КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ШЕЛЮК ОЛЬГА ВІКТОРІВНА

УДК 577.24/352.4

Механокінетика процесу скорочення-розслаблення

гладеньких м'язів caecum щурів

та вплив на неї інгібіторів натрієвої помпи

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біофізики біологічного факультету

Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: |

Член-кореспондент НАН України,

доктор біологічних наук, професор

Костерін Сергій Олексійович,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН

України, завідувач відділу біохімії м’язів

Офіційні опоненти: | доктор біологічних наук, професор

Матишевська Ольга Павлівна,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

професор кафедри біохімії

доктор біологічних наук

Скрипнюк Зеновій Дмитрович,

Науково-дослідний інститут Інтегративної

та Негентропійної медицини,

керівник відділу теоретичної та прикладної інформотерапії

Захист відбудеться «-16» 01 2008 року о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка (м. Київ, пр. академіка Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 215).

Поштова адреса: 01033, м. Київ – 33, вул. Володимирська, 64

З дисертацією можна познайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка (м. Київ – 33, вул. Володимирська, 58).

Автореферат розісланий «12» _12_ 2007 року.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Цимбалюк О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сучасна біофізика має суттєві досягнення у з’ясуванні іонних, молекулярних і мембранних механізмів регуляції скоротливої активності гладеньких м’язів (ГМ) [Шуба, 1981; Bolton, 1985; Barany, 1996; Данилова, 1996; Taggart, 2001; Webb, 2003; Shuba et al., 2003]. Втім залишається нагальним подальше вивчення феноменологічних властивостей ГМ, зокрема кінетичних закономірностей скорочення-розслаблення як в ізометричному, так і в ізотонічному режимі. По-перше, відстеження зміни напруження чи довжини м’язового препарату в часі дає можливість визначити об’єктивні механокінетичні параметри на рівні фаз скорочення та розслаблення. По-друге, комплексне кількісне тлумачення механокінетичних кривих та внутрішньоклітинних Са2+-транзієнтів при збудженні є важливим для вирішення однієї з фундаментальних проблем біофізики ГМ: з’ясування механізмів електро- та фармакомеханічного спряження. По-третє, механокінетичний аналіз, залучений до інтерпретації результатів тензометричних дослідів, є перспективним при проведенні скринінгу та порівняльної кількісної оцінки ефективності дії фармакологічних речовин – модуляторів скоротливої активності ГМ. У літературі описані декілька підходів, спрямованих на аналіз механокінетики скорочення-розслаблення м’язів, зокрема гладеньких [Скрипнюк, 1976; Богач, Підгорна, 1981; Ізаков, 1981; Burduga, Kosterin, 1991; Костерін, 2001]. Зокрема, механокінетичні уявлення були застосовані до опису кофеїнової контрактури м’язу caecum [Давидовська і ін., 2001]. Один із методів був успішно використаний для опису не лише механокінетичних кривих, але й внутрішньоклітинних Са2+-транзієнтів у випадку ГМ сечоводу та міокарду за умов впливу різних фізико-хімічних факторів [Burduga, Kosterin, 1991].

При вирішенні загальної проблеми з’ясування механізмів електро- та фармакомеханічного спряження в ГМ важливе місце посідають дослідження властивостей та функціональної ролі Mg2+,АТФ-залежних іонних помп, які задіяні в контролі механокінетики скоротливої відповіді [Kosterin et al., 1994; Blaustein, Lederer, 1999; Jorgensen et al., 2003]. До таких помп належить Nа+,К+-АТФаза (натрієва помпа). На теперішній час накопичені фундаментальні дані щодо структурної організації, властивостей (кінетичних, каталітичних, енергетичних), особливостей регуляції та механізму функціонування Nа+,К+-АТФази [Therien, Blostein, 2000; Jorgensen et al., 2003].

У літературі широко висвітлено початкові ефекти блокування натрієвої помпи в клітинах інтестинальних ГМ: деполяризація плазматичної мембрани, зміна транссарколемального градієнту іонів Na і K, що супроводжується гальмуванням Nа+-Са2+ обмінника, пригніченням спонтанної активності та зниженням збудливості міоцитів [Богач і ін., 1976; Carl, Sanders, 1989; Dmitrieva, Peter, 2003; Xie, Cai, 2003; Nasu, Takahashi, 2005]. Отже, натрієва помпа – один із факторів контролю функціонування ГМ.

Відповідно до вищезазначеного актуальним є пошук оборотних ефекторів, здатних селективно та ефективно модифікувати активність мембранозв’язаних катіон-транспортуючих помп, у тому числі натрієвої помпи ГМ [Wasserstrom et al., 1991; Rybalchenko et al., 2001; Xie, Cai, 2003].

В останні роки суттєва увага дослідників приділяється каліксаренам – макроциклічним речовинам (циклічним олігомерам фенолів), які можна розглядати в якості своєрідних «молекулярних платформ», перспективних для дизайну сполук, здатних модифікувати протікання біохімічних процесів [Vovk et al., 2004; Kopaczynska et al., 2005; Zhao et al., 2005; Darbost et al., 2005]. Для деяких з каліксаренів доведена бактерицидна, антивірусна, протипухлинна та антитромботична активність, відомі дані щодо їхніх іонофорних, мембранотропних і каталітичних властивостей. Каліксарени також застосовують у біоорганічній хімії та біотехнології з метою створення синтетичних рецепторів, здатних, подібно природним рецепторам, розпізнавати близькі за властивостями молекули та іони [Talanova, Hwang, 1998; Budka et al., 2001]. Продемонстровано, що каліксарени С97, С99 та С107 (зазначені шифри), молекули яких містять на верхньому вінці макроциклу фрагменти альфа-гідрокси-, альфа-аміно- та метиленбісфосфонової кислоти відповідно, значно більш ефективно, ніж оуабаїн, інгібують Nа+,К+-АТФазу клітин ГМ (значення уявної константи інгібування Кі < 100 нМ), але не змінюють активність “базальної” Са2+-незалежної Mg2+-залежної ATФази. У той же час, структурний фрагмент каліксарену С107 – сполука М3 не впливає на ферментативну активність Nа+,К+-АТФази та Mg2+-ATФази [Veklich, Kosterin, 2005; Векліч і ін., 2006]. Очевидно, що зазначені каліксарени можуть бути перспективними для подальших медико-біологічних розробок, спрямованих на скринінг високоефективних нестероїдних інгібіторів натрієвої помпи.

