МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ‘Я УКРАЇНИ
МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ‘Я УКРАЇНИ
ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ВЛАДИМИРОВА МАРИНА ПАВЛІВНА
УДК: 612.461.234:615.33:612-092.9
ПАТОГЕНЕЗ ТОКСИЧНОЇ НЕФРОПАТІЇ, ІНДУКОВАНОЇ ГЕНТАМІЦИНОМ, І ПРИНЦИПИ ЇЇ КОРЕКЦІЇ В ЕКСПЕРИМЕНТІ
14.03.04. – патологічна фізіологія
А В Т О Р Е Ф Е Р А Т
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Одеса – 2007
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Одеському державному медичному університеті МОЗ України.
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор
заслужений діяч науки і техніки України,
ГОЖЕНКО Анатолій Іванович
Одеський державний медичний університет
МОЗ України, завідувач кафедри загальної та
клінічної патологічної фізіології, м. Одеса
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор
СЕРВЕЦЬКИЙ Костянтин Леонідович,
Одеський державний медичний університет
МОЗ України, завідувач кафедри інфекційних
хвороб з курсом епідеміології, м. Одеса
доктор медичних наук, професор
КРИШТАЛЬ Микола Васильович,
Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця
МОЗ України, професор кафедри патологічної фізіології,
м. Київ
Провідна установа: Донецький державний медичний університет
ім. М. Горького МОЗ України, кафедра
патологічної фізіології, м. Донецьк.
Захист дисертації відбудеться ”02” липня 2007 року о 1100 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д41.600.01 при Одеському державному медичному університеті (65082, м. Одеса, пров. Валіховський, 2).
З дисертацією можна ознайомитися у бібіліотеці Одеського державного медичного університету (65082, м. Одеса, пров. Валіховський, 3).
Автореферат розісланий ”01” червня 2007 р.
Вчений секретар
спеціалазованої вченої ради
к.мед.н., доцент Годован В.В.
1
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. В етіології та патогенезі токсичних нефропатій важливе місце займають лікарські препарати. У сучасній фармакотерапії антибіотики посідають провідне місце в комплексному лікуванні ряду інфекційно-запальних захворювань. Незважаючи на впровадження в практику нових засобів антибіотикотерапії, розвиток ренальних дисфункцій, як прояв побічної дії хіміотерапії, залишається однією з актуальних проблем сучасної медицини (Алексеенко Н.В. и соавт., 2000; Возіанов О.Ф. і співавт., 2003).
Відомо, що практично усі водорозчинні хімічні сполуки (ксенобіотики, до числа яких відносяться антибіотики та їх метаболіти) виводяться із організму переважно нирками (Наточин Ю.В., 1997; Шейман Д.А., 1997; Бакалюк О.О., 2000; Вандер А.Д., 2000). Тому антибіотики є серед основних причин виникнення лікарської нефропатії. За даними інформаційних повідомлень Центру побічної дії ліків (1999); Kasama R., Sorbello A., (1996) всі антибіотики можуть бути причиною гострого інтерстиційного нефриту, наслідком якого є гостра ниркова недостатність (ГНН).
Аміноглікозиди широко використовуються в різних сферах медичної практики завдяки багатосторонньому спектру протимікробної дії та бактерицидному механізму (Бертрам Г. Катцунг, 1998; Mingeot-Leclerq M. et al., 1999; Дядька А.И., 2003; Сафина А.И., 2004, Сидоренко С.В. и соавт., 2005). Всі аміноглікозиди є потенційно нефротоксичними, викликають розвиток канальцевих дисфункцій і некроз клітин канальцевого епітелію (Ласиця О.Л., 2001; Березняков И.Г., 2002; Страчунский Л.С. и соавт, 2002). Гентаміцин - препарат з групи аміноглікозидів, який згідно з даними ряду авторів, викликає нефротоксичні реакції у 5-10 % усіх госпіталізованих хворих (Колесник М.О., 2001; Возіанов О.Ф. и соавт., 2003; Хайкина Е.В. и соавт., 2006). За даними літературних джерел, гентаміцин, який накопичується у кірковому шарі нирок, в основному викликає структурно-функціональні порушення канальців нирок, у більшій мірі проксимальних, при відносному збереженні функції клубочкового апарату (Яковлева О.А. и соавт., 2000; Ласиця О.Л., 2001; Вікторов О.П. і співавт., 2002).
Тобто, вищенаведене обумовлює необхідність розробки та впровадження засобів профілактики порушення функції нирок при терапії гентаміцином. Між тим, до нашого часу механізм розвитку гентаміцинової нефропатії вивчений недостатньо. Так, не досліджений час появи перших ознак гентаміцинобумовленої нефротоксичності, не вивчена динаміка морфофункціональних змін та патогенез їх розвитку, не проаналізований дозозалежний характер пошкодження нирок при одноразовому введенні гентаміцину. Лишився не
2
з’ясованим морфофункціональний стан різних відділів нефрону в ранні та віддалені терміни після введення гентаміцину, не вивчено стан адаптаційних механізмів нирки. Зазначені обставини стримують розробку ефективних методів патогенетично обумовленої фармакологічної корекції гентаміцинової нефропатії.
Таким чином, вивчення механізмів розвитку нефропатії, індукованої гентаміцином, має як теоретичне, так і клінічне значення та дозволяє вважати цей напрямок перспективним дослідженням сучасної патофізіології.
Зв‘язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках основного напрямку науково-дослідної роботи Одеського державного медичного університету „Патогенетичні механізми розвитку захворювання репродуктивної системи за умов агресивних факторів середовища і шляхи її корекції” МОЗ України (№ державної реєстрації 0199U004330). Дисертант є співвиконавцем зазначеної теми.
