МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ТКАЧЕНКО Євгенія Василівна

УДК 615.277.3:612.273.2:616

еКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ВИВЧЕННЯ ФАРМАКОЛОГІЧНОЇ

ЕФЕКТИВНОСТІ НОВОГО ПОХІДНОГО ТІАЗОЛІДИНУ

ПРИ ГІПОКСИЧНОМУ СИНДРОМІ

14.03.05 – фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Харків - 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в | Луганському державному медичному університеті МОЗ України.

Науковий керівник: | доктор медичних наук, професор, Заслужений діяч науки і техніки України ЛУК’ЯНЧУК Віктор Дмитрович, Луганський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри фармакології.

Офіційні опоненти: | доктор біологічних наук, професор, завідуюча лабораторією біохімічної фармакології ДП “Державного наукового центру лікарських засобів” МЗ України МАСЛОВА Наталія Федорівна

доктор медичних наук, професор КИРИЧОК Люд-мила Трохимівна, Харківський державний медичний університет МОЗ України, професор кафедри фармакології з медичною рецептурою

Провідна установа: | Національний медичний університет ім. О.О. Бого-мольця, кафедра фармакології з курсом клінічної фармакології.

Захист дисертації відбудеться “20”квітня 2007р. о 1000 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради при Національному фармацевтичному університеті МОЗ України за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету МОЗ України за адресою: 61168, м. Харків, вул. Блюхера,4.

Автореферат розісланий “___ березня 2007р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради

Д 64.605.01,

доктор біологічних наук,

професор | Малоштан Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. За останнє десятиріччя в Україні різко зросла кількість природних та техногенних, у т.ч. виробничих аварій і катастроф у різних галузях промисловості, особливо у вугільній. Це призводить не тільки до економічних та соціальних, але й значних медичних проблем надання ефективної першої допомоги постраждалим (С.И. Азаров, О.В. Святун, 2003, И. Сахань, 2002, В.Г.Климовицкий и соавт., 2002). Дана проблема є особливо актуальною для крупного промислового регіону Донбасу, де вугільні шахти складають значну частину всієї промисловості: 218 глибоких шахт, 114 з яких є вибухонебезпечними (Г.А. Можаев и соавт., 1995). Затяжна економічна криза у вугільній галузі, особливо в питаннях удосконалення систем безпеки та оновлення обладнання, а також вихід на глибокі горизонти, ускладнення гірсько-геологічних умов (температура в забої від 35 до 50С, зниження концентрації кисню у повітрі, що вдихується до 12 об. %, подовження середньої глибини розробки шахт до 1 км, рухливість вугільних пластів, безпечність раптового викиду метану та самозапалювання вугільного пилу, підвищене виділення рудничних газів призводять до зростання кількості підземних аварій, при яких гірняки опиняються, як правило, в умовах гіпоксії замкнутого простору (ГЗП) (М. Мірошніченко, 2005, В.Ю. Ніколенко та співавт., 2005).

За останні 10 років на шахтах України загинуло 3,5 тисячі гірняків (В. Панов, 2005). Згідно даних Державного департаменту промислової безпеки, охорони праці та гірничого нагляду МНС коефіцієнт загибелі шахтарів на 1 млн. тон видобутого в Україні вугілля складає 2,7-5,2, в той час як у Росії він дорівнює 1,1, а в США – 0,03 (В. Панов, 2005, А. Крамаренко, 2000). Встановлено, що підвищення температури робочої зони на кожен 1С понад припустимих границь знижує продуктивність праці шахтарів у середньому на 6% (С. Попова,1997).

Таким чином, зростаюча кількість аварій та катастроф у глибоких вугільних шахтах, що виникають в умовах миттєвопрогресуючої ГЗП, є однією з найбільш важливих соціально-економічних та медичних проблем, що потребують невідкладного вирішення.

Раніше проведеними дослідженнями в лабораторії кафедри фармакології Луганського державного медичного університету (ЛугДМУ) Савченковою Л.В. (1999 р.), Сергеєвим С.Н. (1993 р.), Лисенко О.А. (1994 р.), Дзубан К.М. (1996 р.), Бєлоусовою І.П. (2000 р.), Немятих О.Д. (2004 р.) встановлено, що в основі патогенезу екстремальних киснедефіцитних станів, що формуються на тлі гіпертермії центральне місце займають порушення прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу організму, вуглеводного та енергетичного обмінів, синтезу продуктів арахідонової кислоти та внутрішньоклітинної передачі сигналу.

На сьогоднішній день пошук високоефективних та безпечних засобів фармакокорекції гіпоксичних станів проводиться як серед відомих лікарських засобів, так і зновсинтезованих органічних та елементоорганічних сполук різної структури. В цьому плані особливу увагу представляють гетероциклічні сполуки в ряду похідних тіазолідину, які характеризуються широким спектром фармакологічної активності: протимікробною, протипухлинною, противиразковою, седативною, протидіабетичною, гепатопротекторною, антиоксидантною та ін. (В.П. Музиченко та співав., 2000, Р.Б. Лесик та співавт., 2001, 2003, Б.С. Зіменковський та співавт., 2002, М. Тронько та співавт, 2002). В лабораторії кафедри фармакології ЛугДМУ встановлена висока протекторна активність похідного тіазолідину в умовах гострої ішемії головного мозку (В.Д. Лук’янчук та співав., 2003), а також розроблено оптимальний режим його дозування (М.В. Оглобліна та співав., 2004). При цьому показано, що ця сполука володіє вираженою здатністю корегувати цілий комплекс структурно-функціональних порушень, що розвиваються в процесі циркуляторної гіпоксії при двобічній оклюзії загальних сонних артерій (М.В. Оглобліна, 2004, 2005).

Виходячи з вищезазначеного, пріоритетним напрямком сучасної фармакології є пошук серед оригінальних похідних тіазолідину високоефективних та безпечних засобів лікування та профілактики патологічних станів, викликаних дією на організм екстремальних факторів, у тому числі гострої гіпоксичної гіпоксії з гіперкапнією.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках двох планових НДР кафедри фармакології ЛугДМУ “Пошук та розробка засобів фармакокорекції екстремальних киснедефіцитних станів” (№ держ. реєстрації 0103U005539, 2004-2008 р.р.) і „Пошук засобів профілактики гіпоксичного синдрому серед похідних азолідину та координаційних сполук, отриманих на їх основі” (№ держ. реєстрації 0104U002060, 2003-2006 рр.). .), а також на прохання керівництва вугільних підприємств Донбасу ВП Шахта „Краснолучська” (лист № 369/9 від 14.09.2004 р), ВП Шахта “Міусинська” (лист № 2/923 від 15.09.2004 р), ВП Шахта “ім. Ізвестій” (лист № 1/369 від 14.09.2005 р), ВП Шахта “Хрустальська” (лист № 2/995 від 15.09.2005 р), Державного підприємства “Донбасантрацит”.

Мета та задачі дослідження. Мета роботи – пошук засобів фар-ма-котерапії гіпоксичного синдрому серед нових похідних тіазолідину та вивчення фармакологічної активності найбільш активної сполуки.

Для досягнення поставленої мети вирішувались наступні задачі:

Провести первинний фармакологічний скринінг засобів лікарської профілактики гіпоксичного синдрому серед похідних тіазолідину, а також визначити параметри гострої токсичності та безпечності найбільш ефективної сполуки (Les-15) в умовах інтраперитонеального введення для теплокровних.

1. З використанням методу математичного моделювання визначити оптимальний режим дозування Les-15, як найактивнішої сполуки в умовах гострої гіпоксичної гіпоксії з гіперкапнією.

2. Вивчити в динаміці кінетику вільнорадикальних процесів та показники антиоксидантної системи організму тварин в умовах патологічного стану, що вивчається, на тлі застосування Les-15.

3. Оцінити вплив Les-15 на динаміку рівня компонентів аденіл-нуклео-тидної системи (АТФ, АДФ, АМФ), параметри і активність ферментів енерге-тичного обміну, а також визначити вміст основних показників вуглеводного обміну в біосубстратах щурів з ГЗП.

4. Вивчити вплив Les – 15 на стан електронно-парамагнітних центрів печінки тварин з формою гіпоксичного синдрому, що моделюється.

5. Визначити параметри зворотньої взаємодії похідного тіазолідину, що вивчається, з білками сироватки крові в умовах гострої гіпоксичної гіпоксії з гіперкапнією.

Об'єкт дослідження – 5-фенілпропеніліден-роданін-3-пропіонат натрію, що застосовується в умовах гострої гіпоксичної гіпоксії з гіперкапнією.

Предмет дослідження – фармакодинаміка та біотранспорт 5-фенілпропеніліден-роданін-3-пропіонату натрію в умовах гострого перебігу гіпоксичного синдрому.

Методи дослідження – використовувався комплексний методичний підхід, зокрема, біохімічні, біофізичні, фізико-хімічні та математичні методи дослідження, а також методичні підходи, які застосовуються в експериментальній фармакології та фармакотерапії.

Наукова новизна одержаних результатів. В роботі вперше наведено теоретичне обґрунтування та експериментальне підтвердження доцільності застосування нового похідного тіазолідину 5-фенілпропеніліден-роданін-3-пропіонату натрію (Les-15) у якості високоефективного та безпечного в токсикологічному відношенні засобу лікарської профілактики гіпоксичного синдрому, що розвивається в умовах ГЗП. Розроблено з використанням методу математичного моделювання оригінальний режим дозування Les-15 в досліджуваних умовах експерименту.

Отримані нові дані про фармакодинаміку похідного тіазолідину у часті його впливу на стан антиоксидантно-прооксидантного гомеостазу, а також на вміст та активність металопротеїдних парамагнітних комплексів гепатоцитів в динаміці у тварин з формою гострої патології гіпоксичного ґенезу, що моделюється. Вперше доведена протекторна активність Les-15 в умовах киснедефіцитного стану, що вивчається, на основні компоненти енергетичного та вуглеводного обмінів. Експериментально доведена здат-ність досліджуваного тіазолідину модифікувати комплексоутворюючі вла-сти-вості транспортних білків тварин з ГЗП за рахунок підвищення константи асоціації зворотніх комплексів “білок-ліганд” при незмінній кількості місць зв’язування на молекулах сироваткових протеїнів.

Практичне значення отриманих результатів. На підставі отриманих результатів досліджень розроблені та видані методичні рекомендації „Експериментальне вивчення взаємодії лікарських засобів із сироватковим альбуміном”, які схвалено на засіданні науково-експертної ради ДФЦ МОЗ України (протокол № 5 від 27.05.2004 р.).

За матеріалами дисертації отримано деклараційний патент України на корисну модель „5-фенілпропеніліден-роданін-3-пропіонат натрію, який виявляє протигіпоксичну активність” (№ 5977 від 15 квітня 2005 р.).

Отримані в роботі дані стали основою для планування НДР кафедри фармакології ЛугДМУ за темою: „Пошук засобів профілактики гіпоксичного синдрому серед похідних азолідину та координаційних сполук, отриманих на їх основі” (№ держ. реєстрації 0104U002060).

Матеріали досліджень впроваджені в навчальний процес на кафедрах фармакології Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пірогова та Івано-Франківського державного медичного університету, фармакології та клінічної фармакології Дніпропетровської державної медичної академії, кафедрі клінічної фармакології вищого державного навчального закладу України “Українська медична стоматологічна академія” МОЗ України, а також на кафедрі фармацевтичної, органічної та біоорганічної хімії Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького.

Отримані в роботі результати можуть слугувати експериментальним обґрунтуванням для хіміків-синтетиків у частині цілеспрямованого синтезу оригінальних хімічних сполук тіазолідинового ряду, що володіють певною біологічною активністю.

Особистий внесок дисертанта. Автором самостійно сформульовані мета і задачі, визначені напрямок, обсяг і методичні підходи дослідження, проведений патентно-інформаційний пошук з використанням серверів Yandex, Alta Vista, Rambler, Google, а також медичної бази даних Medline мережі Інтернет.

Всі етапи експериментального дослідження, включаючи аналіз і узагальнення даних, статистичну обробку отриманих результатів, розробку основних положень роботи, її висновків, а також написання огляду літератури автором проведені особисто.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися й одержали позитивну оцінку на: VII Міжнародній науково–практичній конференції „Наука і освіта 2004” (Дніпропетровськ, 2004); II Міжрегіональній конференції молодих вчених “Актуальні питання біології та медицини” (Луганськ, 2004); V Міжнародній медичній конференції студентів та молодих вчених „Молодь медицини майбутнього” (Дніпропетровськ, 2004); IV Українській науково-практичній конференції з міжнародною участю з клінічної фармакології “Актуальні питання фармакології” (Вінниця, 2004); Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених “Вчені майбутнього” (Одеса, 2004); Науково-практичній конференції з міжнародною участю “Від фундаментальних досліджень – до прогресу в медицині” (Харків, 2005); І Регіональній науково-практичній конференції молодих вчених та студентів “Перспективи розвитку фармацевтичної науки та практики в Україні” (Луганськ, 2005); Ювілейному VIII з’їзді Всеукраїнського лікарського товариства (Івано-Франківськ, 2005); XLVIII Підсумковій науково-практичній конференції “Здобутки клінічної і експериментальної медицини” (Тернопіль, 2005); ІІ Науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальні проблеми фармакології та токсикології” (Київ, 2005); Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів, молодих вчених та інтернів “Актуальні проблеми фундаментальної медицини (англійською мовою)” (Луганськ, 2005); I Міжнародній науково-практичній конференції “Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів” (Тернопіль, 2006), ІІІ Міжнародній медико-фармацевтичній конференції студентів і молодих вчених (Чернівці, 2006); ІІІ Національному з’їзді фармакологів України (Одеса, 2006), Всеукраїнській науково-практичній конференції „Актуальні питання біології, медицини та фармації” (Луганськ, 2006).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 24 наукових праці, з них 6 статей у наукових спеціалізованих журналах, затверджених ВАК України, а також 16 тез доповідей на наукових форумах різних рівнів та 1 методичні рекомендації. Отримано 1 деклараційний патент України на корисну модель.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали і методи досліджень”, 6 розділів власних досліджень, розділу “Аналіз та узагальнення отриманих даних”, висновків, списку літератури, який включає 217 вітчизняних і 140 закордонних джерел. Робота викладена на 211 сторінках машинописного тексту (145 стор. основного тексту), ілюстрована 21 малюнком і 22 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проводили в лабораторії кафедри фармакології ЛугДМУ, яка сертифікована ДФЦ МОЗ України (посвідчення № 41 від 30.05.2002 р. та № 07 від 29.09.2005 р.) у повній відповідності з вимогами Комісії з біоетики ЛугДМУ (наказ ректора № 7 від 19.10.2006 р.), та методичними рекомендаціями ДФЦ МОЗ України (Київ, 2002).

Досліди виконані на 755 білих безпородних щурах масою 150-200 г. Всі тварини були статевозрілі, обох статей, знаходились в умовах віварію ЛугДМУ та отримували стандартну дієту у вигляді гранульованого корму за встановленими нормами. Доступ до води був вільним.

Експериментальною моделлю слугував патологічний процес, що розвивався у тварин в умовах замкнутого простору. Моделювання гіпоксії з наростаючою гіперкапнією здійснювали в ізольованих гермооб’ємах (10 дм3) з експозицією 45 хвилин. Іншу форму гіпоксії – гіпоксичну гіпоксію на тлі гіпертермії моделювали в спеціально розробленій співробітниками кафедри фармакології ЛугДМУ камері.

Первинний фармакологічний скринінг потенційних антигіпоксантів проводили серед 16 оригінальних похідних тіазолідину* на моделі гіпо-ксичної гіпоксії з гіперкапнією, що розвивається в замкнутому просторі. Далі скринінгові дослідження проводили серед 7 найбільш активних сполук на моделі гіпоксичної гіпоксії з гіперкапнією на тлі перегріву.

У якості референтного препарату використовували кверцетин (“Борщаговський ХФЗ”, Київ) (Л.В.Савченкова, 1999). Всі сполуки, що досліджувались, вводили одноразово внутрішньоочеревинно в дозі 100 мг/кг за 60 хвилин до початку моделювання патології.

Ефективність субстітуєнтів на моделі ГЗП визначали за величинами коєфіціенту протигіпоксичного захисту (Кз) (В.Д. Лук‘янчук та співавт., 2002) та відносного показника збільшення часу життя тварин (П) (Л.Д. Лукьянова, 1990):

Кз = Тд / Тк; П = (Топ - Тк)/ Тк * 100, де

Тд - середня тривалість життя тварин в дослідній групі (хв.);

Тк - середня тривалість життя тварин в контрольній групі (хв.),

а також за станом клінічної картини досліджуваної форми гіпоксії.

Активність досліджуваних потенційних антигіпоксантів на моделі гіпоксичної гіпоксії на тлі гіпертермії оцінювали за виживанням:

Ефективність = ВЖд – ВЖк , де

ВЖд – виживання в дослідній групі, %;

ВЖк – виживання в контрольній групі, %,

а також за станом клінічної картини досліджуваної форми гіпоксії.

В серії токсикометричних досліджень похідного тіазолідину (Les-15), як найефективнішої сполуки за результатами скринінгових досліджень,

___________________________

*) Виражаємо щиру подяку професору Р.Б. Лесику за синтез похідних тіазолідину

вивчали гостру токсичність з використанням методу найменших квадратів для пробіт-аналізу кривих летальності (В.Б. Прозоровский, 1962). При цьому клінічну картину інтоксикації тварин оцінювали згідно з методичними рекомендаціями ДФЦ МОЗ України (Київ, 2002).

