МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

Тупол Лариса Дмитрівна

уДК 616-001.17-089.844:591.477:599.731.1-06:616.36-018]-092.9

Морфофункціональні зміни та регенераторні процеси в печінці при важких опіках в умовах ранньої некректомії і використання ліофілізованої ксеношкіри

14.03.09 – гістологія, цитологія, ембріологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Тернопільському державному медичному університеті

імені І.Я. Горбачевського МОЗ України.

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор

Волков Костянтин Степанович,

Тернопільський державний медичний університет ім. І.Я. Горбачевського МОЗ України, завідувач кафедри гістології, цитології та ембріології.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Стеченко Людмила Олександрівна, Національний медичний університет імені О.О.Богомольця, МОЗ України, професор кафедри гістології та ембріології;

доктор медичних наук, професор, Гунас Ігор Валерійович, Вінницький національний медичний університет імені М.І. Пирогова, МОЗ України, завідувач науково-дослідного центру.

Провідна установа:

Львівський державний медичний університет імені Данила Галицького, МОЗ України, кафедра гістології, цитології та ембріології.

Захист відбудеться 05 квітня 2007 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.06 при Національному медич-ному університеті імені О.О.Богомольця, МОЗ України (03057, м. Київ, проспект Перемоги, 34).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця МОЗ України за адресою: (03057, м. Київ, вул. Зоологічна, 1.

Автореферат розісланий 03” березня 2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук, професор О.М. Грабовий

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Однією з актуальних і недостатньо вивчених медико-біологічних проблем є патогенез і лікування опіків. В наш час термічні травми дуже розповсюджені, а опікова хвороба, що виникає при тяжких опіках, займає одне з перших місць серед інших захворювань та травматичних пошкоджень, відрізняється високою летальністю, складністю патології, тривалістю протікання та високим ступенем інвалідності (Парамонов Б.А. і співавт., 2000; Григор’єва Т.Г. і співавт., 2004; Козинец Г.П., 2005).

Поряд з втратою шкіри, при тяжких опіках наступають структурно-метаболічні порушення всіх органів та систем організму людини (Гембицкий Е.В., Клячкин Л.М., Кирилов М.М., 1994; Сморщок С.А., 1995; Пасечко Н.В., 1995; Андріїшин О.П. 2003; Brown E.J., 1996), в тому числі і печінки (Гунас І.В., 2002; Шаповал О. М., 2003). Проте в науковій літературі недостатньо даних про морфофункціональний стан найбільшої залози травної системи при термічних ураженнях. Тому проведення комплексних досліджень із застосуванням сучасних морфологічних методів дослідження є вкрай необхідним для встановлення перебігу деструктивних і регенераторних процесів у структурних компонентах печінки.

В практичному відношенні актуальним є лікування опечених. Згідно сучасних уявлень, однією з безпосередніх причин виникнення значних морфофункціональних змін органів і тканин при опіках є екзо- і ендогенна інтоксикація організму (Атясов Н.И., Перетягин С.П, 2001; Козинец Г.П., 2005; Herndon D., 2002). Тому перспективним при лікуванні тяжких опіків є застосування засобів, які б зменшили рівень токсинів в організмі. В останні роки в комбустіології при глибоких, великих за площею опіках широко використовується проведення ранньої некректомії уражених тканин, що зменшує поступлення токсинів в організм (Слесаренко С.В., Радзиховский А.П., Повстяной Н.Е., 2004; Таран В.М., 2006).

Важливим завданням є також відновлення шкіряного покриву і використання засобів, що сприяють покращенню перебігу регенераторних процесів у опіковій рані і в ураженому організмі. В останні роки при лікуванні опіків широко застосовують ліофілізовані ксенодермотрансплантати шкіри свині (Бігуняк В.В., 2003; Повстяний М.Ю. і співавт., 2004). Ефективність використання ліофілізованої ксеношкіри в комплексному лікуванні опечених хворих для тимчасового закриття ран показана в наукових роботах (Савчин В.С., 1998; Ковальчук О.Л., 2000, Мартинюк В.І., 2006). Використання ранньої некректомії з ксенодермопластикою попереджує прогресуючу інтоксикацію з вогнища ураження і розвиток інфекції в ранах, зменшує можливість подальшого розвитку опікової хвороби і сприяє до відновлення шкірного покриву в більш короткий термін (Бігуняк Т.В., 2003; Гуда Н.В., 2006).

Виготовлені за розробленою технологією у Тернопільському державному медичному університеті ім. І.Я. Горбачовського ліофілізовані ксенодермотрансплантати (Бігуняк В.В. і співавт., 1993), затверджені Державним департаментом МОЗ України (свідотство про державну реєстрацію № 1067/2003), що дозволяє їх застосування у медичній практиці.

Таким чином, актуальним і доцільним з теоретичної і практичної точки зору є проведення експериментальних комплексних досліджень з використанням гістологічних, гістохімічних, біохімічних, електронномікроскопічних, морфометричних методик для встановлення змін органів систем організму при тяжких опіках і проведенні ранньої некректомії уражених ділянок шкіри та закриття рани ліофілізованими ксенодермотрансплантатами.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є фрагментом комплексної науково дослідної роботи кафедри гістології, цитології та ембріології Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського „Зміни в ксенодермотрансплантатах при впливі на них фізичних чинників та ефективність їх використання у хворих з опіковою травмою” (планова НДР, номер держреєстрації 0105U004112). Автор є виконавцем даної НДР. Тема дисертаційної роботи затверджена вченою радою Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського (3 березня 2004 р., протокол № 8) та проблемною комісією МОЗ і АМН України „Морфологія людини” (4 червня 2004р., протокол № 60).