Мета і задачі дослідження. Мета роботи - з‘ясування патофізіологічних механізмів порушення функціонального стану та особливостей морфологічних змін тканин нирок у білих щурів при одноразовому та курсовому введенні гентаміцину та обгрунтування використання бурштинової кислоти і предукталу з метою корекції гентаміцинової нефропатії.
Для досягнення мети дослідження були поставлені наступні задачі:
1. Визначити стан ниркових процесів: клубочкової фільтрації (КФ) та канальцевої реабсорбції у тварин через 2 год після одноразового введення гентаміцину в дозі 20 мг/100 г маси тіла при індукованому водному діурезі.
2. Встановити особливості функціонального стану нирок у щурів через 2; 12 та 24 год після одноразового введення гентаміцину в дозі 10 мг/100 г маси тіла за умов індукованого водного діурезу.
3. Обстежити морфофункціональні особливості порушень у тканинах нирок щурів через 2; 4; 6; 8; 10; 12; 24; 48 та 72 год після одноразового введення гентаміцину в дозі 10 мг/100 г маси тіла.
4. Проаналізувати особливості змін та функціональну спроможність нирок у щурів через 7 днів після введення гентаміцину в дозі 10 мг/100 г маси тіла один раз на добу при індукованому водному діурезі.
5. З‘ясувати морфофункціональний стан нирок білих щурів через 7 діб після одночасного введення гентаміцину в дозі 10 мг/100 г маси тіла з предукталом або бурштиновою кислотою один раз на добу за умов індукованого водного діурезу.
3
6. Дослідити морфофункціональний стан нирок білих щурів через 3 та 7 діб після сумісного введення гентаміцину в дозі 10 мг/100 г маси тіла з предукталом і бурштиновою кислотою один раз на добу при індукованому водному діурезі.
Об‘єкт дослідження - патогенетичні механізми токсичної нефропатії за умов введення гентаміцину та методи її корекції шляхом введення предукталу та бурштинової кислоти.
Предмет дослідження - функціональний стан та структурні особливості нирок у щурів після однократного та курсового введення гентаміцину в дозах 10 і 20 мг/100 г маси тіла та при сумісному курсовому введенні гентаміцину з предукталом і/або бурштиновою кислотою за умов індукованого водного діурезу.
Методи дослідження - патофізіологічні, біохімічні, гістологічні, статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. На підставі оцінки результатів комплексного дослідження вперше визначені особливості функціонального та морфологічного стану як канальцевого, так і клубочкового апарату нирок у щурів, які розвиваються вже через 2 год після одноразового введення гентаміцину у терапевтичній та токсичній дозах за умов водного діурезу і клінічно виявляються розвитком ознак олігоануричної стадії ГНН. Дані зміни дещо зменшувались через 12 год з наступною негативною динамікою через 24 год після одноразового введення препарату і зростали при курсовому введенні гентаміцину впродовж 7 діб. Встановлено, що дозозалежний нефротоксичний ефект препарату стосується лише протеїнурії. Вперше при морфологічних та функціональних дослідженнях доведено пряму токсичну дію гентаміцину на клубочки нирок. Вивчено взаємозв’язок між морфологічними змінами в тканинах нирок та функціональними порушеннями ниркових процесів в динаміці перебігу гентаміцинобумовленої нефропатії. Використання водного навантаження при гентаміциновій нефропатії дозволило вперше продемонструвати низькі можливості адаптаційних механізмів осморегулюючої функції нирок. Вперше за умов гентаміцинобумовленої нефропатії показаний позитивний вплив на морфофункціональний стан нирок білих щурів бурштинової кислоти, і, особливо, сумісного введення бурштинової кислоти та предукталу, що супроводжувалось зниженням протеїнурії, нормалізацією діурезу, КФ, реабсорбції осмотично активних речовин (ОАР) та здатності нирок до осмотичного розведення сечі.
Практичне значення одержаних результатів. Важливе практичне значення мають отримані в роботі експериментальні результати щодо часу появи перших проявів гентаміцинової нефропатії у вигляді протеїнурії, як найбільш важливого раннього діагностичного критерію дисфункції нирок. Проведені дослідження обґрунтовують доцільність використання водної навантажувальної проби в діагностиці функціонального
4
стану нирок для виявлення найбільш інформативних ознак патології: порушень діурезу, КФ, екскреції білка, ОАР та води. Експериментально обґрунтована доцільність використання бурштинової кислоти, як енергетичного субстрату, та предукталу, як стабілізатора мітохондрій, з метою корекції гентаміцинобумовленої нефропатії. Ці результати створюють можливість для розширення області застосування даних препаратів у клінічній практиці.
Результати роботи впроваджені в навчальний процес на кафедрі загальної та клінічної патологічної фізіології Одеського державного медичного університету, кафедрах патологічної фізіології Буковинського державного медичного університету, Тернопільського державного медичного університету, Донецького державного медичного університету ім. М.Горького, Харківського державного медичного університету, Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського, Дніпропетровської державної медичної академії.
Особистий внесок здобувача. Автором проведено патентно–інформаційний пошук, обґрунтування схем дослідження, налагоджування експериментальних моделей, вибір обсягів та методів дослідження. Дисертантка самостійно здійснила біохімічні та морфологічні дослідження, статистичну обробку, аналіз, узагальнення та інтерпретацію отриманих результатів; сформулювала основні положення та висновки дисертації. (Авторка висловлює щиру подяку доценту кафедри патологічної анатомії Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського Філоненко Т.Г. за консультування щодо морфологічних препаратів нирок).
