УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР

”ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ”

ЯРОШЕНКО МАРГАРИТА ОЛЕГІВНА

УДК 619:615.9:632.95

ТОКСИКОЛОГІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕЛЬТАМЕТРИНУ

У ФОРМІ ДЕЦИС ФОРТЕ

16.00.04 – ветеринарна фармакологія та токсикологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Харків – 2007Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному науковому центрі “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини”.

Наукові керівники: | доктор ветеринарних наук Шуляк Василь Дмитрович;

доктор ветеринарних наук, старший науковий співробітник Куцан Олександр Тихонович,

ННЦ „Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини”,

заступник директора з наукової роботи і міжнародних відносин, завідувач лабораторії безпеки та якості сільськогосподарської продукції

Офіційні опоненти: |

доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН

Хмельницький Григорій Олександрович,

Національний аграрний університет,

директор НДІ здоров’я тварин;

доктор ветеринарних наук, професор

Гуфрій Дмитро Федорович,

Львівська національна академія ветеринарної медицини ім. С.З. Ґжицького, завідувач кафедри фармакології та токсикології.

Провідна установа – | Державний науково-дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів та кормових добавок, відділ фармакології і імунології,

Міністерство аграрної політики України, м. Львів.

Захист відбудеться “ 12 ” червня 2007 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 в ННЦ “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ННЦ “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий “ 7 ” травня 2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук, професор _____________ Бабкін А.Ф.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В умовах подальшої інтенсифікації сільського господарства невід'ємним складником технології обробки культурних рослин і підвищення продуктивності тваринництва є їх захист від шкідливих членистоногих (Ткачов А.В., 2004). Проте, з позитивною характеристикою використання пестицидів є й певні негативні наслідки їх широкого та науково необґрунтованого застосування. Це, передусім, здатність зберігатися протягом тривалого часу в навколишньому середовищі, накопичуватися в кормах та продуктах харчування. Використання пестицидів у обробках на значних територіях призводить до їх розповсюдження у ґрунті, водоймищах, рослинах, що створює реальні умови для проникнення цих речовин до організму тварин і людини (Мартиненко В.І., Промоненков В.К., Кукаленко С.С. та ін., 1992; Клісенко М.А., Демченко В.Ф., Макарчук Т.Л.,1999; Малинін О.О., Хмельницький Г.О., Куцан О.Т., 2002).

Піретроїдні інсектициди  препарати, які широко застосовуються як у рослинництві, так і у ветеринарній медицині. Відомо, що ці пестициди мають низький рівень кумуляції, незначні тератогенні, мутагенні, ембріотоксичні, бластомогенні та не встановлені канцерогенні властивості (Бредбері С.П., Коупс Дж. Р., 1993; Шепельська Н.Р.,1999).

З одного боку, ці сполуки відносно швидко руйнуються у навколишньому середовищі, особливо під впливом сонячного проміння, що характеризує низьку вірогідність забруднення ними довкілля, а з другого боку – ця властивість обумовлює їх недостатню експозицію під час обробки об'єктів (Андрєєв Л.М., Перлова Т.Г., Промоненков В.К., 1992).

Поява на ринку пестицидів значної кількості різних форм препаратів з діючою речовиною (д.р.) дельтаметрином потребує більш глибокого вивчення їх токсикологічних характеристик щодо біологічних об'єктів.

Децис форте 12,5к.е. – синтетичний піретроїд третього покоління, у якому збережена стереохімія ефіру циклопропанкарбонової кислоти початкового піретрину І, а спиртова та кислотна частини сполуки представлені L-ціано-3-феноксибензильною групою та дибромвініловою в боковому ланцюзі цис-положення (Deltamethrin, IARC Summary and Evaluation, 1997).

Для цього препарату характерна висока швидкість біотрансформації з утворенням у рослинах вуглеводнів і амінокислот, а в організмі тварин – сульфатів і глюкуронатів та виведення його з організму (Малинін О.О., Шуляк В.Д., Бабій Л.І. та ін. 1995; ., ., ., et all., 2001).

Через відсутність даних щодо параметрів гострої токсичності дельтаметрину у формі децис форте, а також суперечливість результатів щодо цитотоксичних властивостей, особливостей його токсикокінетики та токсикодинаміки в гострому та хронічному експериментах, використання недосконалих методик визначення залишкових кількостей згаданого вище препарату є актуальним і необхідним для проведення додаткових досліджень, в яких би визначили ці характеристики інсектициду. Згідно з даними зарубіжної літератури, це питання маловивчене, а у вітчизняній розробляється вперше.

Зв’язок роботи з науковими програмами. Дисертаційна робота є окремою частиною досліджень лабораторії токсикологічного моніторингу, які виконувалися згідно з Державними тематичними планами наукових досліджень ІЕКВМ УААН: Завдання 10 „Провести дослідження по створенню нових хіміко-фармацевтичних лікарських засобів, антибіотиків, фітопрепаратів і профілактики токсикозів” (1996 –2000 рр., номер державної реєстрації 0197 U 000763), Завдання 11 „Розробити методи визначення і засоби профілактики впливу негативних факторів зовнішнього середовища на організм сільськогосподарських тварин з метою одержання екологічно безпечних продуктів тваринництва” (2001-2005 рр., номер державної реєстрації 0101 U 001617).

Мета і завдання досліджень. Метою роботи було наукове обґрунтування параметрів токсикологічної характеристики дельтаметрину у формі децис форте.

У зв'язку з цим було необхідним вирішення наступних завдань:–

удосконалити методику визначення дельтаметрину в молоці способом тонкошарової хроматографії;–

установити валідаційні характеристики методики визначення препарату згідно зі стандартом „ІSO 5725–1:1994” та “Європейською інструкцією щодо застосування аналітичних методів та інтепретації результатів ЄС 657/2002”;–

визначити параметри гострої токсичності децис форте 12,5к.е. для білих щурів за перорального введення;–

вивчити цитотоксичні властивості децис форте в перещеплюваній культурі клітин нирки великої рогатої худоби MDBK;–

вивчити токсикокінетику та токсикодинаміку дельтаметрину у формі децис форте 12,5к.е. у курей за умов гострого та хронічного експериментів.

Об’єкт дослідження: токсикологічна та гігієнічна характеристики децис форте.

Предмет дослідження: визначення залишкових кількостей дельтаметрину, способом тонкошарової та газорідинної хроматографії, параметри гострої токсичності; клінічні, гематологічні, біохімічні, патологоанатомічні показники в разі отруєння децис форте.

Методи дослідження. Для досягнення мети і вирішення поставлених завдань використовували загальноприйняті токсикологічні, хіміко-аналітичні, клінічні, гематологічні, біохімічні, патологоанатомічні, цитогенетичні та статистичні методи досліджень.

Наукова новизна отриманих результатів. Удосконалено методику визначення залишкових кількостей дельтаметрину в молоці. Вперше для ідентифікації залишкових кількостей дельтаметрину в молоці способом тонкошарової хроматографії було використано нову схему визначення препарату із застосуванням як реагента-проявника бензидину, систем рухливих розчинників рухомої фази. Основні елементи методики захищені Патентом України №18381 „Спосіб визначення дельтаметрину в молоці”, від 15 листопада 2006 року. Вперше визначені валідаційні характеристики методики. Встановлено, що отримані результати відповідають стандарту „ІSO 5725–1:1994”. Встановлені параметри гострої токсичності децис форте 12,5к.е. за внутрішньошлункового введення білим щурам. Уперше вивчені цитотоксичні властивості піретроїду в культурі клітин нирки великої рогатої худоби MDBK. Науково обґрунтовані параметри токсикокінетики та токсикодинаміки дельтаметрину у формі децис форте у курей за умов гострого та хронічного експериментів.

Сукупність досліджень дозволили вперше обґрунтувати максимально допустимі рівні дельтаметрину в кормах для сільськогосподарських тварин.

Практичне значення отриманих результатів. Результати досліджень були розглянуті на методичній комісії та увійшли окремим розділом у науково-методичні рекомендації “Максимально допустимі рівні (МДР) синтетичних піретроїдів (перметрину, циперметрину, дельтаметрину, цигалотрину, фенвалерату, флувалінату) в кормах для сільськогосподарських тварин”, які затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України (наказ № 15 від 18.04.2000 року).

Розроблені методичні вказівки щодо визначення дельтаметрину в молоці способом тонкошарової хроматографії, розглянуті та ухвалені на засіданні методичної комісії ННЦ „ІЕКВМ” (протокол № від 29.03.2007 року) та рекомендовані до впровадження.

Особистий внесок здобувача. Автор дисертаційної роботи самостійно провів пошук літературних джерел та зробив їх узагальнення, виконав біохімічні і токсикологічні дослідження, проаналізував результати досліджень. Усі експериментальні дослідження виконані здобувачем самостійно і в повному обсязі.

Гістоморфологічні дослідження проведені сумісно із співробітниками відділу патоморфології ННЦ „ІЕКВМ” (зав. відділу – доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН Красніков Г.А.).

Дослідження щодо визначення цитотоксичних властивостей децис форте у культурі клітин були проведені спільно із співробітниками лабораторії біотехнології ННЦ „ІЕКВМ” (зав. лабораторії – доктор ветеринарних наук, професор Білокінь В.С.).

Обробку отриманих результатів досліджень проводили з використанням загальноприйнятих методів варіаційної статистики та комп’ютерної програми Microsoft Office Excel 2003.

Апробація результатів досліджень. Матеріали досліджень були представлені на конференціях різного рівня, обговорювалися та отримали загальне схвалення на річних звітах ученої ради ННЦ „ІЕКВМ”; Міжнародній науково-практичній конференції з фармакології та токсикології, присвяченій 100–річчю з дня народження С.В. Баженова (м. Київ, 2002 р.); Міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій 80–ти річчю від дня заснування ІЕКВМ УААН (м. Харків, 2002 р.); Міжнародній науково-практичній конференції „Ветеринарна медицина – : сучасний стан та актуальні проблеми забезпечення ветеринарного благополуччя тваринництва” (м. Ялта, 2005 р.), Науково–практичній конференції “Сучасні проблеми ветеринарної фармакології, токсикології та фармації” (м. Київ, 2006 р.).

Публікації. Результи дисертаційної роботи опубліковані у 5 наукових працях, з яких 3 статті у фахових виданнях, перелік яких затверджено ВАК України та науково-методичних рекомендаціях, отримано один деклараційний патент.

Структура та обсяг дисертації. Основний зміст дисертаційної роботи викладено на 119 сторінках комп’ютерного друку, ілюстровано 18 таблицями і 17 рисунками. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, власних досліджень із узагальненням отриманих результатів, висновків, пропозицій виробництву, списку використаної літератури та додатків. Список використаних джерел включає 222 назви, у тому числі 124 зарубіжних авторів.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Робота виконувалась упродовж 1998 – років у лабораторії токсикологічного моніторингу Центру токсикологічних досліджень, ветсанекспертизи, сертифікації кормів та продуктів тваринництва ННЦ “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини”.

Виконання експериментальної частини базувалося на загальновизнаних методах досліджень як вітчизняних, так і зарубіжних учених.

У проведених дослідженнях був використаний децис форте 12,5к.е. (реєстраційний номер Б Управління безпеки хімічних речовин України). Стандартні розчини інсектициду – 1, 10 та 100 мкг/см3 –  готували на гексані. Під час визначення ступеня токсичності на біологічних об’єктах (культурі клітин, тваринах) використовували водні розчини децис форте.

Удосконалення методики ґрунтувалося на: „Методических указаниях по определению синтетических пиретроидов (амбуш, децис, рипкорд, сумицидин) в растениях, почве, воде водоемов методами газожидкостной и тонкослойной хроматографии” (Д.Б. Гиренко, М.А. Клисенко и др.), затверджених 22.10.81 № , які й до сьогодні використовуються в лабораторіях.

Залишки дельтаметрину визначали способом тонкошарової хроматографії. Дослідження передбачали вилучення інсектициду з матриці, підбору оптимального екстрагенту (органічного розчинника), відпрацювання очищення екстрактів – фільтрації, виморожування, перерозподілу в системах розчинників, що не змішуються, та хроматографії на колонках.

Відповідно до стандарту „ІSO 5725-1:1994” встановили валідаційні характеристики удосконаленого методу, які передбачали визначення: специфічності, точності, лінійності, відтворюваності, меж детектування та визначення методу, стабільності дельтаметрину в розчині та матриці.

Дослідження з установлення параметрів гострої токсичності децис форте після одноразового перорального введення білим щурам здійснювали за методичними рекомендаціями (Косенко М.В., Малик О.Г., Коцюмбас І.Я. та ін., 1997). DL50 підраховували, використовуючи метод найменших квадратів для пробіт-аналізу кривих летальності в модифікації Прозоровського В.Б. (1962), а похибку – за методом Miller та Tainter (Miller C.L., Tainter M.L.,1944).

Патологоанатомічний розтин тварин, що загинули, здійснювали з фіксацією змін у органах і тканинах (Жаров А.В., Іванов І.В., Стрельников А.П., 2003)

Цитотоксичні властивості децис форте, його здатність впливати на виникнення патологій, пов’язаних із зміною структури й функціонування клітин, вивчали на перещеплюваній культурі клітин нирки великої рогатої худоби МDBК. Клітини вирощували в ростовому середовищі Ігла і 199 (1:1) з додаванням 10нативної сироватки крові великої рогатої худоби. Інкубували їх за температури 37 °С у культуральних флаконах упродовж 48 годин до утворення моношару клітин. Токсичні концентрації дельтаметрину визначали під час мікроскопічного дослідження після 24–х годинної експозиції моношарової культури. Цитотоксичні властивості оцінювали за цілісністю моношару та ступенем його пошкодження, характером розташування елементів клітин та їх кількістю із зернистою цитоплазмою.

Для вивчення впливу децис форте на мітотичний режим клітини MDBK висівали на накривні скельця розміром 12 х 24 мм і розміщували в культуральних флаконах. Після формування моношару клітин у ростове середовище вносили різні концентрації інсектициду з подальшим визначенням мітотичних параметрів клітин.

Клітини фіксували спиртово-оцтовим розчином (3:1) через 24, 48 і 72 години після внесення дельтаметрину. Препарати фарбували гематоксиліном Карачі згідно методичним рекомендаціям (Голідонова Н.Д., Джарилгасов С.А., Падалкін В.П., 1977; Білокінь В.С., Стегній Б.Т., Берус П.Т та ін., 1993).

Вивчення патологічних форм мітозу здійснювали за класифікацією Алова А.І. (Авцин А.П., Шаламов В.А., 1979; Адамс Р.,1983), визначаючи їх частку від загальної кількості мітозів.

Досліди щодо вивчення токсикокінетики та токсикодинаміки дельтаметрину у формі децис форте 12,5к.е. проводили в гострому та хронічному експериментах на курях м’ясо-яєчного напрямку породи білий леггорн, віком 5 і 18 місяців.

Після закінчення адаптаційного періоду курям у гострому досліді одноразово індивідуально вводили водну емульсію децис форте в дозах 50 мг/кг (перша група) та 100 мг/кг маси тіла (друга група). