НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ імені О.В. ПАЛЛАДІНА

УТКО Наталія Олександрівна

УДК 575.1:612.23:612.67

ВМІСТ мРНК, АКТИВНІСТЬ КЛЮЧОВИХ ФЕРМЕНТІВ АНТИОКСИДАНТНОЇ СИСТЕМИ ТА ШВИДКІСТЬ ГАЗООБМІНУ ПРИ СТАРІННІ ДРОЗОФІЛ, МИШЕЙ І ЩУРІВ

03.00.04 – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті геронтології АМН України

Науковий керівник– доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Мурадян Хачік Казарович,

Інститут геронтології АМН України,

провідний науковий співробітник лабораторії фізіології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Великий Микола Миколайович,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

провідний науковий співробітник

відділу біохімії коферментів;

доктор медичних наук, професор

Мхітарян Лаура Сократівна,

Національний науковий центр “

Інститут кардіології ім. акад. М.Д. Стражеска”

АМН України, керівник відділу біохімії.

Провідна установа – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії.

Захист відбудеться “ 19 ”_лютого__2007 року о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (01601, Київ, вул. Леонтовича 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна (Київ, вул. Леонтовича 9).

Автореферат розісланий “18 ”_січня_____2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. З'ясування взаємин між активними формами кисню (АФК) і антиоксидантною (АО) системою було й залишається однією з пріоритетних проблем біохімії старіння. Таке твердження підкріплюється експонентним ростом кількості робіт із цієї тематики протягом піввіку, що пройшов з моменту публікації вільно-радикальної гіпотези старіння (Harman D., 1956). В останні роки намітилися кардинальні зміни в розумінні значення АФК у старінні та супутній патології. Поряд з уявленнями про виключно негативну роль АФК все частіше з'являються роботи, автори яких припускають, що АФК виконують ряд важливих і, можливо, незамінних функцій, наприклад, у редокс-залежних регуляторних системах. Стає очевидним, що для нормального функціонування клітини важливі не стільки рівень АФК, скільки баланс між інтенсивністю окислювальних процесів і можливостями АО системи. Тільки контрольовані та збалансовані зміни генерації й гасіння АФК можуть забезпечити успішне функціонування, тоді як порушення рівноваги у бік надлишку або зменшення АФК можуть стати причиною прискореного старіння й загибелі клітини (White A. A. et al., 1976, Mittal C. K., Murad F., 1977, Finkel T., Holbrook N. J. 2000, Hool L., 2006, Ardanaz N., Pagano P., 2006, Linnane A., Eastwood H., 2006). Між тим переважна більшість робіт, присвячених віковим змінам АО захисту, зводиться до порівняння середніх величин активності АО ферментів, тоді як не менш важлива, але складна проблема взаємовідносин АФК і АО системи і, зокрема, питання про узгодженість експресії генів та активності ключових АО ферментів з поглинанням кисню залишається практично невивченою. Все це робить актуальним з'ясування зв'язків між АФК та АО системою. Для цього особливу увагу слід звертати на наступні обставини: 1) важливо знати не тільки середні величини, але й параметри розподілів досліджуваних показників; 2) корелятивні методи, незважаючи на їх відомі обмеження, є основними при з'ясуванні природи зв'язків між змінними величинами; 3) для диференціації видоспецифічних і загальнобіологічних закономірностей варто мати дані про декілька біологічних видів, що перебувають на різних рівнях еволюційного розвитку; 4) рішення таких завдань передбачає використання як адекватних біохімічних і аналітичних засобів, так і великих вибірок тварин різного віку. Важливість проблеми та практична відсутність досліджень такого плану обґрунтовує актуальність теми роботи.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи – з'ясувати особливості розподілу, корелятивної та кластерної структури зв'язків між показниками, що характеризують вміст мРНК та активність ключових АО ферментів і швидкість газообміну у тварин різного віку.

Завдання досліджень полягали в наступному:

1. Вивчити вікові зміни супероксиддисмутазної (СОД) та каталазної активності, а також швидкості продукції вуглекислого газу (Vсо2) у молодих і старих імаго Drosophila melanogaster.

2. Порівняти показники, що характеризують ключові ферментативні активності АО системи й швидкість газообміну (Vо2 і Vсо2) у молодих і старих щурів.

3. Дослідити вікові зміни параметрів, що характеризують вміст мРНК та активність ключових АО ферментів і рівень газообміну у мишей.

4. Проаналізувати вікові й видові відмінності типу розподілів, ступеня корелятивності та кластерної структури зв'язків між вивченими показниками за допомогою первинної та багатомірної статистики.

Об'єктом досліджень були вміст мРНК та активність ключових АО ферментів, а також рівень газообміну старіючих популяцій лабораторних комах і ссавців.

Предмет досліджень включав комплекс біохімічних і фізіологічних показників, зокрема, Vо2 і Vсо2, вміст мРНК та активність шести ферментів АО системи: СОД, каталази, глутатіонпероксидази (ГП), глутатіонредуктази (ГР), глутатіонтрансферази (ГТ) і ксантиноксидази (КО).

