ІНСТИТУТ ГЕРОНТОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ

ВАСИЛИНЧУК НАТАЛІЯ МИКОЛАЇВНА

УДК 616.12-091.8:616.153.922-008.61]-085-092.9

ЗМІНИ ЛІПІДНОГО СКЛАДУ, ВМІСТУ ПРОДУКТІВ ПЕРЕОКИСНЕННЯ КОМПОНЕНТІВ ПЛАЗМАТИЧНИХ МЕМБРАН КАРДІОМІОЦИТІВ І ФОРМЕНИХ ЕЛЕМЕНТІВ КРОВІ ЗА УМОВ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ГІПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМІЇ ТА СТРЕСУ І МОЖЛИВОСТІ ЇХ ФАРМАКОЛОГІЧНОЇ КОРЕКЦІЇ

03.00.04 - біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ - 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному науковому центрі “Інститут кардіології

імені академіка М.Д.Стражеска” АМН України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

Мхітарян Лаура Сократівна,

ННЦ “Інститут кардіології імені академіка

М.Д.Стражеска” АМН України,

керівник відділу біохімії.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук,

старший науковий співробітник

Новікова Світлана Миколаївна,

Інститут геронтології АМН України,

головний науковий співробітник лабораторії

регуляції метаболізму

доктор медичних наук, професор

Давидов Вадим Вячеславович,

Інститут охорони здоров’я дітей та підлітків АМН

України, завідувач лабораторії

вікової ендокринології та обміну речовин

Провідна установа - Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН

України, м. Київ, відділ експериментальної кардіології

Захист відбудеться “__31__” _травня_________ 2007 р. о _13 00_годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.551.01 в Інституті геронтології АМН України за адресою: 04114, м.Київ, вул.Вишгородська,67.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту геронтології АМН України (04114, м.Київ, вул.Вишгородська,67)

Автореферат розісланий “_27_” __квітня___________ 2007 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради Потапенко Р.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В теперішній час не викликає сумнівів провідна роль атерогенних дисліпопротеідемій в патогенезі атеросклерозу. Реалізація їх впливу на організм визначається широким діапазоном ефектів, які включають складні конформаційні зміни клітинних мембран, стимуляцію процесів вільнорадикального окиснення ліпідів, білків та інших речовин, зміни іонтранспортних систем в клітинах, функціональні порушення їх рецепторного апарату (В.В.Братусь и др., 2004; Е.И.Митченко, 2004; В.Н.Титов, 2001). Незважаючи на те, що центральне місце в патогенезі атеросклерозу належить ураженню стінки судин при взаємодії з компонентами системи крові (М.И.Лутай, 2004; М.Н.Долженко, 2005), не можна не враховувати можливість патогенного впливу вказаних факторів і на мембрани кардіоміоцитів, що може проявлятись порушенням функціонального стану міокарду, змінами його реактивності, скоротливої функції і ритмічної діяльності (В.И.Волков, 2006; А.В.Курята, 2004; В.А.Шумаков и др., 2005; A.M.Gotto, 2001). В той же час недостатньо вивченою є сама природа змін серцевого м’язу в умовах гіперхолестеринемії, стан її мембранних систем, а також можливий вклад вказаних змін у становлення патологічного процесу (А.Н.Климов,1999; В.Н.Титов, 2000). Слід також відмітити, що в поодиноких роботах, присвячених вивченню питань, які розглядаються, досліджувались не стільки початкові, ранні етапи патологічного процесу, коли ще є значна можливість його профілактики і зворотнього розвитку, скільки уже сформований патологічний стан пізньої (кінцевої) стадії його розвитку (М.И.Лутай и др., 2005).

Функціональний стан клітинних мембран в значній мірі визначається інтенсивністю процесів перeкисного окиснення ліпідів, які якісно і кількісно змінюють їх ліпідний склад, впливаючи тим самим на активність ліпідзалежних мембранних ферментів, іонних насосів, каналів і рецепторів (А.Н.Орехов, 2001; Ю.В.Абакумова, Ардаматский Н.А., 2002; А.П.Северин и др., 2000). Враховуючи білкову природу останніх, особливий інтерес викликає участь білків плазматичних мембран клітин, білків сироватки крові в механізмах розвитку оксидативного стресу при виникненні та прогресуванні атеросклерозу (Л.С.Мхітарян, О.Б.Кучменко, 2004).

Не менш важливим фактором ураження серця і судин є стрес-реакція, яка супроводжується синдромом пероксидації – порушенням збалансованості антиоксидантної і прооксидантної систем (В.А.Барабой, 2006; О.О.Мойбенко, 2005; М.Г.Пшенникова, 2001).

У зв’язку з цим дослідження характеру змін мембранних систем кардіоміоцитів, встановлення біохімічних механізмів їх виникнення в умовах гіперхолестеринемії і обумовленого нею оксидативного стресу і можливість їх корекції є актуальною проблемою (В.И.Волков, 2003; М.И.Лутай, 2004; Д.А.Затейщиков, 2003).