При розробці дозового режиму Les-15 вводили у вигляді 1% розчину внутрішньоочеревинно одноразово в дозах (50, 100 та 150 мг/кг) в різний час (за 1 та 2 години до початку, а також безпосередньо перед моделюванням ГЗП). Ефективність сполуки оцінювали за виживанням щурів. Математичний аналіз за-лежності середньої тривалості життя щурів в умовах ГЗП від введеної дози Les-15 визначали методом двофакторного експерименту (Е.Е. Рафаелес и соавт., 1971) за допомогою спеціально розробленої на кафедрі фармакології Луг дму програми для Pentium 200 MMX в середовищі Turbo Pascal V. 7.0., а аналіз функції та розрахунок оптимальних доз проводили графічним способом з використанням стандартної програми Mach Engine V 2.001 (Д.С. Кравець, 1999)*.

В подальшому щурам дослідної групи Les-15 вводили одноразово внутрішньоочеревинно у вигляді 1% водного розчину в дозі 82,5 мг/кг за 48 хвилин до початку моделювання ГЗП. Всі дослідження проводили в динаміці: через 3, 6 та 24 години після вилучення тварин з гермооб’ємів. Біосубстратами для проведення комплексних біофізичних, біохімічних, а також фізико-хімічних досліджень слугували цільна кров, сироватка крові, кора головного мозку та печінка тварин.

Гомогенати тканин мозку готували на охолодженому (4°С) ізотонічному розчині натрію хлориду.

Антирадикальну активність Les-15 вивчали за допомогою біохемілюмінісценції (БХЛ), яку реєстрували на люмінометрі “Emillite-1105” виробництва фірми “Біо-Хім-Мак” у сироватці крові щурів протягом 5 хвилин та в гомогенаті тканини мозку – протягом 3 хвилин. Кінетику світіння оцінювали за амплітудою повільного спалаху (І), часом індукції повільного спалаху (?), а також загальною світлосумою реакції (S). Розрахунок досліджуваних параметрів проводили за допомогою комп’ютерної програми Emilite Meneger Version 2.00.

Стан процесів ПОЛ у тварин з ГЗП оцінювали за вмістом у сироватці крові первинних продуктів – дієнових кон’югатів (ДК) (И.Д. Стальная, 1977), в крові та тканині мозку – кінцевих продуктів ліпідпереокислення, що реагують з 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБК-реактанти) (И.Д. Стальная, Г.Г. Гаршвили, 1977).

_____________________________

*) Щиро вдячні доц. Д.С. Кравцю за надання консультативно-методичної допомоги

Стан основних компонентів АОС захисту організму оцінювали за активністю двох ключових ферментів її ензимної ланки – супероксиддисмутази (СОД) (В.А. Костюк та співавт., 1990) та каталази (М.А. Королюк та співавт., 1988), а також за рівнем відновленого глутатіону (J. Sedluck, H. Lindsay, 1969) та вільних SH-груп (G.L. Ellman, 1959). Забезпеченість організму тварин у досліджуваних умовах експерименту ендогенними антиоксидантами оцінювали за інтегральним показником стану перекисної резистентності еритроцитів (О.Г. Архипова, 1988). З метою більш коректного судження про ефективність Les-15 у плані його здатності протистояти окисному стресу при ГЗП використовували фактор антиоксидантного стану, який розраховували як частку від добутку активності СОД та каталази на рівень ТБК-реактантів (Л.П. Купраш та співавт., 2000).

Оцінку стану енергетичного гомеостазу у досліджуваних умовах експерименту проводили шляхом визначення рівня АТФ, АДФ та АМФ в еритроцитах методом тонкошарової хроматографії на пластинах фірми “Merk” (Німеччина) (Н.Б. Захарова, В.И. Рубин, 1980). На підставі отриманих даних розраховували показники, що характеризують стан енергетичного обміну при застосуванні Les-15 в умовах ГЗП: енергетичний заряд (ЕЗ), енергетичний потенціал (ЕП), індекс фосфорилювання (ІФ), порівняльний коефіцієнт (Кпор) та термодинамічний контроль дихання (ТКД) (В.Д. Лук’янчук, Л.В. Савченкова, 2000).

Активність ферментів енергетичного обміну оцінювали в сироватці крові за допомогою біохімічних наборів фірми “Філісіт-діагностика”, Україна (лактатдегідрогеназа) та “PLIVA-Lachema”, Чехія (креатинкіназа).

Вміст глікогену оцінювали колориметричним методом з орцином (О.О. Покровський, 1964), рівень глюкози визначали за допомогою біохімічних наборів фірми “Філісіт-діагностика”. Концентрацію лактата та пірувата ідентифікували за допомогою неферментативної методики в одній пробі (И.Г. Герасимов, Е.Н. Плаксина, 2000).

Для більш коректної оцінки стану вуглеводного обміну розраховували окисно-відновний потенціал (ОВП) системи молочна-піровиноградна кислоти (М.Е. Райскина, 1974).

Вміст довгоживучих вільних радикалів і металопротеїдних комплексів у гепатоцитах визначали за допомогою електронного парамагнітного резонансу (ЕПР) на ЕПР-спектрометрі фірми „Varian” марки Е-109 (США). ЕПР-спектрометрію зразків печінки проводили в умовах низькотемпературної стабілізації в рідкому азоті (77?К). Стан мітохондріального та мікросомального ланцюгів транспорту електронів у гепатоцитах оцінювали через 6 і 24 години з моменту реоксігенації за положенням та амплітудою парамагнітних центрів гепатоцитів з g-факторами: 1,94 – залізосірчані білки (ЗСБ); 1,97 - Мо5+- вмісткі комплекси; 2,00 – вільні радикали; 2,03 – нітрозильні комплекси заліза (НКЗ); 2,17 - Мn2+-вмісткі парамагнітні центри; 2,25 - цитохром Р- 450.

Вплив Les-15 на зв’язуючу здатність сироваткових білків при ГЗП визначали за допомогою методу рівноважного діалізу (А.И. Луйк, В.Д. Лукьянчук, 1984). Кількісні параметри комплексоутворення – константу асоціації комплексу “білок-ліганд” (Кас) та число місць зв’язування (N) розраховували за розробленою на кафедрі фармакології ЛугДМУ комп’ютерною програмою (В.Д. Лук’янчук та співавт., 2004).

Отримані дані оброблені статистично за допомогою критерію t Ст’юдента (С. Гланц, 1999), а також непараметричного критерію U (Вілкоксона-Манна-Уітні) (Е. В. Гублер, 1978).

Результати досліджень та їх обговорення.

Первинний фармакологічний скринінг засобів лікарської профілактики гіпоксичного синдрому серед похідних тіазолідину та токсичність найбільш активної сполуки. Результати проведених скринінгових досліджень серед оригінальних сполук, похідних тіазолідину дозволили встановити, що найбільш високу ефективність в плані збільшення середньої тривалості життя тварин та коефіцієнту протигіпоксичного захисту, а також більш сприятливого перебігу клінічної картини гіпоксії, яка сходна з референтним препаратом кверцетином, реалізує субстітуєнт під лабораторним шифром Les-15, що є 5-фенілпропеніліден-роданін-3-пропіонатом натрію (рис. 1), (табл.1)

Рис. 1. 5-фенілпропеніліден-роданін-3-пропіонат натрію (Les-15).

В окремій серії токсикометричних досліджень встановлений вельми високий ступінь безпечності інтраперитонеального застосування Les-15, який згідно з сучасними вимогами до результатів доклінічних досліджень лікарських засобів відноситься до IV класу токсичності “Малотоксичні сполуки” (Сидоров К.К., 1973) для теплокровних, у тому числі і для людини, в плані виникнення та розвитку гострих отруєнь з летальним наслідком.

При розробці оптимального режиму дозування Les-15 в умовах гострої гіпоксичної гіпоксії з гіперкапнією з використанням методу двофакторного експерименту визначено, що максимальну протигіпоксичну активність потенційний антигіпоксант реалізує за умов його застосування в дозі 82,5 мг/кг за 48 хвилин до початку моделювання ГЗП.

При вивченні стану прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу в умовах гіпоксичного синдрому при застосуванні Les-15 встановлено, що цей субстітуєнт здатний суттєво пригнічувати гіперактивацію вільнорадикальних процесів шляхом зменшення інтенсивності повільного спалаху в сироватці (в 1,3 – 1,8 рази) та тканині мозку (в 1,1-1,8 рази), а також площи під кривою БХЛ в обох біоубстратах щурів з ГЗП (в 1,4-2,3 та 1,2-1,8 рази в сироватці крові і тканині мозку, відповідно), що свідчить про високу антирадикальну активність сполуки.

Таблиця 1

Протигіпоксична активність найбільш активних похідних тіазолідину на моделі гіпоксії замкнутого простору (n=6-8)

Шифр сполуки | Тривалість життя,

хв | Час перебування тварин в замкнутому просторі (хв)

Виживання (%) | Кз | П,

%

45 | 55 | 65 | 75

Конт-роль | 48,17

±0,65 | 66,66 | 33,33 | 0 | 0

Les-15 | 72,50

±0,36

Р**<0,001 | 100,00

Р*>0,025 | 100,00

Р*<0,025 | 66,66

Р*<0,025 | 50,00

Р*<0,025 | 1,50 | 50,51

Les-2 | 55,66

±5,14

Р**>0,05 | 66,66

Р*>0,025 | 50,00

Р*>0,025 | 33,33

Р*>0,025 | 0 |

1,15 |

15,55

Les-16 | 58,83 ±2,38

Р**<0,05 | 100,00

Р*>0,025 | 66,66

Р*>0,025 | 16,66

Р*>0,025 | 0 | 1,22 | 22,13

Конт-роль | 47,38

±0,73 | 100,00 | 12,50 | 0 | 0 | - | -

Кверце-тин | 70,75

±0,45 | 100,00

Р*>0,025 | 100,00

Р*<0,025 | 66,66

Р*<0,025 | 50,00

Р*<0,025 | 1,49 | 49,33

Конт-роль | 48,17

±0,65 | 100,00 | 0 | 0 | 0

Les-1 | 53,80

±1,90

Р**<0,05 | 83,33

Р*>0,025 | 66,66

Р*>0,025 | 33,33

Р*>0,025 | 0 | 1,11 | 11,69

Les-3 | 51,00

±2,97

Р**>0,05 | 83,33

Р*>0,025 | 33,33

Р*>0,025 | 0 | 0 | 1,05 | 5,88

Конт-роль | 46,50

±2,02 | 66,66 | 0 | 0 | 0 | - | -

Les-9 | 58,83

±4,54

Р**<0,05 | 83,33

Р*>0,025 | 66,66

Р*<0,025 | 33,33

Р*>0,025 | 0 | 1,26 | 26,52

Les-13 | 53,33

±1,40

Р**<0,05 | 100,00

Р*>0,025 | 50,00

Р*<0,025 | 0 | 0 | 1,14 | 14,69

Примітки: 1. * - Р розраховано в порівнянні з контролем за допомгою

критерію Фішера;

2. ** - Р розраховано в порівнянні з контролем за допомогою

критерію t Стьюдента.

Для отримання більш повної інформації механізму реалізації антиоксидантних властивостей Les-15 в подальшому була виконана серія досліджень по визначенню впливу сполуки на рівень продуктів всіх етапів деградації фосфоліпідної складової клітинних мембран в досліджуваних біосубстратах тварин з ГЗП. Так, потенційний антигіпоксант при профілактичному застосуванні в умовах ГЗП запобігає накопиченню первинних продуктів ліпопереокиснення - ДК в корі головного мозку та сироватці крові, де рівень цього показника зменшується у різні терміни дослідження в середньому в 1,3 рази, а ТБК-реактантів - у 1,2-1,8 рази.

Враховуючи, що стан прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу організму підтримується за рахунок функціонування АОС, вивчали вплив Les-15 на рівень і активність основних її компонентів у щурів за умов гіпоксичного синдрому. Показано, що профілактичне застосування Les-15 істотно попереджає інактивацію основних компонентів ферментативної ланки АОС захисту організму – СОД (в 1,3-2,0 рази в сироватці крові та 1,2-1,7 рази в тканині мозку) і каталази (в середньому в 1,5 рази в обох біосубстратах тварин з ГЗП). Разом з тим, досліджуваний препарат позитивно впливає на функціонування неферментативної ланки АОС за рахунок підвищення рівня вільних сульфгідрильних груп як в сироватці крові в середньому на 26 %, так і корі головного мозку тварин, в середньому на 24 %. Крім того, реєструється вірогідне (Р<0,05) збільшення кон-центрації глутатіону відновленого у порівнянні з контрольною групою тварин в обох досліджуваних біосубстратах.

Доведено, що Les-15 підвищує забезпеченість організму ендогенними антиоксидантами, на що вказує значне збільшення перекисної резистентності еритроцитів у крові тварин з ГЗП. Виражені антиоксидантні властивості потенційного антигіпоксанта підтверджуються також результатами аналізу величини фактора антиоксидантного стану в обох біосубстратах у різні терміни дослідження (рис. 2).

Рис. 2. Вплив Les-15 на динаміку значень фактору антиоксидантного стану в сироватці крові (А) та корі головного мозку (Б) тварин с ГЗП.

Таким чином, отримані дані дозволяють розглядати похідне тіазолідину, що вивчається, як антигіпоксант з вираженою антиоксидантною активністю та антирадикальними властивостями.

При вивченні стану енергетичного гомеостазу при гострому киснедефіцитному стані, що вивчається, та його фармакокорекції Les-15 доведено, що ця сполука перерозподіляє пул аденілових нуклеотидів на користь синтезу АТФ, збільшуючи при цьому такі параметри енергетичного обміну, як ЕЗ, ЕП, ІФ та ТКД , з одночасним зменшенням Кпор (рис. 3).

Рис. 3. Вплив Les-15 на показники енергетичного обміну у щурів з ГЗП (n=6-8):

1 – * - вірогідно у порівнянні з інтактними тваринами (Р<0,001);

2 – ** - вірогідно у порівнянні з контролем (Р<0,001).

Поряд з цим на тлі використання досліджуваного потенційного антигіпок-санта знижується активність лактатдегідрогенази (в середньому на 15 %) та підвищується активність креатинкінази (в середньому на 45 %) у порівнянні з контролем, що таким чином сприяє індукції ефективних шляхів ресинтезу макроергів.

Доведено що Les-15 ефективно коригує процеси глікогенолізу та анаеробного гліколізу в умовах ГЗП, зберігаючи при цьому рівень глюкози, глікогену та пірувату з одночасним зниженням концентрації лактату в обох біосубстратах тварин в усі терміни дослідження. Більш того, на тлі використання досліджуваного потенційного антигіпоксанта в умовах гострої нестачі кисню у тварин вельми суттєво (1,9-3,0 рази в сироватці та 2,5-3,9 рази в тканині мозку) знижується величина ОВП системи лактат-піруват, що вказує на здатність сполуки запобігати виникненню метаболічного ацидозу.

При електронно-парамагнітному аналізі протигіпоксичної дії вивчаємого похідного тіазолідину встановлено, що його профілактичне засто-cування супроводжується попередженням зниження рівня залізосірчаних білків, семіхінонних радикалів, Мn2+-містких парамагнітних комплексів, а також інгібуванням нагромадження нітрозильних комплексів заліза. При цьому введення Les-15 запобігає деградації компонентів мікросомального ланцюга транспорту електронів (див. рис. 4).

Рис. 4. Влив Les-15 на динаміку рівня цитохрому Р-450 (А) та молібденвмістких парамагнітних центрів (В) в гепатоцитах тварин з ГЗП.

Примітка: див. рис. 3.

При визначенні параметрів зворотньої взаємодії потенційного антигіпоксанта з білками сироватки крові доведено, що Les-15 здатний підсилювати природні захисно-адаптаційні механізми організму, модифікуючи процес зворотнього зв’язування лігандів з білками сироватки крові на етапі біотранспорту. Встановлено, що в умовах ГЗП досліджувана сполука значно збільшує афінінет білків сироватки крові до ліганду при незмінній кількості фіксуючих центрів на молекулі білка, що можна розглядати як підсилення антигіпоксантом одного з природних механізмів детоксикації організму від ендо- та екзогенних речовин на етапі біотранспорту.

Таким чином, в основі протигіпоксичної дії Les-15 в умовах ГЗП лежить його здатність попереджати формування розповсюдженої мембранопатії шляхом ефективної регуляції прооксидантно-антиоксидантної рівноваги в силу реалізації вираженої антиоксидантної дії з антирадикальними властивостями. Разом з цим сполука стабілізує енергетичний гомеостаз та підсилює функціонування захисно-компенсаторних реакцій організму на етапі біотранспорту в умовах досліджуваної форми гіпоксії. Свою протекторну активність Les-15 також реалізує за рахунок корекції вмісту основних компонентів мітохондріального та мікросомального ланцюгів переносу електронів гепатоцитів, що стабілізує процеси тканинного дихання та детоксикації.

ВИСНОВКИ

В дисертаційній роботі наведено нове рішення наукової проблеми, що полягає в теоретичному та експериментальному обґрунтуванні доцільності та ефективності профілактичного застосування нового похідного тіазолідину (Les-15) у якості засобу для попередження порушень, що виникають в умовах гострої гі-поксичної гіпоксії на тлі гіперкапнії. Протигіпоксична активність Les-15 реалізується його здатністю коригувати основні ланки патогенезу гострого киснедефіцитного стану, що моделюється, за рахунок встановленого у роботі ряду особливостей фармакологічної дії.

1. Первинний фармакологічний скринінг та порівняльна оцінка ефективності потенційних засобів лікарської профілактики гіпоксичного синдрому серед нових похідних тіазолідину на моделях гіпоксії замкнутого простору та гострої гіпоксичної гіпоксії на тлі гіпертермії показали, що з 16 оригінальних сполук, що вивчалися, найбільш високою протигіпоксичною активністю володіє 5-фенілпропеніліден-роданін-3-пропіонат натрію (Les-15), який підвищує коефіцієнт протигіпоксичного захисту та відносний показник збільшення терміну життя (Кз=1,5, П=50,51%), на рівні референтного препарату – кверцетину, а також сприятливо впливає на перебіг клінічної картини гіпоксичного синдрому у щурів.

Токсикометричними дослідженнями встановлено, що Les-15 в умовах однократного внутрішньоочеревинного введення є малотоксичною (IV клас токсичності) та практично безпечною сполукою для теплокровних, включаючи людину, в плані виникнення та розвитку гострих отруєнь.

2. В серії фармакометричних досліджень з використанням методу двофакторного експерименту розроблено оптимальний режим дозування потенційного антигіпоксанту. Показано, що найбільш високу протигіпоксичну активність Les-15 реалізує при його одноразовому внутрішньоочеревинному введенні у вигляді 1 % водного розчину в дозі 82,5 мг/кг за 48 хвилин до початку моделювання гострого киснедефіцитного стану у поєднанні з гіперкапнією.

3. Експериментально доведена здатність вивчаємого похідного тіазолідину – Les-15 суттєво коригувати кінетику вільнорадикальних реакцій за рахунок зниження в усі терміни дослідження інтенсивності повільного спалаху в сироватці (в 1,3 – 1,8 рази) та тканині мозку (в 1,1-1,8 рази), а також зменшення площи під кривою біохемілюмінісценції в обох біосубстратах щурів з ГЗП (в 1,4-2,3 та 1,2-1,8 рази в сироватці крові і тканині мозку, відповідно), при підвищенні часу індукції повільного спалаху в сироватці (в 1,3-2,2 рази) та тканині мозку (в 1,5-1,6 рази), що свідчить про високу антирадикальну активність сполуки.

4. Профілактичне застосування похідного тіазолидину, що вивчається, проявляється виразною мембранопротекторною дією, що попереджує розвиток розповсюдженої мембранопатії, обумовленої порушенням прооксидантно-антиоксидантної рівноваги за рахунок зниження первинних (дієнові кон’югати) та кінцевих продуктів ліпідпереокислення (ТБК-реактанти) при одночасному збільшенні активності і концентрації компонентів ферментативної (супероксиддисмутаза і каталаза) та неферментативної (SH-группи і глутатіон відновлений) ланок антиоксидантної системи захисту організму в умовах ГЗП.

5. У тварин з гіпоксичним синдромом на тлі введеня Les-15 відмічається нормалізація процесів енергетичного гомеостазу за рахунок попередження дисбалансу в системі аденілових нуклеотидів (АТФ, АДФ, АМФ) з одночасним збільшенням основних показників енергообміну (ЭЗ на 17-36%, ЭП на 33-66%, ТДК на 50-73%, ІФ на 54-62%), а також зниження активності лактатдегідрогенази (у середньому на 15%) і підвищення при цьому активності креатинкінази (у середньому на 45%) в усі терміни дослідження.

6. Потенційний антигіпоксант ефективно регулює вуглеводний обмін в організмі тварин з гіпоксичним синдромом шляхом попередження зниження рівня глюкози та глікогену, а також накопичення молочної кислоти в системі лактат-піруват, що суттєво попереджує розвиток метаболічного ацидозу.

7. ЕПР-спектрометричні дослідження гепатоцитів щурів в динаміці з формою гіпоксії, що моделюється, на тлі введення Les-15 показали, що ця сполука попереджає зниження рівня окремих компонентів мітохондріального (залізосірчані білки, семіхінонні радикали, Мn2+- вмісткі парамагнітні центри), а також мікросомального (цитохром Р-450, парамагнітні центри, що належать Мо5+) електрон-транспортних ланцюгів з одночасною профілактикою утворення нітрозильних комплексів заліза в гепатоцитах тварин.

8. Протигіпоксична активність похідного тіазолідину, що вивчається, реалізується за рахунок його здатності модифікувати в динаміці комплексоутворюючі властивості білків сироватки крові щурів з ГЗП за рахунок збільшення константи асоціації зворотніх комплексів “білок-ліганд” (на 13 - 19%) при незмінній кількості зв’язуючих центрів на молекулах транспортних протеїнів.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Експериментальне вивчення взаємодії лікарських засобів із сироватковим альбуміном: Методичні рекомендації / В.Д. Лук’янчук, Д.С.Кравець, Д,М. Болгов, Є.В. Ткаченко, М.В. Оглобліна – К.: ДФЦ МОЗ України, 2004. – 31 с. (Дисертантом виконані обробка і аналіз даних літератури, оформлення рекомендацій та підготовка до друку).

2. Лук’янчук В.Д., Ткаченко Є.В., Кравець Д.С. Оптимізація режиму дозування похідного тіазолідину та математичний аналіз його протигіпоксичної дії на експериментальній моделі гіпоксії замкнутого простору // Ліки. – 2004. - № 1-2. - С. 77-82. (Дисертантом виконані експериментальні дослід-ження, обробка даних, підготовка матеріалів до друку).

3. Ткаченко Є.В., Лесик Р.Б., Лук’янчук В.Д. Порівняльна оцінка протигіпоксичної дії похідних тіазолідину // Фарм. журнал. - 2004. - № 5. – С. 88-93. (Дисертантом виконані експериментальні дослідження, обробка та інтерпретація даних, оформлення статті).

4. Ткаченко Е.В., Лесык Р.Б., Лукьянчук В.Д. Фармакологическая характеристика и клиническое применение производных тиазолидина (обзор литературы) // Укр. мед. альманах. – 2005. – № 1. - С. 214-218 (Дисертантом виконані пошук та аналіз даних літератури, оформлення статті).

5. Ткаченко Є.В. Роль производных 2,4-тиазолидина в профилактике нарушений окислительного гомеостаза организма при гипоксии замкнутого пространства // Укр. журн. екстремал. мед. ім. Г.О. Можаєва. – 2004. – Т. 5, № 1. – С. 77-81.

6. Ткаченко Є.В. Зв’язуюча здатність сироваткових білків при гострій гіпоксичній гіпоксії та її модифікація похідним тіазолідину // Укр. журн. екстремал. мед. ім. Г.О. Можаєва. – 2005. – Т. 6, № 1. – С. 90-93.

7. Ткаченко Е.В. Оценка антирадикальной эффективности производного 4-тиазолидиндиона при гипоксическом синдроме // Ліки. – 2005. – № 1-2. - С. 78-80.

8. Деклараційний патент на корисну модель 5977, Україна, МПК 7 А61К31/00. 5-фенілпропеніліден-роданін-3-пропіонат натрію, який виявляє протигіпоксичну активність / В.Д. Лук'янчук, Р.Б. Лесик, Б.С. Зіменковський, Є.В. Ткаченко, О.І. Вовк. - № 2004031521; Заявл. 02.03.2004; Опубл. 15.04.2005, Бюл. № 4. – 6 с. (Дисертантом виконаний розділ експериментальних досліджень та оформлення патенту).

9. Ткаченко Е.В. Оптимизация режима дозирования нового высокоэффективного антигипоксанта - производного тиазолидина // Матер. VII Міжнародної наук.-практ. конф. „Наука і освіта 2004”. – Дніпропетровськ, 2004. – С. 39-40.

10. Ткаченко Е.В. 2.4-тиазолидины – новый класс фармакологических веществ политропного типа действия // Матер. ІV Української міжнар. наук.-практ. конф. з між нар. участю з клін. фармакології. – Вінниця, 2004. – С. 145-146.

11. Ткаченко Е.В. Влияние 5-фенипропенилиден-2-тиоксо-4-оксоти-азо-лидин-3-пропионата натрия на процессы липидпереокисления при гипоксическом синдроме // Матер. I Між регіон. конф. мол. вчених „Актуальні питання біології та медицини”. – Луганськ, 2004. – С. 53-54.

12. Ткаченко Є.В. Токсикометричні параметри похідного тіазолідину – 5-фенілпропеніліден-роданін-3-пропіонату натрію // Матер. Міжнар. наук.-практ. конф. мол. вчених “Вчені майбутнього”. – Одеса, 2004. – С. 42.

13. Ткаченко Е.В. Модификация комплексообразующих свойств сывороточных белков 5-фенилпропенилиден-роданин-3-пропионатом натрия в условиях гипоксической гипоксии // Матер. V Міжнар. мед. конфер. студ. і мол. вчених “Молодь – медицині майбутнього”. – Дніпропетровськ, 2004. – С. 28-29.

14. Ткаченко Е.В. Биохемилюминисценция коры головного мозга крыс на фоне применения нового производного 2,4-тиазолидина в условиях острой гипоксии // Укр. мед. альманах (додаток). – 2004. – Т. 7, № 5. – С. 102.

15. Ткаченко Е.В. Влияние 5-фенилпропенилиден-роданин-3-пропионата натрия на биохемилюминисценцию сыворотки крови крыс с гипоксическим синдромом // Матер. наук.-практ. конф. з міжнар. участю “Від фундаментальних досліджень до прогресу в медицині”. – Харків, 2005. – С. 60.

16. Ткаченко Є.В. Фармакокінетика потенційного антигіпоксанта Les-15 на етапі біотранспорту в умовах гіпоксії замкнутого простору // Матер. І регіон. наук.-практ. конф. мол. вчених та студ. “Перспективи розвитку фармацевтичної науки та практики в Україні”. – Луганськ, 2005. – С. 28-30.

17. Ткаченко Є.В. Скринінг потенційних антигіпоксантів серед похідних 2,4-тіазолідиндіону // Матер. Ювілейного VIII з’їзду Всеукр. лікар. тов. – Івано-Франківськ, 2005. – С. 346.

18. Лук’янчук В.Д., Ткаченко Є.В. Фармакокорекція обміну аденілових нуклеотидів похідним 4-тіазолідиндіону при гіпоксичному синдромі // Матер. XLVIII підсумкової наук.-практ. конф. “Здобутки клінічної і експериментальної медицини”. – Тернопіль, 2005. – С. 192-194.

19. Лук’янчук В.Д., Ткаченко Є.В. Корекція енергодефіциту в умовах гіпоксичної гіпоксії // Матер. ІІ наук.-практ. конф. мол. вчених та спеціалістів “Актуальні проблеми фармакології та токсикології”. – Київ, 2005. – С. 35-36.

20. Tkachenko E.V.Experimental investigation pharmacological efficiency of potential antihypoxant – Les-15 in conditions of acute hypoxic hypoxia // Укр. мед. альманах (додаток). – 2006. – Т. 9, № 2. – С. 230.

21. Ткаченко Е.В. Антиоксидантный профиль производного тиазоладина – Les-15 в условиях гипоксии замкнутого пространства // Матер. ІІІ Міжнар. мед.-

фарм. конф. студ. і мол. вчених. – Чернівці, 2006. – С. 213.

22. Ткаченко Е.В. Использование метода математического планирования в разработке дозового режима потенциального антигипоксанта // Матер. I Міжнар. наук.-практ. конф. „Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів”. – Тернопіль, 2006. – С. 107.

23. Лук’янчук В.Д., Ткаченко Є.В. Протигіпоксична активність Les-15 за умов гострого гіпоксичного синдрому // Матер. ІІІ Нац. з’їзду фармакол. України. – Одеса, 2006. – С. 101.

24. Ткаченко Е.В. Состояние углеводного обмена у животных с острой гипоксической гипоксией и его фармакокоррекция Les-15 // Матер. Всеукр. наук.-практ. конф. „Актуальні пит.