Методи досліджень. У роботі застосовані сучасні методи для визначення вмісту мРНК СОД, каталази, ГП, ГР, ГТ печінки за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції (ПЛР) і активності СОД, каталази, ГП, ГР, ГТ і КО спектрофотометричними методами. Були використані вибірки, обсяг яких дозволяє проводити не лише первинну статистичну обробку, але й застосувати аналітичні засоби більш інформативної багатомірної статистики.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлено, що: 1) розподіли багатьох з вивчених показників, зокрема, швидкості газообміну у мишей і щурів, а також вмісту мРНК СОД і каталази в популяціях молодих мишей відрізняються більшим діапазоном, ніж в популяціях старих тварин; 2) субпопуляція молодих дрозофіл з високими значеннями активності СОД і каталази характеризується низькою корелятивністю зазначених показників; 3) позитивна кореляція між вмістом мРНК СОД, каталази й ГП у печінці мишей при старінні не тільки не знижується, але й росте; 4) між активністю СОД, каталази, ГП і ГР печінки молодих і старих щурів існує позитивна кореляція; 5) ферментна пара каталаза – ГП, через яку регулюється рівень перекису водню, може бути однією із центральних ланок вікових змін АО системи ссавців; 6) результати тривимірного нелінійного та кластерного аналізу свідчать про те, що в старості відбуваються зміни структури зв'язків в АО системі, зокрема, ослаблення співвідношень між ГП і каталазою.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані дані мають значення для розуміння взаємозв'язків між АО показниками й газообміном при старінні тварин. Вони можуть бути корисними для виявлення потенційних “короткожителів” і пошуку засобів цілеспрямованої модуляції АО системи. Результати досліджень можуть бути використані в лабораторній і клінічній практиці, для розробки тестів, що характеризують стан АО захисту при старінні й патологічних порушеннях.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася в рамках бюджетних тем лабораторії фізіології Інституту геронтології АМН України № .65.99 "Вплив інгібітору апоптозу (ауринтрикарбонової кислоти) на вікову динаміку смертності й комплекс фізіологічних, імунологічних і молекулярно-біологічних показників у лабораторних комах (дрозофіли) і ссавців (миші)" (№ держреєстрації 0199U000648) та теми № 01.01.03 "Вікові особливості кореляційних зв'язків між інтенсивністю газообміну, температурою тіла й активністю ключових ферментів антиоксидантної системи у лабораторних комах (дрозофіли) і ссавців (миші, щури)" (№ держреєстрації 0103U000652).

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведені патентно-інформаційний пошук, аналіз літературних джерел, опрацьовані моделі, особисто виконані експериментальна частина досліджень і статистичний аналіз отриманих даних. Визначення мети й завдань досліджень, а також аналіз отриманих результатів проведені за участю наукового керівника. При визначенні мРНК та активності АО ферментів, а також при розробці ідей і підготовці публікацій брали участь співробітники лабораторії фізіології (акад. Фролькіс В.В., чл.-кор. АМН України Безруков В.В., Тимченко А.М.), лабораторії патологічної фізіології й імунології (акад. Бутенко Г.М., Пішель І.М., Устименко А.М., Ситнік Л.Н., Родніченко А.Є.) і лабораторії молекулярної генетики (Літошенко О.Я., Мозжухіна Т.Г.) Інституту геронтології АМН України, а також Фрайфельд В.Е. з Університету Бен-Гуріона у Негеві, Бер-Шева (Ізраїль).

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені та обговорені на IV Європейському конгресі геронтологів і геріатрів (Берлін, Німеччина, 1999); II, III і IV Українських конференціях молодих вчених, присвячених пам'яті академіка В.В. Фролькіса (Київ, 2001, 2002, 2003); XVI з'їзді фізіологів України (Вінниця, 2002); IV конгресі Федерації ізраїльських суспільств з експериментальної біології (Ейлат, Ізраїль, 2005); IX Європейському симпозіумі "Life Sciences Research in Space" і XXVI міжнародній зустрічі по гравітаційній фізіології (Кельн, Німеччина, 2005); XVIII конгресі Міжнародної геронтологічної асоціації (Ріо-де-Жанейро, Бразилія, 2005); IV Національному конгресі геронтологів і геріатрів України (Київ, 2005), а також на засіданнях лабораторії фізіології й експериментального сектора Інституту геронтології АМН України. Доповіді, підготовлені на основі дисертаційної роботи, одержали перші премії на конференціях, присвячених пам'яті академіка В.В. Фролькіса в 2002 й 2003 роках (Київ). В 2005 році отримано грант Європейського космічного агенції (ESA) для участі у спільній конференції ESA і Міжнародного суспільства з гравітаційної фізіології (Кельн, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 25 наукових праць, з яких 10 журнальних статей у закордонних та вітчизняних виданнях, рекомендованих ВАК України, і 15 тез доповідей на наукових конгресах і симпозіумах.

Структура й обсяг дисертації. Матеріали дисертації викладені на 235 сторінках машинописного тексту. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, розділів "Матеріали й методи досліджень", трьох розділів власних досліджень, заключного обговорення одержаних результатів, висновків, й списку використаних джерел. Список цитованої літератури містить 258 джерел, з яких 23 опубліковані в Україні й країнах СНД і 235 - у міжнародних журналах. Дисертація ілюстрована 73 рисунками й 53 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Проведений аналіз сучасних уявлень про функціональне значення АФК і АО, їх вікові та видові відмінності, а також можливі модифікації з метою подовження життя. На підставі проведеного аналізу запропонована схема ланцюга генерації та гасіння АФК, що стала основою для проведення досліджень (рис. 1).

Рис. 1. Схема основного ланцюга генерації та гасіння активних форм кисню. СОД – супероксиддисмутаза, ГП – глутатіонпероксидаза, ГР – глутатіон-редуктаза, GSSG – окислений глутатіон, GSH – відновлений глутатіон, .

