НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ФІЗИКО-ХІМІЧНИЙ ІНСТИТУТ ім. О.В. БОГАТСЬКОГО
Скрипинець Юлія Володимирівна
УДК 543.426: 541.49: 546.66: 547.831.9
ЛЮМІНЕСЦЕНТНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ДЕЯКИХ БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ
РЕЧОВИН ЗА ДОПОМОГОЮ КОМПЛЕКСІВ ЛАНТАНІДІВ
З ПОХІДНИМИ ОКСОХІНОЛІН-3-КАРБОНОВОЇ КИСЛОТИ
02.00.02 – Аналітична хімія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата хімічних наук
Одеса-2007
Дисертацією є рукопис
Робота виконана на кафедрі фармацевтичної хімії Одеського національного
університету ім. І.І. Мечникова та у відділі аналітичної хімії та фізико-хімії
координаційних сполук Фізико-хімічного інституту
ім. О.В. Богатського НАН України
Науковий керівник: кандидат хімічних наук, доцент
Єгорова Алла Володимирівна,
Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського
НАН України, старший науковий співробітник
Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор
Єфрюшина Нінель Петрівна,
Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України,
завідувач відділу хімії лантанідів
кандидат хімічних наук, доцент
Кормош Жолт Олександрович,
Волинський державний університет ім. Лесі Українки,
завідувач кафедри аналітичної хімії
Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра аналітичної хімії.
Захист відбудеться “ 31 “ травня 2007 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради
Д. 41.219.01 Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України за адресою:
65080, м. Одеса, Люстдорфська дорога, 86.
З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Фізико-хімічного інституту
ім. О.В. Богатського НАН України (м. Одеса, Люстдорфська дорога, 86).
Автореферат розісланий “ 18 “ квітня 2007 року.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, к.х.н. Безлуцька І. В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. В останні роки для визначення низьких концентрацій лікарських препаратів та їх метаболітів, білків, ферментів, ДНК запропоновано застосування різноманітних варіантів флуоресцентного методу, у тому числі заснованого на характеристичній
4f – люмінесценції іонів лантанідів (Ln).
У випадку лантанідного імунофлуоресцентного аналізу одним з основних напрямків є розробка нових проявляючих розчинів, які дозволяють проводити високочутливе визначення декількох іонів лантанідів, що відкриває можливість визначення мічених ними різних антитіл.
Тільки в деяких роботах показані можливості люмінесцентного визначення сполук, виступаючих у якості “других” лігандів різнолігандних комплексів Ln(III), які чинять вплив (підсилюючий або гасящий) на спектрально – люмінесцентні властивості таких комплексів. В плані розвитку цього перспективного та актуального напрямку, що пов’язаний з використанням сенсибілізованної люмінесценції комплексів іонів лантанідів в біоаналітичній хімії, здійснена дана робота.
Зв’язок роботи з науковими темами, програмами, планами. Робота виконана на кафедрі фармацевтичної хімії Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова та у відділі аналітичної хімії та фізико-хімії координаційних сполук Фізико-хімічного інституту
ім. О.В. Богатського НАН України відповідно до науково-дослідної тематики відділу та держбюджетних тем № 0103U001124 (шифр 2.16.267) “Використання сенсибілізованої люмінесценції лантанідів для визначення біологічно активних речовин” (2002-2004 рр.) та
№ 0102U001630 (шифр III -12.02.260) “Нові люмінесцентні сполуки лантанідів” (2002-2006 рр.).
Мета і задачі дослідження. Метою роботи є пошук нових аналітичних форм на основі комплексних сполук іонів лантанідів (ІІІ) з похідними оксохінолін-3-карбонової кислоти (L) для визначення деяких біологічно активних речовин.
Для досягнення цієї мети потрібно було вирішити такі задачі:
1.
Встановити кислотно – основні властивості та деякі оптичні характеристики похідних 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти;
2.
Вивчити взаємодію іонів Ln(III) з похідними оксохінолін-3-карбонової кислоти у подвійних (Ln-L) та потрійних (Ln-L-ДНК, Ln-L-фосфат–іонів, Ln-L-Сu(II), Ln-L-Н2О2) системах;
3.
Показати можливість застосування досліджених систем у якості аналітичних форм для люмінесцентного визначення біологічно активних лігандів (L), ДНК, пероксиду водню та лужної фосфатази.
Об’єкт дослідження – комплекси Ln (ІІІ) з похідними оксохінолін-3-карбонової кислоти.
Предмет дослідження - комплекси Ln (ІІІ) з похідними оксохінолін-3-карбонової кислоти у якості аналітичних форм для люмінесцентного визначення деяких біологічно активних речовин.
Методи дослідження – спектрофотометрія, люмінесцентна спектроскопія.
Наукова новизна одержаних результатів.
Показана можливість утворення комплексів похідних оксохінолін-3-карбонової кислоти з іонами лантанідів як церієвої (Eu3+, Sm3+) так і ітрієвої (Tb3+, Dy3+) підгруп, які інтенсивно люмінесцирують, що дало можливість запропонувати новий проявляючий розчин для багатократного мічення в імунофлуоресцентному аналізі.
Показано, що максимальні значення квантових виходів (Ф) та часу життя збудженого стану (t) вивчених комплексів можуть бути отримані у водному середовищі без застосування органічних розчинників та поверхнево-активних речовин (ПАР), шо спрощує застосування цих аналітичних форм в біоаналізі.
Встановлено, що для люмінесцентного визначення компонентів, не утворюючих різнолігандних комплексів в системах іон Tb(Eu) –L – ДНК (фосфат – іони, Cu (II), H2O2), але які викликають збільшення (ДНК) або гасіння (фосфат – іони, Cu (II), H2O2) люмінесценції Ln(ІІІ), необхідно застосовувати співвідношення концентрацій Ln(ІІІ) : сенсибілізатор (L) = 1 : 1 або 2 : 1. Для визначення гасіїв найбільш ефективні подвійні комплекси Ln(ІІІ) : (L) з високим квантовим виходом (Ф>0.4 для іонів Tb та Ф>0.1 для іонів Eu), а для визначення ДНК – слабо люмінесцентні комплекси.
