УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК
УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК
НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР
"ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ
ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ"
СКРИПНИК ВАЛЕРІЙ ГРИГОРОВИЧ
УДК 619:616.5–002.828:579:616–076
ТРИХОФІТІЯ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ
(етіологічна структура, діагностика, селекція штамів
та розробка бівалентної вакцини)
16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора ветеринарних наук
Харків – 2007
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Державному науково-контрольному інституті біотехнології і штамів мікроорганізмів.
Науковий консультант доктор ветеринарних наук, професор, член-кореспондент УААН Головко Анатолій Миколайович, Українська Академія Аграрних наук, віце-президент
Офіційні опоненти: –
доктор ветеринарних наук, професор Завгородній Андрій Іванович, ННЦ "Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини", завідувач лабораторії вивчення туберкульозу;–
доктор ветеринарних наук, професор, член-кореспондент УААН Риженко Василь Петрович, Інститут ветеринарної медицини УААН, завідувач лабораторії анаеробних інфекцій;–
доктор ветеринарних наук, професор, член-кореспондент УААН Мандигра Микола Станіславович, Інститут епізоотології УААН, директор.
Захист відбудеться 5 грудня 2007 року о 9 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64 01 в Національному науковому центрі “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” за адресою:
вул. Пушкінська, 83, м. Харків, 61023.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного наукового центру “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” за адресою: вул. Пушкінська, 83, м. Харків, 61023.
Автореферат розісланий 3 листопада 2007 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,
доктор ветеринарних наук, професор А.Ф.Бабкін
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Дослідження епізоотичного стану щодо трихофітії великої рогатої худоби в Україні, з'ясування етіологічної структури захворювання, визначення біологічних особливостей збудників та розробка нових засобів його специфічної профілактики є одним із сучасних напрямків досліджень у ветеринарній медицині. Відомо, що трихофітія (стригучий лишай) великої рогатої худоби має значне поширення у світі та завдає значних економічних збитків у галузі скотарства (Петрович С.В., 1989, Саркисов А.Х., 2000, Саркисов К.А., 2006). Незважаючи на велику кількість наявних методів лікування, включаючи вибракування, трихофітія великої рогатої худоби є невирішеною проблемою, яка знижує продуктивність тваринництва і якість продукції галузі (El Sayed M.T., 1976, Никифоров Л.И., 1984, Петрович С.В., 1989, Головина Н.П., 2003, Лабусова Н.И., 2004).
Трихофітія має епідеміологічне значення, тому що хворі тварини є джерелом ураження людей і, перш за все, працівників тваринництва та членів їхніх сімей (Спесивцева Н.А., 1964, Петрович С.В., 1989, Латыпов А.Б., 2005, Маноян М.Г. и соавт., 2006). Із часів першого повідомлення Ернста в 1820 році про зооантропонозний характер захворювання і до сьогодення є повідомлення про зараження дерматофітами людей від свійських і диких тварин (Маноян М.Г. и соавт., 2007, Латыпов А.Б., 2007).
Науковий пошук засобів специфічної профілактики трихофітії розпочався ще на початку 20 століття (Bloch B., Massini R., 1909). У подальшому з цією метою багато дослідників здійснили експерименти щодо розробки та використання інактивованих і живих вакцин з різних збудників дерматомікозів (De Lamater E.D., 1941, 1965, Кашкин П.Н., 1954, 1956, Левенберг И.Г., 1956, Ford E.J.H., 1956, Jesionek A., 1961, Ариевич А.М. и соавт., 1964, Носков А.И., 1965, Саркисов А.Х. и соавт., 1965, 1970, 1972, Петрович С.В., 1967, 1969, Расулев Ш.Т., 1971, Безнос Т.И., 1977,
Головина Н.П и соавт., 1995, 2003 та інші дослідники).
У результаті здійснених досліджень була створена ефективна жива вакцина ТФ-130, яка широко вивчалась у багатьох країнах (Норвегії, Швеції, Бельгії, Югославії, Болгарії, Румунії, Німеччині, Англії, Угорщині), випробовувалася й застосовувалася з позитивним результатом (Саркисов А.Х., 1972, 1975, 1987, 2000, Петрович С.В., и соавт., 1972, 1977, 1987, Яблочник Л.М., 1972, Жарков И.И., 1976, Станкушев Х., 1979, Плауска В.А., 1975, 1986, Heinrichs B., 1977, Wernicke R., 1978, Gimeshi A., 1978, Rotermund H., 1980, Naess В., Sandvik О., 1981, Fischer J., 1985, Komarek1985, Spanoghe L., 1985, Gudding R., 1987, 1988, Саркисов К.А., 2006, 2007).
Профілактика трихофітії великої рогатої худоби в Україні здійснюється, в основному, живими, сухими ліофілізованими вакцинами: ЛТФ-130 (Ставропольської біофабрики) та "Триховак" (Галещинської біофабрики), які містять антиген до одного збудника трихофітії – Trichophyton verrucosum (Вербицький П.І., Головко А.М. та ін., 2005). У той же час, значна кількість дослідників (Азимов И.М., 1963, Шарапов В.М., 1968, Gedek B., 1980,
Carlisle D.H. et al., 1984, Петрович С.В., 1989, Sik M. et al., 1990,
Саркисов К.А., 2002, 2006) та інші вчені вважають, що трихофітію у великої рогатої худоби й овець може викликати Trіchophуton mentagrophytes.