Матеріали й методи досліджень. Досліди було поставлено на самцях 114 молодих (5 – 15 діб) і 74 старих (35 – 55 діб) імаго дрозофіл, 109 молодих (6 – 8 міс.) і 62 старих (24 – 26 міс.) щурів лінії Wistar та 62 молодих (3 – 5 міс.) і 58 старих (23 – 25 міс.) мишей лінії C57Bl/6. У всіх піддослідних тварин індивідуально визначали швидкість газообміну й активність АО ферментів. У мишей крім цих показників оцінювалася експресія СОД, каталази, ГП, ГР і ГТ за допомогою ПЛР методу. Декапітацію щурів та мишей здійснювали під наркозом при перебуванні тварин протягом 30 – 60 сек. в атмосфері 100 % СО2, відповідно до рекомендацій Американської медичної асоціації ветеринарів. Активність АО ферментів визначали за результатами 2 – 3 паралельних вимірів у гомогенатах дрозофіл та у супернатантах гомогенатів печінки мишей та щурів (10 000g протягом 20 хв.). Це не тільки підвищувало точність, але й дозволяло оцінити мінливість ознаки, зумовлену технічними причинами (технічну варіабельність) і порівняти її з біологічної варіабельністю. Активність АО ферментів вимірювали спектрофотометричними методами. СОД визначали ксантин-ксантиноксидазним методом, що базується на оцінці ступеня інгібування відновлення цитохрома с. Активність СОД виражали в умовних одиницях з розрахунку на 1 мг білка за 1 хв (од..хв-1мг-1) (McCord J.M., Fridovich I., 1969). Активність каталази визначали з кінетики руйнування Н2О2 і виражали в мкмоль утилізованої Н2О2 на 1 мг білка за 1 хв (мкмоль.хв-1мг-1), згідно Aebi H. (1984). Активність ГП вимірювали по зменшенню NАDРН у сполученій глутатіонредуктазній реакції й розраховували як нмоль окисленого NАDРН на 1 мг білка за 1 хв (нмоль.хв-1мг-1) (Paglia D.E., Valentine W.N., 1967). Активність ГР вимірювали по окислюванню NАDРН і виражали в нмоль окисленого NАDРН на 1 мг білка за 1 хв (нмоль.хв-1мг-1), згідно Roos D. (1979). Визначення активності ГТ було засновано на вимірюванні швидкості ферментативного утворення глутатіон-2,4-динітробензолу в реакції відновленого глутатіону з 1-хлор-2,4-динітробензолом (нмоль.хв-1мг-1) (Habig W.H., 1974). Метод визначення активності КО базується на здатності ферменту генерувати супероксид у реакції перетворення ксантину в сечову кислоту (нмоль.хв-1мг-1 ) (Waud W.R., 1976). Вміст білка визначали за методикою Лоурі (Lowry O.H. et al., 1951). Вміст мРНК оцінювали напівкількісним РТ-ПЛР методом. Як контроль для кожної ПЛР реакції використовували експресію гліцеральдегідфосфат-3-дегідрогенази (gapdh). Загальну мРНК виділяли із тканини за допомогою набору реактивів "Рибо-Золь-А" фірми "Ампли-Сенс" (Росія). Для додаткового очищення РНК від ДНК проби обробляли ДНКазою (Sigma, США) протягом 30 хв при 37 єС. Зворотньо-транскриптазну реакцію проводили при 37 єС протягом 30 хв. із додаванням специфічних праймерів та ревертази M-MLV (набір "Реверта", "Ампли-Сенс" Росія). Рівень мРНК визначали за допомогою набору реактивів та праймерів фірми "Ампли-Сенс" (Росія). Ампліфіковану ДНК відділяли від домішок электрофорезом в 1,8 % агарозному гелі з етідіумом бромідом і фотографували під УФ-світлом. Світність проб визначали за допомогою програми Biotest Color, а вміст мРНК визначали відношенням світності проби й відповідного gapdh контролю. З огляду на відомі методологічні й методичні труднощі прямого визначення супероксиду, а також певну пропорційність між рівнем обмінних процесів і генерацією АФК, у даній роботі Vсo2 і Vo2 були використані як непрямі показники, що характеризують швидкості утворення супероксиду й окисні процеси у цілому (Barja G. et al., 1994; Amerand A., et al., 2005; Heise K., et al., 2003; Ramel A. et al., 2004; Gonzalez-Flecha B., Demple B., 2003). Vo2 і Vco2 визначали за допомогою газоаналізатора (Gerb Minhardt, Нідерланди). Для мишей і щурів Vо2 і Vсо2 виражали в мл•хв-1•г-1. Визначення Vсо2 (мкл·хв-1·мг-1) у кожної дрозофіли, як нам відомо, проводилося вперше.

Для всіх досліджених змінних тип розподілів був проаналізований за допомогою середньої величини, стандартного відхилення, коефіцієнтів асиметрії, ексцесу й варіації, а також тестів нормальності Колмогорова-Смирнова, Лілліфорса, 2 і Шапіро-Уілка. Використання різних тестів пояснюється тим, що кожен з них має свої переваги й недоліки, зокрема, потужність, чутливість, “сліпі” крапки та ін. Значимість кореляцій оцінювали за допомогою параметричного коефіцієнта Пірсона й непараметричного рангового коефіцієнта Спірмана, а також часткового та множинного коефіцієнтів кореляції. Ієрархічний кластерний аналіз (tree-clustering) проводили за допомогою “евклідових” відстаней. Всі розрахунки й підготовка графічного матеріалу проводилися за допомогою пакета програм Statistica-6.

