НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ

І РАДІОБІОЛОГІЇ ім. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

СКРИЦЬКА ТЕТЯНА ВІКТОРІВНА

УДК 618. 146: 616. 006-091: 612. 017. 1

ОСОБЛИВОСТІ КЛІНІЧНОГО ПЕРЕБІГУ РАКУ ЯЄЧНИКА,

АСОЦІЙОВАНІ З БІОЛОГІЧНИМИ ВЛАСТИВОСТЯМИ

ПУХЛИННОЇ ТКАНИНИ ТА РІВНЕМ ФАКТОРА НЕКРОЗУ

ПУХЛИН У КРОВІ ХВОРИХ

14.01.07– онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківській медичній академії післядипломної освіти МОЗ України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

Карташов Сергій Михайлович,

в.о. завідувача кафедри онкохірургії та онкогінекології Харківської медичної академії післядипломної освіти МОЗ України.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Шляховенко Володимир Олексійович,

завідувач відділу ензимології

Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України;

доктор медичних наук

Вінницька Алла Борисівна,

старший науковий співробітник науково-дослідного відділу онкогінекології Інституту онкології АМН України.

Провідна установа: Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького МОЗ України, кафедра онкології та медичної радіології, м. Львів.

Захист відбудеться 16 травня 2007р. о 13 годині 30 хвилин на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України (03022, м. Київ, вул. Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Автореферат розісланий “_____“ квітня 2007р.

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої ради,

доктор медичних наук Н. В. БОРОДАЙ

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Рак яєчника (РЯ) становить 5,3% серед усіх злоякісних пухлин у жінок, займає сьоме місце по частоті виникнення та п’яте місце серед захворювань, які призводять до смертності жінок (6,7%) (Greenlee R.T.,2005; Воробйова Л.І., 2006). Захворюваність на РЯ в Україні у 2006 р. за даними Національного Канцер-реєстру складала 15,4 на 100 тис. населення. Щорічно від РЯ помирає більше жінок, ніж від раку шийки матки та ендометрію тіла матки разом узятих (Шалімов С.О. та співавт., 2005; Бондарь В.Г., Думанский Ю.В., 2006). Прогнозоване зростання у жінок онкологічної захворюваності, на 20% до 2020 року вказує на актуальність подальшого вивчення додаткових параметрів, пов’язаних із чинниками, патогенезом з метою знаходження нових шляхів лікування онкологічних хворих (Білинський С.І. та співав., 2006; Свинцицкий В.С. 2006). Висока смертність обумовлена безсимптомним перебігом захворювання, внаслідок чого у 75% випадків РЯ виявляють на III-IV стадїї пухлинного процесу, що погіршує прогноз та результати лікування (Воробйова Л.І., та співав.,2006; Сидоренко Ю.С. і співавт., 2006; Вакуленко Г.О. і співавт., 2006). Таким чином, виявлення та адекватне лікування РЯ є актуальними і важливими задачами онкології в цілому та онкогінекології зокрема (Винницкая А.Б., 2006; Неродо Г.А. и соавт., 2006; Куприенко Н.В. и соавт., 2005; Hoskins P.J., 2007). Коректний системний підхід до вирішення вказаних питань можливий завдяки подальшому вивченню додаткових параметрів патогенезу РЯ , серед яких важливими є епігеномні, цитокінні порушення та механізми запуску апоптозу (Бережная Н.М., Чехун В.Ф., 2005; Полищук Л.З. и соавт., 2005; Михановский А.А. и соавт., 2006; Фильченков А.А., 2006).

Головними регуляторами пухлинного росту є цитокіни (Володько Н.А.,2005; Кудрявец Ю.И. и соавт., 2006), тобто білкові молекули, які контролюють послідовність плейотропних клітинних механізмів (проліферацію, апоптоз, диференціювання клітин пухлини, тощо). Гени-супресори пухлинного росту беруть участь у регуляції пухлинного процесу, а також виступають індукторами синтезу цитокінів (Чехун В.Ф., 2006). Фактор некрозу пухлин-б (ФНП-б) може бути як стимулятором (Rak Y.W.,2004), так і інгібітором (Володько Н.А., 2005) пухлинного росту.

Самостійно або в комбінації із цитостатиками ФНП-б проявляє селективну інгібуючу дію на судини злоякісних пухлин (Дудниченко А.С. и соавт.. 2006; Ten Hagtn T.L.,2003), а також стимулює метастатичне поширення РЯ (Sharp F., 2005). Отже, розвиток РЯ є складним біологічним процесом, в якому приймає участь і ФНП-б, проте його роль у розвитку РЯ до кінця не з’ясована і вимагає додаткових досліджень.

За останні роки велике значення надається дослідженню епігеномних порушень, а саме – метилуванню генів (Cameton E.,2001). Перспективним напрямком при РЯ є дослідження гена-супресора р16 (Dong Y., Dexeus S.,2005; Бучинська Л.Г. та співавтор., 2006). Однак механізми впливу деяких генів та їх роль у процесі малігнізації та прогресії РЯ залишаються маловивченими, хоча велика кількість досліджень присвячена саме вивченню генетичних особливостей РЯ (Горбунова В.Н.,2005; Balkwill F.R.2006). Оскільки пухлиний ріст є результатом дисбалансу між проліферацією клітин і апоптозом, клінічний інтерес представляє, перш за все, можливість використати показник апоптозу для діагностики, оцінки ефективності лікування злоякісних пухлин та прогнозування хвороби (Стариков В.И., 2006; Stratton I.E., 2005).