У науковій літературі відсутні дані щодо етіологічної структури трихофітії великої рогатої худоби в Україні. У той же час дослідження науковців гуманної медицини, здійснені останніми роками
(Коляденко В.Г., Степаненко В.І., 2001, Волкославська В.Н., 2002) свідчать, що проблема дерматомікозів існує і серед населення України, і серед великої рогатої худоби та інших тварин. Через це розробка ефективних засобів специфічної профілактики трихофітії на підставі вивчення особливостей перебігу, етіологічної структури, біологічних властивостей збудників є сучасною й актуальною. Її розвиток вимагає здійснення комплексних досліджень щодо з'ясування клініко-епізоотологічних особливостей перебігу захворювання, його етіологічної структури та біологічних властивостей збудників, відкриває шлях до науково обґрунтованої розробки засобів специфічної профілактики трихофітії великої рогатої худоби.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є складовою частиною досліджень, передбачених тематичними планами ДНКІБШМ: № державної реєстрації 0100U000260 – "Підтримання штамів мікроорганізмів у Національному центрі штамів мікроорганізмів України",
№ 0101U000542 – "Розробити методи підтримання та збереження мікроорганізмів (бактерій, вірусів, грибів), що знаходяться в установах ветеринарної медицини України з подальшим впровадженням їх під час промислового виготовлення біологічних препаратів", № 0104U007530 – "Розроблення засобів діагностики та профілактики інфекційних хвороб сільськогосподарських тварин та засобів їх стандартизації", № 0105U003218 – "Колекція штамів патогенних для тварин мікроорганізмів Національного центру штамів мікроорганізмів Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів", № 0105U005322 – "Розроблення біотехнології виготовлення концентрованої вакцини проти трихофітії великої рогатої худоби (ВРХ) та інактивованої вакцини проти дерматомікозів м'ясоїдних".
Мета і завдання досліджень. Мета роботи – розробка бівалентної, живої, сухої, концентрованої вакцини проти трихофітії великої рогатої худоби на підставі вивчення етіологічної структури, визначення біологічних властивостей та селекції збудників захворювання.
Основні завдання досліджень:
- здійснити ретроспективний аналіз епізоотичного стану щодо трихофітії великої рогатої худоби в Україні;
- вивчити етіологічну структуру захворювання та визначити культурально-морфологічні й біологічні властивості виділених збудників;
- здійснити селекцію та відібрати виробничі штами для виготовлення й контролю бівалентної, живої, сухої, концентрованої вакцини проти трихофітії великої рогатої худоби;
- удосконалити метод довготривалого зберігання штамів дерматофітів;
- теоретично й експериментально обґрунтувати та розробити технологію промислового виробництва бівалентної, живої, сухої, концентрованої вакцини проти трихофітії великої рогатої худоби;
- визначити профілактичну й терапевтичну дози та вивчити нешкідливість, профілактичну й терапевтичну ефективність лабораторних та промислових зразків бівалентної, живої, сухої, концентрованої вакцини проти трихофітії великої рогатої худоби.
Об'єкт дослідження: захворювання великої рогатої худоби на трихофітію та засоби специфічної профілактики трихофітії.
Предмет дослідження: епізоотологічні особливості трихофітії великої рогатої худоби в Україні; етіологічні чинники трихофітії; хворі на трихофітію тварини; способи конструювання засобів специфічної профілактики дерматомікозів; показники факторів імунітету за умов спонтанної трихофітії та в поствакцинальний період.
Методи дослідження: ретроспективний епізоотологічний аналіз, епізоотологічний експеримент, біологічний експеримент, мікологічні, серологічні, біохімічні, статистичні методи.
Наукова новизна отриманих результатів. Уперше в Україні обґрунтовано спосіб виготовлення та складові компоненти бівалентної, живої, сухої, концентрованої вакцини проти трихофітії великої рогатої худоби, визначено її профілактичну та терапевтичну дози, доведено нешкідливість, профілактичну й терапевтичну ефективність цього препарату. Вивчено біологічні особливості виділених штамів, які полягають у різних термінах росту, морфології колоній, виді міцелію і особливостях його росту, структурі та кількості спор.
На підставі клініко-епізоотологічних і мікологічних досліджень установлено роль T. mentagrophytes та T. verrucosum у виникненні трихофітії великої рогатої худоби. Селекціоновано високоімуногенні та високовірулентні штами збудників трихофітії (патенти України №№ 23490–23493).
Уперше в Україні виділено й селекціоновано контрольні високовірулентні штами трихофітонів та запропоновано їх використання для контролювання якості вакцин проти дерматомікозів тварин.
Уперше в Україні теоретично й експериментально обгрунтувано та виготовлено бівалентну, живу, суху вакцину проти трихофітії великої рогатої худоби та розроблено технологію її промислового виробництва (патент України № 25296).
Удосконалено запропоновану А.Х. Саркісовим і співавт. (1971) методику лабораторної діагностики трихофітії тварин, яка дає змогу підвищити на 37 ефективність виділення культур збудників захворювання і скоротити час виділення T. verrucosum більше, ніж удвічі.
Розроблено спосіб довготривалого зберігання штамів збудників дерматомікозів, який дає змогу підвищити кількість життєздатних мікроконідій на 6–8 % та забезпечує життєздатність культур дерматофітів упродовж 2 років за кімнатної температури (патент України № 9617).
Розроблено модифіковане захисне середовище для ліофілізації дерматофітів, яке забезпечує збереженість мікроконідій до 90 % та дозволяє отримувати високоякісну вакцину (патент України № 9637).
Практичне значення одержаних результатів. Виділено, селекціоновано та задепоновано виробничі вакцинні (T. mentagrophytes "ТМЧ" та T. verrucosum "Кн-01") і контрольні вірулентні (T. mentagrophytes "ТМЧ-К" та T. verrucosum "С-102") штами збудника трихофітії великої рогатої худоби.