Запропоновані нові аналітичні форми на основі комплексів Tb(ІІІ) з діфлоксацином і норфлоксацином для високочутливого люмінесцентного визначення ДНК, а також для вивчення інтеркаляційної взаємодії противірусних лікарських сполук з молекулами ДНК.
Практичне значення одержаних результатів. На основі нових аналітичних форм – комплексних сполук Ln (ІІІ) з похідними оксохінолін-3-карбонової кислоти розроблені методики люмінесцентного визначення хіноксикаїну (анестетік) та протитуберкульозних біологічно активних сполук у плазмі крові з межами визначення 1.0 мкг/мл та 0.25 мкг/мл, відповідно; ДНК у модельних розчинах з межами визначення 0.5-10.0 нг/мл, пероксиду водню у воді з межею визначення 0.06 мкг/мл; лужної фосфатази у модельних розчинах з межею визначення 0.05 мU/мл. Показана можливість сумісного визначення іонів Tb (III), Eu (III), Dy (III), Sm (III) із застосуванням у якості органічного сенсибілізатора похідного 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти з метою багатократного мічення в імунофлуоресцентному аналізі.
Методика визначення пероксиду водню випробувана та впроваджена в практику роботи ЦЗЛ фармацевтичного підприємства ВАТ “ІнтерХім”.
Особистий внесок здобувача. Аналіз даних літератури, основний об’єм експериментальних досліджень та обробка експериментальних даних виконані безпосередньо автором. Постановка мети та задач дослідження, а також аналіз отриманих результатів проведено разом з науковим керівником.
Апробація результатів дисертації. Основні матеріали дисертаційної роботи доповідалися на Міжнародній конференції студентів та аспірантів „Сучасні напрямки розвитку хімії” (Одеса, 19-23 квітня 2004р.), V та VI Всеукраїнських наукових конференціях студентів та аспірантів "Сучасні проблеми хімії" (Київ, 20-21 травня 2004 р. та 16-18 травня 2005 р.), XVI Українській конференції з неорганічної хімії (Ужгород, 20-24 вересня 2004 р.), Всеросійській конференції "Аналитика Росии 2004" (Москва, 27 вересня - 1 жовтня 2004 р.), IX international conference on methods and applications of fluorescence (Lisbon – Portugal, September 4-7, 2005), Міжнародній конференції “Analytical chemistry and chemical analysis” (AC& CA – 05) (Kyiv, September 12-18, 2005), VIII і IХ конференції молодих учених та студентів –хіміків південного регіону України (Одеса, 22-23 листопада 2005 р і 16-17 жовтня 2006 р.), Euroоpt(R)ode VIII (Tubingen, April 2-5, 2006), сесії наукової ради НАН України з проблеми "Аналітична хімія" (Одеса, 22-26 травня
2006 р.), International congress on analytical sciences (Moscow, Russia, June 25-30, 2006).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 статей, 13 тез доповідей на наукових конференціях. Отримано 3 деклараційних патента України на корисні моделі.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, 5 розділів, висновків, списку цитованої літератури, що нараховує 264 найменування, містить 72 рисунка та 22 таблиці. Загальний обсяг дисертації складає 175 сторінок машинописного тексту.
Автор висловлює щиру подяку професору І.В. Українцю (Харківський національний фармацевтичний університет) за синтез похідних оксохінолін-3-карбонової кислоти, які були використані у дисертаційній роботі.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У вступі обґрунтовано актуальність теми, сформульовано мету та задачі дослідження, зазначено наукову новизну та практичне значення отриманих результатів.
У першому розділі (огляд літератури) систематизовані дані стосовно використання сенсибілізованої люмінесценції іонів лантанідів у біоаналізі, обговорені можливості та обмеження цих аналітичних форм. Показано широке застосування цього методу для визначення лікарських препаратів, які можуть хелатирувати іони Ln(III). Аналіз літературних даних свідчить про перспективи використання комплексних сполук Ln(III) для підвищення чутливості визначення ДНК та багатократного мічення в імунофлуоресцентному аналізі.
У другому розділі описані вихідні речовини та методики приготування їх розчинів, охарактеризовано використане обладнання та апаратура.
Усі використані у роботі реактиви були за кваліфікацією не нижче ч.д.а. Застосовані реагенти, похідні 2-оксо-4-гідроксихінолін–3 карбонової кислоти, були синтезовані, ідентифіковані та очищені у Національному фармацевтичному університеті (м. Харків). Спектри люмінесценції, збудження та час життя реєстрували за допомогою спектрофлуориметрів: ИСП-51 з ртутно-кварцевою лампою СВД-120А, Aminco-Bowman Series 2 (SLM – Aminco, Rochester, NY) з ксеноновою лампою 150-W, СМ2203 “SOLAR” (Беларусь) з ксеноновою лампою 150-W. Спектри люмінесценції іонів європію (III) реєстрували в області 560 - 650 нм; самарію (III) – 520 - 650 нм; тербію (III) – 480 - 620 нм; диспрозію (III) – 460 - 595 нм.
Вимірювання інтенсивності люмінесценції з часовим розрішенням проводили в чорних плоскодонних 96 - луночних мікропланшетах з полістирола (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany) на спектрофлуориметрі - Genios Plus (Tecan, Grцdig, Austria) з імпульсною ксеноновою лампою.
Спектри поглинання реєстрували на спектрометрах UV-2401 PC (Shimadzu) і Lаmbda-9 UV/VIS/NIR (Perkin Elmer).
ІЧ-спектри зразків у вигляді таблеток з КBr записані в області 400-4000 см-1 на спектрофотометрі FTIR – 8400 S (Shimadzu).
Значення рН розчинів вимірювали за допомогою рН-метру ОР-211/1 зі скляним електродом.