В клінічній практиці для лікування коронарного атеросклерозу та ішемічної хвороби серця (ІХС) широко та успішно застосовуються лікарські препарати, в тому числі антагоністи іонів кальцію (АК), інгібітори ангіотензинперетворюючого ферменту (АПФ) як антиангінальні, ангіопротекторні з антиатерогенним ефектом

засоби (М.И.Лутай, 2002; Г.В.Дзяк и др., 2002; С.Б.Французова, 2000; M.A.Рfeffer et al., 1998; О.В.Курята, В.П.Гейченко, 2001; А.В.Глущенко, М.С.Шуба, 2003; С.А.Костерин, 1990; Л.Т.Малая, 1997; Метелица В.И., 2002; W.L.Boden et al., 2000; A.Simon, 2002; Дегтерева О.В., 1988; Н.А.Горчакова, 1998). В то й же час вкрай недостатньо вивчені можливі метаболічні ефекти вказаних препаратів на біохімічний склад і функції мембранних систем клітин серця при атеросклерозі та ІХС. Звертає на себе увагу також той факт, що в більшості робіт, присвячених цій проблемі, в якості органа-мішені вивчались судини, центральний же орган кровообігу – сердце і мембранні системи його клітин – залишались поза увагою дослідників. В то й же час відомо, що фундаментальні властивості клітин серця – збудливість, проводимість, скоротливість обумовлені і регулюються ліпідним складом їх мембран. Тому вивчення змін біохімічних компонентів і порушень функції плазматичних мембран в умовах патології є актуальною проблемою і потребує подальшого дослідження.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота виконана у відповідності з планом науково-дослідних робіт (НДР) відділу біохімії Національного наукового центру “Інститут кардіології імені академіка М.Д.Стражеска” АМН України і є фрагментом НДР:

1)“Вивчити зміни рецепторного апарату і структурно-функціональний стан мембранних систем кардіоміоцитів, клітин судинної стінки і формених елементів крові при стресі і експериментальному атеросклерозі”, (ДР № UА 01008383 ІХ/22 ); 2)”Вивчити роль змін вільнорадикального окислення білків та ліпідів в механізмах розвитку недостатності коронарного кровообігу при атеросклерозі та загальних захворювань серця для визначення обгрунтованності їх корекції в комплексному лікуванні”, (ДР № ДРО 0101U000118).

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи було з’ясування стану плазматичних мембран кардіоміоцитів, клітин крові за умов експериментальної гіперхолестринемії і больового стресу, а також можливості фармакологічної корекції виявлених порушень на ранніх етапах розвитку патологічного процесу.

Для реалізації поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання - дослідити в умовах експериментальної гіперхолестеринемії (ГХЕ) та больового стресу:

стан поверхневого шару сарколеми кардіоміоцитів – глікокаліксу (вміст основних структурних компонентів – сіалових кислот і гексозамінів);

вміст в мембранах кардіоміоцитів і формених елементів крові (тромбоцитів і еритроцитів) основних структурних компонентів ліпідного матриксу – холестерину (ХС), фосфоліпідів (ФЛ), їх молярне співвідношення (ХС/ФЛ);

інтенсивність процесів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) (вміст первинних продуктів ПОЛ – дієнових кон’югатів і кінцевого – малонового діальдегиду), а також вільнорадикального окиснення білків (ВРОБ) (вміст кінцевих продуктів окисної модифікації - 2,4-динітрофенілгідразонів) в сарколемі кардіоміоцитів, мембранах формених елементів і сироватці крові;

активність ферментів системи антиоксидантного захисту - каталази і

супероксиддисмутази в мембранних структурах і сироватці крові;

іонтранспортні властивості сарколеми (активність Nа+,К+-АТФази);

щільність бета-адренорецепторів в сарколемі;

вплив дилтіазему і каптоприлу на виявлені зміни ліпідного складу, вмісту продуктів переокиснення компонентів плазматичних мембран кардіоміоцитів і формених елементів крові за умов експериментальної ГХЕ.

Об’єкт дослідження: зміни ліпідного складу, процеси переокиснення компонентів плазматичних мембран кардіоміоцитів і формених елементів крові (тромбоцитів, еритроцитів) за умов експериментальної гіперхолестеринемії та больового стресу.

Предмет дослідження: гіперхолестеринемія і больовий стрес, оксидативний стрес, можливість фармакологічної корекції змін мембран.

Методи дослідження. Центрифугування (виділення формених елементів крові та сироватки), диференціальне ультрацентрифугування (виділення та очищення мембранних структур) В експерименті застосовувались спектрофотометричні і спектрофлуориметричні методи визначення показників інтенсивності ПОЛ (малонового диальдегіду (МДА) і дієнових кон’югатів (ДК)), ВРОБ, активності ферментів системи антиоксидантного захисту (каталази і супероксиддисмутази), вмісту структурних компонентів мембран (гексоз, сіалових кислот, ХЛ, ФЛ), визначення концентрації білка, активності Nа+,К+-АТФази; метод радіолігандного зв’язування (визначення щільності бета-адренорецепторів в сарколемі). Статистична обробка отриманих результатів проводилась статистичними методами за допомогою пакету прикладних програм Microsoft Excel.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено характер структурної перебудови плазматичних мембран кардіоміоцитів на ранніх етапах експериментальної ГХЕ (до формування атероматозних бляшок). Показано, що вже на ранніх етапах розвитку експериментальної ГХЕ спостерігаються кількісні та якісні зміни поверхневого шару сарколеми кардіоміоцитів – глікокаліксу, її ліпідного матріксу, що характеризується зменшенням вмісту сіалових кислот і гексоз в поверхневому – зовнішньому шарі сарколеми, зміною щільності бета-адренорецепторів, а також збільшенням молярного співвідношення ХС/ФЛ за рахунок збільшення вмісту ХЛ в мембранах, накопиченням продуктів переокиснення та гідролізу ФЛ мембран – ДК, МДА.

Показано, що експериментальна ГХЕ супроводжується пригніченням активності ферментів системи антиоксидантного захисту, а також зниженням функціональної активності життєво важливого іонного насосу сарколеми - Nа+,К+-АТФази.