У зв’язку з цим актуальним є дослідження механокінетики скоротливих відповідей вісцеральних ГМ та вплив на неї інгібіторів натрієвої помпи.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках теми «Дослідження та моделювання молекулярних та клітинних процесів в збудливих біологічних системах», № держреєстрації 01010001967.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було вивчити механокінетику скорочення-розслаблення гладеньких м’язів caecum щурів за умов дії різних активуючих факторів та впливу інгібіторів Na+,K+-ATФази.

Відповідно до мети роботи були поставлені такі задачі:

1. Дослідити механокінетичні параметри скорочення-розслаблення м’язів caecum за умов дії різних активуючих факторів (K+-деполяризація, аплікація ацетилхоліну).

2.

Вивчити вплив різних фізико-хімічних чинників (гіпонатрієвий розчин, органічні блокатори Са2+-каналів L-типу, температура) на механокінетичні параметри скоротливої відповіді зазначених м’язів.

3. Провести порівняльне дослідження впливу інгібіторів натрієвої помпи оуабаїну та каліксаренів С99 і С107 на кінетику скорочення-розслаблення м’язів caecum.

Об’єкт дослідження – препарати кільцевого шару ГМ caecum щурів.

Предмет дослідження – викликані ацетилхоліном та калієвою деполяризацією скорочення кільцевих ГМ caecum щурів.

Методи дослідження – тензометричний метод реєстрації скоротливих відповідей гладеньком’язових препаратів, метод кінетичного аналізу кривих скорочення-розслаблення, методи статистичного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі були вивчені кінетичні закономірності скоротливих відповідей, викликаних гіперкалієвим розчином та аплікацією ацетилхоліну (АCh), кільцевих ГМ caecum щурів. Уперше продемонстровано, що нові штучні високоефективні інгібітори Na+,К+-АТФази каліксарени С99 та С107, як і оуабаїн, здатні вірогідно пригнічувати м’язові скорочення, які були індуковані як калієвою деполяризацією, так і аплікацією АCh. Із застосуванням кінетичного аналізу вперше було досліджено особливості зміни максимальних швидкостей окремо фаз скорочення і розслаблення скорочень ГМ caecum за умови використання вищезазначених інгібіторів.

Практичне значення одержаних результатів. Дані експериментальних досліджень, що виявили особливості впливу нових високоефективних інгібіторів натрієвої помпи – каліксаренів С99 і С107 на кінетику скорочення-розслаблення м’язів caecum, можуть бути використані при подальшій розробці фармакологічних засобів корекції патологічних станів організму, пов’язаних з порушенням трансмембранного обміну Na+ та К+. Одержані в роботі результати можуть бути залучені при читанні курсів лекцій «Біофізика м’язів», «Біоорганічна хімія», «Фізіологія» тощо у вищих навчальних закладах.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто було опрацьовано фахову літературу за проблемою, виконані експериментальні дослідження (деякі з них були зроблені разом з к.б.н. Цимбалюк О.В.), а також проведено кінетичний аналіз одержаних результатів. Обговорення результатів експериментальних досліджень, формулювання висновків та написання статей було здійснено разом з науковим керівником член-кор. НАН України, проф. Костеріним С.О. При написанні статей матеріали стосовно синтезу та фізико-хімічних властивостей каліксаренів, що були використані у дослідах, були люб’язно надані співробітниками відділу хімії фосфоранів Інституту органічної хімії НАН України (керівник відділу – член-кор. НАНУ, проф. Кальченко В.І.).

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були представлені та обговорені на: конференції молодих учених «Актуальні проблеми біохімії та біотехнології» (Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2006); IV з’їзді Українського біофізичного товариства (Донецьк, 2006); V Міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених «Шевченківська весна»: «Сучасний стан науки: досягнення, проблеми та перспективи розвитку» (Київ, 2007); ІІІ Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів «Молодь та поступ біології» (Львів, 2007); засіданнях кафедри біофізики Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 робіт, з яких 3 статті у фахових наукових виданнях, 5 тез у збірниках, матеріалах та тезах конференцій, які повністю відбивають основний зміст дисертації.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 142 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків. Список використаних джерел літератури містить 241 найменування. Робота ілюстрована 35 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи досліджень

Тензометричні досліди проводили на мультиклітинних препаратах кільцевих ГМ сліпої кишки (cаecum) щурів. Самців щурів (маса тварин варіювала в межах 200 – 250 г) декапітували, вилучали cаecum, промивали розчином Кребса (мМ: NaCl – 120,4; KCl – 5,9; NaHCO3 – 15,5; NaH2PO4 – 1,2; MgCl2 – 1,2; CaCl2 – 2,5; глюкоза –11,5, рН – 7.4 ± 0,1).

У ході приготування препаратів шар кільцевих м’язів звільняли від слизової оболонки і нарізали на смужки (середній розмір – 1,5 Ч 10 мм). Усі процедури проводилися при кімнатній температурі.