Розроблено та затверджено в установленому порядку технологію виготовлення "Вакцини "Триходерм" проти трихофітії великої рогатої худоби бівалентної, живої, сухої, концентрованої" – технічні умови, настанова щодо застосування, інструкція по виготовленню –
ТУУ 24.4-19024865 – 002:2005. На Державній Сумській біологічній фабриці освоєно промислове виробництво розробленого препарату.
За результатами досліджень розроблено методичні рекомендації "Лабораторна діагностика дерматомікозів тварин", які затверджені на НМК Державного департаменту ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України (протокол № 3 від 20 грудня 2006 року).
Розроблено спосіб довготривалого зберігання штамів збудників дерматомікозів та модифікованого захисного середовища для їх ліофілізації, впровадження яких у практику дасть змогу ефективно зберігати необхідні штами дерматофітів у наукових установах і виробничих умовах.
Отримані результати досліджень упроваджені в лабораторіях ветеринарної медицини, а також використовуються в навчальному процесі студентами напрямку “Ветеринарна медицина” аграрних ВНЗ України IV рівня акредитації в процесі вивчення дисциплін “Мікробіологія”, “Вірусологія”, “Біотехнологія”, “Імунологія”.
Особистий внесок здобувача. Автор особисто здійснив аналіз літературних даних за темою роботи; теоретично й експериментально обґрунтував наукову концепцію та напрямки роботи; здійснив клініко-епізоотологічні обстеження, мікологічні дослідження, виділив та селекціонував виробничі штами; розробив схеми та методики і здійснив експериментальні дослідження в лабораторних та виробничих умовах; проаналізував та узагальнив одержані результати; сформулював висновки та рекомендації для практики; розробив нормативну документацію на "Вакцину "Триходерм" проти трихофітії великої рогатої худоби бівалентну, живу, суху, концентровану".
Біохімічні дослідження здійснювали спільно із співробітником ННЦ "ІЕКВМ" к.б.н. Романько М.Є. Методичні рекомендації "Лабораторна діагностика дерматомікозів тварин" готували спільно з докторами вет. наук Головком А.М., Ушкаловим В.О., к.вет.н. Литвиновим О.М. Результати цих досліджень відображені в спільних публікаціях і патентах.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на звітних сесіях Вченої ради ДНКІБШМ упродовж 2001–2007 років, на НМК Державного департаменту ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України в 2005–2006 роках та на ІІ-му Міжнародному конгресі спеціалістів ветеринарної медицини (м. Київ, 2004 р), Міжнародній науково-практичній конференції "Сучасні аспекти розробки маркетингу і виробництва ветеринарних препаратів" (АР Крим, м. Феодосія, 2004 р.), Міжнародній науково-практичній конференції "Современное состояние и актуальные проблемы обеспечения ветеринарного благополучия животноводства" (АР Крим,
м. Ялта, 2005 р.), Міжнародній науково-практичній конференції “Актуальные проблемы ветеринарной медицины в условиях современного животноводства” (г. Минск, 2005 г.), Міжнародній науково-практичній конференції "Ветеринарні препарати: розробка, контроль якості та застосування" (м. Львів, 2005 р.), Міжнародній науковій конференції “Мікробні біотехнології” (м. Одеса, 2006 р.), IV Міжнародному конгресі спеціалістів ветеринарної медицини (м. Київ, 2006 р), V Всеросійському конгресі з медичної мікології “Успехи медицинской микологии” (м. Москва, 2007 р.), Міжнародній конференції “Актуальні проблеми молекулярної діагностики у ветеринарній медицині та біології” (АР Крим, м. Феодосія, 2007 р.), II Міжнародній науково-практичній конференції "Ветеринарні препарати: розробка, контроль якості та застосування" (м. Львів, 2007 р.).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 34 друковані праці, з них один посібник-довідник, одні методичні рекомендації, 8 патентів, 19 (16 одноосібних) статей у фахових виданнях, що затверджені ВАК України, 5 – матеріалів і тез конференцій.
Структура дисертації. Дисертація викладена на 272 сторінках друкованого тексту і складається з таких розділів: вступ, огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати власних досліджень, аналіз та узагальнення одержаних результатів, висновки і пропозиції виробництву, список використаної літератури, додатки. Роботу ілюстровано 43 рисунками і 53 таблицями. Список використаних літературних джерел містить 479 найменувань, у тому числі 250 праць зарубіжних авторів.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження здійснювали впродовж 2001–2007 років у Державному науково-контрольному інституті біотехнології і штамів мікроорганізмів, лабораторії біохімії ННЦ “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини”, Сумській і Херсонській державних біологічних фабриках, тваринницьких господарствах різної форми власності Київської, Донецької, Чернігівської, Сумської, Луганської, Харківської, Черкаської, Хмельницької областей та АР Крим. При цьому використовували ретроспективний епізоотологічний аналіз, епізоотологічний експеримент, біологічний експеримент, клінічні, мікологічні, серологічні, біохімічні та статистичні методи досліджень.
Динаміку поширення трихофітії великої рогатої худоби у різних регіонах України вивчали за результатами аналізу й узагальнення звітних матеріалів за формою № 1-Вет, одержаних у Державному департаменті ветеринарної медицини України та Державній центральній лабораторії ветеринарної медицини.
Для з’ясування видового складу збудників трихофітії відбирали патологічний матеріал від тварин з ураженнями шкіри та волосяного покриву. Визначаючи вид дерматофіта, враховували швидкість росту, розмір, структуру колоній, форму ростучого краю колоній, колір, пігментацію зворотнього боку.