Результати досліджень та їх обговорення

Дані про активність досліджених АО ферментів, а також Vсo2 і Vo2 у молодих і старих самців дрозофіл, мишей і щурів наведені в табл.1.

Таблиця 1

Середні величини й стандартні похибки (СВ±S.E.) активності СОД, каталази, ГП, ГР, ГТ, КО, Vo2 і Vco2 , їх коефіцієнти варіації (КВ±S.E.), асиметрії (КА±S.E.) і ексцесу (КЕ±S.E.) у молодих і старих самців D. melanogaster, щурів і мишей

Показники та

од. вимірів | Вид | Вік | СВ±S.E. | КВ±S.E. | КА±S.E. | КЕ±S.E.

СОД,

од.хв-1.мг-1 | дрозофіли | молоді | 58,4±2,0 | 37,3±2,8 | 0,75±0,2 | -0,01±0,5

старі | 56,8±1,9 | 28,9±2,6* | 0,07±0,2* | -0,35±0,6

щури | молоді | 37,3±0,6 | 14,4±1,2 | -0,11±0,3 | -0,40±0,5

старі | 37,8±1,0 | 16,6±2,2 | -0,19±0,4 | -0,48±0,8

миші | молоді | 38,2±0,3 | 7,5±0,7 | 0,40±0,3 | 0,19±0,6

старі | 37,2±0,3 | 9,1±0,9 | -0,49±0,3 | 1,84±0,6*

Каталаза,

мкмоль.хв-1.мг-1 | дрозофіли | молоді | 98,0±3,2 | 35,1±2,6 | 0,62±0,2 | -0,18±0,5

старі | 71,5±3,9* | 46,8±4,6* | 1,09±0,3 | 1,00±0,6

щури | молоді | 287,1±12 | 37,7±3,4 | 0,53±0,3 | 0,08±0,5

старі | 307,3±16 | 28,8±3,3 | 0,85±0,4 | 0,04±0,8

миші | молоді | 88,8±2,2 | 19,3±1,8 | 0,43±0,3 | 0,30±0,6

старі | 97,3±2,9* | 22,5±2,2 | 0,34±0,3 | -0,10±0,6

ГП,

нмоль.хв-1мг-1 | щури | молоді | 57,1±2,1 | 33,6±3,0 | 0,03±0,3 | 0,09±0,5

старі | 57,4±2,4 | 23,3±3,1* | -0,30±0,4 | -0,74±0,8

миші | молоді | 22,4±1,5 | 51,1±5,7 | 0,92±0,30 | 0,12±0,6

старі | 29,3±1,3* | 33,3±3,4* | 0,31±0,3* | 0,03±0,6

ГР,

нмоль.хв-1мг-1 | щури | молоді | 43,5±0,8 | 16,5±1,3 | -0,21±0,3 | -0,65±0,5

старі | 47,1±1,4* | 16,3±2,1 | 0,43±0,4 | 0,35±0,8

миші | молоді | 35,7±0,5 | 10,8±1,0 | -0,01±0,3 | -0,25±0,6

старі | 38,5±0,5* | 9,7±0,9 | -0,02±0,3 | 0,67±0,6

ГТ,

нмоль.хв-1мг-1 | миші | молоді | 507±18 | 28,7±2,8 | 0,57±0,3 | 0,57±0,6

старі | 532±21 | 29,5±3,0 | -0,47±0,3 | -0,02±0,6

КО,

нмоль.хв-1мг-1 | миші | молоді | 13,2±0,2 | 12,8±1,2 | 0,98±0,3 | 1,04±0,6

старі | 12,6±0,3 | 14,9±1,4 | 0,88±0,3 | 1,33±0,6

Vco2,

мл•хв-1•г-1 | дрозофіли | молоді | 0,51±0,02 | 33,5±2,5 | 1,36±0,2 | 2,15±0,5

старі | 0,52±0,02 | 34,6±3,2 | 1,21±0,3 | 1,76±0,5

щури | молоді | 29,6±1,4 | 25,7±3,5 | 0,09±0,4 | -0,58±0,8

старі | 23,8±1,1* | 25,2±3,5 | 1,06±0,4* | 1,34±0,8

миші | молоді | 68,6±1,4 | 15,4±1,5 | 0,19±0,3 | 0,66±0,6

старі | 58,8±1,5* | 19,3±1,9 | 0,52±0,3 | -0,23±0,6

Vo2,

мл•хв-1•г-1 | щури | молоді | 34,9±2,0 | 25,7±3,5 | -0,18±0,4 | -0,49±0,8

старі | 28,5±1,0* | 25,2±3,5 | 1,56±0,4* | 2,85±0,8*

миші | молоді | 80,4±1,5 | 14,7±1,4 | 0,22±0,3 | 0,23±0,6

старі | 68,4±1,7* | 18,2±1,8 | 0,25±0,3 | -0,67±0,7

Примітка: * – P<0,05, порівняно з молодими.