Таким чином, дослідження апоптозної загибелі пухлинних клітин у доброякісних і злоякісних пухлинах яєчника, уточнення процесів апоптозу з особливостями розповсюдження та клінічним перебігом пухлинного процесу, морфологічними показниками, частотою метилування гена р16, рівнем цитокіну ФНП-б та їх змінами після неоад’ювантної хіміотерапії, а також прогнозуванням захворювання є актуальними питаннями сучасної онкології.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна работа виконана відповідно до планів науково-дослідних робіт кафедри онкохірургії та онкогінекології Харківської медичної академії післядипломної освіти МОЗ України за темою “Етіопатогенетичні фактори розвитку раку органів репродуктивної системи жінок та їх вплив на перебіг та рецидивування захворювання“ (№ держ. реєстрації 01.05.U.002871, 2005-2009рр.).

Мета дослідження – підвищити ефективність терапії РЯ шляхом визначення зв’язку фактора некрозу пухлин-б, метилування гена р16 та апоптозу з клінічним перебігом захворювання.

Задачі дослідження:

1. Дослідити клініко–біологічні особливості доброякісних пухлин та РЯ і визначити їх взаємозв’язок з перебігом захворювання.

2. Вивчити зв’язок ФНП-б, апоптичного індекса (АІ) та метилування гена р16 із розповсюдженістю РЯ.

3. Провести порівняльний аналіз рівня ФНП-б, АІ і частоти метилування гена р16 при різних ступенях диференціювання РЯ.

4. Оцінити зміни ФНП-б, епігеномних порушень гена р16 та АІ при проведенні неоадґювантної хіміотерапії (нео-ХТ) хворим на РЯ в залежності від ступеня диференціювання пухлини.

5. Проаналізувати ефективність лікування хворих на РЯ в залежності від епігеномних порушень гена р16, морфологічних особливостей новоутворень, рівня ФНП-б, АІ.

Об’єкт дослідження: 383 хворих на РЯ і 50 жінок з доброякісними пухлинами яєчника (ДПЯ).

Предмет дослідження: рак яєчника, доброякісна пухлина яєчника, концентрація ФНП – б у крові хворих, апоптоз пухлинних клітин, епігеномні порушення гена р16.

Методи дослідження: клінічні, ультразвукові, рентгенологічні, цитологічні, морфологічні, імуноферментні, флюоресцентна мікроскопія, метилспецифічна ПЛР, статистичні.

Наукова новизна результатів дослідження. Вперше з’ясовано, що рівень ФНП-б у крові хворих вірогідно збільшується при малігнізації доброякісних пухлин яєчника (ДПЯ) і при поширеності раку яєчників (РЯ). Вперше виявлено взаємозв’язок між ФНП-б, метилуванням гена р16, АІ та клініко- морфологічними особливостями доброякісних пухлин та РЯ, що може сприяти своєчасній діагностиці хвороби.

Доведено, що АІ і ФНП-б відіграють незначну роль у терапевтично обумовленій регресії та інволюції пухлини після проведення нео-ХТ. Вперше встановлено, що АІ у хворих на РЯ після проведення нео-ХТ зростав тільки після третього курсу, коли зменшувався об’єм пухлинної маси.

Показано, що частота метилування гена р16 у хворих на РЯ збільшується в порівнянні з серозними доброякісними пухлинами, що може бути інформативним критерієм для ранньої діагностики РЯ.

Практичне значення роботи: Застосування комплексного підходу до вивчення клінічних і структурних особливостей доброякісних і злоякісних пухлин яєчника надасть можливість прогнозувати перебіг та прогресію хвороби, а також обґрунтувати нові шляхи до терапії.

Концентрація ФНП-б вища за 13,4 пкг/мл свідчить про високий ризик малігнізації ДПЯ.

Доведено, що ремісію у хворих на РЯ, яка перевищує 24-місячний термін, можна прогнозувати, якщо показник ФНП-б вищий за 22,3 пкг/мл при високодиференційованих пухлинах, вищий за 24,1 пкг/мл при помірно-диференційованих пухлинах і вищий за 26,5 пкг/мл при низькодиферен-ційованих пухлинах.

Критерієм сприятливого прогнозу перебігу захворювання та тривалості ремісії хвороби слід вважати метилування гена р16 у хворих на РЯ.

Хворі на РЯ з безпліддям в анамнезі та жінки у період менопаузи потребують більш інтенсивного лікування і адекватного спостереження після лікування у зв’язку з можливим раннім розвитком рецидивів.

Отримані результати можуть бути використані в практичній роботі поліклінічних, гінекологічних і онкологічних відділень лікарень, а також в лікарнях загального профілю.