Виділення та ідентифікацію культур трихофітонів здійснювали згідно з “Практическим руководством по медицинской микологии” (Кашкин П.Н., Лисин В.В., 1983), “Лабораторной диагностикой грибковых заболеваний” (Лещенко В.М., 1982), “Диагностики грибных болезней (микозов и микотоксикозов) животных” (Саркисов А.Х. и др.,1971). Виділення, культивування та зберігання польових ізолятів і виробничих штамів трихофітонів здійснювали з використанням таких середовищ: бульйон Сабуро, агар Сабуро, модифікований агар Сабуро, сусло-агар, експериментальне середовище ДНКІБШМ, середовища з вуглеводами, а також комерційні сухі середовища для індикації дерматофітів виробництва фірми Hi-Media.
Вивчення культурально-морфологічних і біохімічних властивостей культур трихофітонів визначали за “Практическим руководством по медицинской микологии” (Кашкин П.Н., Лисин В.В., 1983)
Патогенність виділених культур трихофітонів визначали в дослідах на морських свинках масою 250–350 г і телятах віком 1–6 місяців нашкірним методом. Цей метод передбачає нанесення культури гриба на попередньо виголену та скарифіковану поверхню шкіри. Оцінку патогенності культур здійснюють за ступенем важкості клінічного перебігу захворювання.
Для довготривалого зберігання штамів трихофітонів використовували ліофілізовані культури. Підготовку культур до висушування здійснювали як за загальноприйнятими методиками (Зак А.Ф., Успенская А.П., 1960,
Никитин Е.Е., Звягин И.В., 1971, Никифоров Л.И., 1981), так і за методом, розробленим нами. Культури дерматофітів вирощували на пробірках зі скошеним сусло-агаром упродовж 20–25 діб. Потім в пробірки додавали по
3–5 см3 стерильного фізіологічного розчину кухонної солі та змивали спори. Доводили концентрацію мікроконідій до 400 х 106 в 1 см3. Суспензію спор трихофітонів асептично змішували в рівних об’ємах із захисним середовищем і фасували по 1 см3 в стерильні пеніцилінові флакони. Як захисні середовища використовували цукрозо-желатинові та цукрозо-желатинові з добавками мікро- і макроелементів.
У дослідах щодо ліофілізації ми використовували сублімаційний апарат LP3 фірми Jouan, у якому після глибокого заморожування за мінус 64 °С впродовж 24 годин здійснюється висушування мікроконідій дерматофітів. Залишкова вологість у висушеній масі становила 2–3 %. Наявність вакууму у флаконах перевіряли за допомогою апарату типу Д’арсанваль. Висушені мікроконідії штамів трихофітонів зберігали за температури 2–4 °С.
Вміст мікроконідій визначали кількісно – шляхом підрахунку в камері Горяєва за розробленою нами формулою. Життєздатність мікроконідій (колонієутворюючі властивості) підраховували шляхом послідовних розведень від 10-1 до 10-5. Із п’ятого розведення по 0,5–1 см3 висівали на чашки Петрі із сусло-агаром та інкубували за температури 26–28 °С. Через 5–7 діб здійснювали підрахунок вирослих колоній.
Визначення профілактичної й терапевтичної доз вакцини здійснювали на кролях з масою тіла 2,5–3 кг і телятах віком 1–6 місяців. Нешкідливість виготовлених зразків вакцини проводили на морських свинках з масою тіла 250–350 г і телятах віком 1–6 місяців загальноприйнятими у ветеринарії методами, використовуючи потрійну імунізуючу дозу (ОІЕ, 2004).
Імуногенну й терапевтичну ефективність виготовлених зразків вакцини вивчали на морських свинках з масою тіла 250–350 г, кролях з масою тіла
2,5–3 кг, телятах віком 1–6 місяців і молодняку ВРХ від 7 до 18 місяців і старше. Імуногенну ефективність визначали шляхом прямого нашкірного зараження тварин з подальшими дослідженнями за допомогою клінічного та мікологічного методів. Терапевтичну ефективність визначали введенням терапевтичної дози вакцини та контролювали за допомогою клінічного та мікологічного методів досліджень.
Визначення імуногенної ефективності вакцини також здійснювали, використовуючи епізоотологічний експеримент. Для цього щеплене поголів’я великої рогатої худоби вводили у стадо з клінічно хворими тваринами. Прояви захворювання контролювали за допомогою клінічного і мікологічного методів досліджень.
Імунобіологічні зміни після щеплення вакцинами проти трихофітії вивчали в дослідах на кролях з масою тіла 2,5–3 кг і телятах віком 1–6 місяців і старших.
Визначення рівня аглютинінів у сироватці крові щеплених тварин визначали за допомогою реакції аглютинації з виготовленими нами антигенами. Реакцію ставили в планшетах за загальноприйнятою методикою. Антигени виготовляли з культур T.verrucosum і T.mеntagrophytes шляхом подрібнення грибниці в міксері. Суспензію інактивували формаліном. Отриману суспензію відфільтровували й використовували для постановки РА в кінцевій концентрації 10 МО за стандартом оптичним мікробіологічним ДНКІБШМ (ТУ У 24.4-19024865-660-2002).
Вміст білка в плазмі та сироватці крові визначали за методикою Лоурі в модифікації Міллера (1959), класів імуноглобулінів G та M – за методикою радіальної імунодифузії (Manchini G., 1965), активність лізоциму (КФ 3.2.1.17) – турбідиметричним методом за Перрі в модифікації Гранта зі співавторами (1978). Вміст циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) у сироватці крові здійснювали за методом Ю.А. Гриневича. шляхом осадження білкових комплексів антиген-антитіло ПЕГ – 6000 (1981). Вміст серомукоїдів у пробах сироватки крові щеплених тварин установлювали за методом
В.В. Меньшикова, (1987).