Привертає до себе увагу те, що при старінні швидкість газообміну знижується у мишей і щурів, тоді як активність ключових АО ферментів у більшості випадків не змінюється або зростає. З усіх досліджених ферментів тільки у дрозофіл активність каталази значимо знижувалася, а коефіцієнт варіації збільшувався при старінні, що підкреслює особливе значення цього ферменту в старіючих імаго. Це може мати певне відношення до того факту, що у нижче стоячих в таксономічній ієрархії видів, зокрема дрозофіл, каталаза є єдиним ферментом, безпосередньо відповідальним за регуляцію рівня важливого для АО системи продукту – перекису водню. Очевидно, не випадково у вище стоячих в таксономічній ієрархії видів, у тому числі ссавців, за цю функцію відповідальні вже два ферменти – каталаза та ГП. При старінні мінливість ознаки, судячи з коефіцієнту варіації, вірогідно знижується для СОД у дрозофіл і ГП у мишей і щурів, що може бути наслідком відповідних вікових змін або раннього вимирання субпопуляції особин з високими значеннями активності цих ферментів. Доречно також відзначити, що технічна варіація була значно нижче від загальної варіації, тобто відмінності активності та варіації АО ферментів були в основному зумовлені біологічними причинами.

З порівняння гістограм частотного розподілу тварин за активністю СОД у дрозофіл видно, що на тлі порівняно стабільної середньої величини (табл.. 1) старіння призводить до звуження діапазону в основному внаслідок зменшення частки особин з активністю СОД вище 80 – 90 од..хв-1.мг-1. Наприклад, частка особин з активністю СОД вище 90 од..хв-1.мг-1 становить 10,4 % у молодих і тільки 1,4 % у старих імаго (P<0,01) (рис. 2).

Рис. 2. Гістограми частот і лінії нормального розподілу активності СОД у молодих і старих імаго D. melanogaster

Подібне вікове зниження кількості особин з високими значеннями активності, що могло привести, наприклад, до зниження коефіцієнту асиметрії, було характерно й для активності інших АО ферментів (табл. 1).

Для успішного функціонування клітин, мабуть, важливі не стільки середні величини, скільки співвідношення між інтенсивністю окисних процесів і активністю АО ферментів, що вивчалося нами за допомогою парних, часткових і множинних коефіцієнтів кореляції. Згідно з отриманими даними, у дрозофіл у старості знижується не тільки активність каталази, але і її відповідність окисним процесам. Так, у молодих і старих імаго між активністю каталази і Vсо2 існувала значима позитивна залежність у молодих (P<0,01), але не у старих дрозофіл (P>0,1). Доречно підкреслити, що між активністю СОД і Vсо2 була виявлена позитивна кореляція в обох вікових групах (P<0,05).

Вікове порушення погодженості стає ще очевидніше при оцінці кореляції між активністю СОД і каталази. Ймовірно, при ефективному АО захисті повинна зберігатись певна пропорційність між активністю СОД і каталази, тому що вони беруть участь у регуляції двох послідовних етапів одного й того ж ланцюга перетворень (рис. 1). У молодих дрозофіл така узгодженість проявляється у вигляді високо значимого позитивного коефіцієнта кореляції (P<0,00000002). У старих же імаго кореляція між СОД і каталазою відсутня (рис 3).

Рис. 3. Діаграми розсіювання, лінії регресії та рангові коефіцієнти кореляції (R) між активністю каталази та СОД у гомогенатах молодих та старих імаго D. melanogaster

Така “неузгодженість” СОД і каталази у старих тварин може свідчити про порушення координованості роботи АО системи, підвищення ризику розвитку окисного стресу й прискореного старіння. При більш детальному аналізі з'ясовується, що навіть високо достовірний коефіцієнт кореляції не означає, що популяція однорідна за ознакою корелятивності СОД і каталази. Так, у групі молодих дрозофіл з активністю СОД вище 80 – 90 од.хв-1.мг-1 позитивна залежність між активністю СОД і каталази не тільки відсутня, але, судячи з нахилу лінії, має тенденцію змінюватись на негативну (рис. 3). Не виключено, що високий ризик вимирання таких особин є однією з причин змін гістограм СОД і каталази у популяції старих імаго (рис. 2).

Суттєвим недоліком кореляційного аналізу вважається те, що кореляція між парою показників може бути обумовлена не лише прямим функціональним зв’язком, але й може реалізуватися через “побічні” канали. Наприклад, кореляція між активністю каталази та Vсо2 може бути підсумком дії регуляторних факторів, що діють як безпосередньо між каталазою та Vсо2, так і факторів, що реалізуються через СОД, тобто через шлях Vсо2 – СОД – каталаза. Як відомо, парціальні коефіцієнти кореляції дозволяють виключити внесок опосередкованих каналів, тим самим, дозволяючи оцінити кореляцію прямого зв’язку. Порівняльна оцінка парних та парціальних коефіцієнтів кореляції для Vсо2, СОД та каталази у молодих і старих дрозофіл наведена на рис. 4.

Рис. 4. Коефіцієнти кореляції Пірсона (r) та парціальні (rp) коефіцієнти кореляції між Vсо2, СОД та каталазою (КАТ) у молодих і старих D. melanogaster

Звертає на себе увагу те, що кореляція між активністю СОД та каталази молодих дрозофіл, а також між СОД і Vсо2 у молодих та старих імаго залишається достовірною при її оцінці за допомогою як парного, так і парціального коефіцієнтів кореляції, тоді як кореляція між Vсо2 та каталазою у молодих стає недостовірною при її оцінці за допомогою парціального коефіцієнта, що підкреслює слабкі зв’язки каталази з іншими АО показниками.