Скоротливу активність ГМ препаратів досліджували в ізометричному режимі за допомогою ємнісного датчика сили; сигнали реєстрували використовуючи потенціометр Н339. Вільні від слизової оболонки препарати вміщували в робочу камеру (об’єм – 2 мл) з проточним розчином Кребса (швидкість протікання – 5 мл/хв), термостатовану при 37оС. Препарату надавали пасивний натяг на рівні 10 мН і залишали на 1 годину (до появи спонтанних скорочень постійної амплітуди і частоти та викликаних АCh і гіперкалієвим розчином скорочень постійної амплітуди).

Розрахунки механокінетичних характеристик процесу скорочення-розслаблення cаecum здійснювали відповідно до методу кінетичного аналізу [Burdyga, Kosterin, 1991]. Метод ґрунтується на кількісному описі лівої (df/dt>0, скорочення) та правої (df/dt<0, розслаблення) фаз повної механокінетичної кривої відповідно до емпіричних рівнянь:

(скорочення), (1)

(розслаблення), (2)

де f та fm – миттєва (у момент часу t) та максимальна сила відповідно, ф –характеристичний час (ф = t, коли f = 0,5 fm), n – логарифмічний коефіцієнт крутизни ( для фаз розслаблення (“+”) та скорочення (“-”) відповідно). Відлік часу t для фази розслаблення розпочинали з умовної “нульової” часової точки, при якій f = fm. Лінеаризовані механокінетичні криві відповідали співвідношенням (3) та (4), які, по суті, є графічними критеріями коректності використання рівнянь (1) та (2):

(скорочення), (3)

(розслаблення). (4)

В експериментах типові значення коефіцієнтів кореляції r для лінеаризованих механокінетичних графіків становили не менше, ніж 0,95.

У якості головного механокінетичного параметру використовували нормовану на значення fm максимальну (у точці перегину t = и) швидкість Vn зміни м’язової сили f у часі. Згідно з рівняннями (1) та (2) після диференціювання маємо: |

(5)

для фаз скорочення (“+” , Vnс) та розслаблення (“-” , Vnr) відповідно. При цьому значення кінетичних показників ф та n визначали з відповідних лінеаризованих графіків, які будували відповідно до рівнянь (3) та (4).

В експериментах для стимуляції скорочень гладеньком’язових препаратів використовували АCh (10 мкМ), для чого початково готували його концентрований водний розчин, аліквоту якого вносили в розчин Кребса до одержання необхідної кінцевої концентрації, та гіперкалієвий розчин (80 мМ). Останній готували шляхом заміни у вихідному розчині Кребса необхідної частини іонів Na на іони К (рН 7,4 ± 0,1). Гіпонатрієвий розчин готували шляхом часткової заміни іонів Na в омиваючому розчині на іони холіну чи Li (концентрація Na+ становила 25 мМ).

Номінально безкальцієвий розчин готували аналогічно до розчину Кребса, замінюючи іони Са іонами Мg (рН 7,4 ± 0,1).

Досліди по вивченню ефекту органічних блокаторів потенціалкерованих кальцієвих каналів L-типу на ГМ здійснювали з використанням ніфедипіну та D600, при цьому попередньо готували їх концентрований розчин у диметилсульфоксиді, кінцева концентрація – 1%.

При порівняльному дослідженні впливу оуабаїну, каліксаренів С99 і С107 та структурної частини останнього – фрагменту М3 на кінетику скорочення-розслаблення м’язу caecum аналогічно готували концентрований розчин даних речовин (структурні формули каліксаренів наведені на рис.1). Каліксарени та фрагмент М3 були синтезовані у відділі хімії фосфоранів в Інституті органічної хімії НАН України під керівництвом член-кор. НАН України, проф. Кальченка В.І.

В усіх експериментах досліджувані речовини в необхідних концентраціях вносились у розчин Кребса за 30 хвилин до вивчення їх ефекту на скоротливі відповіді ГМ препаратів.

Механокінетичні параметри розраховували із лінеаризованих графіків згідно зі співвідношеннями (3) – (5), застосовуючи програму Оrigin 7.0. Статистичну обробку результатів експериментів здійснювали за методами варіаційної статистики за допомогою програмного забезпечення Оrigin 7.0. Вірогідність різниці між групами числових характеристик (контрольними та дослідними вимірами) визначали за t-критерієм Ст’юдента. У всіх випадках вірогідною вважали різницю при Р < 0,05.

Рис. 1. Структурні формули каліксаренів, що були використані в експериментах.

Результати досліджень та їх обговорення

Дослідження механокінетичних параметрів скорочення-розслаблення ГМ caecum за умов дії різних активуючих факторів (K+-деполяризація, аплікація АCh).

З метою дослідження динамічних закономірностей скоротливого процесу ГМ caecum щурів були вивчені ізометричні скоротливі відповіді, викликані калієвою деполяризацією та аплікацією АCh.

Механокінетичний аналіз процесу скорочення-розслаблення проводили окремо на рівні кожної фази повного циклу скоротливої відповіді. Фазою скорочення вважали частину механограми від початку зміни сили f до її максимального значення fm (df/dt>0), фазою розслаблення – частину механограми після досягнення величини fm (df/dt<0). У попередніх дослідах було знайдено, що такі механокінетичні показники, як n, ф та Vn (див. «Матеріали і методи досліджень»), у випадку фаз скорочення та розслаблення, не залежали від амплітуди скоротливої відповіді fm. При проведенні експериментів в однакових умовах (АCh – 10 мкМ, гіперкалієвий розчин – 80 мМ) були одержані скоротливі відповіді, які наведено на рис. 2 як типові механокінетичні криві 1 та 2 відповідно.