Результати досліджень впроваджені в практичну роботу Харківського обласного клінічного онкологічного диспансеру, Харківського інституту медичної радіології АМН України ім. С.П.Григор’єва, Харківського центру репродуктивної медицини та ендоскопічної гінекології “Сана-мед”.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено клінічний відбір хворих на РЯ та ДПЯ. На основі вивчення даних літератури і проведеного патентного пошуку за темою дисертації автором були визначені мета і задачі дослідження, зібрано первинний матеріал. Самостійно оброблені і проаналізовані результати дослідження, сформульовані основні положення і висновки дисертації, підготовлені публікації, зроблені доповіді на з’їздах та конференціях.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на: III з’їзді онкологів країн СНД (м.Мінськ, 2004 ); обласних науково-практичних конференціях: “Рак шийки матки“ (м. Харків, 2004), “Пухлини жіночих репродуктивних органів“ (Харків,2005); науково-практичній конференції “Ліки людині“ (Харків, 2004); Харківському науковому товаристві онкологів (2006); науково-практичній конференції молодих вчених (Харків, 2005); на XI з’їзді онкологів України (Судак, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 наукових робіт, із них 6 статей у провідних фахових виданнях, 3 тези у матеріалах з’їздів і наукових конференцій, одержано 1 патент на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, 6 розділів, висновків, практичних рекомендацій. Вона викладена на 136 сторінках друкованого тексту, ілюстрована 24 таблицями та 28 рисунками. Список літератури містить 185 англомовних і 106 українських та російських джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи дослідження. У роботі представлені результати комплексного обстеження і лікування 433 жінок віком від 20 до 79 років у період з 2001 по 2006 роки, з них 383 хворих на РЯ та 50 з ДПЯ. Хворим проводили бімануальне, ректовагінальне, трансвагінальне ультразвукове дослідження органів малого тазу та черевної порожнини, рентгенобстеження ОГК та ЖШТ. У плазмі крові визначали рівень СА-125, проводили цитологічне і морфологічне дослідження видаленого післяопераційного матеріалу у хворих з доброякісними і злоякісними пухлинами. У 285 жінок (235 хворих на РЯ і 50 з ДПЯ віком від 20 до 79 років) досліджували рівень концентрації ФНП-б у сироватці крові, АІ і метилування гена р16 в пухлинах яєчників. Серед обстежених переважали хворі на РЯ віком 50-70 років. Всі хворі дали свою згоду на участь у дослідженні.

За даними анамнезу у хворих на РЯ було виявлено, що 76 жінок мали спадкову онкопатологію різних органів. Безпліддя у цих хворих виявлено у 73 (19,1%) випадках, 310 (80,9%) мали пологи.

Визначення стадії РЯ проводили за класифікацією TNM (2003p.) і FIGO (1997p.). Хворі на РЯ були розподілені за стадіями процесу (T1a-cNoMo – T1-3N0-1M0-1).

У всіх 433 хворих на РЯ і ДПЯ діагноз був гістологічно верифікований. Для визначення гістологічної структури пухлини, ступеня диференціювання, мітотичної активності, мітотичного індексу та кількості патологічних мітозів проводили цитологічне та гістологічне дослідження післяопераційного матеріалу.

Метилування гена р16 у пухлинах яєчника визначали у 235 хворих на РЯ і 50 з ДПЯ. Екстракцію ДНК і ПЛР здійснювали за допомогою програмованого термоциклера фірми “Techne” (США) з використанням термофільної ДНК- полімерази (НВО “Ферментранс”, Литва). Для визначення метилування промоторної області гена р16 ДНК обробляли метилчутливими рестриктазами. Пошук сайтів рестрикції здійснювали за допомогою програми “WIN-SUN” в лабораторії “Вірола” ХМАПО.

У 235 хворих на РЯ і 50 жінок з ДПЯ проведено дослідження ФНП-б у сироватці крові. В наборі ProCon TNF "Протеїновий контур" (С.-Петербург) вимірювали рівень ФНП-б використовували твердофазний імуноферментний метод із застосуванням пероксидази хріну як індикаторного ферменту в лабораторії “Вірола” ХМАПО.

Кількість клітин у стані апоптозної загибелі підраховували (в лабораторії “Вірола” ХМАПО) у 235хворих на РЯ і 50 жінок з ДПЯ. Аналіз проводили за допомогою флуоресцентного мікроскопа при Ч 140, мазки-відбитки пухлинної тканини фарбували пропідій-йодидом у розведенні 5мг/мл. При ідентифікації таких клітин керувались загальновідомими цитологічними ознаками апоптозу. Рівень АІ визначали як співвідношення між кількістю клітин в стані апоптозу на 100 досліджуваних клітин і виражали у відсотках (Yamasаki F., Tokunara O.,2003.).

Усім хворим на РЯ проводили комбінований курс лікування: 260 хворим на РЯ I-II ст. та 171 хворій на РЯ III-IV ст. на першому етапі лікування виконано операцію, 122 жінкам проведено нео-ХТ з подальшою операцією. Усі хворі одержали ад’ювантну поліхіміотерапію.