Відомо, що між складністю досліджуваних явищ та методом аналізу отриманих даних повинна існувати певна відповідність. Очевидно, використані вище двомірні лінійні методи не зовсім адекватні складності біологічних процесів, котрі, як правило, йдуть з одночасною участю трьох та більше перемінних, взаємовідносини між якими до того ж можуть бути далекими від лінійності. З цієї точки зору тривимірні нелінійні методи уявляються більш адекватними складності досліджуваних явищ. На рис. 5 наведені тривимірні поверхні, що описують залежність між каталазою, СОД та VCO2. З даних, отриманих на молодих імаго випливає, що відповідна поверхня майже паралельна осі VCO2, отже, активність каталази мало залежить від змін швидкості газообміну. В той же час залежність між каталазою та СОД характеризується майже лінійним ростом активності каталази в області малих та середніх значень СОД (приблизно до 80 – 90 од•хв-1•мг-1), після чого наступне підвищення СОД не приводить до зростання активності каталази (рис. 5).

Рис. 5. Тривимірні залежності активності каталази (мкмоль·-1хв·мг-1) від активності СОД (од.•хв-1•мг-1) і VCO2 (мкл·-1хв·мг-1) у молодих та старих Drosophila melanogaster

З аналогічної тривимірної залежності для старих дрозофіл видно, що активність каталази мало залежить від СОД при малих значеннях VCO2. Тільки у особин з високим рівнем продукції вуглекислого газу спостерігається певна позитивна залежність між каталазою та СОД (рис. 5).

Ссавці, зокрема, миші й щури, уявляються більше “благополучними” в АО захисті, ніж дрозофіли. У них не було виявлено вікового зниження середніх величин і кореляції між більшістю АО ферментів. Наприклад, у старих щурів на тлі істотного зниження Vсо2 і Vо2 середні значення активності СОД, каталази й ГП не змінювалися, а активність ГР збільшувалася (табл. 1).

Аналіз розподілів показує, що у щурів, як і у дрозофіл, для ферментів, безпосередньо відповідальних за регуляцію рівня перекису водню (каталази та ГП), характерно вікове звуження їх діапазону через зниження частки особин з високими значеннями активності АО ферментів (рис. 6).

Рис. 6. Гістограми частот і лінії нормального розподілу активності ГП у печінці молодих і старих щурів

Особливе значення взаємин між каталазою і ГП підкреслюється ще й тим, що вони були єдиною парою ферментів, кореляція між якими знижувалася при старінні (рис.7).

Рис. 7. Діаграми розсіювання, лінії регресії та рангові коефіцієнти кореляції (R) між активністю каталази і ГП у печінці молодих і старих щурів

У мишей середні значення Vсо2 і Vо2, як і у щурів, вірогідно знижувалися в старості. Однак середні величини активності СОД, ГТ і КО зберігалися незмінними, а активності каталази, ГП і ГР росли в старості (P<0.01) (Табл. 1).

Визначення вмісту мРНК СОД, каталази, ГП і ГТ у печінки молодих і старих мишей за допомогою ПЛР аналізу показало, що достовірне (P<0.0001) вікове зниження експресії було характерно лише для мРНК каталази (Табл.2).

Таблиця 2

Середні величини і їхні стандартні похибки (СВ±S.E.), а також коефіцієнти варіації (КВ±S.E.), асиметрії (КА±S.E.) і ексцесу (КЕ±S.E.) для вмісту мРНК супероксиддисмутази (sod1), каталази (cat), глутатіонпероксидази (gpx1), глутатіонредуктази (gr) і глутатіонтрансферази (gt) у печінці молодих і старих самців мишей лінії C57Bl/6

Ген | Вік | n | СВ±S.E. | КВ±S.E. | КА±S.E. | КЕ±S.E.

sod1 | молоді | 56 | 0,74±0,02 | 22,2±2,2 | 0,57±0,32 | 0,13±0,63

старі | 49 | 0,70±0,02 | 19,7±2,1 | -0,02±0,34 | -0,89±0,67

cat | молоді | 54 | 0,70±0,03 | 27,2±2,8 | 0,39±0,33 | 0,15±0,64

старі | 49 | 0,52±0,02* | 32,9±3,7 | 0,10±0,34 | -0,09±0,67

gpx1 | молоді | 32 | 0,56±0,04 | 43,9±6,5 | 1,96±0,41 | 5,83±0,81

старі | 23 | 0,53±0,06 | 56,6±10,7 | 0,79±0,48 | -0,26±0,94*

gr | молоді | 11 | 1,20±0,12 | 32,4±7,6 | 1,05±0,66 | 1,56±1,28

старі | 7 | 0,94±0,13 | 37,8±11,5 | 1,81±0,79 | 3,40±1,59

gt | молоді | 10 | 0,36±0,03 | 29,0±7,0 | -0,38±0,69 | 1,28±1,33

старі | 11 | 0,42±0,07 | 52,8±14,0 | 2,38±0,66* | 7,12±1,28*

Примітка: * – P<0,05, порівняно з молодими

У цілому низькі значення коефіцієнтів асиметрії й ексцесу, а також аналіз типу розподілів за допомогою тестів Колмогорова-Смірнова, Лілліфорса, 2 і Шапіро-Уілка свідчать про те, що для молодих і старих мишей характерним є нормальний розподіл мРНК. Однак при цьому, як і для активності АО ферментів у дрозофіл і щурів, у мишей спостерігається вікове зниження частки особин з високими значеннями експресії, що наочно випливає, наприклад, зі спільного розподілу за вмістом мРНК СОД і каталази. На відміну від молодих у старих мишей ділянки, що відповідають тваринам з більшим значенням мРНК, “порожні”, тобто такі особини відсутні в популяції старих (рис. 8).