У третьому розділі викладені результати вивчення спектральних властивостей 17 нових реагентів - похідних амідів 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти. В авторефераті більш докладно наведені результати дослідження реагентів L1, L10, L15, L16, L17, лантанідні комплекси яких використані у роботі у якості аналітичних форм (табл.1).
Встановлено, що для цих сполук характерна наявність смуг поглинання в УФ – області спектра з високими молярними коефіцієнтами поглинання (е), а значення енергій триплетних рівней лігандів (Т) дозволяють припустити, що в комплексах іонів лантанідів з ними можливий перенос енергії збудження від органічної частини молекули комплексу до іону лантаніду.
Для даного класу вивчених органічних сполук стандартним спектрофотометричним методом були визначені константи іонізації (рис. 1, табл. 2). З отриманих даних можливо констатувати, що усі досліджені реагенти є слабкими органічними кислотами (рК от 5.83 до 7.85).
На прикладі L2 показано, що константа іонізації в збудженому стані (рК = 6.89) (одержана по зміні власної люмінесценції реагенту) практично співпадає з такою, що отримана за результатами спектрофотометричних вимірювань, і підтверджує її правильність та дозволяє проводити співставлення люмінесцентних характеристик комплексів (t, Ф), отриманих у збудженому стані, з рК лігандів.
Таблиця 1
Спектрально-люмінесцентні характеристики лігандів (*) та їх комплексів з іонами лантанідів
(CTb = СEu = 1Ч10-5 моль/л; CL = 5Ч10-5 моль/л; pH 9.0)
№ | Реагент | Тсм | lнм |
eґ |
лзбуднм | Tb(III) |
Eu(III)
Ф |
ф, мкс |
Ф | ,,
ф,мкс
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10
1 | 22100 | 290,2
238,0 | 2,56
7,33 | 309 | 0,40 | 1080 |
0,23 |
530
2 | 22250 | 290,0
238,0 | 2,58
6,91 | 322 | 0,32 | 950 |
0,070 |
500
3 | 22200 | 295,6
231,4 | 2,05
6,48 | 320 | 0,25 | 1040 |
0,140 |
470
4 |
21050 | 292,2
246,3 | 2,34
5,38 | 325 | 0,23 | 980 |
0,065 |
525
5 | 21740 | 292,1
236,9 | 2,60
6,40 | 322 | 0,38 | 1070 |
0,030 |
610
6 | 22200 | 290,1
237,5 | 2,93
8,78 | 310 | 0,24 | 920 |
0,002 |
450
7 | 21500 | 292,2
236,9 | 3,18
7,93 | 315 | 0,37 | 950 |
0,003 |
590
8 |
21740 | 290,8
237,6 | 1,81
5,24 | 320 | 0,36 | 950 |
0,054 |
480
9 | 22200 | 292,0
236,0 | 2,66
6,33 | 319 | 0,39 | 1050 |
0,158 |
515
10 | 21000 | 292,3
237,1 | 2,96
7,25 | 340 | 0,35 | 1100 |
0,110 |
610
11 | 21750 | 291,4
236,7 | 2,54
6,75 | 320 | 0,28 | 1000 |
0,09 |
480
12 | 21500 | 294,1
237,2 | 2,85
7,70 | 320 | 0,23 | 975 |
0,11 |
480
13 | 21200 | 293,5
237,0 | 2,43
6,37 | 340 | 0,20 | 830 |
0,08 |
420
Продовження табл. 1
14 | 21500 | 291,5
237,4 | 2,45
6,41 | 340 | 0,21 | 990 |
0,12 |
500
15 | 21050 | 309 | 2,30 | 320 | 0,43 | 1850 |
0,35 |
1100
16 | 21280 | 310 | 1,90 | 325 | 0,41 | 1750 |
0,32 |
1050
17 | 21370 | 314 | 0,8 | 320 | 0,40 | 1700 |
0,30 |
950
а) | б)
Рис. 1. Спектри поглинання розчину L2 при різних значеннях рН (а) та залежність оптичної густини розчину L2 від рН (б) (СL2 = 5Ч10-5 моль/л)
Таблиця 2
Значення рК для вивчених реагентів L1-L17 (n = 3; Р = 0.95; довірчі інтервали 0.05 - 0.12)
L | рК | L | рК | L | рК
1 | 7.06 | 7 | 7.17 | 13 | 7.34
2 | 6.87 | 8 | 7.58 | 14 | 7.47
3 | 6.51 | 9 | 7.85 | 15 | 5.83
4 | 6.88 | 10 | 7.56 | 16 | 5.89
5 | 7.2 | 11 | 7.49 | 17 | 5.97
6 | 7.05 | 12 | 7.62
У четвертому розділі наведені результати дослідження люмінесцентним методом взаємодії іонів Eu(III) і Tb(III) з похідними 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти.
Комплексоутворення похідних хінолонкарбонової кислоти з іонами Ln(III) спостерігається в широкому інтервалі значень рН від 3.0 до 11.0 з максимумами люмінесценції при рН 8.0 – 9.0. При більш низьких значеннях рН ступінь утворення комплексів мала, а в лужних розчинах (при рН>9) хелатоутворенню пререшкоджає гідроліз іонів Ln (III). Показано, що іони лантанідів у недостачі ліганду або при еквімолярних концентраціях Ln:L1-17 утворюють комплекси зі співвідношенням компонентів Ln:L = 1:1, а у надлишку лігандів утворюють комплекси зі співвідношенням компонентів Ln:L = 1:2. За даними ІЧ - спектроскопії встановлено, що в координації приймає участь карбонільна група ліганду. Максимальна Iлюм вивчених комплексів спостерігається в водних розчинах. Органічні розчинники, ПАР та донорно-активні речовини (ДАР) практично не підвищують Iлюм хелатів, що свідчить про мінімальні втрати енергії збудження в подвійних комплексах.
Збільшення кислотних властивостей лігандів сприяє підсиленню люмінесцентних характеристик відповідних комплексів Eu(III) та Tb(III) (рис. 2).
Рис. 2. Залежність від рК лігандів: (а) квантового виходу люмінесценції комплексів Eu(III) з L1-17; (б) часу життя люмінесценції комплексів Tb(III) з L1-17 (СLn = 1Ч 10-5 моль/л; СL= 5Ч 10-5моль/л)
Встановлено збільшення Iлюм комплексів: Tb(III) – L1 (в 10 разів); Tb(III) – L10 (в 25 разів); Tb(III) – норфлоксацин (Нор) (в 95 разів); Tb(III) – діфлоксацин (ДФ) (в 85 разів) у присутності ДНК, що свідчить про можливість застосовування цих комплексів у якості люмінесцентних зондів для високочутливого визначення ДНК. На прикладі комплексу Tb(III) – діфлоксацин у присутності різних кількостей ДНК наведені зміни у спектрах люмінесценції (рис. 3, а); спектрах збудження (спостерігається батохромний зсув на 3 - 10 нм) (рис. 3, б); часу життя (рис. 3, в).
Рис. 3. Спектри люмінесценції (а), збудження (б), криві затухання люмінесценції (в) комплексу Tb(III) – ДФ у присутності ДНК: а) CTb = CДФ = 1 Ч10-6 моль/л; CДНК = 5 - 1500 нг/мл;
б) CTb = CДФ = 1Ч10-7 моль/л; CДНК = 5 - 500 нг/мл; в) ДНК, нг/мл: 1) - 0; 2)-10; 3)-50; 4)-100
(C Tb = CДФ = 1 Ч10-7 моль/л)
Встановлено, що при концентрації NaCl 2Ч10-3 моль/л спостерігається зменшення інтенсивності люмінесценції системи Tb(III)–ДФ-ДНК на 50%. Це можливо пояснити електростатичною взаємодією комплексів з фосфатними групами ДНК, яка зменшується при збільшенні іонної сили середовища, що проявляється в зниженні Iлюм.
У спектрах поглинання комплексів у присутності ДНК спостерігаються гіпо- та батохромні зсуви у порівнянні зі спектрами поглинання подвійних комплексів, що свідчить про інтеркаляційний механізм взаємодії. Для підтвердження механізму інтеркаляції комплексів з молекулами ДНК застосовували метод витиснення ними етідію броміду (ЕБ) з його сполуки з ДНК, та розраховували константи зв’язування запропонованих зондів з ДНК: lgKTb-L1=6.1±0.4;
lgKTb-L10= 5.5±0.4; lg KTb-Нор = 4.56±0.11; lgKTb-ДФ = 4.69±0.12, які характерні для моноінтеркаляторів ДНК.
Висловлено припущення про можливі механізми взаємодії вивчених комплексів з молекулами ДНК:
1.
електростатичний (взаємодія з фосфатними групами ДНК);
2.
інтеркаляційний (фіксація комплексу між парами основ в молекулах ДНК);
3.
можливість взаємодії бокових протонованих фрагментів лігандів комплексу з жолобом ДНК за рахунок утворення водневих зв’язків.
Для підтвердження можливості застосування запропонованих зондів для вивчення взаємодії ДНК з “малими молекулами” - лікарськими засобами було розглянуто витиснення ЕБ (за люмінесценцією ЕБ) та зонду Tb(III) - ДФ (за люмінесценцією тербію) з ДНК молекулами відомого противірусного лікарського препарату – аміксину (рис.4).
Рис. 4. Залежності витиснення (%) ЕБ (а) та Tb(III) - ДФ (б) від lg Cаміксина
(CЕБ = C Tb = CДФ = CДНК= 1 Ч 10-6 моль/л)
Значення С50, отримані за допомогою ЕБ та Tb(III)-ДФ, задовільно узгоджуються. Так як величина С50 характеризує ступінь взаємодії лікарських препаратів з молекулами ДНК, то у рядах біологічно активних речовин, які близькі за структурою, можна використовувати запропоновані зонди – комплекси тербію (III) з L1, L10, Нор, ДФ.
Виявлено ефект гасіння люмінесценції комплексів тербію з досліджуваними реагентами фосфат-іонами. Із застосуванням цього ефекту на прикладі комплексу Tb (III) - L15 показана принципова можливість посереднього високочутливого визначення лужної фосфатази (ЛФ), заснована на реакції ферментативного гідролізу фенілфосфату (ФФ):
Встановлено, що при збільшенні концентрації ЛФ спостерігається зменшення інтенсивності в спектрах люмінесценції комплексу Tb (III) - L15, що обумовлено збільшенням концентрації
фосфат - іонів у результаті ферментативного гідролізу ФФ (рис. 5, а). Встановлено, що не відбувається зміна часу життя збудженого стану 5D4 іонів Tb(III) у присутності різних концентрацій ЛФ. Це свідчить про незмінність хімічної форми флуорофору (комплексу
Tb (III) - L15), а лише про зменшення його кількості за рахунок конкурентного комплексоутворення Tb (III) з фосфат – іонами. Даний вид гасіння може бути віднесений до статичного типу.
Введення в систему Eu(III) – L10 = 1:1 пероксиду водню при рН 9.0 приводить до значного гасіння люмінесценції комплексу (рис. 5, б). При збільшенні концентрації Н2О2 спостерігається збільшення інтенсивності власної люмінесценції ліганду. Вимірювання часу життя збудженого стану 5D0 іонів Eu(III) показало відсутність залежності ф від концентрації гасія (Н2О2). Даний вид гасіння можливо пояснити хімічною взаємодією комплексу Eu(III) – L10 з Н2О2 у збудженому стані та відповідним зменшенням масової долі комплексу Eu(III) – L10 при збільшенні концентрації Н2О2.