Клінічними критеріями оцінки ефективності лікування були: частота виникнення ремісії, її тривалість (ВООЗ, 1998) і дворічна виживаність хворих, яку оцінювали за методом Каплана-Мейєра. Статистична обробка одержаних результатів проведена за допомогою програми STATISTIKA 6.0 (StatSoft Inc.,1994-2001-www.statsoft.com).

Результати дослідження та їх обговорення. Проведені дослідження показали, що РЯ не має патогномонічних клі-нічних симптомів, однак на основі проведених нами досліджень можна стверджувати про наступні симптоми і частоту їх прояви: болі унизу живота - 71,8%, втрата ваги - 60,1%, загальна слабкість – 59,0%, збільшенння об’єму живота - 39,7%, задишка - 36,8%. При цьому необхідно звернути увагу на те, що у 78,4% хворих на РЯ до моменту встановлення ді-агнозу була III або IV ст. захворювання. За нашими даними, кров’янисті виділення із статевих шляхів не були характерними для хворих на РЯ, а були наслідком ураження маткових труб і закиду крові у матку у хворих 4 (1,3%) та проростання пухлини в усі шари матки у 1 хворої (0,3%).

Відомо, що своєчасне встановлення діагнозу – найважливіша задача клініциста. У зв’язку з цим ми провели аналіз діагностичної інформативності скарг, ректовагінального дослідження, УЗД і рівня СА 125 у крові. Аналіз діагностичної цінності цих методів дослідження на амбулаторному етапі (скарги і ректовагінальне обстеження) дозволили встановити, що діагноз РЯ був встановлений у 68,7% випадків. У хворих з діагнозом РЯ і підозрою на РЯ за даними скарг, ректовагінального і УЗД досліджень був встановлений у 91,0% випадків, а визначення СА 125 дозволило зменшити кількість помилкових діагнозів до 34,7%.

Проведений аналіз також показав, що прогностично несприятливі морфологічні варіанти РЯ діагностувались лікарями набагато частіше у порівнянні з прогностично сприятливими формами. Водночас, результати лікування мають зворотну залежність. З нашої точки зору, це можна пояснити тим, що при клінічному обстеженні у хворих на муцинозний і ендометріоїдний РЯ ставиться діагноз ДПЯ.

Проведені нами дослідження частоти метилування гена р16 показали (таблиця), що частіше ці порушення спостерігались при РЯ, ніж при ДПЯ. Так, частота метилування гена р16 у хворих на РЯ I ст. у 5 разів (р<0,01) більша, ніж при ДПЯ. Водночас прогресія захворювання немала чіткої тенденції до збільшення частоти метилування гена р16, в той же час цей показник у хворих з IV ст. РЯ не відрізнявся від такого у хворих з I ст. Ці дані дозволяють припустити, що порушення функції даного гена відіграють більш вагому роль саме при малігнізації ДПЯ і меншу – при прогресії даного захворювання.

Визначення вмісту ФНП-б у крові хворих на РЯ показало, що він вірогідно вищий, ніж у хворих з ДПЯ. При порівнянні вмісту ФНП-б у крові хворих на РЯ з наявністю асциту було встановлено наступне. При асцитних формах рівень цитокіну дорівнював 24,4±1,91 пкг/мл; при полісерозитах– 26,1±1,95 пкг/мл, тоді як при безасцитних формах раку – 20,3±1,77 пкг/мл. Можна припустити, що рівень ФНП-б залежить не тільки від об’єму метастазів, а також від об’єму первинної пухлини. Це підтверджено при аналізі вмісту ФНП-б при кістозній (16,7±1,95 пкг/мл), кістозно-солідній (23,9±1,37 пкг/мл, р<0,01) і солідній (26,4±1,97 пкг/мл, р <0,01) формах пухлин. Зменшення кістозного і збільшення солідного компонентів пухлини прямопропорційно корелює із зростанням об’єму пухлинної маси і зменшенням ступеня диференціювання пухлини. Залежність ФНП-б від стадії захворювання представлена в таблиці.

Визначення АІ у пухлині показало, що АІ при РЯ зростає в 4-5 разів при I-IV ст. захворювання (р<0,01), в той же час цей показник при IV ст. виявився нижчий, ніж при III ст. Можна зробити висновок, що АІ в пухлинних клітинах зростає тільки при I-III ст. процесу.

Крім того виявлено, що рівень АІ при безасцитній формі РЯ становив 1,15±0,08%, при наявності полісерозиту – 1,14±0,07%. При асцитній формі РЯ АІ виявився більш високим – 1,20±0,09% у порівняні з безасцитною і полісерозитною формами.

Таблиця

Вміст ФНП-б у крові, АІ в пухлинних клітинах і частота метилування гена р16 у хворих на РЯ в залежності від стадії захворювання

Досліджувані групи (n – кількість хворих) | ФНП-б,

пкг/мл | АІ, % | Частота метилування

гена р16, (кількість хворих з метилуванням гена р16 у пухлині / загальна кількість хворих)%

1. 1. ДПЯ (контроль)

(n=50) | 13,4±1,20 | 0,25±0,03 | 8,0±5,4 (4/50)

2. РЯ I ст.