Рис. 8. Розподіли вмісту мРНК СОД і каталази у печінці молодих і старих мишей лінії С57Bl/6

Проведені дослідження з вивчення взаємозв'язку між мРНК СОД, каталази й ГП свідчать про те, що між експресією генів відповідних АО ферментів існує позитивна кореляція. Причому виразність такого корелятивного зв'язку, як це, наприклад, вплива з аналізу мРНК СОД і каталази, з віком не слабшає (рис. 9).

Рис. 9. Діаграми розсіювання, лінії регресії й рангові коефіцієнти кореляції (R) між вмістом мРНК СОД і каталази у печінці молодих і старих мишей лінії С57Bl/6

Завдяки тому, що в тих самих тварин одночасно визначалися вміст мРНК та активність АО ферментів, як нам відомо, уперше вдалося оцінити вікові зміни кореляції між вмістом мРНК та активністю відповідних ферментів. Між мРНК СОД та її активністю не було виявлено значимої кореляції у тварин обох вікових груп (рис. 10).

Рис. 10. Діаграми розсіювання, лінії регресії та рангові коефіцієнти кореляції (R) між вмістом мРНК та активністю СОД у печінці молодих і старих мишей лінії С57Bl/6.

Аналогічна залежність виявлена також для каталази, тоді як для вмісту мРНК ГП та її активності була знайдена негативна кореляція у молодих і позитивна кореляція у старих мишей (рис. 11).

Рис. 11. Діаграми розсіювання, лінії регресії і рангові коефіцієнти кореляції (R) між вмістом мРНК та активністю ГП у печінці молодих і старих мишей лінії С57Bl/6

Посилення узгодженості між експресією та активністю ГП у печінці старих мишей, можливо, свідчить про особливу роль цього ферменту в регуляції АО процесів в старості. Таке припущення в цілому підтверджується результатами кластерного аналізу (рис. 12).

Рис. 12. Кластерне дерево активності СОД (од.•хв-1•мг-1), каталази (КАТ) (мкмоль•хв-1•мг-1), ГП (нмоль•хв-1•мг-1) і вмісту мРНК СОД (sod1), каталази (cat) і ГП (gpx1) у печінці молодих і старих мишей лінії С57Bl/6

У молодих мишей найменша “евклидова” відстань була виявлена для мРНК СОД, каталази й ГП, які й утворюють перший кластер. Це уявляється закономірним, тому що синтез мРНК насамперед регулюється загальними факторами ядерної локалізації. Другий кластер утворений активністю СОД і ГП, тоді як активність каталази займає проміжне положення між обома кластерами. У старих мишей близькі “евклідові” відстані між мРНК СОД, каталази й ГП зберігаються. Однак відстані між цим кластером і активністю ферментів змінюються. У старих мишей найбільш близьким сусідом до кластера мРНК є не каталаза, а ГП. Не виключено, що така зміна “посередника” між ядерними й цитоплазматичними системами регуляції є наслідком вікового переносу акценту регуляції з каталази на ГП, і це пояснює, чому вікові зміни ГП нерідко відрізнялися від таких для каталази. Можливо, що взаємозв’язки між ферментативною парою каталаза – ГП є критичними при цілеспрямованій модуляції АО системи та розробки відповідних профілактичних засобів.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі вивчені вікові зміни вмісту мРНК та активності супероксиддисмутази (СОД), каталази, глутатіонпероксидази (ГП), глутатіонредуктази (ГР), глутатіонтрансферази і ксантиноксидази, а також швидкості газообміну (Vо2, Vсо2) у комах (дрозофіл) та ссавців (мишей, щурів), що дозволяє зробити наступні висновки:

1. При старінні дрозофіл, мишей та щурів у цілому спостерігалося зменшення кількості особин з високим рівнем газообміну, вмісту мРНК та активності антиоксидантних (АО) ферментів.

2. Активність каталази піддається найбільш значним змінам при старінні дрозофіл: у старих комах знижується її середня величина, росте коефіцієнт варіації й відсутня кореляція із активністю СОД і рівнем Vсо2.

3. У 89,6 % молодих дрозофіл виявлена висока позитивна кореляція між активністю супероксиддисмутази (СОД) і каталази (P<0,00000002). У решти 10,4 % особин, які характеризується найбільш високою активністю цих ферментів, така кореляція відсутня.

4. У щурів на фоні вікового зниження Vо2 і Vсо2 не спостерігається зменшення середніх величин активності СОД, каталази, ГП та ГР.

5. Між активністю більшості вивчених АО ферментів печінки щурів виявлена позитивна кореляція, яка у цілому зберігається в старості. Тільки кореляція між активністю каталази й ГП стає незначною у старих тварин.

6. В печінці молодих та старих мишей знайдена позитивна корелятивна залежність між вмістом мРНК СОД, каталази та ГП, яка не змінюється при старінні.

7. Між вмістом мРНК та активністю СОД або каталази печінки молодих і старих мишей не виявлено корелятивної залежності, тоді як аналогічна кореляція для ГП негативна в молодих і позитивна в старих мишей.