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були оприлюднені на наступних наукових конференціях: на ІV національному конгресі патофізіологів України з міжнародною участю „Фундаментальні аспекти сучасної медицини” (Чернівці, 2004), на наукових конференціях „ІV, V Читання ім. В.В. Підвисоцького” (Одеса, 2005, 2006), на ювілейному VІІІ Всеукраїнському з’їзді товариства лікарів (Київ, 2005), на ІІ Міжнародній науково-практичній конференції „Гомеостаз: фізіологія, патофізіологія, фармакологія і клініка” (Одеса, 2005), на міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених (Одеса, 2005), на симпозіумі „Патогенетичні механізми токсічних нефропатій” (Одеса, 2006).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових робіт, з них 5 – наукові статті в провідних фахових виданнях ВАК України, 6 - тези доповідей на наукових конференціяї та з‘їздах.
Обсяг та структура дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 189 сторінках. Вона складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, чотирьох
5
розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків. Текст дисертації ілюстровано 30 таблицями та 55 рисунками. Список літератури містить 264 джерела, з них 116 іноземні.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи досліджень. Експериментальні дослідження проведені на кафедрі загальної та клінічної патологічної фізіології Одеського державного медичного університету на 150 статевозрілих щурах-самцях вагою 100-250 г з дотриманням усіх вимог щодо роботи з лабораторними тваринами. Комісією Одеського державного медичного університету з питань біоетики (протокол № 102а, від 21 квітня 2006р.) порушень у проведенні дослідів на тваринах не виявлено. Згідно з метою та задачами дослідження гентаміцин (фірма „Здоровґя”, м. Харків) вводили щурам внутрішньочеревинно з розрахунку 20 мг/100 г маси тіла, що відповідає токсичній дозі препарату (Martinez-Salgado Carlos et al., 2004) та дозі 10 мг/100 г маси тіла, яка викликає мінімальні зміни в нирках білих щурів і відповідає „терапевтичній” дозі гентаміцину (Mingeot-Leclerq M.et al., 1999; Martinez-Salgado Carlos et al., 2004), одноразово через 2; 12 і 24 год або протягом 7 днів один раз на добу в дозі 10 мг/100 г маси тіла. Бурштинову кислоту вводили підшкірно у вигляді 5% розчину сукцинату натрію (СН), попередньо забуференому 10% розчином NaOH, із розрахунку 25 мг/100 г маси тіла. Предуктал (фірма „Серв‘є”, Індастрі, Франція) вводили внутрішньочеревинно у вигляді 5% розчину у дозі 0,5 мг/100 г маси тіла. Контрольні групи були сформовані з 30 інтактних щурів (по 10 тварин у кожній групі), подібних за віком і статтю, яким вводили внутрішньоочеревинно воду для ін’єкцій та проводили водне навантаження). Індукований водний діурез відтворювали без знеболення шляхом введення у шлунок щурів за допомогою металевого зонду дистильованої води, підігрітої до 37 0С, в об’ємі 5% від маси тіла тварини (Гоженко А.І. і співавт., 1991). Забір сечі проводили протягом 2 год за умов знаходженнія тварин в обмінних клітках. Евтаназію щурів виконували шляхом швидкої декапітації під легкою ефірною анестезією, забір крові проводили в пробірки, які стабілізували гепарином. Проводили біохімічне дослідження плазми крові та сечі, в яких фотометрично (довжина хвилі 590 нм) на “СФ-46” („Ломо”, виробництво Росія) визначали загальний білок у сечі сульфосаліциловим методом (Михеева А.И. и соавт., 1969); креатинін плазми крові і сечі - фотометрично на “СФ-46” (довжина хвилі 520 нм) за реакцією з пікриновою кислотою; осмоляльність сечі та плазми крові визначали загальноприйнятим кріоскопічним методом на осмометрі „3Д3” (виробництво США) (Рябов С.И. и соавт., 1979). Показники функціонального стану нирок вивчали за
6
стандартними загальноприйнятими формулами, запропонованими Ю.В. Наточіним (1974), О. Шюк (1981) та А.І. Гоженко (1991). Морфологічні дослідження нирок проводили на зрізах товщиною 5,01,0 мкм, які забарвлювали гематоксиліном і еозином, а також за Ван-Гізоном (Меркулов А.Г, 1969; Саркисов Д.С. и соавт., 1996). Статистичну обробку результатів досліджень проводили за допомогою комп’ютерного пакета програм “Exсel” з використанням критерію Ст’юдента (Лапач С.Н. и соавт., 2000).
Результати досліджень та їх обговорення. Дослідження функціонального стану нирок у білих щурів через 2 год після одноразового внутрішньоочеревинного введення гентаміцину в дозах 10 та 20 мг/100 г маси тіла.
Результати проведених досліджень свідчать, що одноразове введення щурам гентаміцину як в дозах 10, так і 20 мг/100 г маси тіла призводить вже в перші 2 год до змін цілого ряду показників діяльності нирок. Так дані, наведені у табл. 1, вказують на достеменне зменшення діурезу щодо контролю майже вдвічі як в абсолютних, так і в відносних величинах, найбільш вагоме після введення препарату в токсичній дозі.
Необхідно відмітити, що у інтактних тварин завжди в невеликій кількості спостерігається протеїнурія, однак, у сечі тварин через 2 год після одноразового введення гентаміцину в дозі 10 мг/100 г маси тіла достовірно (p0,001) збільшувалась концентрація білка в сечі (в 4,7 рази) та його екскреція (в 4,25 рази) відносно контролю, а у тварин при введенні препарату в дозі 20 мг/100 г маси тіла відмічено ще більш різке вірогідне (p0,01) підвищення концентрації білка у сечі (в 17 разів) та його екскреції (в 7 разів) в порівнянні з контрольною групою щурів, що дозволяє даний ефект вважати дозозалежним.