Мета дослідження. Встановити морфофункціональні зміни та перебіг регенераторних процесів в печінці при важких опіках і в умовах ранньої некректомії ураженої ділянки та закритті ранової поверхні ліофілізованою ксеношкірою.

Завдання дослідження.

1. Провести детальні гістологічні дослідження печінки інтактних тварин на різних рівнях її структурної організації, встановити морфометричні і гістохімічні показники її компонентів.

2. Встановити гістологічні, гістохімічні, ультраструктурні та морфометричні зміни структур печінки, токсичність плазми при важких опіках в динаміці досліду.

3. Встановити ступінь пошкодження структури печінки, перебіг регенераторних процесів, а також гістохімічні, морфометричні показники в умовах ранньої некректомії уражених тканин і закритті ліофілізованою ксеношкірою опікових ран.

Об’єкт дослідження: тяжка термічна травма, печінка.

Предмет дослідження: морфофункціональні зміни печінки при опіках та перебіг регенераторних процесів в умовах ранньої некректомії і використанні ксеношкіри.

Методи дослідження: гістологічні (світлооптичні та електронномікроскопічні), які дозволили встановити зміни на різних рівнях структурної організації печінки; морфометричні, які забезпечили отримання кількісних параметрів та об’єктивізацію отриманих даних; гістохімічні (сукцинатдегідрогеназа, лужна фосфатаза, глікоген), які показали активність ферментів та вміст трофічної сполуки; біохімічний, для вивчення токсичності плазми крові, статистичні які забезпечили обробку і показали достовірність отриманих цифрових даних.

Наукова новизна одержаних результатів. У результаті комплексних досліджень з використанням гістологічних, гістохімічних, морфометричних, електронномікроскопічного методів отримані нові данні і цілісне уявлення про морфофункціональні зміни печінки в динаміці розвитку опікової хвороби. Встановлено, що характер і ступінь морфофункціональних пошкоджень структурних компонентів органу, пригнічення регенерації на клітинному і внутришньоклітинному рівнях, зміни гістохімічних і морфометричних показників неоднакові у різні періоди експерименту і розвиваються на фоні зростання токсичності плазми крові.

Уперше встановлено позитивний вплив проведення ранньої некректомії і закриття ранової поверхні ліофілізованою ксеношкірою при важких експериментальних опіках на перебіг регенераторних процесів у структурах печінки, морфометричні і гістохімічні показники та суттєве зменшення токсичності плазми крові.

Практичне значення одержаних результатів. Результати комплексних досліджень розкривають характер і ступінь структурних змін, які розвиваються в печінці при експериментальній опіковій хворобі. Важливим з практичної точки зору є встановлення перебігу регенераторних процесів у структурах печінки при важких опіках і в умовах ранньої некректомії і закритті ранової поверхні ліофілізованою ксеношкірою. Отримані результати впроваджені в навчальний процес кафедр гістології, цитології та ембріології Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського, Івано-Франківського державного медичного університету, Кримського державного медичного університету імені С.І. Георгієвського, Вінницького національного медичного університету імені М.І. Пирогова, Запорізького державного медичного університету, Української медичної стоматологічної академії, Харківського державного медичного університету, кафедри анатомії людини Ужгородського національного університету, кафедри медичної біології Вінницького національного медичного університету імені М.І. Пирогова.

Особистий внесок здобувача. Автор здійснив розробку основних теоретичних і практичних положень роботи. Самостійно провів інформаційний пошук та аналіз джерел наукової літератури. Самостійно проведена постановка досліду забір матеріалу для світлової та електронної мікроскопії з наступною їх обробкою, заливкою та приготуванням препаратів. Здобувач самостійно описав гістологічні та гістохімічні препарати та електроннограми, провів морфометричні дослідження з наступною статистичною обробкою отриманих. Автор провів аналіз та узагальнення результатів дослідження, сформулював положення і висновки.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації оприлюднені на ІХ, Х „Міжнародному конгресі студентів і молодих учених” (2005, 2006 р.р.), ХLIХ підсумковій науковій конференції Тернопільського державного медичного університету „Здобутки клінічної та експериментальної медицини” (2006), науково-практичній конференції з міжнародною участю „Морфологічний стан тканин і органів у нормі та при моделюванні патологічних процесів” (Тернопіль 2006р.), ІІІ Всеукраїнській морфологічній науковій конференції „Карповські читання” (Дніпропетровськ 2006р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 наукових праць, які повністю відображають зміст проведеного дослідження, з них 4 – у фахових виданнях, 10 – у матеріалах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 150 сторінках і складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, розділу власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел. Робота містить 67 ілюстрацій (30 мікрофотографій, 37 електронних фотографій), 10 таблиць. Список використаних літературних джерел включає 271 найменувань (89-держав СНД, 182-держав далекого зарубіжжя).

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Експерименти проведено на 48 статевозрілих морських свинках, маса тіла яких становила 550-600 г. При проведенні дослідів дотримувались "Правил використання лабораторних тварин", 1984 (додаток 4). Опікову травму відтворювали згідно методики, розробленої на кафедрах біохімії та гістології Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я.Горбачевського Опік наносили під загальним ефірним наркозом водяною парою при температурі 96-97 0С на епільовану поверхню шкіри спини протягом 60 секунд. Розміри ділянки враження визначали за спеціальною таблицею (Казимирко Н.З., 1962), вона становила 18-20поверхні тіла тварин. Результати гістологічних досліджень шкіри засвідчили глибину її пошкодження, що відповідає опіку ІІІА-ІІІБ ступеня.

Піддослідні тварини були розділені на такі групи:–

інтактні морські свинки – 12 голів;–

тварини з термічною травмою – 18 голів;–

опечені тварини, яким проводилась рання некректомія закриття рани ліофілізованою ксеношкірою – 18 голів.