8. Вікові зміни, виявлені при кластерному аналізі, свідчать про важливу роль пари ферментів каталаза – ГП в регуляції АО системи старих мишей.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Muradian Kh., Utko N., Fraifeld V., Mozzhukhina T., Pishel I., Litoshenko A. Superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase activities in the liver of young and old mice: linear regression and correlation //Arch. Geront. and Geriatr.- 2002.- V. 35. - P.205 - 214.

2. Muradian Kh., Utko N., Mozzhukhina T., Litoshenko A., Pishel I., Bezrukov V., Fraifeld V. Pair-wise linear and 3D nonlinear relationships between the liver antioxidant enzyme activities and the rate of body oxygen consumption in mice // Free Radical Biol. & Medicine. – 2002.– V.33, N12. – P.1736 –1739.

3. Утко Н.А., Мозжухина Т.Г., Пишель И.Н., Литошенко А.Я., Безруков В.В., Фрайфельд В.Э., Мурадян Х.К. Возрастные особенности корреляции между интенсивностью газообмена, температурой тела и активностью супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы печени мышей// Пробл. стар. и долг. – 2002. – Т. 11, №1. – С.23 – 29.

4. Мурадян Х.К., Утко Н.А., Мозжухина Т.Г., Пишель И.Н., Литошенко А.Я., Безруков В.В., Фрайфельд В.Э. Двух- и трехмерный анализ зависимостей между скоростью потребления кислорода, количеством митохондриального белка и активностью супероксиддисмутазы и каталазы печени мышей // Доповіді НАН України. - 2002. - №9. - С.165-169.

5. Мурадян Х.К., Утко Н.А., Мозжухина Т.Г., Пишель И.Н., Литошенко А.Я., Безруков В.В. Коррелятивные связи между активностью супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы печени мышей// Укр. біохім. ж. - 2003. – Т. 75, №1. – С. 33-37.

6. Мурадян Х.К., Утко Н.А., Мозжухина Т.Г., Пишель И.Н., Фрайфельд В.Э., Литошенко А.Я. Каталаза и глутатионпероксидаза: качественно различная корреляция со скоростью потребления кислорода // Укр. біохім. ж. – 2004. – Т. 76, № 3. – С. 36 – 41.

7. Мурадян Х.К., Утко Н.А., Мозжухина Т.Г., Пишель И.Н., Литошенко А.Я., Безруков В.В., Фрайфельд В.Э. Коррелятивные взаимоотношения между скоростью потребления кислорода, температурой тела и активностью ключевых антиоксидантных ферментов печени Mus Musculus // Ж. эвол. биохимии и физиологии. – 2004. - Т. 40, № 1.- С. 51 – 54.

8. Утко Н.А. Возрастные особенности распределений супероксиддисмутазной и каталазной активности, продукции СО2 и содержания белка у самцов имаго Drosophila melanogaster// Пробл. стар. и долг. – 2005. – Т. 14, № 3. – С. 217 – 225.

9. Утко Н., Пишель И., Устименко А., Безруков В., Бутенко Г. Экспрессия супероксиддисмутазы и каталазы в печени молодых и старых мышей // Доп. НАН України. – 2005. – N 11. – C. 160 – 164.

10. Utko N. Superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase and reductase in the heart of hypergravity-treated and aging rats // J. Gravitational Phys. – 2005.– V. 12.– P. 103 – 104.

11. Frolkis V.V., Limareva A.A., Utko N.A., Pishel I.N., Fraifeld V.E., Mozhukhina T.G., Butenko G.M., Litoshenko A.Y., Muradian Kh.K. Antioxidant enzymes activity and malone dialdehyde content in the liver and heart of intact and aurintricarboxylic acid-treated young and old mice // Abstrt. 4th European congress on biogerontology, Berlin (Germany). In: Gerontologie und Geriatrie, 1999, v. 32, №2, P. II/7.

12. Утко Н. Взаимосвязь про- и антиоксидантных систем при старении // Матер. II Укр. конф. молодих вчених, присв. пам’яті акад. Фролькіса В.В. – Київ, 2001. – С. 119.

13. Utko N., Muradian Kh. Correlative links between the rate of gaseous exchange and antioxidant enzymes in the heart of young and old mice // 17th Congress of the Intern. Assoc. of Gerontology.– Vancouver (Canada), 2001. – P. 620-621.

14. Утко Н.А. Коррелятивные связи между уровнем газообмена и активности ключевых антиоксидантных ферментов печени молодых и старых мышей //Матер. III Укр. конф. молодих вчених, присв. пам’яті акад. Фролькіса В.В. – Киев, 2002. – С. 198.

15. Утко Н.А., Пишель И.Н., Безруков В.В., Мурадян Х.К. Корреляция между активностью супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы печени молодых и старых мышей// Матер. VIII Українськ. біохім. з'їзду.– Чернівці, 2002.– Укр. біох. ж. - 2002. - Т.74 №4а.– С. 89 – 90.

16. Мурадян Х.К., Мозжухина Т.Г., Утко Н.А., Пишель И.А., Безруков В.В. Парные линейные и непарные трехмерные методы оценки коррелятивных связей между активностью антиоксидантных ферментов // Матер. VIII Укр. біохім. з'їзду. – Чернівці, 2002. – Укр. біох. ж. - 2002. - Т.74 №4б (додаток 2). - С.188-189.

17. Утко Н.О., Мурадян Х.К. Зміни взаємозв'язків ферментів антиоксидантної системи при старінні// XVI з'їзд фізіологів України. – Вінниця, 2002. –