Аналогічною була динаміка змін концентрації креатиніну сечі, яка збільшувалась у 1,5 рази після введення гентаміцину в „терапевтичній” дозі і в 2,5 рази після введення в токсичний дозі. Екскреція креатиніну збільшувалася незначно, але достовірно, у щурів при введенні гентаміцину в дозі 20 мг/100 г маси тіла, а при введенні препарату в дозі 10 мг/100 г маси тіла відзначено збільшення показника концентрації креатиніну на тлі зниження його екскреції. Подальше дослідження КФ та канальцевої реабсорбції виявило підвищення показника концентрації креатиніну в плазмі крові та зниження швидкості клубочкової фільтрації за кліренсом ендогенного креатиніну, більш вагоме у щурів при введенні гентаміцину в токсичній дозі.
Зміни показників екскреторної функції нирок, свідчать про нефротоксичність гентаміцину як у терапевтичній, так і в токсичній дозах і можуть бути результатом порушення ниркових процесів – КФ та канальцевої реабсорбції.
7
Підвищення показників осмоляльності сечі (табл. 2) відносно контролю у тварин при введенні гентаміцину в дозах 10 та 20 мг/100 г маси тіла свідчить про зменшення здатності нирок до осмотичного розведення сечі та порушення осморегулюючої функції нирок, яка є найбільш чутливою до дії токсичних речовин. Незначне, але достовірно (p0,01) зниження осмоляльності плазми крові свідчить про затримку частини введеної води в організмі піддослідних тварин, що підтверджується даними збільшення реабсорбції води. Достовірно зменшувалось виведення ОАР на одиницю екскретуємого креатиніну.
Таблиця 1
Показники функціонального стану нирок у щурів через 2 год після одноразового введення гентаміцину в дозах 10 та 20 мг/100 г маси тіла за умов індукованого водного діурезу, Mm
Показники | Контроль, n=10 | Гентаміцин 10 мг/100 г маси тіла, n=9 | Гентаміцин 20 мг/100 г маси тіла, n=9 | Діурез, мл/2год | 6,120,16 |
2,970,56
p0,001 | 3,141,09
p10,001 | Діурез, мл/1год/100г | 1,780,02 |
1,190,20
p0,01 | 0,850,09
p10,001 | Діурез,% | 71,310,88 |
47,728,04
p0,01 | 34,443,30
p10,001 | Концентрація білка, мг/л | 22,000,58 |
103,817,4
p0,001 | 382,4498,80
p10,01 | Екскреція білка, мг/год | 0,040,01 |
0,170,04
p0,001 | 0,310,05
p10,001 | Креатинін сечі, мкмоль/л | 1155,8047,10 |
1784,22255,51,
p0,05 | 2846,00136,68
p0,001 | Креатинін плазми, мкмоль/л | 67,700,93 |
74,003,20
p0,05 | 85,844,68
p10,01 | Екскреція креатиніну,
мкмоль/год | 2,060,08 |
1,760,12
p0,05 | 2,350,14 |
Кліренс креатиніну, мкл/хв/100г | 504,0515,09 | 389,2334,11
p0,001 | 412,6730,98
p10,02 | Примітки : у табл. 1-4: р, р1 – показники вірогідності щодо контролю; n – кількість спостережень.
Значно зростали показники відносної протеїнурії при розрахунку екскреції білка на 1 мл клубочкового фільрату, що вказує на вагомі втрати протеїну кожним діючим нефроном. Значне збільшення, особливо у щурів при введенні гентаміцину в дозі 20 мг, показників концентраційного індексу осмотично активних речовин Uosm/Posm та концентраційного
8
індексу креатиніну Ucr/Pcr, який характеризує совокупне концентрування первинної сечі у нефроні, свідчить про підвищення реабсорбції води переважно в дистальних канальцях або в збиральних трубочках.
Таким чином, отримані нами результати досліджень дають нам змогу стверджувати, що у нирках при введенні гентаміцину в дозах 10 та 20 мг/100 г маси тіла пошкоджуються як канальці, переважно проксимальні, так і клубочки з порушенням екскреторної та осморегулюючої функції. Це підтверджується даними морфологічного дослідження тканини нирок: інтракапілярна гломерулопатія, набряк та фібріноїдний некроз клубочків, некробіоз та некроз епітелію проксимальних канальців, еозинофільна інфільтрація дистальних канальців.
Таблиця 2
Показники осморегулюючої та екскреторної функції нирок у щурів через 2 год після одноразового введення гентаміцину в дозах 10 та 20 мг/100 г маси тіла за умов індукованого водного діурезу, Mm
Показники | Контроль, n=10 | Гентаміцин 10 мг/100 г маси тіла, n=9 | Гентаміцин 20 мг/100 г маси тіла, n=9
Осмоляльність сечі, мосмоль/л | 103,31,68 |
142,4315,32
p0,02 | 195,389,85
p10,001
Осмоляльність плазми,
мосмоль/л | 298,900,43 |
287,831,54
p0,01 | 290,000,67
p10,01
Екскреція білка/
клубочкова фільтрація, мг/ 1 мл клубочкового фільтрату | (1,310,56)10-3 | (7,111,58)10-3
p0,01 | (7,511,58)10-3
p10,01
Екскреція ОАР /Екскреція креатиніну, мосмоль/мкмоль | 0,090,003 |
0,070,002
p0,001 | 0,070,003
p10,001
Ucr/Pcr | 16,990,63 | 23,653,86 | 29,671,29
p10,001
Uosm/Posm0,350,01 |
0,540,06
p0,02 | 0,670,04
p10,001
Реабсорбція H2O, % | 94,050,20 |
94,341,48
96,560,12
p10,001
Дослідження функціонального стану нирок у білих щурів через 12 та 24 год після одноразового внутрішньоочеревинного введення гентаміцину в дозі 10 мг/100 г маси тіла.
Вищенаведені результати проведених досліджень обумовили подальше вивчення в динаміці механізму нефротоксичної дії гентаміцину через 12 та 24 годи після одноразового
9
його введення в дозі 10 мг/кг маси тіла за умов індукованого водного діурезу з метою уточнення характеру та механізмів пошкодження клубочків нирок та канальців.
Показано, що через 12 та 24 год після введення гентаміцину (табл. 3) діурез залишався достовірно зниженим відносно контролю. Причому, через 24 год сечовиділення було дещо нижчим, ніж у тварин через 12 год.
Концентрація і екскреція білка з сечею залишалися більш високими порівняно з контролем, менш вираженого через 12 год після введення препарату. Концентрація креатиніну в сечі була достовірно вищою через 24 год після введення гентаміцину порівняно з контрольною групою. У щурів через 12 год концентрація креатиніну в сечі мала тенденцію до збільшення, але достовірно не відрізнялась від показників креатиніну в контролі. Одночасно спостерігалась суттєва динаміка змін з боку КФ. Так, через 12 год відбувалась нормалізація показників швидкості КФ та екскреції креатиніну на тлі зниження концентрації креатиніну в плазмі крові щодо контролю. Тоді як через 24 год нормалізувався вміст креатиніну в плазмі крові при зниженні КФ.
Таблиця 3
Показники функціонального стану нирок у щурів через 12 та 24 год після одноразового введення гентаміцину в дозі 10 мг/100 г маси тіла при водному навантаженні, Mm
Показники | Контроль, n=10 | Через 12 год після введення гентаміцину , n=9 | Через 24 год після введення гентаміцину , n=9 | Діурез, мл/2год | 7,27±0,20 | 4,300,40
p0,001 | 4,520,77
p10,01
Діурез, мл/1год/100г | 1,80±0,05 | 1,260,11
p0,001 | 1,120,18
p10,001
Діурез,% | 71,20±1,83 | 50,554,41
p0,001 | 44,87,23
p10,01
Концентрація білка, мг/л | 29,10±0,43 | 80,009,61
p0,001 | 69,5714,42
p10,02
Екскреція білка, мг/год | 0,050,001 | 0,110,01
p0,001 | 0,090,018
p10,05
Креатинін сечі, мкмоль/л | 1669,7±21,82 | 1796,56188,98 |
2559,752,32
p10,001
Креатинін плазми, мкмоль/л | 80,30±0,65 | 59,223,20
p0,001 | 87,84,6
Екскреція креатиніну,
мкмоль/год | 2,14,09 | 2,200,28 |
2,120,14
Кліренс креатиніну, мкл/хв/100г | 623,47±18,66 | 643,5579,05 |
408,2128,54
p10,001
10
Виявлені порушення функції нирок, як з боку обміну креатиніну, так і особливо на рівні канальцевих процесів супроводжувались вагомими змінами осморегулюючої функції нирок (табл. 4). Порушувалась здатність нирок до розведення сечі, судячи з достовірного (p0,001) підвищення рівня її осмоляльності, особливо через 24 год. Слід відмітити, що осмоляльність плазми через 12 год досягала контрольного рівня, а через 24 год залишалась достовірно вищою відносно контролю. При цьому, відносна реабсорбція води у тварин через 12 год після введення препарату незначно, але достовірно перевищувала контрольні показники, а через 24 год мало відрізнялась щодо контролю, що свідчить про відносну нормалізацію реабсорбції води у нирках.
Таблиця 4
Показники осморегулюючої та екскреторної функції нирок у щурів через 12 та 24 год після одноразового введення гентаміцину в дозі 10 мг/100 г маси тіла за умов індукованого водного діурезу, Mm
Показники | Контроль, n=10 | Через 12 год після введення гентаміцину , n=9 | Через 24 год після введення гентаміцину , n=9 | Осмоляльність сечі, мосмоль/л | 92,60±1,30 | 115,332,67
p0,001 | 173,302,89
p10,001 | Осмоляльність плазми,
мосмоль/л | 298,70±1,77 | 297,890,26 |
302,80,78
p10,05 | Екскреція білка/
клубочкова фільтрація, мг/ 1 мл КФ | (1,400,03)10-3 |
(3,000,3)10-3
p0,001 | (3,660,63)10-3
p10,01
Екскреція ОАР /, клубочкова фільтрація, мосмоль/ 1 мл КФ | (4,480,09)10-3 |
(4,000,3)10-3 |
(6,080,23)10-3
p10,001
Ucr/Pcr | 20,80±0,27 | 30,853,32
p0,001 | 28,424,76
p10,001 | Uosm/Posm0,31±0,003
0,390,03
p0,001 | 0,570,09
p10,001 | (Ucr/Pcr) / (Uosm/Posm) | 66,97±1,12 | 80,347,93 |
50,552,27
p10,001 | Реабсорбція H2O, % | 95,19±0,06 | 96,300,47
p0,05 | 95,620,66 |
Через 12 год після введення гентаміцину, в зв‘язку з включенням функціонального ниркового резерву та нормалізацією КФ, спостерігалась тенденція до зниження показників екскреції ОАР стандартизовано до 1 мл клубочкового фільтрату. Через 24 год у тварин виявлено підвищення даного індексу, що обумовлено зниженням кліренсу креатиніну та
11
більш вагомим навантаженням на канальці нирок, переважно дистальних. Екскреція білка відносно одиниці екскретованого креатиніну або при розрахунку на 1 мл клубочкового фільтрату збільшувалась ще значніше, що вказує на те, що кожен з функціонуючих нефронів втрачає суттєво більше білка, ніж у нормі. Значне збільшення, особливо у щурів через 24 год після введення гентаміцину, показників індексу Uosm/Posm свідчить про підвищення реабсорбції води переважно у дистальних канальцях і/або у збиральних трубочках. Більш вагоме підвищення показника концентраційного індексу креатиніну у тварин через 12 год після одноразового введення препарату порівняно з аналогічними показниками через 24 год після введення гентаміцину вказує на відновлення проксимальної реабсорбції у даної групи тварин. Підтвердженням цього припущення є підвищення показника ((Ucr/Pcr)/(Uosm/Posm)), який дозволяє „від‘єднати” концентрування на рівні проксимального канальця із загального концентрування і свідчить що можливе збільшення реабсорбції води у проксимальних канальцях через 12 год зі зниженням через 24 год після введення гентаміцину.
Спостерігалась наступна динаміка морфологічних змін ниркової тканини: з боку клубочків зафіксовано стійкі зміни у вигляді інтракапілярної гломерулопатії, проліферації мезангіальних та ендотеліальних клітин, інфільтрації лімфоцитами, гістіоцитами та нейтрофілами, менш виражені через 12 год. Зі сторони проксимальних канальців – паренхіматозна дистрофія, вогнищевий некробіоз та некроз епітелію, який мав менш виражений характер через 12 год після введення препарату та посилювався через 24 год. З боку дистальних канальців прогресування змін не відбувалось, навпаки, прояви гідропічної дистрофії їх епітелію поступово зменшувались протягом доби.
Таким чином, можна стверджувати, що впродовж доби після введення гентаміцину функція нирок суттєво порушується як за рахунок зниження швидкості КФ, так і процесів канальцевої реабсорбції, про що свідчить зменшення реабсорбції води і, частково, протеїнурія. Дані порушення менш виражені у щурів через 12 год після введення гентаміцину та характеризуються нормалізацією показників КФ, екскреції креатиніну та реабсорбції на тлі зниження діурезу і наявності протеїнурії, що пов‘язано з включенням функціонального ниркового резерву. Суттєво порушується осморегулююча функція нирок - найбільш чутливий показник для виявлення нефротоксичності, про що свідчить порушення здатності нирок до осмотичного розведення сечі.
Дослідження функціонального стану нирок у білих щурів при курсовому введенні гентаміцину, СН та предукталу за умов індукованого водного діурезу.
12
З метою корекції гентаміцинової нефропатії були застосовані СН, як енергетичний субстрат циклу Кребса, та предуктал, як стабілізатор синтезу макроергів, які раніше успішно використовувались для нефропротектеції при експериментальній сулемовій нефропатії.
При сумісному введенні гентаміцину з СН і/або предукталом, як видно із табл. 5, виявлено значне покращання показників діурезу порівняно з щурами при курсовому впродовж 7 діб введенні гентаміцину, як у абсолютних і відносних величинах, так і при розрахунку на 100 г маси тіла тварин.
Таблиця 5
Деякі показники функціонального стану нирок у щурів за умов введення гентаміцину в дозі 10 мг/100 г маси тіла, СН в дозі 25 мг/100 г маси тіла та предукталу в дозі 5 мг/100 г маси тіла при індукованому водному діурезі, Mm
Показники | Контроль, n=10 | Гентаміцин 10 мг/100 г маси тіла, 7 діб , n=9 | Гентаміцин та СН, 7 діб, n=9 | Гентаміцин, СН та предуктал, 3 доби, n=10 | Діурез, мл/2год | 3,36±0,16 | 0,890,04
p0,001 | 1,490,18
p10,001 | 1,470,38
p20,001 | Діурез, мл/1год/100г | 1,92±0,09 | 0,540,03
p0,001 | 0,990,11
p10,001 | 0,880,04
p20,001 | Діурез,% | 77,36±3,67 | 21,641,21
p0,001 | 36,234,25
p10,001 | 35,061,67
p20,001 | Концентрація білка, мг/л | 0,01±0,0007 | 0,520,007
p0,001 | 0,260,03
p10,001 | 0,120,009
p20,001 | Екскреція білка, мг/год | 0,02±0,01 | 0,280,02
p0,001 | 0,250,03
p0,001 | 0,110,01
p20,001 | Креатинін сечі, мкмоль/л | 1135,90,25 | 1934,2519,46
p0,001 | 1919,3881,33
p10,001 | 2042,4112,82
p20,001 | Креатинін плазми, мкмоль/л | 69,80,37 | 185,101,13
p0,001 | 178,77,26
p10,001 | 101,63,24
p20,001 | Екскреція креатиніну,
мкмоль/год | 2,16±0,05 | 0,500,03
p0,001 | 1,900,11
p10,001 | 1,770,08
p20,001 |
Кліренс креатиніну, мкл/хв/100г | 518,00±13,31 | 45,202,44
p0,001 | 88,6111,30
p10,001 | 270,1512,96
p20,001 | Ucr/Pcr | 16,39±0,72 | 5,030,11
p0,001 | 10,740,16 |
20,331,38
p20,05 | Примітки: у табл. 5, 6: p, p1 і p2 – показники вірогідності щодо контролю, n – кількість спостережень.
Вдвічі знижувалась концентрація білка в сечі тварин при сумісному введенні гентаміцину з СН, а у щурів за умов введення СН та предукталу – в 4,3 рази. Аналогічна
13
динаміка змін спостерігалась з боку показників екскреції протеїну, що свідчить про покращання під дією сукцинату та предукталу процесів реабсорбції у проксимальних канальцях.
Концентрація креатиніну сечі достовірно (p0,001) зростала у щурів всіх груп. Показники креатиніну плазми крові також вірогідно перевищували контрольні величини, з найменшими величинами при сумісному введенні гентаміцину з предукталом і СН. Екскреція креатиніну була достовірно в 4 рази нижчою щодо контролю у щурів при курсовому введенні гентаміцину, що пов‘язано зі значним падінням діурезу у тварин даної групи, а при введенні гентаміцину з нефропротекторами є достовірно нижчою контрольних показників. Значне, в 11,5 разів, зниження швидкості КФ в порівнянні з контролем спостерігалось у щурів за умов курсового введення гентаміцину, а при введенні його з СН та предукталом – в 2 рази.