Встановлено, що на ранніх етапах ГХЕ відбуваються зміни щільності бета-адренорецепторного апарату сарколеми кардіоміоцитів, в механізмах яких важливу роль можуть грати порушення в кількісному та якісному складі ліпідних та неліпідних компонентів мембрани і, особливо, інтенсифікація процесів ПОЛ та ВРОБ, первісні і кінцеві продукти яких є прямими модуляторами рецепторного апарату клітин.

Встановлено, що в процесі формування оксидативного стресу в умовах експериментальної ГХЕ і больового стресу окрім ліпідних беруть участь також білкові компоненти мембран і периферичної крові, про що свідчить підвищення в них вмісту 2,4-динітрофенілгідразонів.

Вперше показано, що больовий стрес навіть у інтактних тварин має атерогенний ефект: сприяє збагаченню мембран кардіоміоцитів холестерином, тим самим порушуючи молярне співвідношення “ХС/ФЛ”. Встановлено, що поєднання ГХЕ і стресорного впливу призводить до більш значних у кількісному вираженні змінам ліпідного складу, показників стану оксидантно-антиоксидантної систем мембран клітин у порівнянні з ефектами кожного з цих факторів окремо.

Вперше показані мембранопротекторні ефекти дилтіазему та каптоприлу в умовах експериментальної атерогенної ГХЕ, що може бути враховано в кардіологічній практиці.

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведеної роботи можуть бути використані для розробки патогенетично обгрунтованих шляхів і засобів попередження та корекції порушень бар’єрної, іонтранспортної і рецепторної функцій сарколеми кардіоміоцитів на ранніх етапах розвитку атеросклеротичного процесу. Дані по характеру впливу дилтіазему та каптоприлу можуть бути враховані в кардіологічній практиці при складанні схем терапії із включенням вказаних лікарських засобів.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто проведено патентно-інформаційний пошук, опрацьована наукова література за темою дисертації. З огляду на актуальність і ступінь вивчення проблеми аргументовано робочу гіпотезу дослідження, самостійно сформульовано мету і завдання, обгрунтовані і вибрані методичні підходи і біохімічні методи дослідження. Автором виконана експериментальна частина роботи, збір і обробка лабораторного матеріалу, виділення мембранних структур міокарду і клітин крові, визначення вмісту в них структурних компонентів, активності ферментів. Автором проведена статистична обробка і аналіз отриманих результатів із застосуванням сучасних математичних методів і компютерної техніки, сформулировані основні положення і висновки.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були оприлюднені на IV з’їзді кардіологів України ( Дніпропетровськ, 1993 р.); Міжнародному конгресі в США “The ХVth Meeting (American Section) of the International Society for Heart Research”, (Missouri, USA, 1993); III Республіканському з’їзді кардіологів Білорусі разом з Асоціацією кардіологів СНД “Актуальные вопросы кардиологии” (Мінськ, 1994 р.); Міжнародному симпозиумі в Монреалі (Канада) “The International Symposium of Atherosclerosis of Int. Atherosclerosis Society (Monreal, 1994); XV Міжнародному конгресі в Празі (Чехія) “The XV World Congress of the Int.Society for Heart Research” (Prague,1995); XV Конгресі Європейської спілки кардіологів (Амстердам, 1995 р.); V конгресі кардіологів України (Київ, 1997 р.); Міжнародному кардіологічному форумі “Кардіологія вчора, сьогодні, завтра” (Київ, 2006 р.); Міжнародній науково-практичній конференції “Біологічне окиснення в нормі і патології” (Тернопіль, 2006 р.), ІХ Українському з’їзді біохіміків (Харків, 2006 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 13 робіт, серед яких 6 статей у фахових наукових виданнях, що входять до переліку, затвердженого ВАК України, і 7 тез доповідей у збірках матеріалів вітчизняних та міжнародних з’їздів, конгресів та конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 184 сторінках друкованого тексту і складається із вступу, 5 розділів, списку 269 використаних джерел (182 робіт українською та російськими мовами і 87 іноземних джерел, що займає 27 сторінок). Дисертація ілюстрована 26 таблицями і 15 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Експериментальні дослідження проведені на безпородних кролях з масою тіла 2,8-3,0 кг, які перебували на стандартному раціоні харчування та утриманні у віварії.

В роботі були використані експериментальні моделі гіперхолестеринемії (ГХЕ), больового стресу (одноразового та довготривалого) та довготривалого больового стресу на тлі ГХЕ.

Експериментальну гіперхолестеринемію викликали щоденним годуванням піддослідних тварин зависсю холестерину із розрахунку 0,5 г на кг маси тіла, в 10 % розчині рослинної олії на протязі 8 тижнів.

Для моделювання больового стресу використали класичне больове подразнення з допомогою електричного струму (O.Desiderato, Ф.З. Меєрсона) При відпрацьовуванні даної експериментальної моделі (разом з провідним науковим співробітником відділу біохімії ННЦ “Інститут кардіології імені академіка М.Д.Стражеско”, д.м.н. Орловою Н.М.) була сконструйована спеціальна металева клітка, на дно якої через випадкові проміжки часу подавали імпульси електричного струму силою до 5 мА. Тривалість стресорного впливу (сеансу) була в середньому 1 год. Ефективність стресорного впливу оцінювали за поведінкою тварин (неспокій, рухова активність) та збільшенням вмісту 11-оксикортикостероідів в плазмі крові в 2-5 раз.

Для моделювання довготривалого больового стресу на тлі ГХЕ у тварин відтворювали аліментарну гіперхолестеринемію на протязі 2 місяців. Через 6 тижнів від початку навантаження холестерином приєднували сеанси електробольового подразнення, які продовжувались на протязі 2 тижнів. Розроблена модель включала 8 сеансів електробольового подразнення, які чергувались випадково через нерівномірні проміжки часу – від одної до трьох діб. Тривалість кожного сеансу становила 1 годину, в межах якої емпірично підібраний режим електробольового подразнення складався з випадкового чергування періодів подразнення і відпочинку.