Тварини всіх груп утримувались на загальноприйнятому раціоні віварію Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я.Горбачевського. При щоденному огляді контролювали загальний стан, ступінь прояву місцевих змін в ділянці опікової рани, масу тіла і летальність морських свинок.

Об'єктом дослідження була печінка. Для дослідження морфофункціональних змін органу тварин декапітували за допомогою гільйотини в строки, що, згідно сучасних уявлень (Кузин М.И., Сологуб В.К.,1986), відповідають стадіям опікової хвороби: на 7, 14 і 21 добу (відповідно – стадії ранньої і пізньої токсемії та септикотоксемії).

Для гістологічних досліджень шматочки печінки фіксували в 10 % нейтральному розчині формаліну та фіксаторі Ліллі, з наступною заливкою в парафін. Отримані на санному мікротомі зрізи фарбували гематоксиліном-еозином (Меркулов Г.А., 1969, Саркісов Д.С., Перова Ю.Л.,1996).

Гістологічні препарати вивчали в світлооптичному мікроскопі і документували за допомогою мікроскопа ЛОМО Биолам И і системи виводу зображення гістологічних препаратів.

Для оцінки гістохімічних змін печінки визначали активність лужної фосфатази за методом Гоморі, сукцинатдегідрогенази за методом Нахласа, глікогену за методом Шабадаша (Пирс, Э. 1962; Волкова О.В., Елецкий Ю.К., 1982). Для аналізу результатів гістохімічних реакцій використовували напівкількісний метод візуальної оцінки інтенсивності забарвлення мікроструктур. (Чекарева Г.А., Мишнев О.Д., Карпова В.В., 1982).

Рівень ендогенної інтоксикації оцінювали шляхом вивчення неспецифічної токсичності плазми крові, яку визначали за вмістом молекул пептидів середньої маси, їх низько- та високомолекулярних фракцій шляхом прямої спектрофотометрії (Рябов Г.А. и соавт., 1985).

Забір матеріалу для електронномікроскопічних досліджень проводили згідно загальноприйнятої методики. Маленькі шматочки печінки фіксували в 2,5% розчині глютаральдегіду на фосфатному буфері Міллоніга з активною реакцією середовища рН 7,2-7,4. (Уіклі Б., 1975). Постфіксацію здійснювали 1% розчином чотириокису осмію на буфері Міллоніга протягом 60 хвилин, після чого проводили їх дегідратацію в спиртах і ацетоні та заливали в епоксидні смоли з аралдитом.

Ультратонкі зрізи, виготовлені на ультрамікротомах УМПТ-7 та ЛКБ-ІІІ, забарвлювали 1водним розчином уранілацетату, контрастували цитратом свинцю згідно методу Рейнольдса (Уіклі Б., 1975) та вивчали в електронному мікроскопі ЕМ-125К.

Вагоме місце серед морфологічних досліджень посідають морфометричні та кількісні методи дослідження, які дають можливість більш об'єктивно оцінювати морфофункціональний стан гістологічних структур в нормі, а також вивчити закономірності перебігу пристосувально-компенсаторних та патологічних процесів в них. Морфометричні дослідження проводили, використовуючи систему візуального аналізу гістологічних препаратів. Зображення на монітор комп’ютера виводили з мікроскопу ЛОМО Биолам И за допомогою відео-камери Vision CCD Camera і програми InterVideoWinDVR. Морфометричні дослідження проведені за допомогою програм UTHSCSA Image Tool, КААРА Image Base та Microsoft Exel на персональному комп’ютері. Дослідження проводили у визначені терміни досліду в препаратах забарвлених гематоксиліном-еозином. Оцінювали площу цитоплазми гепатоцитів, площу їх ядер та ядерно-цитоплазматичне співвідношення.

Статистична обробка цифрових даних, одержаних при розрахунках середнього цитохімічного коефіцієнта активності досліджуваних ферментів, рівня токсичності плазми крові проведена з використанням методів варіаційної статистики. Відмінності між групами середніх величин і їх помилками оцінювали за допомогою критерія Стюдента (Автандилов Г.Г., 1990).

Основні результати досліджень та їх обговорення. Гістологічні та електронномікроскопічні дослідження печінки інтактних морських свинок показали, що структурна організація органу має загальні закономірності будови її компонентів. Встановлена висока активність сукцинатдегідрогенази в гепатоцитах – середній цитохімічних коефіцієнт активності (СЦКА) дорівнює 4,77 ± 0,12, лужної фосфатази в стінках судин і жовчних капілярах (СЦКА – 4,49 ± 0,15), високий вміст глікогену в гепатоцитах (СЦКА – 4,81 ± 0,22). Це свідчить про активний перебіг метаболічних процесів в печінці в умовах норми, що необхідно для виконання її чисельних функцій (Нейко Е.М. і співавт., 2004).

Проведені комплексні дослідження печінки в динаміці досліду після тяжкої термічної травми встановили значні зміни всіх структурних компонентів органу. На 7 добу експерименту характерні зміни, що носять пристосувально-компенсаторний характер та ознаки початку деструктивних процесів. Гістологічно спостерігаються повнокрів’я центральних і підчасточкових вен, а також судин тріад. Навколо останніх наявна лейкоцитарна інфільтрація. У розширених просвітах синусоїдних капілярів чітко визначаються клітини Купфера. Подібні реакції печінки на пошкоджуючий термічний фактор встановлені у дослідженнях І.В. Гунаса [1998] та О.М. Шаповал [1999]. У цей термін досліду часточково-балкова будова органу збережена. Навколо центральних вен та проміжних зонах часточок переважають збільшені за площею гепатоцити з просвітленою цитоплазмою, ознаками гідропічної дистрофії та круглими еухроматиновими ядрами. Проте по периферії часточок спостерігається невелика кількість темних клітин.