(n=25) | 15,1±1,48 | 0.93±0,09

**1 | 44,0±9,9 (11/25)

**1

3. РЯ II ст.

(n=46) | 18,9±1,82

*1 | 1,07±0,10

**1 | 50,0±7,4 (23/46)

**1

4. РЯ III ст.

(n=94) | 24,3±1,49

*3*1;2 | 1,23±0,08

**1 | 58,5±5,1 (55/94)

**1

5. РЯ IV ст.

(n=70) | 26,1±1,95

*3*1;2 | 1,14±0,07

**1 | 52,9±6,0 (37/70)

**1

Примітка - *<0,05; **<0,01 – різниця між групами статистично достовірна.

Таким чином, як видно із отриманих результатів, АІ при РЯ більший ніж АІ при ДПЯ, в той же час рівень апоптичної загибелі пухлинних клітин залежить від об’єму пухлини, оскільки при зростанні стадії захворювання збільшується і показник апоптозу.

Якщо порівняти динаміку вмісту ФНП-б і АІ у пухлинній клітині на різних стадіях процесу (рис. 1), можна прослідкувати, що її спрямованість співпадає до IIIст. захворювання, а потім АІ знижується, причому рівень ФНП-б продовжує зростати. Важливо, що збільшення АІ спостерігали і при зростанні об’єму пухлини при переході від кістозної до кістозно–солідної і солідної форм РЯ.

При кістозній формі РЯ, коли пухлинна маса невелика, АІ – найменший (0,95±0,11%), а вміст цитокіну становить 16,7±1,95 пкг/мл. При збільшенні маси кістозно-солідних пухлин АІ та рівень ФНП-б достовірно зростали у порівнянні з показниками при кістозних формах РЯ – 1,21±0,06% (р<0,05) і 23,9±1,37 (р<0,01) пкг/мл відповідно. При солідній формі РЯ АІ знижувався практично до 1,09±0,07%, яку виявили при кістозних формах, а вміст цитокіну мав чітку тенденцію до зростання і становив 26,4±1,97 пкг/мл. При цьому динаміка частоти метилування гена р16 співпадала з динамікою змін АІ і відповідно становила: 34,3% при кістозних пухлинах, 60,3% при кістозно-солідних і 45,3% при солідних формах РЯ.

Рис 1. Вміст ФНП-б у крові, рівень АІ і частота метилування гена р16 в пухлинах хворих на РЯ в залежності від макроскопічної структури новоутворення.

Оскільки, що апоптоз є генетично обумовленим явищем, ми провели оцінку співвідношення рівня АІ і частоти метилування гена р16 при сімейних РЯ у 48 хворих і 187 хворих зі спорадичними РЯ. Нашими дослідженнями встановлено, що АІ при спадково обумовленому РЯ недостовірно нижчий (1,09±0,11%), ніж у хворих на РЯ без онкологічної родинної патології (1,15±0,05%), а вміст ФНП-б станови 20,3 і 24,6 пкг/мл, відповідно. Частота метилування гена р16 в групі хворих із сімейним РЯ становила 45,8 і 56,7% у хворих із спорадичним РЯ. Зростання досліджуваних показників відмічено у безплідних хворих на РЯ (АІ – 1,10±0,12%, рівень ФНП-б – 21,9 пкг/мл, частота метилування гена р16 – 47,8%) порівняно з жінками, що мали пологи (АІ – 1,15±0,05% (р<0,05), рівень ФНП-б – 24,1 пкг/мл (р<0,05), частота метилування гена р16 – 55,0% (р>0,05)). Відомо, що причина безпліддя частіше за все пов’язана з генетичними факторами. Скоріше за все, у безплідних хворих на сімейний РЯ має місце деяке пригнічення процесів апоптозу, що може бути одним із патогенетичних ланцюгів розвитку раку, а отже впливати на особливості клінічного йього перебігу.

Відомо, що РЯ є гормонозалежною пухлиною, в той же час відомий факт участі апоптозу на процеси гормональної інволюції органів. В період менопаузи відмічається зниження імунореактивності організму і інволюції гормонозалежних органів і систем. Нами встановлено, що вміст ФНП-б у крові не залежить від віку хворих на РЯ і репродуктивної фукції, а рівень АІ у пухлинних клітинах залежить від віку. Найменший рівень АІ відмічався у пухлинах хворих на РЯ в репродуктивному віці (0,97±0,07%), в клімактеричному він був достовірно вищим (1,28±0,13%). Наявність високого вмісту ФНП-б у крові хворих на РЯ у всіх вказаних вікових періодах свідчить про те, що система мононуклеарних фагоцитів функціонує незалежно від віку і гормональної активності яєчників, а рівень ФНП-б у крові залежить від ступеня поширеності пухлинного процесу і маси пухлини. Частота метилування гена р16 у пухлинах зростає у хворих більш похилого віку. Встановлено також, що найбільш помітні зміни відмічені у хворих на РЯ репродуктивного віку (38,1%) та в період менопаузи (63,3%, р<0,01), при цьому ще більше ці зміни проявляються у хворих в клімактеричному періоді (59,5%, р<0,05).