У роботі використані лікарські препарати – з групи антагоністів кальцію – дилтіазем, з групи інгібіторів ангіотензинперетворюючого ферменту – каптоприл.

Всього в експериментах було використано 145 тварин. В залежності від задачі дослідження тварини були розподілені на такі групи: 1-у (контрольну) склали інтактні тварини; 2-у – тварини з експериментальною ГХЕ; 3-ю групу склали інтактні тварини, які підпадали впливу одноразового стресу; 4-у – інтактні тварини, які підпадали довготривалому стресорному впливу; 5-у – тварини з експериментальною ГХЕ, які підпадали довготривалому стресорному впливу; 6-у – тварини з експериментальною ГХЕ, у яких на протязі останніх двох тижнів на тлі атерогенної дієти застосовувалось курсове введення дилтіазему per os в дозі 5 мг на кг маси тіла щоденно; 7-у - тварини з експериментальною ГХЕ, у яких на протязі останніх двох тижнів на тлі атерогенної дієти застосовувалось курсове введення каптоприлу per os в дозі 1 мг на кг маси тіла щоденно.

Експерименти були проведені з дотриманням вимог гуманного ставлення до тварин, під наркозом (етамінал натрію в дозі 30 мг на 1 кг маси тіла внутрішньовенно).

Біохімічному дослідженню піддавали міокард піддослідних тварин, виділені з нього і очищені мембранні структури, сироватку і формені елементи крові (тромбоцити та еритроцити). Слід врахувати, що для отримання достатньої кількості білку мембран для досліджень в одному експерименті були об’єднані тканини міокарду мінімум трьох піддослідних тварин.

Після закінчення строку експерименту із міокарда піддослідних тварин було отримано і очищено везикульовані фрагменти сарколеми кардіоміоцитів із застосуванням методів диференційного ультрацентрифугування (Louis P.J., Sulakhe P.V., 1976). Мембранні структури виділяли і очищували з використанням препаративної ультрацентрифуги VAC-602 (ГДР) і ультрацентрифуги 1-5-50 “Бекман” (США). Про якісь і чистоту отриманого препатару мембран висновки робили на основі електронномікроскопічного контролю та визначення активності маркерних ферментів – 5-нуклкеотидази (Aronson N.N., Touster O., 1974) і Nа+,К+-АТФази (Даниленко М.П., Ким Є.А., Омарова Р.Д. и др.,1983). Активність вказаних ферментів вимірювали за збільшенням вмісту у середовищі інкубації неорганічного фосфату, який утворився внаслідок ферментативної реакції між ферментом та субстратом. Концентрацію неорганічного фосфату визначали за методом (Rathbun W.B. et al., 1969). Сироватку та мембрани формених елементів крові виділяли за допомогою центрифугування на центрифузі ОПН-3 з використанням загальновідомих методів (Чиркин А.А., 2002). Для оцінки стану зовнішнього поверхневого шару сарколеми – глікокаліксу – визначали вміст в мембрані структурних компонентів – сіалових кислот та гексозамінів за описаними в літературі спектрофотометричним методам (Колб В.Г., Камышников В.С., 1982; Камышников В.С., 2000). Для визначення вмісту основних структурних компонентів ліпідного матриксу сарколеми і мембран формених елементів крові – холестерину і фосфоліпідів – з подальшим розрахунком їх молярного співвідношення (ХС/ФЛ) – використовували хлороформ-метанолові екстракти із суспензій вказаних мембранних структур, які було отримано за методом (Folch J.M. et al., 1957). Вміст холестерину визначали з використанням біохімічного автоматичного аналізатора “Express-550” (“Ciba-Corning”, Великобританія), діагностичних тест-систем і реагентів фірми. Вміст фосфоліпідів визначали спектрофотометрично (Fiske S.H., Subarrow J., 1925). Визначення щільності бета-адренорецепторів проводили з використанням (3Н)дигідроалпренололу (Lifrowitz R.J. et al., 1976); радіоактивність рахували в сцинтилляційному лічильнику “Delta-300”. Інтенсивність процесів ПОЛ оцінювали за вмістом первинних та кінцевих продуктів цих реакцій – дієнових кон’югатів (ДК) та малонового диальдегіду (МДА), які визначали спектрофотометрично з використанням методів в модифікації Стальної І.Д. і співавт. (Орехович В.Н.,1977). Вміст кінцевих продуктів окислювальної модифікації білків сироватки крові та в гомогенатах міокарду визначали за методом Дубініної О.Є. і співавт. (1995), де вміст продуктів вільнорадикального окислення білків (ВРОБ) оцінювали за оптичною щільністю утворених 2,4-динітрофенілгідразонів. З факторів антиоксидантного захисту проводили вивчення активності каталази (КТ) (Архипова О.Г., 1988) і супероксиддисмутази (СОД). Активність СОД оцінювали за зниженням інтенсивності аутоокислення адреналіну в адренохром, вміст якого визначали спектрофлуориметрично (Misra H., Fridovich I., 1969). Вміст білка у мембранних препаратах визначали за Лоурі О.Н. (1951).

Результати досліджень оброблено методами варіаційної статистики на персональному комп’ютері з використанням програм Microsoft Excel і Statistica 5.0. Числові дані представлено як середні величини зі стандартною помилкою (Mm). Вірогідність отриманих результатів визначали, використовуючи t-критерій вірогідності Стьюдента. Статистично значущою вважали відмінність показників при р0,05.