Морфометричні дослідження печінки в стадії ранньої токсемії опікової хвороби показали, що площа світлих гепатоцитів зростає і дорівнює 226,9 9,9 мкмІ, що в 1,14 раз більше показника середньої площі гепатоцитів печінки інтактних тварин. Площа цитоплазми таких клітин дорівнює 185,28,1 мкмІ, а площа ядер гепатоцитів становить 41,71 1,82 мкмІ, що достовірно більше показників норми. Проте ядерно-цитоплазматичне співвідношення таких гепатоцитів в цей термін досліду недостовірно більше інтактного показника (табл. 1).

Гістохімічні дослідження встановили, що на 7 добу після опіку зменшується активність ферментів, СЦКА СДГ-ази складає 0,75, а лужної фосфатази – 0,68 від показників печінки інтактних тварин. Значно падає вміст глікогену у цитоплазмі гепатоцитів ( 0,43 від показника норми). Це свідчить про порушення метаболічних процесів в печінці, викликаних тяжкою термічною травмою.

Таблиця 1

Морфометричні показники компонентів гепатоцитів у різні терміни після опікової травми (m m) |

Норма | 7 доба | 14 доба | 21 доба

Sгпт мкмІ

світлі

темні | 198,911,3 |

226,99,9 |

261,113,0

164,28,4 |

272,413,6

172,78,6

Sц мкмІ світлі

темні | 162,49,3 |

185,28,1 |

228,611,4

139,77,0 |

239,812,0

147,37,4

Sя мкмІ

світлі

темні | 36,462,08 |

41,711,82 |

32,531,63

24,471,37 |

32,641,58

25,371,27

Sя/Sц

світлі

темні | 0,22 |

0,23 |

0,14

0,18 |

0,13

0,17

Р < 0,05 у всіх випадках у порівнянні з показниками інтактних тварин.

Гістохімічні дослідження встановили, що на 7 добу після опіку зменшується активність ферментів, СЦКА СДГ-ази складає 0,75, а лужної фосфатази – 0,68 від показників печінки інтактних тварин. Значно падає вміст глікогену у цитоплазмі гепатоцитів (0,43 від показника норми). Це свідчить про порушення метаболічних процесів в печінці, викликаних тяжкою термічною травмою.

Електронномікроскопічні дослідження печінки тварин у цей термін досліду показали, що для більшості гепатоцитів характерні порушення структурної організації ядер і цитоплазматичних структур. Електроннопрозора каріоплазма, щільні ядерця, мало рибосомальних гранул, нечіткі ядерні пори в поєднанні з розширенням, частковою фрагментацією гранулярної ендоплазматичної сітки (ГЕС), зменшенням рибосом і полісом свідчить про пригнічення білоксинтезуючої функції таких клітин. Гіпертрофія мітохондрій, зміна їх форми, просвітлення матриксу і часткова редукція крист є ультраструктурним відображенням порушення енергетичних процесів і підтверджують встановлені порушення активності СДГ-ази. Субмікроскопічні зміни комплексу Гольджі, агранулярної ендоплазматичної сітки, активація лізосом свідчить про реакцію гепатоцитів на підвищений вміст токсичних продуктів, що є характерним для стадії токсемії опікової хвороби. Так, токсичність плазми крові на 7 добу досліду збільшується в 1,79 рази в порівнянні з інтактними тваринами.

Встановлена реакція ультраструктури гепатоцитів на термічну травму є неспецифічною ї згідно літературних даних відбувається при дії різних факторів (ішемія, інтоксикація та інші) (Субботина Т.И., 1997; Шаповал. О.М., 1999; Маєвський О.Є., 2003).

Між біліарними ділянками гепатоцитів наявні розширені жовчні капіляри, що мають мало мікро ворсинок внаслідок їх редукції. Це відображає, згідно наукових даних (Song S.Y. et al., 1998) порушення екскреторної функції при внутрішньо часточковому холестазі.

Важливим при розвитку морфофункціональних змін часточок є ультраструктурний стан гемокапілярів. Розширення просвітів Діссе, часткова деструкція мікроворсинок, порушення структурної організації ендотеліоцитів показують, що вже на 7 добу внаслідок дії термічного фактора змінюється структура гістогематичного бар’єру. Встановлена активація клітин Купфера свідчить про реакцію макрофагічної системи на пошкоджуючий фактор.

Подальші гістологічні, морфометричні і гістохімічні дослідження встановили, що на 14 і особливо 21 добу після термічної травми в печінці розвиваються глибокі деструктивні зміни, встановлені значні порушення активності ферментів. Значні судинні розлади, різке повнокрів’я, вогнищеві крововиливи поєднуються з лейкоцитарною інфільтрацією навколо портальних трактів, що захоплює прилеглі ділянки паренхіми органу. Порушується часточкого-балкова будова печінки та кровонаповнення часточок. В окремих їх ділянках синусоїдні гемокапіляри розширені і кровонаповнені, в інших – просвіти синусоїдів незначні або спалися. У багатьох гепатоцитах розвиваються незворотні зміни ядер і цитоплазми (пікноз, каріорексис, вакуольна дистрофія).