Комісійні випробування вакцини здійснювали на базі Державної Сумської біологічної фабрики та в господарствах Полтавської, Сумської і Харківської областей.
Одержані результати піддавали статистичній обробці з використанням методів варіаційної статистики, вірогідність різниці обчислювали за критерієм Т. Стьюдента-Фішера (Урбах, 1964).
Усього в дослідах і випробуваннях ми використали 160 морських свинок, 244 кроля, 1345 голів великої рогатої худоби.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Вивчення етіологічної структури трихофітії ВРХ та перебіг захворювання. Згідно з даними ветеринарної статистики, захворювання на трихофітію серед великої рогатої худоби в нашій країні не реєструється, облік дерматомікозів дрібних свійських тварин здійснюється лише в місті Києві. Наші дослідження свідчать, що випадки стригучого лишаю у великої рогатої худоби України спостерігаються в господарствах багатьох областей.
Під час обстеження 24855 голів великої рогатої худоби всіх вікових груп у 29 господарствах 9 областей України ми виявили 903 голови клінічно хворих тварин, переважно молодняку, мікологічно дослідили зразки патологічного матеріалу (зіскрібки шкіри та уражене волосся) від 293 голів (табл. 1). Обстеженню піддавали господарства, в яких за даними анамнезу реєстрували захворювання, за клінічними ознаками схожі на трихофітію.
Таблиця 1
Результати клінічного та мікологічного обстеження ВРХ
у господарствах України
Область | Кількість госпо-
дарств |
Обстеже-но
поголів'я
(голів) | Виявлено
клінічно
хворих (гол/%) | Кількість дослідже-них проб | Виявлено мікроскопічно
позитивних
проб | Виділено культур
T. verru-
cosum | T.menta-
grophytes
АР Крим | 4 | 1840 | 52/2,8 | 34 | 16 | 15 | -
Київська | 3 | 1725 | 54/3,1 | 30 | 17 | 15 | -
Донецька | 1 | 1640 | 160/9,8 | 15 | 12 | - | 10
Луганська | 3 | 2120 | 79/3,7 | 30 | 13 | 5 | 8
Сумська | 3 | 3170 | 145/4,6 | 33 | 17 | 18* | 14*
Харківська | 3 | 1485 | 104/7 | 33 | 12 | 13 | -
Хмельницька | 4 | 4935 | 92/1,8 | 46 | 14 | 17 | -
Черкаська | 4 | 3710 | 117/3,2 | 34 | 19 | 12* | 8*
Чернігівська | 4 | 4230 | 100/2,4 | 38 | 26 | 16 | -
Всього | 29 | 24855 | 903 | 293 | 143 | 107 | 40
Позначення: - = культура не виділена; * = виділено два види збудників.
У кожній з 9 областей проводили обстеження 3–4 господарств з поголів’ям великої рогатої худоби від 80 до 2000 голів.
Під час мікологічного дослідження ми виділили і дослідили 147 культур трихофітонів. Установлено, що перебіг трихофітії великої рогатої худоби виявлявся як ензоотії на молочно-товарних фермах і фермах з відгодівлі тварин.
У обстежених господарствах клінічні ознаки трихофітії реєстрували протягом усього року, однак найбільше хворих тварин виявляли у зимово-весняний період, особливо в лютому – квітні. Захворювання спостерігали переважно в телят віком 2–6 місяців (84,0 %). Найменше тварин хворіло у віці до 2-х місяців і старше від 2-х років. Впливу статі або породи на рівень захворюваності великої рогатої худоби на трихофітію не встановлено.
Ми відзначили, що клінічні ознаки трихофітії великої рогатої худоби виникали навіть у тварин після щеплення живими вакцинами ЛТФ-130 і "Триховак" у рекомендованих дозах. Поширенню захворювання сприяли порушення санітарно-гігієнічних норм утримання тварин і порядку здійснення профілактичних заходів щодо даного захворювання: скупчене утримання тварин особливо в сирих, забруднених і погано вентильованих приміщеннях, несвоєчасне здійснення очищення, дезінфекції й дератизації приміщень, порушення термінів щеплення, утримання хворих і перехворілих тварин зі здоровими (щепленими), а також неповноцінна й однорідна годівля тварин.
Улітку, на вигульному утриманні телят, під впливом сонячного опромінення та гарного зеленого корму захворювання на трихофітію спонтанно припинялося.
У господарствах, де ураження поголів'я сягало 8–10 % і більше телята починали хворіти з 1,5–2 місячного віку, і самоодужання наставало у віці
6–7 місяців у літній період. Профілактичні щеплення вакцинами ЛТФ-130 виробництва Ставропольської біофабрики, "Триховак" виробництва Новогалещинської біофабрики, "Триховак" виробництва Сумської біофабрики у рекомендованих дозах не були достатньо ефективними. Використання цих препаратів з терапевтичною метою також було неефективним.
Наведені дані свідчать, що захворювання на трихофітію великої рогатої худоби має місце в тваринницьких господарствах різних регіонів України і реєструється впродовж усього року, але частіше в зимово-весняний період, переважно в телят віком 2–6 місяців. Сприятливими факторами виникнення трихофітії були порушення санітарно-гігієнічних норм утримання тварин і ветеринарно-санітарних правил.
Клінічні ознаки захворювання були більш детально вивчені на 207 телятах до 9-місячного віку й 18 тваринах, старших за 2 роки. Інкубаційний період захворювання, за нашими спостереженнями, сягав 12–25 діб, що чітко виявлялося за спільного утримання хворих і здорових телят. Під час вивчення клінічних ознак хворої на трихофітію великої рогатої худоби виявлено десиміновану, плямисту й стерту (атипову) форми. Найбільше поширення мала плямиста форма хвороби – 69,6 % від обстежених тварин. При цьому на шкірі в різних ділянках тіла спостерігали плями діаметром
1–3 см і більші, покриті сіро-білими лусочками зі скуйовдженим волоссям або азбестоподібними жовтими струпами. Плями збільшувалися повільно, нерідко спостерігалося спонтанне одужання, що починалося із центру осередку ураження. У більшості тварин у першій стадії хвороби й під час загоєння спостерігалася сверблячка. Волосся на уражених ділянках було обламане та легко висмикувалося.
Десимінована форма трихофітії реєструвалася в 17,7 % випадків. Захворювання характеризувалося тривалим перебігом з охопленням великих ділянок шкіри й різко вираженими запальними процесами. Часто на уражених ділянках шкіри формувалися товсті кірки із засохлого ексудату у вигляді сухого тіста. У разі натискання з-під кірок виділявся гнійний ексудат, а в разі їхнього видалення відкривалася поверхня шкіри, вкрита гнійними виразками. Десиміновану форму реєстрували тільки в молодняку, найчастіше за незадовільних умов утримання й годівлі.
У дорослих тварин (2,7 %), а також у значної кількості телят (10 %) захворювання характеризувалося появою великих плям, що лупляться, зі слабко вираженою запальною реакцією. Це характерно для стертої (атипової) форми хвороби. У разі видалення лусочок залишалася гладка поверхня шкіри.
Здійснений аналіз ступеня ураженості свідчив, що найбільше тварин траплялося з 6–15 осередками ураження – 65,8 %. Тяжкий ступінь ураження (понад 15 вогнищ) спостерігався в 12,0 % хворих тварин. Слабкий
(1–5 вогнищ) – у 22,2 % тварин.
Найчастіше місця ураження виявляли на голові – 42,8 %; шиї – 18,8 %; лопатках – 8,8 %; спині й грудях – 9,6 %; хрестці – 7,1 %; крупі та корені хвоста – 11,4 %; кінцівках – 1,5 %. У більшості тварин осередки ураження траплялися одночасно в різних ділянках тіла. У дорослої великої рогатої худоби осередки ураження здебільшого локалізувалися на тулубі з боків грудної клітини й на крупі.
Отже, перебіг трихофітії великої рогатої худоби в тваринницьких господарствах України мав різні клінічні прояви. Особливістю захворювання було охоплення до 10 % поголів'я тварин, частіше на окремих фермах клінічно хворіли від 6 до 20 тварин; збільшення кількості тварин з атиповою формою перебігу захворювання (до 10 %), а також те, що здійснення профілактичних щеплень вакцинами ЛТФ-130 і “Триховак” без інших оздоровчих заходів не завжди попереджувало захворювання тварин, а використання цих препаратів з терапевтичною метою без інших оздоровчих заходів не завжди було ефективним.
Удосконалення лабораторної діагностики дерматомікозів тварин. Під час клініко-епізоотологічного обстеження поголів’я великої рогатої худоби в різних регіонах країни було виявлено 903 хворих на трихофітію тварини. Досліджуючи 293 зразки патологічного матеріалу, відібраного від цих тварин, ми виділили 147 культур трихофітонів.
З досліджених зразків матеріалу було виділено 107 культур Trichophyton verrucosum і 40 культур Trichophyton mentagrophytes. Культуру Trichophyton mentagrophytes у чистому вигляді було виділено від хворих тварин у 4 господарствах, що становило 13,8 % від числа обстежених. Ще в трьох господарствах було виявлено змішаний перебіг захворювання на трихофітію, спричинений Trichophyton verrucosum і Trichophyton mentagrophytes одночасно (10,3 %). В інших господарствах від хворих тварин виділяли Trichophyton verrucosum (75,9 %). Під час проведення мікологічних досліджень виявилася низка проблем (постійна сильна контамінація бактеріальною мікрофлорою й пліснявими грибами, стерильність посівів після обробки матеріалу спиртом тощо), які не давали змоги в більшій кількості виділяти чисті культури трихофітонів та збільшували терміни дослідження матеріалу, що свідчило про недосконалість лабораторної діагностики дерматомікозів.
За первинного висіву матеріалу, як правило, не вдається виділити чисту культуру збудника. Висів патологічного матеріалу на середовище Сабуро з
5 % дріжджового екстракту та 0,5 мг/дм3 циклогексиміду (актидіону) забезпечував виділення культури збудника трихофітії впродовж
7–10 діб. Якщо первинний ріст дерматофітів був контамінований бактеріальною мікрофлорою, то матеріал висівали на середовища з антибактеріальними препаратами, зокрема гентаміцином (0,1 г/дм3) і хлорамфеніколом (0,5 г/дм3). Якщо виявляли змішану культуру дерматофітів – проводили висіви суміші, розведеної в рідкому середовищі Сабуро, дрібно на 2–3 чашки з агаром Сабуро з дріжджовим екстрактом. Після отримання чистої культури визначали вид збудника.
Результати здійснених досліджень свідчать, що традиційним методом (Саркисов А.Х и соавт., 1971) культури трихофітонів виділили у 21 % випадків, а удосконаленим нами методом – у 58 %. При цьому строк виділення культур T. verrucosum за модифікованою методикою скоротився вдвічі. Строк виділення T. mentagrophytes був однаковим під час роботи за обома методиками. Таким чином, модифікована методика має суттєві переваги й за простотою виконання не поступається традиційній.
Вивчення біологічних властивостей та селекція епізоотичних штамів трихофітонів. Для виділення та вивчення культур збудників трихофітії використовували агар Сабуро в зазначених вище модифікаціях, сусло-агар, експериментальне середовище ДНКІБШМ.
У процесі роботи з культурами й пересівів на поживних середовищах ми визначали швидкість росту, морфологію колоній, ступінь дисоціації культури, кількість мікроконідій та інших спор, характер росту міцелію. За висновками А.Х. Саркісова і співавт. (1972) головною ознакою для виробничих штамів є продукція мікроконідій (айлерій). Тому передусім ми звертали увагу на цей показник.
У виділених нами первинних ізолятах невелика кількість культур
(10–15 %) активно продукували мікроконідії. Такі культури ми й залишали для подальшої роботи. Ми відхиляли від подальшого дослідження культури з великим відсотком дисоціації в популяції, з тенденцією до плеоморфного переродження й зменшення продукування мікроконідій при пересівах на поживних середовищах, або швидкого старіння культур (поява великої кількості хламідоспор, артроспор у молодих культурах після 5–7 пасажів). Після такої первинної селекції виділених культур у нашій колекції залишилося 10 перспективних культур для селекції виробничих штамів, з якими в подальшому й здійснювалася робота.
Вивчення біологічних властивостей відібраних нами культур засвідчило, що штами Trichophyton verrucosum за культурально-морфологічними ознаками можна поділити на декілька груп. Слід зазначити, що лише штам С-102 відповідав класичним ознакам Trichophyton verrucosum, тобто характеризувався повільним ростом (7–15 діб), був бугристим, з гладким і рівним краєм, субстратним міцелієм. Інші культури трихофітонів росли більш швидко, давали ріст на 5–7 доби та відрізнялись одна від однієї за морфологією й кольором колоній. У той же час усі вони мали характерний для виду міцелій і продукували велику кількість овальних, грушовидних, округлих мікроконідій. Виділені культури Trichophyton mentagrophytes утворювали колонії, які можна було поділити на два типи. Колонії першого типу мали жовто-коричневий колір, зернисто-гранулярну поверхню, зірчастий ростучий край, давали інтенсивний жовто-коричневий пігмент на зворотному боці. Колонії другого типу мали гіпсовидно-мучнисту поверхню біло-бежевого кольору з рівним ростучим краєм. Культури обох типів утворювали велику кількість округлих мікроконідій, окремі сигароподібні макроконідії та мали спіралевидні закінчення гіф. Ці якості зберігались упродовж 7 і більше послідовних пасажів.
Вважається, що гриби не досить активні до асиміляції вуглеводів (Кашкин П.Н., Лисин В.В, 1983, Лещенко В.М., 1982). Вивчення біохімічних властивостей виділених нами культур засвідчило, що прояв біохімічних реакцій наставав через 8–12 діб інкубування, а інколи – через 14–16 діб. Усі виділені культури асимілювали глюкозу з утворенням кислоти, майже всі (за винятком 333/1) асимілювали дульцит. Деякі культури були активними відносно манніту та мальтози. Всі виділені культури асимілювали глюкозу з утворенням кислоти, майже всі (за винятком 333/1 і 49) асимілювали дульцит. Культури Кн-01, 703, 49, Х-03, 333/1 були активними по відношенню до манніту, а 703, СБ, 49 – мальтози. Культури T. mentagrophytes ТМЧ, 333/1 давали позитивну реакцію на фосфатазу, аргініндегідрогеназу, розщеплювали сечовину. Культури С-102 і С-202 були найбільш інертними і розщеплювали лише два вуглеводи (глюкозу і дульцит). В окрему групу також можна виділити культури КН-01, 703 та ТМЧ, які були біохімічно активнішими від інших культур і асимілювали одні і ті ж вуглеводи – глюкозу, лактозу, дульцит, манніт.
Для вивчення здатності відібраних культур продукувати мікроконідії та з метою підвищення її активності на поживних середовищах ми використовували методику, запропоновану Н.П. Головіною (1984) з нашою модифікацією. У попередніх дослідах ми встановили, що використання модифікованого сусло-агару (Головко А. і співавт., 2004) для вирощування й селекції трихофітонів за показником “спороутворення” є більш перспективним, ніж загальноприйнятий сусло-агар. Тому в селекційній роботі ми використали модифікований сусло-агар. Результати селекції культур трихофітонів подані в таблиці 2.
Дані, наведені в таблиці 2, свідчать, що в процесі адаптації до модифікованого поживного середовища продуктивність селекціонованих штамів збільшилася майже вдвічі. Отримані результати дали підставу відібрати як виробничі культури T. verrucosum Кн-01 та 703,
T. mentagrophytes ТМЧ та 333/1. Культури, які дають накопичення мікроконідій 8 х 106 /см3 і більше за використання даного методу, мають промислову перспективу (Головина Н.П., 1984).
Таблиця 2
Результати селекції штамів трихофітонів за показником
спороутворення (M±m; n=6)
Ступінь селекції | Накопичення мікроконідій у штамів (млн/см3)
С-102 | С-202 | 703 | СБ | СВ | 49 | ТМЧ | 333/1
Неселекці-онована
культура | 3,2±0,54* | 3,3±0,21 | 4,6±0,35 | 4,2±0,15 | 5.1±0,34 | 3,8±0,33 | 4.8±0,29 | 4,5±0,36
1-й ступінь відбору | 3,6±0,33 | 3,6±0,85* | 5,5±0,39 | 5,0±0,77 | 7,6±0,13 | 4,4±0,7* | 6,0±0,25 | 5,3±0,33
2-й ступінь відбору | 4,0±0,72 | 4,0±0,51 | 6,4±0,75 | 6,2±1,45* | 8,4±0,6 | 5,3±0,56 | 6,9±0,75 | 6,4±1,02*
3-й ступінь відбору | 4,2±0,34 | 4,4±1.02 | 7,4±0,62 | 7,0±0,33 | 8,9±0,25 | 6,0±025 | 7,7±0,63 | 7,2±0,42
4-й ступінь відбору | 4,4±0,9* | 4,6±o,54 | 8,2±1,12 | 7,7±0,29 | 9,8±1,64* | 6,6±0,5 | 8,6±0,27 | 8,0±0,46
Примітка: Р < 0,001; * = 0,01 < Р < 0,001
За основним показником – кількістю продукції мікроконідій – названі культури нас задовольняли. Ураховуючи їхні позитивні культурально-морфологічні показники, стійкість до плеоморфного переродження, ми залишили їх як основні (Кн-01, ТМЧ) та резервні (703, 333/1) виробничі штами збудника трихофітії великої рогатої худоби.
Під час постійної роботи з культурами було відзначено, що штам ТМЧ мав колонії, що різнилися між собою за кольором і структурою. Невелика кількість колоній (приблизно 10–15 %) мала більш темний кремовий відтінок і більш щільну структуру з невеликою кількістю повітряного міцелію. До того ж ці колонії мали борошнистість. Ми маркували ці колонії як “ТМЧ-К” і в подальшому досліджували їх як окремі клони штаму ТМЧ. У дослідах на лабораторних тваринах клон ТМЧ-К виявився патогенним. Ми здійснили цілеспрямоване підвищення його вірулентності для тварин шляхом проведення 10 пасажів на морських свинках. Клінічно здорових тварин послідовно заражали патологічним матеріалом від хворої тварини, втираючи струп у скарифіковану поверхню її шкіри. Так нам вдалося отримати стабільний результат з характерними клінічними проявами трихофітії тяжкого ступеня ураження у морських свинок. Отриманий результат нас задовольнив і в подальшому штам ТМЧ-К ми використовували як контрольний вірулентний для експериментального зараження щеплених тварин.
У такий же спосіб ми підвищили патогенність культур С-102 та С-202, які в подальшому ми використали для контрольного зараження щеплених тварин. Імуногенність вакцин проти дерматомікозів тварин визначають шляхом прямого зараження. Для цього необхідно мати штами із стабільними патогенними властивостями, які після нашкірного зараження призводять до клінічно вираженого перебігу захворювання в тварин.
Визначення оптимальної заражаючої дози ми здійснювали на кролях і телятах. Для цього використовували нашкірний метод зараження. 18–20 добові культури трихофітонів у дозах від 102 до 2,5 х 106 мікроконідій на
1 см2 шкіри наносили на скарифіковані ділянки. У досліді використовували відібрані нами виробничі (Кн-01, ТМЧ) та контрольні (С-102, ТМЧ-К) штами трихофітонів, а також вакцинний штам ЛТФ-130.
Отримані результати свідчать, що заражаюча доза 102 мікроконідій на
1 см2 шкіри виражених клінічних проявів захворювання у кролів не спричиняла. Зараження в дозі 104 мікроконідій на 1 см2 шкіри викликало незначне утворення лупи на 13–16 доби в тварин, заражених штамами С-102 та ТМЧ-К, яка до кінця спостереження (30 діб) зникала. Під час мікроскопічного і культурального досліджень патологічного матеріалу збудника трихофітії не було виявлено. Зараження кролів у дозі 106 мікроконідій на 1 см2 шкіри викликало утворення лупи в тварин, заражених штамами ЛТФ-130, Кн-01 та ТМЧ, яка до кінця спостереження зникала. Під час мікроскопічного і культурального досліджень зіскрібків шкіри збудника трихофітії також не було виявлено. У тварин, заражених штамами С-102 та ТМЧ-К, захворювання починалося з утворення лупи на 10 добу та появи кірочок і струпів на 13–22 доби. До кінця досліду спостерігали лупу й почервоніння шкіри в місцях зараження. У період появи струпів і кірок діагноз на трихофітію вдавалося підтвердити мікроскопічно та культурально.
Зараження кролів у дозі 2,5 х 106 мікроконідій на 1 см2 шкіри викликало появу кірочок і струпів різного ступеня тяжкості за використання всіх штамів. Різниця в клінічних проявах полягала в тому, що кірочки та струпи в кролів, заражених вакцинними штамами ЛТФ-130,
Кн-01 та ТМЧ, були тонкими й “легкими”, самі відпадали після 22 доби, і до кінця спостереження місця зараження загоювались і з’являлося нове волосся. Після зараження штамами С-102 та ТМЧ-К перебіг захворювання був тяжким: утворювалися масивні струпи й кірки, з-під яких виділявся гній. До кінця спостереження клінічна картина не змінювалася, тому тварин, заражених цими штамами, піддавали лікуванню за допомогою вакцини. Захворювання за цієї інфікуючої дози підтверджувалось мікроскопічними й культуральними дослідженнями.
Клінічні прояви трихофітії в телят були аналогічними. Лише зараження тварин у максимальній дозі 2,5 х 106 мікроконідій на 1 см2 шкіри викликало появу