Таблиця 6
Показники осморегулюючої функції нирок у щурів за умов введення гентаміцину в дозі 10 мг/100 г маси тіла, СН в дозі 25 мг/100 г маси тіла та предукталу в дозі 5 мг/100 г маси тіла при індукованому водному діурезі, M±m
Показники | Контроль, n=10 | Гентаміцин 10 мг/100 г маси тіла, 7 діб , n=9 | Гентаміцин та СН, 7 діб, n=9 | Гентаміцин, СН та предуктал, 3 доби, n=10
Осмоляльність сечі, мосмоль/л | 115,20,47 | 183,383,46
p0,001 | 152,523,16 | 134,58,44
p20,05 | Осмоляльність плазми,
мосмоль/л | 294,004,00 | 295,16,52 | 293,79,27 | 288,51,46
p20,001 | Екскреція білка/
клубочкова фільтрація, мг/ 1 мл КФ | (0,620,04)10-3 |
0,100,002
p0,001 | (27,77,03) 10-3
p10,001 | (6,140,69) 10-3
p20,001 | Uosm/Posm0,920,04 | 0,640,01
p0,001 | 0,520,07
p10,001 | 0,470,02
p20,001 | Екскреція ОАР/ клубочкова фільтрація, мосмоль/ 1 мл КФ | (7,070,18) 10-3 | 0,040,001
p0,001 | (11,171,72) 10-3
p10,05 | (6,830,52) 10-3
p20,001 | (Ucr/Pcr) / (Uosm/Posm) | 16,39±0,72 | 5,030,11
p0,001 | 20,650,24
p10,001 | 44,382,84
p20,001 | Реабсорбція H2O, % | 93,79±0,29 | 80,080,43
p0,001 | 87,451,33
p10,001 | 94,900,37
p20,05 |
14
Спостерігались значні зміни з боку осморегулюючої функції нирок (табл. 6). Значно порушувалась їх здатність до осмотичного розведення сечі у щурів при гентаміциновій нефропатії з найменшими змінами у тварин за умов введення гентаміцину з СН та предукталом. Осмоляльність плазми істотно не відрізнялась в порівнянні з контролем у щурів за умов курсового введення гентаміцину та сумісного його введення з СН, на відміну від тварин, яким одночасно вводили сукцинат з предукталом, у даній групі відмічено достеменне зниження даного показника. Це узгоджується з даними реабсорбції води, показники якої були вищими відносно контролю у тварин при сумісному застосуванні нефропротекторів. Показники відносної протеїнурії були найвищими у щурів при курсовому введенні гентаміцину, найменшими – при введенні СН та предукталу. Аналогічна динаміка змін спостерігалась з боку показника співвідношення екскреції ОАР щодо 1 мл клубочкового фільтрату. Підвищення показника концентраційного індексу креатиніну у щурів при введенні гентаміцину з СН та предукталом свідчить про відновлення проксимальної реабсорбції, що підтверджується збільшенням величини показника (Ucr/Pcr)/(Uosm/Posm). У свою чергу, зменшення величин концентраційного індексу ОАР (Uosm/Posm) говорить про зниження реабсорбції води переважно в дистальних канальцях або в збиральних трубочках.
Морфологічна картина нирок у щурів при курсовому введенні гентаміцину характеризувалась вираженим некрозом капілярів клубочка та епітелію проксимальних та дистальних канальців. При сумісному введенні гентаміцину з СН спостерігалось зменшення проявів нефронекрозу. За умов одночасного введення гентаміцину, СН та предукталу впродовж 3 діб відмічено відсутність некрозу капілярів клубочка, частковий некробіоз та некроз епітелію проксимальних канальців, відсутність або незначні порушення структури епітелію дистальних кнальців, що свідчить про позитивний вплив СН та предукталу на морфофункціональний стан тканини нирок та вагоме зменшення гістологічних проявів гострої ниркової недостатності.
Таким чином, гентаміцин виявляє нефротоксичну дію вже через 2 год після одноразового його введення в дозах 10 і 20 мг/100 г маси тіла. Нефротоксичність зберігається впродовж доби і посилюється при курсовому введенні препарату протягом 7 діб та морфофункціонально відповідає проявам ГНН. Через 12 год після одноразового введення гентаміцину спостерігається покращання ниркових функцій, що пов‘язано з включенням функціонального ниркового резерву. При введенні препарату спостерігається значне порушення канальцевої реабсорбції, особливо у проксимальному відділі нефрону, та клубочкової фільтрації, що підтверджується даними морфологічного дослідження ниркової
15
тканини. Використання предукталу та СН при гентаміциновій нефропатії виявило позитивний ефект на екскреторну та осморегулюючу функції нирок.
ВИСНОВКИ
У дисертації наведено теоретичне узагальнення та експериментальне вирішення наукової проблеми щодо патогенезу гентаміцинової нефропатії, досліджено загальні закономірності цих порушень і особливості морфологічного стану тканин нирок та обгрунтовано патогненетичне використання з нефропротекторною метою СН та предукталу.
1. Встановлено, що одноразове введення щурам гентаміцину в дозі 10 мг/100г маси тіла призводить до низки порушень екскреторної та осморегулюючої функцій нирок, що проявляється зниженням КФ, діурезу, екскреції креатиніну та ОАР, розвитком протеїнурії, порушенням осмотичного розведення сечі.
2. Нефротоксична дія гентаміцину в дозі 10 мг/100 г маси тіла у білих щурів зберігається протягом 24-х год після одноразового його введення, реалізується як на клубочковому, так і на канальцевому рівнях та має морфофункціональні ознаки олігоануричної стадії ГНН. Через 12 год після введення препарату спостерігається покращання морфофункціонального стану клубочків, проксимальних та дистальних звивистих канальців.
3. Зі збільшенням дози гентаміцину з 10 до 20 мг/100 г маси тіла збільшується протеїнурія, тобто нефротоксичний ефект препарата вважати дозозалежним. Виходячи з даних гістологічного дослідження тканини нирок, вважаємо, що це обумовлено пошкодженням проксимальних канальців та морфологічними ознаками пошкодження клубочків.
4. Порушення функції проксимального відділу нефрону під впливом гентаміцину є наслідком його пошкоджуючої дії на канальцеві клітини. Зниження швидкості КФ за цих умов відбувається за механізмом канальцево-клубочкового балансу та за рахунок прямої пошкоджуючої дії препарату на клубочки нирок, що підтверджується даними їх гістологічного дослідження.
5. Наслідком нефротоксичної дії гентаміцину є порушення екскреторної та осморегулюючої функцій нирок. Останнє обумовлено зменшенням осмотичного розведення сечі і, у цілому, виведенням води із організму щурів. Патогенез цього явища може бути обумовлений дією гентаміцину на епітелій дистальних відділів нефрону та їх пошкодженням зі збільшенням проникності до води, що має гістологічне підтвердження. Як наслідок,
16
знижується здатність нирок до максимального осмотичного розведення сечі, а в організмі затримується частина введеної води.
6. Введення гентаміцину в дозі 10 мг/100 г маси тіла 1 раз на добу протягом семи днів викликає порушення функції проксимальних канальців та поглиблює морфофункціональні зміни у нефронах і поступове наростання ознак ГНН.
7. Введення білим щурам СН в дозі 25 мг/100 г маси тіла один раз на добу одночасно з гентаміцином протягом 7 діб призводить до покращення екскреторної та осморегулюючої функцій нирок, що проявляється підвищенням показників діурезу, зниженням протеїнурії, нормалізацією КФ, реабсорбції ОАР, покращанням здатності нирок до осмотичного розведення сечі. Предуктал при сумісному введенні з гентаміцином на протязі 7 діб у вигляді 5% розчину в дозі 0,5 мг/100 г маси тіла один раз на добу веде до покращання ниркових функцій.
8. Сумісна дія СН та предукталу в умовах пошкодження клітин нирок при гентаміциновій нефропатії має позитивний вплив на динаміку ниркових функцій за рахунок зменшення пошкодження проксимальних канальців, що виявляється у зниженні протеїнурії, нормалізації КФ із зменшенням азотемії. СН та предуктал значно покращують осморегулюючу функцію нирок, і, особливо, стан реабсорбції у проксимальних канальцях, що проявляється у підвищенні показників реабсорбції ОАР і води.
СПИСОК НАУКОВИХ праць, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Вплив гентаміцину на функціональний стан нирок білих щурів / А.І. Гоженко, М.П. Владимирова, С.І. Доломатов, І.А. Кузьменко // Одеський медичний журнал. - 2005. - №3. – С.15-18. Внесок дисертанта: пошук та аналіз літературних джерел, аналіз та інтерпретація отриманих результатів дослідження.
2. Гоженко А.И., Владимирова М.П., Топор Е.А. Ренальные дисфункции у белых крыс после однократного введения гентамицина // Нефрология. – 2005. – Т.9, №4. – С.75-79. Внесок дисертанта: пошук та аналіз літературних джерел, експериментальні дослідження, оформлення статті.
3. Корекції гентаміцинової нефропатії шляхом введення бурштинової кислоти та предукталу у білих щурів / М.П. Владимирова, С.Г. Котюжинська, Т.В. Корнеєнко, І.С. Кругман // Актуальные проблемы транспортной медицины. – 2006. - №2. – С.40-43, (Матеріали симпозіуму „Патогенетичні механізми токсічних нефропатій”). Внесок
17
дисертанта: експериментальні дослідження з інтерпретацією отриманих результатів, обгрунтування мети наукового дослідження та висновків).
4. Гоженко А.І., Владимирова М.П., Кузьменко І.А.; Вплив бурштинової кислоти і предукталу на осморегулювальну функцію нирок у білих щурів при гентаміциновій нефропатії // Одеський медичний журнал. - 2006. - №4. – С.8-11. Внесок дисертанта: експериментальні дослідження з аналізом та інтерпретацією отриманих результатів).
5. Гоженко А.І., Владимирова М.П., Топор О.А. Вплив бурштинової кислоти на функцію нирок білих щурів при гентаміциновій нефропатії // Фізіологічний журнал. – 2006. - №5. – С. 41-46. Внесок дисертанта: пошук та аналіз літературних джерел, експериментальні дослідження з аналізом та інтерпритацією отриманих результатів.
6. Владимирова М.П., Топор О.А., Савицький І.В. Вплив бурштинової кислоти на енергетичний обмін білих щурів при експериментальній сулемовій нефропатії // Клінічна та експериментальна патологія. – 2004. – Т.3, №2. – С.430-431. (Матеріали IV національного конгресу патофізіологів України з міжнародною участю. – Чернівці, 2004). Внесок дисертанта: аналіз літературних джерел, експериментальні дослідження з інтерпретацією отриманих результатів.
7. Владимирова М.П. Механизмы повреждения и компенсации почек при гентамициновой нефропатии // Бюлетень IV читань ім.В.В.Підвисоцького. – Одеса, 2005. – С.29.
8. Владимирова М.П., Кузьменко І.А. Вплив гентаміцину на осморегулюючу функцію нирок в експерименті // Тези доповідей Ювілейного VІІІ з’їзду ВУЛТ. - Київ, 2005. – С.150-151. Внесок дисертанта: пошук та аналіз літературних джерел, обгрунтування мети наукового