Морфометричні дослідження печінки показали, що на 14 і 21 доби досліду в часточках наявна чітка диференціація відмінність параметрів світлих і темних клітин. В світлих гепатоцитах значно зростає площа цитоплазми (228,6 ± 11,4 мкмІ – 14 доба, 239,8 ± 12,0 мкмІ – 21 доба), що відповідно в 1,41 та в 1,48 рази більше показника середньої площі цитоплазми гепатоцитів печінки інтактних тварин. Площа ядер у такого типу гепатоцитів становить 32,53 ± 1,63 мкмІ (14 доба), 32,64 ± 1,58 мкмІ (21 доба), що відповідно складає 0,89 і 0,87 від показника площі гепатоцитів у нормі. Тому ядерно-цитоплазматичне співвідношення світлих гепатоцитів складає 0,14 (14 доба) та 0,13 (21 доба), що значно менше інтактного показника (табл. 1). В темних клітинах значно зменшується площа цитоплазми (139,7 ± 7,0 мкмІ – 14 доба, 147,3 ± 7,4 мкмІ – 21 доба), що відповідно складає 0,86 та 0,91 від показника середньої площі цитоплазми гепатоцитів печінки інтактних тварин. Площа ядер у такого типу гепатоцитів становить 24,47 ± 1,37 мкмІ (14 доба), 25,37 ± 1,27 мкмІ (21 доба), що відповідно складає 0,67 і 0,70 від показника площі ядер гепатоцитів у нормі. Тому ядерно-цитоплазматичне співвідношення світлих гепатоцитів складає 0,175 (14 доба) та 0,17 (21 доба), що значно менше інтактного показника (див. табл. 1).

Гістохімічно виявлено зменшення активності ферментів, лужної фосфатази та сукцинатдегідрогенази, а також трофічної сполуки глікогену, відповідно СЦКА на 14 добу складає 0,56, 0,45 та 0,24 від показника інтактних тварин, на 21 добу – 0,29, 0,28 та 0,015 від показника інтактних тварин.

Таким чином, на 14 і 21 доби, тобто в період сформованої опікової хвороби (стадії пізньої токсемії і септикотоксемії), виявлено значну деструкцію і пригнічення функціональної активності структурних компонентів печінки. В ці терміни посилюється роль ендогенної інтоксикації, про що свідчать отримані дані, про надлишкове нагромадження низько-, середньо- і високомолекулярних сполук пептидів, які вивчались у плазмі крові. Головним джерелом їх утворення є опікова рана (Заец Т.Л., Корякина И.К., 1986; Галайчук И.И., 1990). Токсичні речовини різного генезу всмоктуються в ділянці термічного пошкодження тканин шкіри і розносяться з током крові і лімфи по всьому організмі (Федоров Н.А., 1985). При цьому вони спричиняють дестабілізуючу і пошкоджуючу дію на плазматичні і внутрішньоклітинні мембрани органів (Сморщок С.А., 1990; Пасєчко Н.В., 1995; Андріїшин О.П., 2003).

Субмікроскопічні дослідження показали, що на 14 і 21 доби наявні глибокі зміни ядер і цитоплазми як у світлих так і темних гепатоцитах. У світлих клітинах наявні як круглі так і ядра з інвагінованою каріолемою, які містять невеликі ядерця. Цитоплазма має світлу гіалоплазму і невисоку щільність органел. Мітохондрії гіпертрофовані зі світлим матриксом, наявна редукція крист. Гранулярна ендоплазматична сітка втрачає упорядковане розташування, значно потовщені просвіти канальців, відмічається пошкодженням мембран, що їх формують, рибосом помітно менше. У складі диктіосом КГ мало пухирців і вакуолей, цистерни різко розширені та фрагментовані; первинні і вторинні лізосоми нерівномірно розсіяні по цитоплазмі, кількість їх збільшена. Жовчні капіляри мають значно розширені просвіти, небагато мікроворсинок, які часто фрагментуються. Трофічні включення глікогену у цитоплазмі світлих гепатоцитів спостерігаються у невеликій кількості.

В осміофільній гіалоплазмі темних гепатоцитів встановлена глибока деструкція ядер і органел. Уосміофільній каріоплазмі зустрічаються невеликі електроннощільні ядерця, каріолема нерівна з невеликими інвагінаціями та нечіткими контурами. В цитоплазмі органели розташовані щільно. Мітохондрії деформовані, матрикс помірної щільності з поодинокими короткими кристами. Канальці гранулярної ендоплазматичної сітки значно розширені, фрагментовані, неправильної форми, порушується цілісність їхмембран, рибосом мало. Цистерни КГ різко розширені, збільшуються вакуолі і мало пухирців. Наявні аутофагосоми та мієліноподібні структури, частина лізосом втрачає притаманну осміофільність. Грудок глікогену мало або вони зовсім відсутні. Просвіт жовчних капілярів як значно розширений, так і дуже вузький, мікроворсинки короткі, фрагментовані, наявні ділянки плазмолеми без мікроворсинок. Гемокапіляри розширені, змінені компоненти стінок. Простори Діссе нерівномірні, кількість мікроворсинок зменшена. У просвітах кровоносних капілярів часто спостерігаються макрофаги насичені осміофільним матеріалом.У перисинусоїдальних просторах відмічаються пучки колагенових фібрил. Їх утворення пов’язують з клітинами Іто (Стеченко Л.О., 2003; Sakamoto M. et al., 1993, Bachem M.G. et al., 1990).

Наступним етапом досліджень було встановлення морфофункціонального стану печінки в умовах ранньої некректомії уражених опіком ділянок шкіри і закриття рани ліофілізованою ксеношкірою.

Гістологічні, гістохімічні, електронномікроскопічні та морфометричні дослідження печінки тварин, рани яких після термічної травми були вкриті ліофілізованою ксеношкірою показали, що на 7 добу експерименту структурна перебудова органа подібна до нелікованих тварин, проте ступінь деструктивних змін менша, відмічаються ознаки регенераторних процесів. Структурні зміни проявляються повнокрів’ям судинної системи, помірною лейкоцитарною інфільтрацією в ділянці тріад. В часточках спостерігається багато світлих гепатоцитів. Встановлене зростання площі цитоплазми та площі ядер таких клітин в порівнянні з показником середньої площі цитоплазми та площі ядер гепатоцитів печінки інтактних тварин. Ядерно-цитоплазматичне співвідношення клітин печінки в цей термін досліду незначно більше інтактного показника (табл.2).