Ми проаналізували зміни АІ у хворих на РЯ в залежності від проведеної ХТ. Після використання схемі двох хіміопрепаратів (циклофосфаміду і цисплатину) рівень АІ становив 1,22%, трьох хіміопрепаратів (циклофосфаміду, цисплатину, доксірубіцину) АІ знижувався до 1,12%.

У крові хворих на РЯ, які одержували на першому етапі ПХТ, виявлена висока концентрація ФНП-б (25,4±1,98 пкг/мл). Таку ж концентрацію цього цитокіну спостерігали у хворих, які не одержували ПХТ (24,8±1,47 пкг/мл). АІ у пухлинах хворих, яким проводили ПХТ, практично не відрізнявся від АІ у хворих без ПХТ (18±0,09 і 1,20±0,08% відповідно). Частота метилування гена р16 виявилася в 3 рази вищою у групі хворих, яким на першому етапі виконано хірургічне втручання (60,4% в порівнянні з 47,1%). Отже, ФНП-б, синтезований гістіоцитами, і генетично запрограмований апоптоз не пов’язані з некрозом пухлини, індукованим хіміопрепаратами. Водночас вміст ФНП-б у крові хворих на РЯ певною мірою залежить від кількості курсів ПХТ. Так, після одного курсу ПХТ вміст ФНП-б у крові становив 20,13±1,98; після двох курсів – 25,0±3,81, а після трьох курсів – 26,8±5,40 пкг/мл. Ці зміни виявилися недостовірними, але помітна чітка тенденція до зростання концентрації цитокіну після третього курсу ПХТ. Рівень АІ після першого і другого курсів ПХТ однаковий (1,13±0,23 і 1,14±0,19 відповідно), а після третього курсу зростав до 1,30±0,28%. Можна припустити, що ФНП-б не відіграє значної ролі в некротичних процесах при інволюції РЯ. Не встановлено зв’язку між частотою метилування гена р16 та кількістю курсів ПХТ, після яких було б можливо перевести хвору в операбельну форму. Зміна показників апоптозу у хворих на РЯ залежить не тільки виду ПХТ, але і від кількості курсів ПХТ, одержаних до операції, що, безперечно, пов’язано з дозою цитостатиків.

Відомо, що гістологічний тип пухлини та ступінь її диференціювання впливають на результати лікування. Ми зіставили вміст у крові ФНП-б і гістологічний тип пухлини (рис. 2). При кістозній формі РЯ переважали високодиференційовані аденокарциноми, і рівень ФНП-б (16,7±1,95 пкг/мл) наближався до показника його вмісту при доброякісних цистаденомах яєчника (13,4±1,20 пкг/мл). При зростанні солідного компонента в пухлинах рівень вмісту ФНП-б постійно зростав. При кістозно-солідному типі РЯ з перевагою компонентів низькодференційованної аденокарциноми рівень вмісту ФНП-б достовірно був вищий, ніж при кістозних формах і становив 23,9±1,37 пкг/мл (р<0,01). При низькодиференційованих солідних формах РЯ рівень ФНП-б у крові найбільш високий і становив 26,4±1,97 пкг/мл (р<0,01). Отже, цей показник достовірно вищий, ніж при кістозній формі РЯ і майже не відрізнявся від вмісту цитокіну при кістозно-солідних формах РЯ (рис. 2).

Рис. 2. Вміст ФНП-б у крові, величина АІ і частота метилування гена р16 у хворих на РЯ в залежності від ступеня диференціювання пухлин.

При зниженні ступеня диференціювання пухлини збільшувалась кількість і об’єм некрозів, що можна пояснити недосконалим ангіогенезом і швидким зростанням пухлинної маси. При кістозному РЯ (0,95±0,11%) АІ майже в 4 рази перевищував таковий при цистоаденомах яєчників (0,25±0,03%). Але цей рівень був достовірно нижчим, ніж при кістозно-солідних формах РЯ – 1,21±0,06% ( р<0,05). При солідних формах РЯ АІ знижувався у порівнянні з цим показником при кістозно-солідних формах, але залишався високим (1,09±0,07%).

Безрецидивна виживаність протягом двох років становила: у хворих з кістозною структурою пухлини – 69,2±6,4% (36 із 52 хворих); у хворих з кістозно-солідною структурою – 48,6±3,4% (103 із 212 хворих, р<0,01 у порівнянні з такою у хворих з кістозними пухлинами) і у хворих з солідною структурою новоутворення – 34,5±4,3% (41 із 119 хворих, р<0,01 у порівнянні з такою у хворих з кістозними пухлинами та р<0,05 у порівнянні з такою у хворих з кістозно-солідними пухлинами). Нами також встановлено, що концентрація у крові ФНП-б у випадках, коли маса пухлини превалювала над масою метастазів, вміст ФНП-б у крові становив 23,2±1,21 пкг/мл, а при перевищенні маси метастазів над масою пухлини концентрація ФНП-б у крові становила 24,9±1,88 пкг/мл. Таким чином, вміст ФНП-б залежить не від об’єму пухлини або метастазів, а від всього об’єму пухлинної маси. Показники дворічної безрецидивної виживаності хворих становили: при перевищенні маси метастазів над масою пухлини 27,2±4,4% (28 із 103 хворих), а при перевищенні маси пухлини над масою метастазів – 54,3±3,0% (152 із 280 хворих, р<0,01).

Нами також встановлено, що дворічна безрецидивна виживаність у безплідних хворих становила 39,7±5,7% (29 із 73 хворих), а у жінок, які мали пологи, 48,7±2,8 % (151 із 310 хворих). При цьому показник дворічної безрецидивної виживаності у хворих із сімейним раком становив 39,5±5,6% (30 із 76 хворих), а у жінок зі спорадичною формою рака – 48,9±2,9 % (150 із 307 хворих). При низькому вмісті ФНП-б визначались вищі показники виживаності хворих на РЯ (рис.3).

Відомо, що нео-ХТ приводить до регресії як первинної пухлини яєчника, так і метастазів. Проведені нами дослідження показали, що дворічна виживаність у 122 хворих, які отримували неоад’ювантну ПХТ, становила 34,4±4,3% (42 хворі). В залежності від кількості курсів ПХТ становила: при використанні одного курсу – 38,9±9,1% (11 із 29 хворих), двох курсів – 33,3±6,4% (18 із 54 хворих) і при трьох курсах – 33,3±7,5% (13 із 39 хворих).

При порівнянні показників, що характеризують мітотичну активність високодиференційованих пухлин з тривалим безрецидивним періодом, відмічені чіткі тенденції до зростання мітотичного індексу (з 1,29±0,29% до 1,43±0,43%) і зростання кількості патологічних мітозів (з 20,3 до 23,1%) у хворих на РЯ з меншою тривалістю ремісії. При зменшенні тривалості ремісії спостерігається тенденція до зниження АІ (з 1,37 до 1,25%) в пухлинах і вмісту ФНП-б у крові (з 22,3 до19,7 пкг/мл). Більша тривалість ремісії частіше спостерігалась у хворих, в пухлинах яких виявлено метилування гена 16.

Рис. 3. Виживаність хворих на РЯ в залежності від рівня ФНП-б у крові

(метод Каплана-Мейєра).

Також нами встановлено, що в некротичних ділянках високодиференційованих аденокарцином були виявлені поля загибелі пухлинних клітин шляхом апоптозу. Разом з тим, є поля, де відзначалися апоптоз і некроз, це дозволяє стверджувати про перехід апоптозу в некроз і про поєднання цих процесів в пухлині. При помірнодиференційованому РЯ також відмічені численні поля апоптозу і некрозу, а при низькодиференційованих пухлинах – превалюють некротичні зміни після проведення поліхіміотерапії.

При порівнянні показників, що характеризують мітотичну активність помірнодиференційованих пухлин, з тривалим безрецидивним періодом, відмічено достовірне зростання мітотичного індексу (з 2,45 до 3,70%, р<0,01) і кількості патологічних мітозів (з 33,2 до 47,4%, р<0,05) у хворих на РЯ з меншою ремісією. При цьому АІ в пухлинах і вміст ФНП-б у крові мали незначну тенденцію до зниження при зменшенні у хворих на РЯ тривалості ремісії. Нами також відмічена достовірно більша частота метилування гена р16 у пухлинах хворих на РЯ з більшою тривалістю ремісії (83,0% в порівнянні з 56,5% при меншій ремісії, р<0,01). Оцінюючи показники мітотичної активності у низькодиференційованих пухлинах з тривалим безрецидивним періодом, достовірної різниці не виявили. Мітотичний індекс мав слабко-виражену тенденцію до зростання (з 5,22 до 5,37%), а кількість патологічних мітозів – чітку тенденцію до збільшення (з 43,6 до 50,7%) у хворих на РЯ з меншою тривалістю ремісії. Залежність показників дворічної виживаності хворих від частоти метилування гена р16 у пухлинах, наведені на рис. 4.

Рис. 4. Виживаність хворих на РЯ в залежності від наявності метилування гена р16 у пухлинах (метод Каплана-Мейєра).

Математична обробка одержаних нами даних показала, що існує високий негативний рівень кореляції між тривалістю ремісії і рівнем ФНП-б у крові (r = -0,77), мітотичним індексом (r = -0,79), кількістю некрозів в пухлинах (r = -0,80), ступенем диференціювання пухлини (r = -0,81) і стадією захворювання (r = -0,85). Водночас, кореляція тривалості ремісії з АІ (r = 0,58) і частотою метилування гена р16 (r = 0,59) позитивно-помірна.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі проаналізовані зв’язки між певними біологічними властивостями пухлинної тканини, рівнем у крові ФНП-б, АІ і частотою метилування гена р16 у пухлині та обґрунтовано підхід до покращення діагностики раку яєчників та результатів лікування хворих.

1. Комплексне застосування ректо-вагінального та ультразвукового дослідження, визначення рівня пухлинного маркера СА125 у крові хворих з пред’явленими скаргами і виявленням наявності сімейного раку дозволяють підвищити частоту встановлення вірних діагнозів до 92,2% та зменшити кількість невірних діагнозів на 34,7%.

