідно підвищений вміст глікопротеїнів, загальних хондроїтин-сульфатів, суми фракцій ГАГ, третьої фракції ГАГ (кератансульфатів), що відзеркалювало початкову стадію відновного процесу у зоні дефекту, початок процесу перебудови та приживлення трансплантату на фоні гострої запальної реакції. У подальшому, після тривалої відсутності змін рівня показників, відбувалося підвищення вмісту ГАГ сироватки крові – у період від 63 до 69-ї діб та з 130 по 132-у доби, що, вірогідніше за все, віддзеркалювало етапи перебудови трансплантату без клінічних ознак порушень функції суглоба і за відсутності підвищення рівня інших біохімічних маркерів запального процесу (глікопротеїнів і фракцій б1-, б2- та г-глобулінів). Одержані результати були підтверджені результатами рентгенографії та комп’ютерної томографії (рис.2).

Рисунок 2 – Томограма лівої (а), не оперованої та правої (б), оперованої головок стегнових кісток собаки

Таким чином, використання сироваткових вуглеводно-білкових біополімерів як показників перебудови кістково-хрящового аутотрансплантата дозволяє здійснювати контроль цього процесу на етапах приживлення трансплантата за розробленого варіанта аутоартропластики.

ВИСНОВКИ

1. На підставі дослідження динаміки сироваткових вуглеводно-білкових біополімерів (глікопротеїнів, глікозаміногліканів та їх фракційного складу) за експериментального остеоартрозу суглобів у білих щурів та спонтанного остеоартрозу кульшового суглоба в собак встановлені біохімічні критерії стадій цього захворювання для вивчення його патогенезу й оцінки ефективності консервативного лікування із застосуванням ГАГ-містких препаратів. Визначені клініко-біохімічні критерії стану суглобів собак ахондро- і хондродистрофоїдних порід у нормі та за дисплазії кульшового суглоба. Розроблена нова методика хірургічного лікування повношарового дефекту суглобової поверхні кульшового суглоба тварин методом аутопластики проксимальним фрагментом реберної кістки.

2. Рання стадія перебігу посттравматичного процесу на моделі повношаро-вого дефекту суглобів білих щурів – остеоартрит – характеризується підвищенням умісту глікопротеїнів – 0,920,03 од., у контрольній групі – 0,720,07 од. на тлі незміненого рівня фракцій ГАГ (хондроїтинсульфати – 0,3880,014 г/л; І, ІІ та ІІІ фракції ГАГ – 15,30,7 од., 8,50,07, 1,80,2 од. відповідно). Стадія регенерації ушкоджених тканин не супроводжується вірогідними змінами цих показників. Дистрофія тканин суглоба – остеоартроз – характеризується підвищеним умістом загальних хондроїтинсульфатів (0,4440,014 г/л) за рахунок хондроїтин-6-сульфату (17,80,5 од.). Посилення деструктивних змін супроводжується