Результати досліджень та їх обговорення

Проведені дослідження показали, що вже на ранніх етапах розвитку експериментальної ГХЕ відбувається структурна перебудова сарколеми кардіоміоцитів. Спостерігалось зменшення вмісту основних структурних компонентів поверхневого шару сарколеми – глікокаліксу – гексоз і сіалових кислот відповідно на 34 % і на 44 % у порівнянні з контролем. Одночасно з цим в сарколемі вміст холестерину (ХС) збільшився на 81 % у порівнянні з контрольними показниками. Мембрани формених елементів крові також збагачувались ХС: приріст цього показника в мембранах тромбоцитів та еритроцитів склав, відповідно, 64 % і 100 % у порівнянні з контролем. Вміст фосфоліпідів (ФЛ) в досліджуваних мембранах, навпаки, знижувався: найбільш суттєво - в сарколемі кардіоміоцитів – на 44 % порівняно з контролем, та менш виражено - в мембранах тромбоцитів та еритроцитів (відповідно на 18 % та 16 % менше у порівнянні з контролем). В результаті вказаних змін молярне співвідношення “холестерин/фосфоліпіди” (ХС/ФЛ) зростало: в сарколемі більш ніж у 3 рази, в тромбоцитах і еритроцитах, в середньому, в 2 рази у порівнянні з контролем (рис.1).

Слід відмітити, що співвідношення вмісту ХЛ і ФЛ змінювалось також у внутрішньоклітинних мембранних структурах – мітохондріях: рівень ХС в них вірогідно зростав на 22 %, а вміст ФЛ зменшувався на 31 % порівняно з контролем; молярне співвідношення ХС/ФЛ збільшувалось в 1,9 раза.

Проведені дослідження показали, що експериментальна ГХЕ супроводжувалась активацією вільнорадикальних окислювальних реакцій. В сироватці крові піддослідних тварин відмічалось значне накопичення продуктів ПОЛ – вміст ДК збільшився в 6,6 раз, МДА – в 2,9 рази. Спостерігалось також достовірне збільшення вмісту кінцевих продуктів окислювальної модифікації білків сироватки крові (ВРОБ) – 2,4-ДНФ-гідразонів - на 96 % у порівнянні з контролем. Аналогічну направленість мали зміни вмісту продуктів ПОЛ в формених елементах крові експериментальних тварин: приріст ДК і МДА склав в еритроцитах і тромбоцитах відповідно 70 % і 150 % у порівнянні з контролем. В сарколемі кардіоміоцитів вміст ДК і МДА збільшився, в середньому, в 2-2,5 рази у порівнянні з контролем (рис.1). Накопичення продуктів ПОЛ відбувалось також в мітохондріях, виділених із міокарду експериментальних тварин: вміст ДК і МДА в них зріс в 2,5 та 1,4 рази у порівнянні з контролем. В міокарді суттєво (на 72 %) збільшився вміст продуктів ВРОБ.

Рис.1 Зміни вмісту продуктів ПОЛ та структурних компонентів у сарколемі міокарду кролів з експериментальною ГХЕ (%): - р0,05 відносно контролю на цьому рисунку та всіх інших.

Вивчення активності антиоксидантних ферментів – КТ і СОД в умовах експериментальної ГХЕ дозволило зробити висновок, що пригнічення каталітичної

активності вказаних ферментів має однонаправлений характер як на системному рівні (сироватка крові), так і в мембранних структурах кардіоміоцитів і клітин крові. Так, активність КТ і СОД у сироватці крові снижувалась у 2 і в1,9 раза у порівнянні з контролем, в міокарді – відповідно у 1,9 і 2 рази порівняно з тваринами контрольної групи. Таким чином, вже на ранньому етапі розвитку ГХЕ спостерігається виражений синдром пероксидації в крові і тканині міокарду експериментальних тварин на фоні значного зниження активності ферментної антиоксидантної ланки захисту, що може оцінюватись як розвиток оксидативного стресу в організмі піддослідних тварин.

Слід відмітити, що при експериментальній ГХЕ спостерігається також достовірне зниження каталітичної активності Nа,К-АТФази – на 46 % по відношенню до контролю (від 10,700,26 мкмоль Фн/мг білка/год в контролі до 5,800,13 мкмоль Фн/мг білка/год при експериментальній ГХЕ).

Дослідження щільності бета-адренорецепторів сарколеми міокарду виявило, що в мембранах кардіоміоцитів і тромбоцитів кролів, які утримувались на протязі двох місяців на холестериновій дієті, містилось значно більше місць зв’язування (3Н)-дигідроалпренололу (відповідно на 95 % і 30 %) порівнянно з контрольними показниками.

Таким чином, в умовах оксидатавного стресу, який супроводжує експериментальну ГХЕ, відбуваються якісні та кількісні зміни структури глікокаліксу, ліпідного бішару плазматичних мембран кардіоміоцитів, що виражається в значному збільшенні рівня ХС, зменшенні вмісту ФЛ, накопиченні в них продуктів ПОЛ, ВРОБ на фоні пригнічення активності ферментної антиоксидантної системи; зміни активності Na+,К+-АТФази та щільності бета-адренорецепторів мембран.

Вивчення компонентів глікокаліксу плазматичних мембран кардіоміоцитів в умовах стресорного впливу у інтактних тварин показало, що експериментальний стрес супроводжується змінами вмісту гексоз і сіалових кислот в поверхневому шарі мембран. Так, їх вміст достовірно зменшувався у порівнянні з контролем відповідно на 60 % і 41 % в результаті короткотривалаго стресорного впливу.