2. Концентрація ФНП-б у крові хворих на РЯ постійно і достовірно зростає у порівнянні з цим показником у хворих на серозні доброякісні пухлини яєчника (13,4 пкг/мл). Поширеність пухлинного процесу при I ст. захворювання – 15,1; II ст. – 18,9; III ст. – 24,3; IV ст. – 26,1 пкг/мл та при переході від кістозної (16,7 пкг/мл) до кістозно-солідної (23,9 пкг/мл) і солідної (26,4 пкг/мл) форм РЯ може свідчити про участь ФНП-б в прогресії РЯ.

3. Частота метилування гена р16 у пухлинній тканині хворих на РЯ в залежності від стадії захворювання достовірно не відрізняється ( I cт.- 44,0; II ст. – 50,0; III ст. – 58,5; IV ст. – 52,5%), але значно перевищує цей показник у хворих з ДПЯ (8,0%, р<0,01). Ці дані дозволяють зробити припущення, що порушення функції даного гена відіграють головну роль при розвитку РЯ і менш значну – в прогресії цього захворювання.

4. Рівень АІ зростає при розповсюдженні РЯ: I ст.– 0,93; II ст.–1,07; III ст. –1,23, а при IV ст. незначно знижується до 1,14%. Зростання АІ у ДПЯ більше ніж на 0,77% свідчить про їх малігнізацію (р<0,01). Наявність або відсутність полісерозиту не впливає на рівень АІ у пухлинній тканині РЯ.

5. Нео-ХТ не впливає на вміст ФНП-б у крові хворих на РЯ і на АІ пухлини (ФНП-б – 24,8 і 25,4 пкг/мл; АІ – 1,20 і 1,18% відповідно після нео-ХТ і без неї). Регресія пухлини під дією ХТ залежить від ступеня її диференціювання: при високодиференційованій аденокарциномі регресія пухлини відбувається в основному шляхом апоптозу. Разом з тим спостерігаються поодинокі дрібні поля поєднання апоптозу і некрозу. При раку помірного ступеня диференціювання мають місце великі поля апоптозу і некрозу, а при низькодиференційованих пухлинах превалюють некротичні зміни внаслідок ХТ.

6. Зростання концентрації ФНП-б у крові хворих на РЯ, пов’язане із зростанням пухлинної маси, слід розглядати як несприятливий прогноз, а при зростанні АІ можна прогнозувати сприятливий прогноз. Дворічна виживаність хворих з кістозною структурою пухлини склала 66,0±6,9; кістозно-солідною – 44,7±3,5 (р<0,01 в порівнянні з кістозними пухлинами) і солідною – 31,6±4,3 % (р<0,01 в порівнянні з кістозними пухлинами і р<0,05 в порівнянні з кістозно-солідними пухлинами).

7. Тривалість ремісії має сильний кореляційний зв’язок з рівнем ФНП-б у крові (r = -0,77), мітотичним індексом (r = -0,79), кількістю некрозів у пухлині (r = -0,80), ступенем диференціювання пухлини (r = -0,81) та стадією захворювання (r = -0,85). Водночас кореляція тривалості ремісії з АІ (r = 0,58) і наявністю метилування гена р16 (r = 0,59) помірна.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

При поглибленому обстеженні хворих на пухлини яєчника необхідно визначати рівні у крові не тільки маркера СА125, а також цитокіну ФНП-б. Визначення наявності метилування гена р16 та збільшення рівня ФНП-б вище, ніж 13,4 пкг/мл у крові хворих, та зростання АІ вище, ніж 0,25%, є фактами малігнізації доброякісних пухлин яєчника.

Кращий прогноз перебігу рака яєчника та більша виживаність хворих спостерігаються при наявності метилування гена р16.

Зростання концентрації ФНП-б у крові хворих на РЯ після проведення хіміотерапії є несприятливим фактом, який вказує на необхідність застосування більш агресивних курсів ХТ.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

Здобувачем зібрано клінічний матеріал, написана робота та підготовлена до друку.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

АНОТАЦІЯ

Скрицька Т.В. Особливості клінічного перебігу раку яєчника, асоційовані з біологічними властивостями пухлинної тканини і рівнем фактора некрозу пухлин у крові хворих. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.07 — Онкологія. — Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Е.Кавецького НАН України, Київ– 2007.

На основі результатів обстеження 383 хворих на рак яєчника (РЯ) та 50 хворих з доброякісними пухлинами яєчника проаналізовано вплив біологічних властивостей пухлини на прогресію захворювання і обґрунтовані шляхи підвищення ефективності хіміотерапії (ХТ). Встановлено, що зростання концентрації фактору некрозу пухлин-б (ФНП-б) і апоптозного індексу (АІ) при РЯ спостерігається при зростанні маси пухлини від I ст. до III ст. захворювання. При РЯ IVст. концентрація цитокіну у крові зростає, а АІ зменшується. Метилування гена р16 істотно впливає на розвиток РЯ і менш значно – на прогресію цього захворювання. Показано,