Рис. 2. Типові скоротливі відповіді кільцевих гладеньких м’язів caecum щурів у відповідь на аплікацію ацетилхоліну (10 мкМ, механограма 1) та гіперкалієвого розчину (80 мМ, механограма 2).

При проведенні кількісного аналізу скоротливих відповідей механокінетичні криві для фази розслаблення лінеаризували відповідно до співвідношення (4), у координатах {ln [(fm – f)/f ]; ln t}. З лінеаризованих графіків (рис. 3, А) визначали проміжні кінетичні параметри: логарифмічний коефіцієнт крутизни n і характеристичний час ф. Так, при амплітуді скорочень fm 24,6 та 19,5 мН (рис. 2, механокінетичні криві 1 та 2 відповідно) ці показники становили: 2,14 і 0,34 хв та 2,11 і 0,31 хв відповідно. За формулою (5) було розраховано нормовані максимальні швидкості фази розслаблення Vnr, які для механограм 1 та 2 (рис. 3, А) відповідно становили: 1,97 та 2,18 хв-1.

Рис. 3. Лінеаризація механограм фаз розслаблення (А) та скорочення (Б) викликаних скорочень гладеньком’язових препаратів caecum щурів: ацетилхолін (10 мкМ, механограма 1) та гіперкалієвий розчин (80 мМ, механограма 2) (r = 0,97 – 0,99).

Оскільки повний профіль механокінетичної кривої куполоподібного вигляду (рис. 2), а характер залежностей зміни напруження м’язу в часі (відносно максимуму fm) для фаз скорочення та розслаблення не мав принципових відмінностей (див. рівняння (3) та (4)), було застосовано вищезазначений механокінетичний метод для кількісної характеристики не лише фази розслаблення, але й фази скорочення відповідних кривих.

Як виявилось, кінетичні криві для фази зростання сили скорочення також добре лінеаризувались відповідно до рівняння (3) (рис. 3, Б). Цей факт свідчить про принципову можливість використання кількісного методу, що початково був залучений до опису фази розслаблення, для кінетичного аналізу скоротливих відповідей ГМ caecum не лише на рівні фази зменшення м’язового напруження, але й фази його збільшення.

З лінеаризованих графіків (рис. 3, Б) були визначені кінетичні параметри фази зростання напруження для скоротливих відповідей. При вищезазначених амплітудах скорочень fm (рис.2, механокінетичні криві 1 та 2 відповідно) для n і ф відповідні показники становили: 3,57 і 0,09 хв та 3,46 і 0,13 хв відповідно, величини ж нормованої максимальної швидкості скорочення Vnс у випадку обох кривих приймали наступні значення: 10,72 та 7,24 хв-1 відповідно.

Вцілому за масивом проведених експериментів (n = 21) були одержані наступні значення нормованих максимальних швидкостей Vn: 1) для скорочень, що були індуковані АCh (10 мкМ) Vnr = 1,88±0,10 хв-1; Vnс = 10,36±0,61 хв-1; 2) для скорочень, що були викликані К+-деполяризацією (80 мМ) Vnr = 1,85±0,05 хв-1; Vnс = 6,71±0,34 хв-1. Таким чином, метод механокінетичного аналізу, який був використаний у роботі, цілком придатний для кількісної характеристики викликаних ізометричних скорочень кільцевих м’язів caecum щурів і, відповідно, для вивчення впливу різних ефекторів на їхню механокінетику. Дійсно, по-перше, незалежно від природи стимулу, який індукував скорочення (калієва деполяризація, АCh), механокінетичні криві добре лінеаризувалися у відповідних координатах (див. рівняння (3) та (4)). По-друге, було знайдено, що значення таких механокінетичних параметрів, як показник n, характеристичний час ф та, що особливо важливо, нормована максимальна швидкість Vn, не залежали від амплітуди скоротливої відповіді fm у випадку як фази розслаблення, так і фази скорочення.

Вивчення впливу різних фізико-хімічних чинників (гіпонатрієвий розчин, органічні блокатори Са2+-каналів L-типу, температура) на механокінетичні параметри скоротливої відповіді м’язів caecum.

Було досліджено АCh-індуковані скорочення за умови часткової заміни іонів Na в омиваючому гладеньком’язові препарати розчині на непроникний катіон холін. Після витримування смужок ГМ в умовах зниженої концентрації іонів Na в омиваючому розчині спостерігалось статистично вірогідне пригнічення скоротливих відповідей на аплікацію АCh (10 мкМ). Так, максимальна сила, яку розвивали препарати, знижувалась до 17,6±7,0% (n = 7, P < 0,01) відносно контролю, прийнятого за 100% (рис.4, А).

Кінетичний аналіз окремо фаз розслаблення та скорочення з наступним розрахунком нормованих максимальних швидкостей (Vnr та Vnc) виявив, що ці параметри вірогідно знижувались у випадку обох фаз скоротливої відповіді і складали 75,7±12,4% та 64,8±7,4%, відповідно (n = 7, P < 0,05) відносно контролю, прийнятого за 100% (рис. 4, Б, В).

A Б В

Рис. 4. Вплив часткової заміни іонів Na (25 мМ) в омиваючому розчині на непроникні катіони холіну на механокінетичні параметри викликаних ацетилхоліном (10 мкМ) скорочень (M±m, n = 7) гладеньком’язових препаратів caecum щурів: А – амплітуда скорочення (fm), Б – нормована максимальна швидкість скорочення (Vnc), В – нормована максимальна швидкість розслаблення (Vnr).