Слід відмітити, що вже при короткотривалому стресорному впливі у інтактних тварин виникали виражені зміни про- і антиоксидантних систем як в окремих клітинних мембранах, так і в організмі в цілому. В сироватці крові піддослідних тварин вміст ДК збільшився у 2,5 рази, а МДА – в 2 рази. Короткотривалий стрес обумовлював відчутну активацію процесів ПОЛ в мембранах формених елементів крові, причому більш виражену в тромбоцитах, ніж в еритроцитах: в мембранах тромбоцитів вірогідно (в 1,5 раза у порівнянні з контролем) збільшувався вміст ДК і МДА. Вивчення мембран кардіоміоцитів – сарколеми та мітохондрій в цих умовах показало, що вміст ДК в сарколемі достовірно не відрізнявся від вихідних показників, але збільшувався в мітохондріях. Активація ПОЛ під впливом стресу на протязі 1 год сприяла достовірному (в 2 рази) збільшенню вмісту МДА в сарколемі і мітохондріях мембран кардіоміоцитів.

Активація процесів ПОЛ в міокарді і клітинах крові в умовах короткотривалого стресорного впливу супроводжувалась вираженими змінами ліпідного складу мембранних структур. При цьому в плазматичних мембранах кардіоміоцитів спостерігалось збільшення вмісту ХС (на 32 %) і ФЛ (в сарколемі – в 1,7 раза, в мембранах мітохондрій – на 22 %), в мембранах формених елементів крові – збільшення вмісту ХС ( в тромбоцитах - на 80 %) в поєднанні із зменшенням вмісту ФЛ (в тромбоцитах – на 35 %). В еритроцитарній мембрані не спостерігалось суттєвих змін основних компонентів ліпідного бішару и коеффіцієнт ХС/ФЛ майже не відрізнявся від контрольної величини. На відміну від еритроцитів, в мембранах тромбоцитів величина ХС/ФЛ збільшувалась у 2 рази, в сарколемі кардіоміоцитів спостерігали зменшення цього показаника на 40 %, в мітохондріях вказаний еффект проявився в якості тенденції.

Довготривалий стрес спричинив менш виражені зміни стану глікокаліксу, ніж короткотривалий – вміст гексоз та сіаловых кислот зменшився на 30 % і 20 % відповідно (у порівнянні з контролем).

При довготривалому стресорному впливі було відмічено зменшення щільності бета-адренорецепторів в сарколемі кардіоміоцитів та мембранах тромбоцитів експериментальних тварин: відповідно, на 60 % і 34 % по відношенню до контролю.

При довготривалому стресорному впливі не відмічалось вірогідного збільшення вмісту продуктів ПОЛ (ДК) в сироватці крові. Рівень МДА виявляв тенденцію до збільшення (на 17 % у порівнянні з контролем). Це може бути пов’язано із компенсаторним підвищенням активності антиоксидантних систем, про що свідчила достовірна активація КТ в сироватці крові.

Менш виражені зміни цих показників у порівнянні з короткотривалим стресорним впливом були також відмічені в сарколемі: рівень ДК виявляв тенденцію до підвищення, рівень МДА був близький до контролю. Поряд з цим, рівень ДК в мембранах мітохондрій кардіоміоцитів і мембранах тромбоцитів був підвищений у 2 рази. Збільшений при короткотривалому стресі вміст МДА в мітохондріях і мембранах еритроцитів продовжував зростати.

Таким чином, на відміну від короткотривалого, при довготривалому стресі слід відмітити менш виражену інтенсивність процесів ПОЛ. Вірогідно, це можна розцінювати як адаптивну реакцію, яка встигає розвинутись у динаміці довготривалого експерименту.

Вказані зміни спостерігали на фоні достовірної активації в сироватці антиоксидантного фермента КТ – в умовах довготривалого стресорного впливу цей показник виявився на 20 % вище контрольних. Зниження активності СОД в сироватці крові в цих умовах виявилось менш вираженим, ніж при короткотривалому стресорному впливі – на 40 % менше контрольних показників (при короткотривалому впливі – на 55 %). При довготривалому стресі спостерігалась також деяка активація антиоксидантних ферментів і в міокарді.

Зміни ліпідного складу досліджуваних мембранних структур в умовах довготривалого стресу характеризувались відносною нормалізацією рівня ХС в сарколемі і ФЛ в мембранах тромбоцитів, зменшенням молярного співвідношення ХС/ФЛ в мембранах тромбоцитів. Деякі зміни, що виникли під впливом короткотривалого впливу, при довготривалому стресі полиблювались: підвищувався вміст ХС в мембранах формених елементів крові при зменшенні рівня ФЛ та збільшенні співвідношення ХС/ФЛ в мембранах еритроцитів. В сарколемі, на відміну від мітохондрій, зберігався помірно підвищений рівень ФЛ, що супроводжувалось зниженням показника щільності упаковки мембранних структур (ХС/ФЛ).

В умовах стресорного впливу (у інтактних тварин з незміненим ліпідним обміном - без ГХЕ) каталітична активність Nа,К-АТФази достовірно зменшилась порівняно з контролем, причому більш суттєво при короткотривалому стресорному впливі – на 52 % ( при довготривалому – на 46 % у порівнянні з контрольними показниками).

Вивчення стану глікокаліксу плазматичних мембран кардіоміоцитів в умовах поєднаного впливу ГХЕ та стресу показало, що в цих умовах зміни в поверхневому шарі вказаних мембран значно посилювались у порівнянні із впливом цих факторів окремо: вміст гексоз і сіалових кислот вірогідно зменшувався порівняно з контролем відповідно на 73 % і 55 % .