Гістохімічно в печінці виявлено зменшення активності ферментів але не так значно, як у нелікованих тварин. СЦКА лужної фосфатази та сукцинатдегідрогенази, а також трофічної сполуки глікогену відповідно становить 0,78, 0,78 та 0,54 від показника інтактних тварин, проте зростає відповідно у 1,04; 1,13 і 1,27 рази порівняно з нелікованими тваринами.

Субмікроскопічно вже на 7 добу в частині гепатоцитів наявні ознаки репаративної регенерації. В цитоплазмі клітин крім гіпертрофованих мітохондрій, є невеликі органели, що свідчить про їх гіперплазію. Гранулярна ендоплазматична сітка не має чіткої орієнтації у розташуванні, частково фрагментована і вогнищево потовщена, але не так значно, як у печінці нелікованих тварин, рибосом помітно менше; канальці агранулярної ендоплазматичної сітки потовщені, мають вакуолеподібний вигляд; цистерни КГ розширені, частково фрагментовані, біля них небагато пухирців; лізосоми розташовані групами, частіше у біліарних полюсах цитоплазми гепатоцитів. Округлі еухроматинові ядра гепатоцитів містять електроннощільні ядерця. Простори Діссе нерівномірні є розширені ділянки і щільне прилягання ендотеліоцитів до васкулярних полюсів гепатоцитів. У просвітах кровоносних капілярів часто спостерігались активні макрофаги. Просвіт жовчних капілярів розширений, а мікроворсинки частково фрагментовані.

На 14 та 21 доби після опіку в умовах використання ліофілізованої ксеношкіри морфофункціональні порушення печінки помітно зменшуються, відмічається активний перебіг регенераторних процесів, особливо на внутрішньоклітинному рівні. Наявна тенденція до відновлення судинної системи залози і паренхіматозних клітин. Порівняно чітко спостерігається часточково-балкове розміщення гепатоцитів. Багато двоядерних або з одним великим ядром клітин, що являється морфологічним показником поліплодії і свідчить про активацію структурно-метаболічних процесів (Гунас І.В., 1998). Разом з тим у цей термін в печінці ще зустрічаються часточки зі зміненими гепатоцитами і порушенням судин.

Морфометричні дослідження печінки після опіку в умовах використання ліофілізованої ксеношкіри показали, що на 14 добу в світлих гепатоцитах значно зростає площа цитоплазми (243,1 ± 17,15 мкмІ), що в 1,5 рази більше показника середньої площі цитоплазми гепатоцитів печінки інтактних тварин. Проте на 21 добу досліду відмічається відносна нормалізація площі цитоплазми, вонаі становить (177,5 ± 7,9 мкмІ), що в 1,09 рази більше показника площі гепатоцитів у нормі. Площа ядер у такого типу гепатоцитів становить 48,52 ± 2,43 мкмІ (14 доба), 39,40 ± 1,74 мкмІ (21 доба), що відповідно 1,33 і 1,08 більше показника площі ядер гепатоцитів печінки інтактних тварин. Тому ядерно-цитоплазматичне співвідношення світлих гепатоцитів складає 0,20 (14доба) та 0,22 (21 доба), що практично ідентичне з нормою (див. табл. 2).

В темних клітинах площа цитоплазми (152,1 ± 8,6 мкмІ – 14 доба, 172,1 ± 7,9 мкмІ – 21 доба), що відповідно складає 0,94 та 1,06 від показника середньої площі цитоплазми гепатоцитів печінки інтактних тварин. Площа ядер у такого типу гепатоцитів становить 30,26 ± 1,71 мкмІ (14 доба), 32,72 ± 1,7 мкмІ (21 доба), що відповідно складає 0,83 і 0,90 від показника площі ядер гепатоцитів у нормі. Тому ядерно-цитоплазматичне співвідношення світлих гепатоцитів складає 0,20 (14 доба) та 0,19 (21 доба), що наближається до норми (див. табл. 2).

Таблиця 2

Морфометричні показники компонентів гепатоцитів у різні терміни після опікової травми в умовах використання ксеношкіри (m m) |

Норма | 7 доба | 14 доба | 21 доба

Sгпт мкмІ світлі

темні | 198,911,3 |

227,911,59 |

291,619,6

182,410,3 |

216,99,6

204,88,2*

Sц мкмІ світлі

темні | 162,49,3 |

186,9±9,8 |

243,1±17,1

152,1±8,6 |

177,5±7,9

172,1±6,4*

Sя мкмІ

світлі

темні | 36,462,08 |

40,97±1,75 |

48,52±2,43

30,26±1,71 |

39,40±1,74*

32,72±1,58

Sя/Sц

світлі

темні | 0,22 |

0,22* |

0,20

0,20 |

0,22*

0,19

* Р >0,05у порівнянні з показниками інтактних тварин.

Р < 0,05 у всіх інших випадках у порівнянні з показниками інтактних тварин.

Гістохімічно встановлено збільшення активності і відносна нормалізація лужної фосфатази, сукцинатдегідрогенази, а також трофічної сполуки глікогену, відповідно на 14 добу їх показники становлять 0,93; 0,87 та 0,65, та на 21 добу – 0,96; 0,94 та 0,89 від показника інтактних тварин.