Рис. 5. Спектри люмінесценції комплексів: Tb(III) – L15 (а) у присутності різних концентрацій ЛФ (СTb = СL15 =1Ч 10-6 моль/л; CФФ = 1Ч 10-4 моль/л); Eu(III) – L10 (б) у присутності різних концентрацій Н2О2 (CEu = CL10 = 1Ч10-4 моль/л)
Виявлені ефекти гасіння люмінесценції комплексів Tb (III) - L15 та Eu(III) – L10 запропоновані для високочутливого люмінесцентного визначення лужної фосфатази та пероксиду водню.
Показана можливість високочутливого визначення іонів міді (II) по гасінню люмінесценції комплексної сполуки Tb(III) - L15. Встановлено, що при додаванні Cu(II) до даного комплексу відбувається зменшення часу життя збудженного стану 5D4 іонів Tb(III). Висловлено припущення, що ефект гасіння пов’язаний з конкуруючим комплексоутворенням іонів міді (II) з лігандом комплексу. Даний тип гасіння є змішаним (одночасне гасіння як по статичному, так і по динамічному механізмові). Межа визначення іонів міді (II) - 5 Ч10-9 моль/л.
В п’ятому розділі показана можливість використання вивчених комплексів для високочутливого визначення органічних лігандів і сполук, підсилюючих (ДНК) або зменшуючих (лужної фосфатази і пероксиду водню) люмінесценцію аналітичних форм (табл. 3).
Таблиця 3
Аналітична форма | Визначаєма речовина | Об’єкт аналізу | Межа визначення | Діапазон визначаємих концентрацій
Tb(III) – L1 | L1 | Плазма крові | 1.0 мкг/мл | 2.5 - 250 мкг/мл
Tb(III) – L15-17 | L15-17 | Плазма крові | 0.25 мкг/мл | 0.5 - 500 мкг/мл
Eu(III) – L10 | Н2О2 | Вода | 0.06 мг/л | 0.17 - 34 мг/л
Tb – L15- ЛФ | ЛФ | Модельний розчин | 0.05 мU/мл | 0.1 - 70 мU/мл
Tb(III)–L1-ДНК | ДНК | Модельний розчин | 10 нг/мл | 25 –1200нг/мл
Tb(III)–L10-ДНК | ДНК | Модельний розчин | 3 нг/мл | 10 – 1200 нг/мл
Tb(III)-Нор-ДНК | ДНК | Модельний розчин | 1 нг/мл | 3 - 1200 нг/мл
Tb(III)–ДФ-ДНК | ДНК | Модельний розчин | 0.5 нг/мл | 1 - 1500 нг/мл
Для кількісного визначення нового місцевого анестетика - хіноксикаїна (L1) і нових протитуберкульозних біологічно активних речовин (L15-17) у плазмі крові людини використовували метод додатків, який дозволяє елімінувати вплив біоматриці.
Для визначення пероксиду водню у воді використовували метод градуювального графіку. Методика апробована на змивних водах після дезінфекції 30% розчином Н2О2 обладнання водопідготовки на фармацевтичному підприємстві. Цей же метод використовували для визначення ЛФ за ефектом гасіння люмінесценції комплексу Tb (III) - L15 фосфат – іонами.
Градуювальні графіки для визначення ДНК в інтервалах концентрації 1-100 нг/мл та
5-1500 нг/мл наведені на рис. 6, а та 6, б (1), відповідно. Градуювальний графік для визначення ДНК в інтервалі більших концентрацій із затримкою у часі 40 мкс та з інтегруванням сигналу на протязі 1400 мкс показано на рис. 6, б (2).
Рис. 6. Градуювальні графіки для визначення ДНК в концентраційних інтервалах: а) 1 – 100 нг/мл; (C Tb = CДФ = 1Ч10-7 моль/л); б) 5 - 1500 нг/мл (1 – заснованому на вимірюванні інтенсивності люмінесценції; 2 – заснованому на вимірюванні інтенсивності люмінесценції з часовим розрішенням; C Tb = CДФ = 1Ч10-6 моль/л)
Запропанований ефективний проявляючий розчин для багатократного мічення в імунофлуоресцентому аналізі, який дозволяє проводити одночасне визначення Tb(III), Eu(III), Dy(III), Sm(III) із застосуванням у якості органічного сенсибілізатора похідного 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти (L15), який дозволяє збільшити чутливість визначення іонів тербію (III) на порядок і диспрозію (III) на два порядки величин, у порівнянні з аналогічними методами, описаними в літературі.
Встановлена можливість визначення іонів Tb(III), Dy(III), Eu(III), Sm(III) при одній довжині хвилі збудження (рис. 7, а), вузькополосні спектри лантанідів достатньо розділені
(рис. 7, б), що дозволяє вести їх визначення з однієї проби.
Рис. 7. Спектри збудження (а) і люмінесценції (б) іонів лантанідів в комплексах з L15
(СTb = 1Ч 10-6 моль/л; СDy = CEu = 1Ч 10-5 моль/л; CSm = 1Ч 10-4 моль/ л; CLn :СL15 = 1:5)
Для кількісного визначення іонів лантанідів використовували метод додатків. Порівняння меж визначення іонів лантанідів з використанням запропонованого проявляючого розчину та розчину порівняння на основі півалоілтрифторацетону та 1,10 – фенантроліну наведено в табл. 4.
Таблиця 4
Порівняння меж визначення іонів лантанідів із застосуванням проявляючих розчинів
Іон Ln | Межі визначення, моль/л
Запропонований розчин | Розчин порівняння
Tb(III) | 1.2Ч10-14 | 3.4Ч10-13
Eu(III) | 1.3Ч10-13 | 3.5Ч10-14
Dy(III) | 1.5Ч10-13 | 4.6Ч10-11
Sm(III) | 1.6Ч10-11 | 7.9Ч10-12
Перевірку правильності визначення проводили методом “введено-знайдено” (табл. 5) та порівнянням результатів, отриманих запропонованим нами люмінесцентним методом для визначення пероксиду водню, та стандартним методом, який використовується для таких задач (табл. 6).
Таблиця 5
Правильність люмінесцентного визначення у модельних розчинах методом
“введено-знайдено” (n=5, P=0,95)
Визначаєма речовина | Об’єкт аналізу | Введено, мкг/мл | Знайдено, мкг/мл | sr
Плазмакрові | 5.0 | 5.02±0.38 | 0.065
25.0 | 24.86±1.26 | 0.043
50.0 | 49.75±1.64 | 0.028
Плазмакрові | 0.10 | 0.11 ± 0.01 | 0.073
1.00 | 0.95 ± 0.04 | 0.034
5.00 | 5.11 ±0.20 | 0.031
Плазмакрові | 0.10 | 0.10 ± 0.01 | 0.080
1.00 | 0.97 ± 0.04 | 0.033
5.00 | 5.05 ± 0.18 | 0.029
Плазмакрові | 1.00 | 0.11 ± 0.01 | 0.073
5.00 | 1.10 ± 0.05 | 0.037
0.10 | 4.92 ± 0.20 | 0.033
ЛФ | Модельнийрозчин | 0.5 | 0.52 ± 0.03 | 0.049
5.0 | 5.09 ± 0.21 | 0.033
50.0 | 50.27 ± 1.44 | 0.023
ДНК |
Модельнийрозчин |
0.050 | 0.052±0.003 | 0.049
0.50 | 0.49±0.02 | 0.029
1.00 | 0.99±0.03 | 0.022
ДНК |
Модельнийрозчин |
0.050 | 0.047±0.003 | 0.046
0.50 | 0.49±0.02 | 0.031
1.00 | 1.07±0.03 | 0.019
ДНК
Нор | Модельнийрозчин |
0.005 | 0.0052± 0.0003 | 0.041
0.01 | 0.098± 0.004 | 0.037
0.05 | 0.051± 0.002 | 0.025
ДНК
(Tb(III)–ДФ) | Модельнийрозчин | 0.005 | 0.0053± 0.0003 | 0.049
0.05 | 0.052±0.003 | 0.047
0.5 | 0.48±0.013 | 0.021
*концентрація ЛФ наведена у мU/мл
Таблиця 6
Порівняння результатів визначення пероксиду водню у воді (мг/л) (n = 5; Р = 0,95)
Люмінесцентний метод | Спектрофотометричний метод
Знайдено | sr | Знайдено | sr
0.34 ± 0.02 | 0.051 | 0.35 ± 0.02 | 0.041
0.51 ± 0.03 | 0.042 | 0.49± 0.03 | 0.038
0.73± 0.03 | 0.039 | 0.71± 0.02 | 0.028
1.24± 0.04 | 0.029 | 1.26± 0.03 | 0.021
Усі розроблені методики дорівнюють або перевищують за чутливістю методики, які використовуються в аналітичній практиці, але перевершують їх за простотою та експресністю виконання.
ВИСНОВКИ
Запропоновані нові аналітичні реагенти – похідні амідів 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти, які дозволяють отримувати комплекси Tb(III), Eu(III), Dy(III), Sm(III) з високими люмінесцентними характеристиками без використання органічних розчинників, поверхнево активних речовин та додаткових донорно - активних лігандів.
1.
Для всіх вивчених реагентів визначені їх константи іонізації та встановлено, що ліганди з найбільш сильними кислотними властивостями утворюють в більш кислій області комплексні сполуки з іонами лантанідів з найбільш високими значеннями квантових виходів та часу життя збудженого стану Ln(III).
2.
Люмінесцентним методом вивчено утворювання подвійних комплексів європію (III) та тербію (III) з похідними оксохінолін-3-карбонової кислоти. Показано, що іони лантанідів утворюють з досліджуваним класом сполук комплекси у недостачі ліганду або при еквімолярних концентраціях Ln:L1-17 зі співвідношенням компонентів Ln:L = 1:1, а у надлишку лігандів утворюють комплекси зі співвідношенням компонентів
Ln:L = 1:2.
3.
Показано, що для люмінесцентного визначення компонентів, які не утворюють різнолігандні комплекси в системах іон Tb(Eu) – похідні оксохінолін-3-карбонової кислоти – ДНК (фосфат – іони, іони Cu(II), H2O2), але підсилють (ДНК) або гасять (фосфат – іони, іони Cu(II), H2O2), люмінесценцію Ln(ІІІ), потрібно застосовувати співвідношення концентрацій Ln(ІІІ):сенсибілізатор = 1:1 або 2:1. Для визначення гасіїв найбільш ефективні подвійні комплекси Ln(ІІІ) : (L) з високим квантовим виходом (Ф>0.4 для іонів Tb та Ф>0.1 для іонів Eu), а для визначення ДНК – слабо люмінесцентні комплекси.
4.
Показана можливість ефективного застосування нових люмінесцентних зондів на основі комплексів Tb(III) для високочутливого визначення ДНК та вивчення інтеркаляційної взаємодії противірусних біологічно активних речовин з молекулами ДНК.
5.
На основі нових аналітичних форм – комплексних сполук Ln(ІІІ) з похідними оксохінолін-3-карбонової кислоти розроблені методики люмінесцентного визначення L1 (хіноксикаїна) та L15-17 (протитуберкульозних біологічно активних речовин) у плазмі крові з межами визначення 1.0 мкг/мл та 0.25 мкг/мл, відповідно; ДНК у модельних розчинах з межами визначення 0.5-10.0 нг/мл; пероксиду водню в змивних водах при очищенні обладнання водопідготовки на фармпідприємстві з межею визначення 0.06 мкг/мл. Вперше знайдена можливість посереднього високочутливого люмінесцентного визначення лужної фосфатази в модельних розчинах за гасінням люмінесценції комплексу Tb(III) з похідним 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти з межею визначення 0.05 мU/мл. Показана можливість сумісного визначення іонів Tb(III), Eu(III), Dy(III), Sm(III) із застосуванням у якості органічного сенсибілізатора похідного 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти для цілей багатократного мічення в імунофлуоресцентному аналізі.
СПИСОК ПУБЛИКАЦІЙ
1.
Егорова А.В., Скрипинец Ю.В., Антонович В.П., Украинец И.В., Сидоренко Л.В.,
Рыбаков В.Б., Чернышев В.В. Комплексные соединения лантанидов с гидрохлоридом
(2 диэтиламиноэтил)-амида 1-аллил-4-гидрокси-2-оксо-1,2-дигидро-хинолин-3-карбоновой кислоты // Журн. орг. та фарм. хімії. – 2004. – Т. 2, вип. 4 (8). – С. 32 - 37.
Особистий внесок здобувача полягає в плануванні та виконанні експериментального дослідження люмінесцентних властивостей комплексу тербію (III) з похідним 2 – оксо - 4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти.
2.
Скрипинец Ю.В., Егорова А.В., Антонович В.П., Украинец И.В. Люминесцентное определение некоторых новых противотуберкулёзных биологически активных соединений с помощью их тербиевых комплексов // Вісн. Одеськ. нац. ун-ту. Хімія. – 2005. - Т. 10, вип.
9. – С. 77-84.
Здобувачем встановлені умови утворення та люмінесцентні характеристики комплексів тербію (III) з новими протитуберкульозними біологічно активними сполуками. Проведено люмінесцентне визначення цих речовин у плазмі крові людини.
3.
Скрипинец Ю.В., Егорова А.В., Украинец И.В., Антонович В.П. Люминесцентное определение ДНК с использованием в качестве зондов новых комплексных соединений тербия // Журн. аналит. химии. – 2006. – Т. 61, № 1. – С. 50-58.
Здобувачем виконана експериментальна робота по вивченню спектрально - люмінесцентних характеристик комплексних сполук тербію (III) з похідними амідів 2-оксо-4-гідроксіхінолін-3-карбонової кислоти та впливу на них молекул ДНК. З використанням цих комплексів розроблені люмінесцентні методики кількісного визначення ДНК.
4.
Скрипинец Ю.В., Егорова А.В., Антонович В.П., Украинец И.В. Определение пероксида водорода в воде по тушению флуоресценции комплекса Eu (III) // Химия и технология воды. – 2006. - Т. 28, № 2. – С. 143-151.
Здобувачем вивчено люмінесцентні властивості комплексної сполуки Eu(III) з похідним
2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти у присутності пероксиду водню. Розроблена методика визначення пероксиду водню у змивних водах. Проведено оцінку правильності та відтворюваності методики.
5.
Скрипинец Ю.В., Егорова А.В., Антонович В.П., Украинец И.В. Люминесцентное определение щелочной фосфатазы с использованием комплексного соединения тербия(III) // Вісник УжНУ. - 2006. – вып. 16. – С. 100 – 106.
Здобувачем виконана експериментальна робота по вивченню люмінесцентних характеристик комплексу тербію (III) з похідним 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти у присутності лужної фосфатази, котра ферментативно розщеплює фенілфосфат натрію до фосфат - іонів. З використанням цього комплексу розроблено люмінесцентну методику кількісного визначення лужної фосфатази у модельному розчині.
6.
Yegorova A.V., Scripinets Y.V., Duerkop A., Karasyov A.A., Antonovich V.P., Wolfbeis O.S. Sensitive luminescent determination of DNA using the terbium(III)–difloxacin complex // Anal. Chim. Acta. – 2007. – Vol. 584. - P. 260 – 267.
Особистий внесок здобувача полягає в плануванні та виконанні експериментального дослідження спектрально - люмінесцентних властивостей комплексу тербію (III) з діфлоксацином у присутності молекул ДНК. З використанням цього комплексу розроблено високочутливу люмінесцентну методику кількісного визначення ДНК.
7.
Пат. 4837 A МПК7 G01N33/15. Спосіб кількісного визначення ДНК. / Скрипинець Ю.В., Єгорова А.В., Українець І.В., Антонович В.П. (Україна). - №20040403191; Заявл. 27.04.04; Опубл. 15.02.05, Бюл. №2. - 3 с.
Здобувачем розроблено методику кількісного визначення ДНК із застосуванням у якості люмінесцентного зонду комплексу тербію (III) з гідрохлоридом діетиламіноетиламіду-1-пропіл-2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти гідратом.
8.
Пат. 4952 A МПК7 G01N33/15. Спосіб кількісного визначення ДНК./ Скрипинець Ю.В., Єгорова А.В., Українець І.В., Антонович В.П. (Україна). - №20040604207; Заявл. 01.06.04; Опубл. 15.02.05. Бюл. №2.- 4 с.
Здобувачем розроблено методику кількісного визначення ДНК із застосуванням у якості люмінесцентного зонду комплексу тербію (III) з гідрохлоридом амінобутиламіду–1,8-діметилен-2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти.
9.
Пат. 14609 МПК G01N33/53. Спосіб сумісного визначення іонів тербію, диспрозію, європію і самарію в імунофлуоресцентному аналізі./ Скрипинець Ю.В., Єгорова А.В., Українець І.В., Антонович В.П. (Україна). - № U 200511683; Заявл. 08.12.05; Опубл. 15.05.06. Бюл. №5. – 4 с. Здобувачем розроблено методику сумісного визначення іонів тербію, диспрозію, європію і самарію з метою багатократного мічення в імунофлуоресцентному аналізі із застосуванням комплексів Ln(III) з похідним 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти.
10.
Скрипинец Ю.В. Использование комплексных соединений тербия (III) с амидами 2-оксо-4-гидроксихинолин-3-карбоновой кислоты для люминесцентного определения ДНК // Тез. доп. міжнародної конференції студентів та аспірантів „Сучасні напрямки розвитку хімії”. –
Одеса. – 2004. - С. 111.
11.
Скрипинец Ю.В. Сенсибилизированная люминесценция тербия в комплексе с хиноксикаином и ее использование в биоанализе // Тез. доп. V Всеукраїнської наукової конференції студентів та аспирантів „Сучасні проблеми хімії”. – Київ. – 2004. – С. 156.
12.
Скрипинец Ю.В, Егорова А.В., Украинец И.В. Комплексные соединения европия (III) и тербия (III) с амидами 2-оксо-4-гидроксихинолин-3-карбоновой кислоты // Тез. доп. XVI Української конференції з неорганічної хімії. - Ужгород. - 2004. - С. 93.
13.
Скрипинец Ю.В., Егорова А.В., Украинец И.В., Антонович В.П. Определение ДНК с использованием комплексных соединений тербия (ІІІ) в качестве люминесцентных зондов // Тез. докл. Конференции “Аналитика России”. – Москва. – 2004. – С. 121-122.
14.
Скрипинец Ю.В. Люминесцентное определение пероксида водорода в воде // Тез. доп. VI Всеукраїнської наукової конференції студентів та аспірантів „Сучасні проблеми хімії”. – Київ. – 2005. – С. 171.
15.
Scripinets Y., Alexandrova D., Yegorova A., Antonovich V. Determination of DNA by its enhancement effect on the fluorescence of Tb3+-norfloxacin complex // Book of abstracts International conference “Analytical chemistry and chemical analysis” (AC& CA – 05). – Kyiv. – 2005. - Р. 377.
16.
Yegorova A., Scripinets Y., Karasyov A., Duerkop A., Wolfbeis O. Extremely sensitive luminescent determination of ds-DNA using the terbium (III) - norfloxacin complex // Book of abstracts 9th. International conference on methods and applications of fluorescence. - Lisbon – Portugal. - 2005. - P. 262.
17.
Duerkop A., Yegorova A.,Turel M., Karasyov A., Lobnik A., Scripinets Y., Ukrainets I.,
Wolfbeis O., Sensitive probe for phosphate based on the quenching of the luminescence of a the terbium (III) – ligand complex // Book of abstracts 9th. International conference on methods and applications of fluorescence. - Lisbon – Portugal. - 2005. - P. 99.
18.
Скрипинец Ю.В. Люминесцентные свойства комплексных соединений лантанидов с производными 2-оксо-4-гидроксихинолин-3-карбоновой кислоты и применение их в анализе // Тез. доп. VIII конференції молодих учених та студентів-хіміків південного регіону України. - Одеса. - 2005. – С. 32.
19.
Turel M., Duerkop A., Yegorova A., Scripinets Y., Lobnik A. Detection of copper(II) in nanomolar concentrations by luminescence quenching of a Tb-ligand probe // Book of abstracts Euroоpt(R)ode VIII. - Tubingen. - 2006. - P. 171.
20.
Скрипинец Ю.В. Люминесцентные свойства комплексов лантанидов с производными 2-оксо-4-гидроксихинолин-3-карбоновой кислоты и применение их в биоаналитической химии // Тез. доп. Cесії наукової ради НАН України з проблеми "Аналітична хімія". – Одеса. - 2006. – С. 72.
21.
Scripinets Y., Yegorova A., Antonovich V. Application of the luminescence of lanthanide complexes with the 2-oxo-4-hydroxy-quinoline-3-carboxylic acid derivatives in bioanalytical chemistry // Book of abstracts International сongress on аnalytical sciences. – Moscow. - 2006. - P.127.
22.
Скрипинец Ю.В. Люминесцентные определение ДНК с использованием в качестве зонда комплексного соединения тербия с дифлоксацином // Тез. доп. IX конференції молодих учених та студентів-хіміків південного регіону України. - Одеса. -2006. – С. 69.
АНОТАЦІЯ
Скрипинець Ю.В. Люмінесцентне визначення деяких біологічно активних речовин за допомогою комплексів лантанідів з похідними оксохінолін-3-карбонової кислоти. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.02. – аналітична хімія. – Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, Одеса, 2007.
Дисертація присвячена пошуку нових аналітичних форм на основі комплексних сполук іонів Ln(ІІІ) з новим класом реагентів – похідних 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти та використанню їх для люмінесцентного визначення біологічно активних речовин.
Встановлено, що іони Ln(ІІІ) утворюють з вивченими реагентами при рН 3.5-11.0 комплекси зі співвідношенням компонентів Ln(ІІІ):L = 1:1 при надлишку метала та 1:2 при надлишку реагенту. Визначені спектрофотометричні та кислотно-основні характеристики реагентів, квантові виходи та час життя їх лантанідних комплексів. Встановлено незначний вплив на сенсибілізовану люмінесценцію лантанідів у вивчених комплексах органічних розчинників, поверхнево - активних та донорно - активних речовин, а максимальна інтенсивність люмінесценції спостерігається в водних розчинах.
Комплекси Tb(III) з хіноксикаїном (L1) та новими протитуберкульозними біологічно активними речовинами (L15-17) застосовані для їх люмінесцентного визначення у плазмі крові у діапазонах 2.5-250.0 мкг/мл (L1) та 0.5-500.0 мкг/мл (L15-17). Встановлено, що люмінесценція комплексів Tb(III) та Eu(III) з новими реагентами суттєво зменшується у присутності фосфат-іонів, пероксиду водня та іонів Cu(II). Обговорені механізми гасіння люмінесценції Ln(ІІІ) у системах Eu(III)-L10-Н2О2, Tb(III)-L15-Н2РО4- (Cu2+). Запропоновані чутливі методики люмінесцентного визначення пероксиду водню та лужної фосфатази, котра ферментативно розщеплює фенілфосфат натрію до фосфат - іонів.
Здатність L15 до одночасного утворення комплексів Tb(III), Eu(III), Dy(III) та Sm(III) з високими люмінесцентними характеристиками використано для створення нового ефективного проявляючого розчину для цілей багатократного мічення в імунофлуоресцентному аналізі.
Встановлено, що люмінесценція комплексів Tb(III) з новими реагентами суттєво збільшується у присутності молекул ДНК. Розроблені високочутливі