При довготривалому стресорному впливі на фоні ГХЕ спостерігалось збільшення кількості адренорецепторів в сарколемі кардіоміоцитів і мембранах тромбоцитів експериментальних тварин, однак не таке значне, як при ізольованій ГХЕ: щільність бета-адренорецепторів в цих умовах в міокарді і мембранах тромбоцитів збільшувалась, відповідно, на 39 % і 16 % по відношенню до контролю.

В усіх досліджуваних мембранах направленність змін вмісту ліпідних компонентів виявилась однаковою – в них підвищувався вміст як ХС, так і ФЛ. Однак кількісні характеристики цих реакцій мали свої особливості. Так, ХС накопичувався переважно в мембранах тромбоцитів (його вміст збільшився в 4,6 рази), потім в мембранах еритроцитів, сарколемі, менше всього – у внутрішньоклітинних органелах – мітохондріях (відповідно на 175%, 125% і 40%). Зміни вмісту ФЛ розподілялись інакше: в мембранах формених елементів крові спостерігалась лише тенденція до його підвищення (в тромбоцитах – на 12%, в еритроцитах – на 18%) , в сарколемі, і особливо, в мітохондріях його вміст зростав більш виразно (на 30% і 48% відповідно у порівнянні з контрольним рівнем).

В даних умовах експерименту спостерігалось суттєве підвищення щільності тромбоцитарної мембрани за рахунок накопичення ХС, внаслідок чого коефіцієнт ХС/ФЛ збільшився на 305% (з 0,37 до 1,5). Підвищення цього показника (ХС/ФЛ) було визначено і в еритроцитарній мембрані – на 120% (з 0,5 до 1,1). Це підвищення пов’язане в значній мірі із збільшенням вмісту ХС в мембрані еритроцитів. Сарколема кардіоміоцитів характеризувалась значним збільшенням вмісту як ХС, так і ФЛ, однак у зв’язку з більш суттєвим накопиченням ХС коефіцієнт ХС/ФЛ підвищувався на 70% (з 0,64 до 1,09). Таким чином, стрес на тлі ГХЕ характеризувався збільшенням молярного співвідношення ХС/ФЛ в сарколемі кардіоміоцитів. В цих же умовах мембрана мітохондрій накопичує як ХС, так і ФЛ, причому в більшій мірі спостерігалось накопичення ФЛ (коефіцієнт ХС/ФЛ проявляв деяку тенденцію до зниження - з 0,32 до 0,26, тобто на 19%).

При ГХЕ в поєднанні з довготривалим стресорним впливом спостерігалося досить значне (в 6 разів) підвищення вмісту первинних продуктів ПОЛ у сироватці крові (рис.2). Вміст ДК в тромбоцитах був на 74%, а МДА – на 77% вище, ніж у

Рис.2. Стан про- і антиоксидантної систем сироватки крові кролів в умовах поєднаної дії ГХЕ та стресу (%).

контролі. Було встановлено також накопичення продуктів ПОЛ і в мембранах еритроцитів: вміст ДК в них збільшився на 60%, МДА – на 140%. ГХЕ в поєднанні із стресом здійснювали виразний вплив і на стан мембранних систем кардіоміоцитів. Рівень накопичення в них проміжних продуктів ПОЛ підвищувався: в сарколемі на 155%, в мітохондріях – на 117% ; МДА – на 135% і 123% відповідно.

Ці зміни розвивались на тлі пригнічення ферментативної ланки антиоксидантного захисту. Так, в сироватці крові спостерігали вірогідне зниження активності КТ і СОД – на 35% і 60% відповідно (рис.2). В тканині міокарду експериментальних тварин в цих умовах активність КТ і СОД вірогідно знижувалась відповідно на 25% і 63% у порівнянні з контролем. Очевидно, що поєднаний вплив пошкоджуючих факторів здійснив значно більш згубну дію на активність цих ферментів, ніж ГХЕ і стрес окремо.

Вивчення активності Nа,К-АТФази в сарколемі кардіоміоцитів виявило, що в умовах експериментальної ГХЕ в поєднанні із стресом спостерігалось подальше

(вірогідне) пригнічення активності цього ферменту у порівнянні з контролем (від 10,700,96 в контролі до 4,9 0,35 мкмоль Фн/мг білка/год при поєднаній дії ГХЕ та стресу).

Співставлення якісних і кількісних ефектів активації процесів ПОЛ та структурної перебудови клітинних мембран в умовах окремого моделювання ГХЕ і стресу та при їх поєднаному впливі дозволило виділити варіанти поєднання ефектів, обумовлених кожним з цих патологічних станів: кумулятивні ефекти на досліджувані мембранні системи (наприклад, величина приросту вмісту ДК в сарколемі, інтенсивне накопичення ХС в мембранах тромбоцитів, збільшення молярного співвідношення ХС/ФЛ в їх мембранах); однонаправлені реакції без кумулятивного ефекту (накопичення ДК в тромбоцитах і мітохондріях та МДА – в еритроцитах, а також підвищення співвідношення ХС/ФЛ в тромбоцитах); поєднання різнонаправлених реакцій з перевагою ефектів ГХЕ (зростання вмісту ДК в сироватці крові та одночасному зменшенні її антиоксидантного потенціалу; підвищення вмісту ДК в еритроцитах і МДА в тромбоцитах, а також ХС в мітохондріях і сарколемі із зростанням співвідношення ХС/ФЛ в їх мембранах) і з перевагою ефектів стресу (помірне збільшення вмісту ФЛ в сарколемі) (рис.3).

Рис.3. Зміни вмісту продуктів ПОЛ та структурних компонентів у сарколемі міокарду кролів в умовах експериментальної ГХЕ, стресу та їх поєднаному впливі

Особливої уваги заслуговує виявлене при поєднанні ГХЕ і стресу посилене накопичення ФЛ в клітинних мембранах – реакція, яка при підвищенні вмісту ХС в мембранах може бути оцінена як ефект, що має компенсаторне значення, направлена на підтримку молярного співвідношення ХС/ФЛ в межах фізіологічних значень.

Під впливом курсового застосування дилтіазему найбільш суттєві зміни, що вказують на позитивну дію препарату щодо структурного складу мембран, відбуваються в сарколемі кардіоміоцитів (рис.4): вміст гексоз і сіаловых кислот нормалізувався і навіть дещо перевищував контрольні показники - на 21% і 17% відповідно. Щільність бета-адренорецепторів в міокарді і мембранах тромбоцитів зменшувався, відповідно, на 58% і 30% у порівнянні з показниками у тварин з ГХЕ, що не приймали препарат, достовірно не відрізняючись від контролю. Вміст ХС і ФЛ в мембранах кардіоміоцитів також вірогідно не відрізнявся від контролю, у зв’язку з чим наближалась до контролю і величина співвідношення ХС/ФЛ, відрізняючись від вихідного рівня всього на 8% (р0,05). Поряд з цим спостерігали вірогідне підвищення активності Na+,К+-АТФази (8,260,75 у порівнянні з 5,800,13 мкмоль Фн/мг білка/год при ГХЕ без введення препарату; в контролі – 10,70,26 мкмоль Фн/мг білка/год). Таким чином, дилтіазем має антиатерогенні властивості, здатність до нормалізації ліпідного складу клітинних мембран кардіоміоцитів та щільності мембранних бетаадренорецепторів, сприяє зберіганню ФЛ у сарколемі та молярного співвідношення ХС/ФЛ.

Рис.4 Зміни вмісту продуктів ПОЛ та структурних компонентів у сарколемі міокарду кролів з експериментальною ГХЕ під впливом крсового застосування дилтіазему та каптоприлу (%);

** - р0,05 відносно ГХЕ

Дилтіазем також значно пригнічує процеси ПОЛ (рис.5) і ВРОБ в сарколемі кардіоміоцитів (ДК і МДА знижувались на 43% порівнянно з групою тварин з ГХЕ без введення препарату, в міокарді – більш як у 2 рази; вміст продуктів ВРОБ в міокарді знижувався до рівня контролю - в 2,2 рази), в сироватці крові спостерігали зменшення рівня ДК майже у 4 рази, МДА на 54%, ВРОБ на 60% (рис.5); в меншій мірі - в мембранах еритроцитів і тромбоцитів. Це може сприяти зменшенню пошкодження клітин міокарду вільнорадикальними сполуками і, таким чином, здійснювати безпосередній їх захист.

Рис.5. Зміни вмісту продуктів ПОЛ в сироватці крові кролів з експериментальною ГХЕ під впливом курсового застосування дилтіазему та каптоприлу (%);** - р0,05 відносно ГХЕ

Дилтіазем здійснював також нормалізуючий вплив на ферменти антиоксидантного захисту: в міокарді активність КТ і СОД зростала відповідно на 44% і 61% порівняно з групою тварин без введення препарату, в сироватці – на 68% і 192% (рис.5). Таким чином, дилтіазем зменшував дисбаланс між про- та антиоксидантними системами і цим самим знижував інтенсивність оксидативного стресу в умовах експериментальної ГХЕ.

Аналізуючи отримані результати, слід відзначити, що дилтіазем, окрім свого специфічного, блокуючого вхід кальцію в клітину ефекту, має більш багатогранний вплив на міокардіальні клітини.

Курсове застосування каптоприлу призводило до значного зменшення вираженості патологічних змін показників, що вивчались: вміст гексоз і сіалових кислот в глікокаліксі (їх вміст був тільки на 8% і 10% менше контрольних показників), вміст ХС і ФЛ в ліпідному матриксі мембран наближався до контролю, у зв’язку з чим зменшилась і величина співвідношення ХС/ФЛ (на 55% у порівнянні з ГХЕ; рис.4). Активність Na+,К+-АТФази при цьому також проявляла тенденцію до нормалізації, однак не досягала рівня контролю - від 5,800,13 при ГХЕ до 6,40+0,25 мкмоль Фн/мг білка/год під впливом курсового введення каптоприлу, р0,05).

Аналізуючи вплив каптоприлу на показники ПОЛ, слід відмітити їх позитивну динаміку: відбувалось вірогідне зниження рівнів ДК та МДА в сарколемі кардіоміоцитів (на 27% і 30% відповідно; рис.4), в сироватці крові (на 37% і 42% відповідно; рис.5), а також в мембранах тромбоцитів і еритроцитів у порівнянні з показниками при ГХЕ без введення препарату.

При цьому слід зауважити, що мембранопротекторний вплив каптоприлу проявлявся і в значному пригніченні вільнорадикальної модифікації білкових молекул в умовах експерименту. На це вказує вірогідне зменшення продуктів ВРОБ (в 2,6 рази) в міокарді кролів під впливом курсового застосування каптоприлу при експериментальній ГХЕ, в сироватці - на 50% у порівнянні з тваринами з ГХЕ, яким препарат не вводився.

Отже, каптоприл, окрім основного відомого специфічного ефекту (інгібірування АПФ, тобто переходу ангіотензинуI в ангіотензинII), має здатність до нормалізації ліпідної структури клітинних мембран, явні антиоксидантні властивості, зменшуючи інтенсифікацію вільнорадикальних окислювальних процесів в міокардіальних клітинах, в формених елементах крові - еритроцитах і тромбоцитах, а також збільшуючи антиоксидантний потенціал крові,