Субмікроскопічно також спостерігаються двоядерні гепатоцити або клітини з крупними ядрами, у каріоплазмі яких переважає еухроматин, ядерця великі, значна кількість рибосомальних гранул у каріоплазмі та біля чисельних ядерних пор. Мітохондрії округло-овальні або подовгасті, кристи чіткі, матрикс помірної електронної щільності. Канальця ГЕС мають переважно упорядковане розташування, на її мембранах багато рибосом і вільних полісом у цитоплазмі. Невеликі канальця агранулярної ендоплазматичної сітки добре структуровані, цистерни комплексу Гольджі розташовані упорядковано, по цитоплазмі розсіяні лізосоми. Жовчні капіляри мають помірні просвіти, багато мікроворсинок. У складі часточок спостерігаються невеликі за площею „молоді” гепатоцити, що утворились внаслідок поділу. Вони мають округло-овальні ядра з ексцентрично розташованими ядерцями. У часточках є також темні гепатоцити, цитоплазма яких насичена добре структурованими і помірно зміненими органелами, що відрізняє їх від темних деструктивно змінених клітин, що наявні в печінці нелакованих тварин.

Простори Діссе неширокі, ендотеліоцити з овальними еухроматиновими ядрами і добре структурованими цитоплазматичними ділянками. Клітини Купфера мають помірну кількість лізосом і фагосом та добре виражені цитоплазматичні вирости.

Таким чином застосування ліофілізованих ксенодермотрансплантатів для закриття опікових ран після проведення ранньої некректомії уражених ділянок шкіри помітно зменшує вміст токсичних продуктів у плазмі крові, зменшує ступінь структурних змін печінки, активізує регенераторні процеси і позитивно впливає на морфофункціональний стан органа у всі терміни досліду порівняно з опеченими нелікованими тваринами.

Висновки

У дисертації наведено теоретичне узагальнення та нове вирішення наукової задачі, яка встановлює закономірності структурних змін печінки при тяжкій термічній травмі та після проведення ранньої некректомії пошкодженої шкіри і закриття рани ліофілізованими ксенодермотрансплантантами в експерименті.

1. Структурна організація печінки інтактних морських свинок на світлооптичному та електронномікроскопічному рівнях має загальні закономірності будови її компонентів. Морфометричні показники гепатоцитів відрізняються від інших тварин і людей. Гістохімічно встановлена висока активність сукцинатдегідрогенази, лужної фосфатази та вмісту глікогену.

2. Тяжка опікова травма викликає значні структурні зміни всіх компонентів печінки. Характер і ступінь морфофункціональних пошкоджень органу, зміни гістохімічних і морфометричних показників неоднакові у різні періоди експерименту і розвиваються на фоні зростання токсичності плазми крові.

3. На 7 добу після термічної травми (стадія ранньої токсемії) морфофункціональні зміни печінки характеризуються пристосувально-компенсаторними процесами, пригніченням регенерації на клітинному і субклітинному рівнях, початком розвитку деструктивних змін. Гістохімічно достовірно знижується активність СДГ-ази і складає 0,68, лужної фосфатази- 0,75, вміст глікогену - 0,43 в порівнянні з показниками інтактних тварин.

4. На 14 добу (стадія пізньої токсемії) і особливо на 21 добу (стадія септикотоксемії) розвиваються глибокі деструктивні зміни всіх компонентів печінки. Розширення і кровонаповнення судин, крововиливи, деструкція стінки гемокапілярів, активація макрофагів поєднуються з лейкоцитарною інфільтрацією, порушенням часточково-балкової будови органу. У часточках наявні „світлі” гепатоцити середня площа яких зростає в 1,32 рази (14 доба) і в 1,37 рази (21 доба), а ядерно-цитоплазматичні співвідношення відповідно складають 0,14; 0,13. Зростає кількість темних гепатоцитів, у яких встановлена глибока деструкція ядер і цитоплазматичних структур. Їх середня площа зменшується у 0,83 рази (14 доба) і у 0,87 рази ( 21 доба), а ядерно-цитоплазматичні співвідношення дорівнюють відповідно 0,18 і 0,17.

5. Використання ліофілізованих ксенодермотрансплантатів для закриття опікових ран після проведення ранньої некректомії помітно знижує вміст токсичних продуктів у плазмі крові (пептидів середніх молекул, їх високо- і низькомолекулярних фракцій), зменшує ступінь судинних розладів і деструктивних змін компонентів печінки, активізує регенераторні процеси і позитивно впливає на морфофункціональний стан органа у всі терміни досліду порівняно з опеченими нелікованими тваринами.

6. Застосування ліофілізованої ксеношкіри вже на 7 добу досліду покращує структурну організацію синусоїдних гемокапілярів, у часточках печінки менше пошкоджуються плазматичні, ядерні та органоїдні мембрани гепатоцитів, активізуються регенераторні процеси та покращуються гістохімічні показники.

7. На 14 добу і особливо на 21 добу досліду в умовах використання ліофілізованої ксеношкіри активний перебіг регенераторних процесів призводить до покращення морфофункціонального стану і відносної нормалізації всіх структурних компонентів печінки. Зменшуються судинні розлади і лейкоцитарна інфільтрація, в складі часточок багато двоядерних гепатоцитів, покращуються морфометричні показники та ядерно-цитоплазматичні співвідношення. У 1,65 рази (14 доба) і у 3,31 рази вище активність лужної фосфатази, у 1,93 рази (14 доба) і у 3,38 (21 доба) вище активність сукцинатдегідрогенази порівняно з опеченими нелікованими тваринами. Поступово зростає вміст глікогену.

8. Одержані результати свідчать про позитивний вплив застосування ліофілізованих ксенодермотрансплантатів при тяжких опіках на структурну організацію печінки експериментальних тварин, гістохімічні та морфометричні показники, що дозволяє рекомендувати їх в використання в комбустіології при лікуванні важкоопечених.

Перелік робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Л.Д. Лучанко (Тупол), К.С. Волков, О.П.Андріїшин // Гістологічні та гістохімічні зміни печінки при експериментальній термічній травмі// Таврический медико-биологический вестник. – Сімферополь, 2004. – Т.7, № 4 – С. 80-81 (здобувач брала участь в постановці експерименту, заборі матеріалу, виготовленні гістологічних препаратів, описанні матеріалу і формулюванні висновків).