Отже, із застосуванням використаного методу механокінетичного аналізу було додатково встановлено, що зниження концентрації іонів Na у зовнішньому середовищі спричиняє зміну важливих кінетичних параметрів скоротливої відповіді: спостерігається вірогідне зменшення нормованих максимальних швидкостей фаз скорочення і розслаблення Vnc та Vnr. На підставі аналізу власних результатів експериментів та даних, отриманих іншими дослідниками [Vogalis, Sanders, 1990; Lee et al., 1993; Inoue, 1995; Kurijama et al., 1998; Gordienko, Zholos, 2004; Sakamoto et al., 2007], можна припустити, що зміни механокінетичних параметрів АCh-викликаних скорочень гладеньком’язових препаратів caecum за цих умов можуть бути пояснені, зокрема, з точки зору важливості катіонних каналів (внаслідок залежності їх функціональних властивостей від величини трансмембранного градієнту іонів К і Na) при активації мускаринових холінорецепторів в ГМ caecum. Окрім того, не можна виключати й внесок системи Na+-Ca2+ обміну плазматичної мембрани у контролі механічного напруження вісцеральних ГМ [Blaustein, Lederer, 1999].

При активації скорочення ГМ важливу роль відіграють потенціалкеровані кальцієві канали L-типу, відкривання яких в процесі холінергічного збудження інтестинальних ГМ є важливим джерелом збільшення внутрішньоклітинної концентрації іонів Са [Kurijama et al., 1998; Shuba et al., 2003]. Для дослідження було обрано представників двох класів блокаторів цих каналів: ніфедипін (дигідропіридини) та D600 (фенілалкіламіни). У роботі вивчали вплив цих речовин (у концентраціях 10-10 – 10-4 М), які додавали в омиваючий розчин кумулятивно, на АCh-викликані скорочення (10 мкМ) (рис. 5).

А Б

Рис. 5. Концентраційні залежності впливу блокаторів потенціалкерованих Са2+-каналів ніфедипіну та D600 на механокінетичні параметри викликаних ацетилхоліном (10 мкМ) скорочень гладеньком’язових препаратів caecum щурів, (М±m, n = 7): А – вплив на амплітуду скорочення (fm); Б – лінеаризація типових кривих концентраційної залежності амплітуди скорочення fm в координатах Хілла (r = 0,97-0,98).

При збільшенні концентрацій блокаторів спостерігалось стрімке дозозалежне інгібування АCh-викликаних скорочень гладеньком’язових препаратів. У присутності високих концентрацій ніфедипіну (10 мкМ) та D600 (1 мМ) скорочення повністю пригнічувались (рис. 5, А). Як видно з графіків Хілла (рис. 5, Б), ніфедипін володів вірогідно більшою ефективністю (IC50=(4.04±0.14)*10-9 M, коефіцієнт Хілла nH = 0.34±0.03; n = 9) порівняно з D 600 (IC50=(2.09±0.11)*10-7 M, nH = 0.26±0.02; n = 7). Щодо механокінетичних параметрів, то лише нормована максимальна швидкість фази розслаблення (Vnr) виявила вищу чутливість до дії ніфедипіну, тоді як всі інші досліджувані параметри знижувались за дії обох блокаторів в однаковій мірі. Для дії обох блокаторів, судячи із значень коефіцієнтів Хілла nH < 1, властиве явище негативної кооперативності. Молекулярне тлумачення цього факту потребує подальшого з’ясування.

Отже, дослідження концентраційних залежностей амплітуд АCh-викликаних скорочень м’язів caecum в присутності ніфедипіну і D600 виявило вірогідно вищу інгібуючу здатність ніфедипіну (величини ІС50 відрізняються майже на два порядки), що підтверджується даними літератури [Hirota, 2003]. Відомо, що фенілалкіламіни (зокрема D600) і дигідропіридини (ніфедипін) здатні блокувати не тільки потенціалзалежні кальцієві канали L-типу, але й змінювати провідності плазматичної мембрани для інших іонів. Зокрема, фенілалкіламіни у високих концентраціях потужно блокують майже всі наявні іонні (зокрема, кальцієві і калієві) канали плазматичної мембрани клітин ГМ [Rauer et al., 1996; Catacuzzeno et al., 1999; Jones et al., 2000; Braun et al., 2000; Dreker et al., 2005]. Деякі автори вважають, що ефективність пригнічення АCh-викликаних скорочень ГМ цими блокаторами залежить від розташування сайтів їх зв’язування по різні боки плазматичної мембрани міоцитів [Hirota, 2003]. Тому можна припустити, що особливості зміни механокінетичних параметрів скоротливих відповідей ГМ caecum під дією досліджених блокаторів пов’язані з їх комплексним впливом на зазначені вище іон-транспортні системи.

У роботі було досліджено особливості зміни механокінетичних параметрів викликаних калієвою деполяризацією і АCh скорочень ГМ caecum при варіюванні температури навколишнього середовища (20 – 45 Со). Варіювання температури омиваючого розчину в межах 25 – 45 оС супроводжувалася зміною кінетичних характеристик скорочень. Порівняння скоротливих відповідей залежно від джерела їх активації (ACh та калієва деполяризація) свідчить про вищу термочутливість показників амплітуди fm та нормованої максимальної швидкості фази скорочення Vnc саме ACh-індукованих скорочень. У випадку скоротливих відповідей, що були викликані калієвою деполяризацією та аплікацією ACh (М±m, n = 4 – 5), відповідні значення коефіцієнту Вант-Гоффа Q10 становили: для фази скорочення – 1,3±0,1 і 1,7±0,3; для фази розслаблення – 1,5±0,2 і 2,4±0,6. У цих розрахунках температурний інтервал становив 25 – 35° С. Зазначені величини Q10, що були одержані в наших експериментах відповідають таким, які були описані в літературі для інших вісцеральних ГМ [Богач і ін., 1976; Scripnyuk, Burdyga, 1976; Скрипнюк, Бурдига, 1986].

Отже, методологія аналізу скорочення-розслаблення ГМ caecum з використанням механокінетичних параметрів (n, ф і Vn) може бути корисною при дослідженні кількісних закономірностей дії різних фізико-хімічних факторів на скоротливу відповідь.

Порівняльне дослідження впливу інгібіторів натрієвої помпи оуабаїну та каліксаренів С99 і С107 на кінетику скорочення-розслаблення ГМ caecum.

Беручи до уваги важливу роль Nа+,К+-АТФази у регуляції збудливості ГМ [Carl, Sanders, 1989; Nasu, Takahashi, 2005], пошук оборотних селективних ефекторів, які були б здатні спрямовано впливати на цю ферментативну систему, є важливим як з фундаментальної, так і з практичної точок зору.

У дослідженнях, проведених в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України [Векліч, Костерін, 2005], було встановлено, що каліксарени С99 та С107, ефективно гальмуючи активність Nа+,К+-АТФази ГМ (значення уявних констант інгібування Кі становило відповідно 98±8 та 54±6 нМ), практично не впливають на активність іншої мембранозв’язаної Са2+-незалежної Mg2+-залежної ферментативної системи –«базальної» Mg2+-ATФази. Наявність оуабаїнподібної інгібуючої дії цих каліксаренів на Nа+,К+-АТФазу та відсутність їхнього впливу на «базальний» Mg2+-залежний ферментативний гідроліз АТФ ставить питання щодо можливого використання зазначених сполук у якості ефективних інгібіторів Nа+,К+-АТФази ГМ. З метою вивчення закономірностей дії вищезазначених каліксаренів на функціонування ГМ було проведено порівняльне дослідження впливу цих сполук та оуабаїну на механокінетику скорочення-розслаблення смужок м’язу caecum при калієвій деполяризації та аплікації АCh (n = 6 – 7) (рис. 6).

Аплікація гіперкалієвого розчину (80 мМ) після 30 хв попередньої інкубації препаратів в розчині Кребса з оуабаїном (10 мкМ) супроводжувалась вірогідним зниженням амплітуди скорочень fm на 36,2±8,0 % порівняно з контролем, прийнятим за 100 %. В аналогічних умовах каліксарен С99 (10 мкМ) спричиняв вірогідне зниження амплітуди скорочень приблизно на таку ж саму величину – на 28,9±6,0 % відносно контролю (рис. 6, А).

Для кількісного визначення зміни різних етапів розвитку скоротливої відповіді під дією оуабаїну і каліксарену С99 відповідні механограми аналізували, використовуючи вищенаведений кінетичний метод з наступним розрахунком механокінетичних показників n, ф і Vn. Виявилось, що в умовах дії оуабаїну та каліксарену С99 значення нормованих максимальних швидкостей Vnс у випадку фаз скорочення зменшувались, порівняно з контролем, відповідно на 21,3±16,7 та 33,4±11,1 % (відмінності були вірогідними щодо контролю, Р < 0,05). Середнє ж значення максимальної нормованої швидкості розслаблення Vnr вірогідно зменшувалось як під дією оуабаїну (на 14,1±5,9%), так і каліксарену С99 (на 15,1±10,4 %) (Р < 0,05) (рис. 6, А).

У дослідах по вивченню скоротливої активності препаратів caecum, спричиненої ACh (10 мкМ) в нормальному розчині Кребса, було встановлено, що оуабаїн (10 мкМ) та каліксарен С99 (10 мкМ) вірогідно, стосовно контролю, знижували амплітуду скорочень fm відповідно на 36,3±8,0 та 24,8±8,5 % (Р < 0, 05) (рис. 6, Б).

При порівнянні нормованих максимальних швидкостей Vnc фаз скорочення (рис. 6, Б) у контролі та за умов присутності каліксарену С99 було виявлено, на відміну від результатів експериментів з оуабаїном, вірогідне зростання цього показника на 17,2±3,3 % (Р < 0,05). Водночас під дією каліксарену С99 нормована максимальна швидкість Vnr фази розслаблення суттєво зменшувалась – на 43,9±10,3 % (Р < 0,05) (в присутності оуабаїну вона залишались практично на контрольному рівні).

Для подальшого вивчення закономірностей впливу пригнічення Na+,К+-АТФази каліксаренами на функціонування ГМ caecum було досліджено дію каліксарену С107 (здатен ефективно інгібувати натрієву помпу) та його структурної частини – фрагменту М3 (ефекторну дію на натрієву помпу не виявлено [Векліч, Костерін, 2005]), на механокінетичні параметри викликаних ACh та гіперкалієвою деполяризацією скорочень.

Аналогічно до дії оуабаїну та каліксарену С99 (рис. 6), проведені дослідження спонтанної скоротливої активності та базального напруження м’язових препаратів у середовищі з каліксареном С107 (10 мкМ) та фрагментом М3 (10 мкМ) виявили пригнічення спонтанних скорочень без вірогідних змін базального напруження смужок протягом декількох годин інкубації. Такий ефект речовин може бути пояснений, зокрема, деполяризацією плазматичної мембрани клітин ГМ, яка індукується блокуванням натрієвої помпи.

Було встановлено, що обидві речовини (С107, М3) вірогідно знижували значення fm скорочень, викликаних калієвою деполяризацією (рис. 7, А), однак каліксарен С107 більш інтенсивно пригнічував скорочення порівняно із дією фрагменту М3 (величина ефекту складала відповідно 21,8±4,6 та 12,1±4,0 % стосовно контролю, прийнятого за 100 %). Проведення механокінетичного аналізу показало, що зазначені речовини справляли ідентичний вплив на кількісні показники у випадку гіперкалієвих скорочень. Каліксарен С107 та фрагмент М3 не змінювали нормовану максимальну швидкість фази скорочення Vnc, але вірогідно знижували показник Vnr (рис. 7, А) відповідно до величини 78,0±2,1 і 74,6±4,6 % (M+m; n = 6) порівняно з контролем, прийнятим за 100%.

Також було досліджено особливості розвитку скоротливої відповіді препаратів caecum на аплікування медіатора мускаринових холінорецепторів AСh в присутності С107 та його фрагменту М3 (рис 7, Б). Початково реєстрували скоротливі відповіді гладеньком’язових препаратів, особлива увага приділялась такій характеристиці, як амплітуда фазного компоненту fm. Як і у випадку скорочень, спричинених аплікацією гіперкалієвого розчину (рис 7, А), AСh-викликані скоротливі відповіді під дією каліксарену С107 вірогідно пригнічувались (до 75,6±4,4% порівняно з контролем, прийнятим за 100%). Втім, на противагу С107, його структурний фрагмент М3 не впливав на параметр fm AСh-індукованих скорочень (рис. 7, Б). Для кількісної оцінки ефекту каліксарену С107 та його фрагменту на динаміку ACh-викликаних скорочень проводили кінетичний аналіз механограм відповідно до апробованого вище методу. Узагальнені результати дії С107 та М3 на показники нормованих максимальних швидкостей фаз скорочення та розслаблення (Vnc та Vnr) наведено на рис. 7, Б. Як видно, обидві сполуки не впливали на кінетичні властивості фази зростання сили (показники Vnc залишались на контрольному рівні). Проте, каліксарен С107 та фрагмент М3, так само як і каліксарен С99 (рис. 6), в однаковій мірі зменшували нормовану швидкість розслаблення (Vnr) препаратів ГМ відповідно до 63,8±6,3% та 62,3±5,9% порівняно з контролем, прийнятим за 100% (рис. 7, Б).

Отже, під дією каліксарену С107 механокінетичні характеристики (fm, Vnr) скорочень, активованих К+-деполяризацією, змінюються так само, як за дії природного інгібітора натрієвої помпи оуабаїну. Вцілому особливості зміни викликаних калієвою деполяризацією та АCh скорочень під дією обох каліксаренів (С99, С107) подібні. Фрагмент М3, як і каліксарен С107, не впливає на такий механокінетичний показник, як Vnc, але пригнічує величину Vnr.

Вищенаведені дані вказують на те, що оуабаїн та нові штучні високоефективні інгібітори натрієвої помпи каліксарени С99 та С107 здатні пригнічувати скоротливі відповіді м’язів caecum, які були індуковані як калієвою деполяризацією, так і аплікацією ACh. Найбільш чуттєвим до пригнічуючої дії каліксаренів є механокінетичний параметр Vnr.

Виявлений характер змін у механокінетиці скоротливої відповіді м’язів caecum на фоні дії досліджених інгібіторів натрієвої помпи дозволяє міркувати, що каліксаренам, крім ефектів, які можна пояснити наслідком блокування Na+,K+-АТФази [Векліч, Костерін, 2005], властива також додаткова здатність до модифікування механізмів, що лежать в основі холінергічного збудження. Відомо, що однією із ланок, модифікування якої супроводжується зміною відносного внеску фазного і тонічного компонентів ACh-індукованого скорочення, є зміна інозитолтрифосфат-чутливого шляху мобілізації Са2+ [Kurijama et al., 1998; Gordienko, Zholos, 2004]. Тому було перевірено здатність каліксаренів впливати на вивільнення іонів Са2+ з саркоплазматичного ретикулуму клітин ГМ. Дослідження скоротливих відповідей смужок ГМ сліпої кишки в присутності каліксарену С99 на дію ACh в безкальцієвому розчині показали значне їх пригнічення порівняно з контролем. Крім того, вони були більше пригнічені, порівняно зі скороченнями у присутності оуабаїну. Також дослідження ACh-викликаних скорочень за умови застосування інгібітора інозитолтрифосфатних рецепторів 2-АРВ (50 мкМ) показало, що препарати ГМ caecum, які були оброблені розчином каліксарену, втрачають здатність мобілізувати Са2+ з інозитолтрифосфатного кальцієвого депо саркоплазматичного ретикулуму у відповідь на дію ACh. Приймаючи до уваги дані літератури [Carl, Sanders, 1989; Barajas-Lopes et al., 1989], згідно яких блокування натрієвої помпи оуабаїном спричиняє деполяризацію і збільшення внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію, можна передбачити посилення Са2+-залежних провідностей плазматичної мембрани, зокрема через системи Са2+-залежних К+-каналів. З огляду виявленої зміни тонічної складової ACh-викликаного скрочення в присутності каліксаренів та фрагменту М3, можна припустити пригнічення цими речовинами саме Са2+-залежних провідностей плазматичної мембрани. Також не можна виключати, що деякі з каліксаренів можуть впливати на системи активного транспорту іонів Са, що локалізовані у субклітинних мембранних структурах і є надійно охарактеризовані [Kosterin, 1994; Векліч, Костерін, 2005].

Отже, у цій роботі було з’ясовано кінетичні закономірності скорочення-розслаблення ГМ caecum щурів за умов використання різних за своєю природою активуючих факторів (К+-деполяризація, аплікація ACh), досліджено зміни у механокінетиці скоротливої відповіді при дії різних фізико-хімічних чинників (гіпонатрієвий розчин, органічні блокатори Са2+-каналів L-типу, температура), а також класичного (оуабаїн) та штучних (каліксарени С99 і С107) інгібіторів Na+,K+-ATФази. Оуабаїн (10 мкМ), каліксарени С99 та С107 (10 мкМ) вірогідно та в однаковій мірі пригнічували спонтанну та викликану скоротливу активність ГМ caecum. Факт чутливості нормованої максимальної швидкості розслаблення Vnr до дії зазначених каліксаренів є важливим для проведення подальших розробок у галузі спрямованого синтезу ефективних модуляторів скоротливої активності, що є важливим для фармакології ГМ.

У наступних експериментах, спрямованих на вивчення біофізичних механізмів дії вищезазначених каліксаренів на електро- та фармакомеханічне спряження в ГМ caecum, перспективним варто вважати комплексне дослідження впливу цих сполук на механокінетику скорочення-розслаблення та динаміку іонних (Са2+, Na+) транзієнтів у міоплазмі, а також на трансмембранний обмін зазначених іонів в плазматичній мембрані, саркоплазматичному ретикулумі та мітохондріях.

ВИСНОВКИ

1.   У даній роботі, що була виконана із використанням методів тензометрії та кінетичного аналізу на інтактних препаратах кільцевих гладеньких м’язів сліпої кишки (caecum) щурів, досліджували динамічні закономірності скоротливих відповідей, індукованих калієвою деполяризацією та аплікацією ацетилхоліну, вплив деяких фізико-хімічних факторів (ізотонічна заміна іонів Na на іони холіну, температура, блокатори кальцієвих каналів L-типу) та інгібіторів Na+,K+-ATФази – оуабаїну, каліксаренів С99 і С107 на механокінетичні показники.

2.   Доведено, що метод кінетичного аналізу, який ґрунтується на лінеаризації у подвійних логарифмічних координатах механограм окремо для фаз скорочення та розслаблення, може бути застосований для кількісного опису ізометричних скорочень м’язів caecum щурів.

3.  Значення таких механокінетичних параметрів скоротливої відповіді м’язів caecum, як логарифмічний коефіцієнт крутизни n, характеристичний час ф та, що особливо важливо, нормовані максимальні швидкості зміни механічного напруження Vn у випадку фаз скорочення Vnс та розслаблення Vnr відповідно, не залежать від амплітуди скоротливої відповіді fm. Отже, “швидкісні” показники Vnc та Vnr є універсальними кількісними механокінетичними параметрами, які можуть бути використані як при вивченні електро-, так і фармакомеханічного спряження.

4.  Продемонстровано, що нормована максимальна швидкість Vn є об’єктивним параметром, що характеризує чутливість динаміки скоротливої відповіді м’язів caecum щурів до зміни фізико-хімічних факторів (гіпонатрієве середовище, блокатори кальцієвих каналів, температура).

5.  При вивченні впливу гіпонатрієвого середовища на викликані ацетилхоліном скорочення caecum встановлено, що значення fm, Vnc та Vnr вірогідно зменшуються стосовно контрольних величин. Це вказує на суттєву роль транссарколемального натрієвого градієнту у контролі механокінетики зазначених м’язів.

6.  Результати досліджень концентраційних залежностей впливу блокаторів кальцієвих каналів L-типу ніфедипіну та D600 на амплітуду fm скорочень м’язів caecum, викликаних ацетилхоліном, показали, що ніфедипін є більш ефективним у своїй дії, ніж D600. Для ефекту обох блокаторів на скоротливу активність властивим є явище негативної кооперативності.

7.  Уперше продемонстровано, що новий штучний високоефективний інгібітор Na+,K+-ATФази каліксарен С99, як і оуабаїн, здатний вірогідно пригнічувати скоротливі відповіді м’язів caecum, індуковані як калієвою деполяризацією, так й аплікацією ацетилхоліну. У випадку ацетилхолін-індукованих скорочень каліксарен С99 значно пригнічував параметр Vnr, а оуабаїн – практично не впливав на цей показник.

8.  Уперше показано, що новий штучний високоефективний інгібітор Na+,K+-ATФази – каліксарен С107 викликав однакове за інтенсивністю пригнічення амплітуди fm викликаних скоротливих відповідей м’язів caecum як у випадку калієвої деполяризації, так і ацетилхоліну. Структурний фрагмент цього каліксарену – сполука М3 слабше пригнічував скорочення, що були викликані калієвою деполяризацією, порівняно з дією каліксарену С107. Обидві сполуки зменшували значення Vnr, але практично не впливали на величину Vnc.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Цимбалюк О.В., Онуфрийчук О.В., Векліч Т.О., Черенок С.О., Кальченко В.І., Мірошниченко М.С., Костерін С.О. Порівняльне дослідження впливу оуабаїну і каліксарен біс-гідроксиметилфосфонової кислоти на активність Na+/K+-АТФази на міханокінетику процесу “скорочення-розслаблення” гладенького м’язу // Фізика живого. – 2006. – Т.14, №1. – С. 53–72. (здобувачем здійснено вивчення літератури з проблеми дослідження, проведення експериментальної частини досліджень, статистичну обробку одержаних результатів. Разом з науковим керівником зроблено узагальнення результатів та формулювання висновків дослідження).

Онуфрийчук О.В., Цимбалюк О.В., Мірошниченко М.С., Костерін С.О. Механокінетика “скорочення-розслаблення” кільцевого м’язу сліпої кишки (caecum) щурів // Фізика живого. – 2006. – Т.14, №3. – С. 63–75. (здобувачем здійснено аналіз літератури з цього питання, проведено експериментальні дослідження, кінетичний і статистичний аналіз отриманого матеріалу).

Онуфрийчук О.В., Цимбалюк