2. Л.Д. Лучанко (Тупол), К.С.Волков // Гістологічні та гістохімічні зміни печінки при експериментальній термічній травмі умовах застосування ліофілізованих ксенодермотрансплантатів// Biomedical and Biosocial Anthropology. – Вінниця, 2005. – № 5, – С. 86 – 89 (здобувач брала участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, проведенні і описанні гістохімічних досліджень, формулюванні узагальнень).

3. К.С. Волков, Л.Д. Лучанко (Тупол), М.В. Самборський // Перебіг пристосувальнo-компенсаторних та регенераторних процесів у деяких органах травної системи при термічній травмі в умовах використання ліофілізованих ксенодермотрансплантатів// Вісник наукових досліджень. – Тернопіль, 2006. – С. 78-79 (здобувач брала участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, узагальнення та формулювання висновків).

4. Л.Д. Тупол, К.С. Волков // Структурні і морфометричні зміни печінки при опіках та в умовах застосування ліофілізованої ксеношкіри// Biomedical and Biosocial Anthropology. – Вінниця, 2006. – № 7, – С. 48 – 50 (здобувач брала участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, проведенні морфометричних досліджень, формулювання узагальнень).

5. Л. Д. Лучанко (Тупол), Л.П. Ломага, Р.К Волков // Структурні зміни гемокапілярів печінки при опіках в експерименті// Матеріали 8 міжнародного медичного конгресу студентів і молодих учених. – Тернопіль 2004 (здобувач брала участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, узагальнення та формулювання висновків).

6. К.С. Волков, О.П. Андріїшин, Л.В. Якубишина, Л.Д. Лучанко (Тупол), А.В. Довбуш, О.І. Грималюк, А.О. Котик, О.Я. Чорнописький // Структурні зміни деяких внутрішніх органів при тяжкій опіковій травмі після проведення ранньої некректомії і використання ліофілізованих ксенодермотрансплантатів// Матеріали ХLVII підсумкової науково-практичної конференції. – Тернопіль, 2004 (здобувач брала участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, узагальнення та формулювання висновків).

7. К.С.Волков, Л.Д Лучанко (Тупол) // Структурні зміни печінки при тяжких експериментальних опіках в стадії токсемії// Матеріали конференції „Гістологія на сучасному етапі розвитку науки”. – Тернопіль, 2004 (здобувач брала участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, узагальнення та формулювання висновків).

8. Волков К.С., Лучанко (Тупол) Л.Д., Довбуш А.В. // Репаративні процеси при термічній травмі в умовах ранньої некректомії та застосуванні ліофілізованої ксеношкіри// Матеріали наукової конференції, присвяченої 100-річчю з дня народження М.І. Зазибіна „Гістологія та ембріологія периферійної нервової системи”. – Київ, 2004. – С. 74-75 (здобувач брала участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, узагальнення та формулювання висновків).

9. К.С. Волков, О.П. Андріішин, О.Я. Чорнописький, Л.Д. Лучанко (Тупол), Т.В. Бігуняк, А.В. Довбуш // Структурний стан деяких органів при термічній травмі в умовах ранньої некректомії і застосування ксеношкіри// Матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю, присвяченої 200-річчю з дня заснування Харківського державного медичного університету. – Харків, 2005. С. 12 (здобувач брала участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, узагальнення та формулювання висновків).

10. Лучанко (Тупол) Лариса, Тупол Наталія, Радійовська Ірина // Структурні зміни судин печінки при термічних опіках в експерименті// Матеріали ІХ міжнародного конгресу студентів і молодих учених. – Тернопіль, 2005 (здобувач брала участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, узагальнення та формулювання висновків).

11. Лучанко (Тупол) Лариса, Крутиголова Юлія, Карпенюк Сергій, Бурак Ольга // Структурні зміни гепатоцитів при експериментальних опіках в стадії септикотоксемії// Матеріали Х міжнародного конгресу студентів і молодих учених. – Тернопіль, 2006 (здобувач брала участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, узагальнення та формулювання висновків).

12. К.С. Волков, Л.Д. Лучанко (Тупол), З.М. Небесна, А.В. Довбуш // Ультраструктура гепатоцитів та епітеліоцитів канальців нефрона при застосуванні ксеношкіри при тяжких опіках в експерименті// Матеріали третьої всеукраїнської морфологічної наукової конференції „Карповські читання” – Дніпропетровськ, 2006. – С.21 (здобувач брала участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, узагальнення та формулювання висновків).

13. К.С. Волков, Л.Д. Лучанко (Тупол), З.М. Небесна, М.В.Самборський, Л.В. Якубишина, О.П. Андріїшин, А.В. Довбуш // Субмікроскопічний стан деяких внутрішніх органів при експериментальній термічній травмі в умовах застосування ліофілізованої ксеношкіри// Матеріали ХLIХ підсумкової науково-практичної конференції. – Тернопіль, 2006. – С. 146-148 (здобувач брала участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, узагальнення та формулювання висновків).

14. Тупол Л.Д., Волков К.С. // Впровадження в навчальний процес результатів якісного і кількісного аналізу структур печінки в нормі і експерименті // Матеріали науково-практичної конференції „Впровадження досягнень морфологічної науки в навчальний процес та його значення для європейської інтеграції медичної освіти”. – Тернопіль 2006 (здобувач брала участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, узагальнення та формулювання висновків).

Анотація

Тупол Л.Д. Морфофункціональні зміни та регенераторні процеси в печінці при важких опіках в умовах ранньої некректомії і використання ліофілізованої ксеношкіри. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.09 – гістологія, цитологія, ембріологія. – Національний медичний університет імені О.О.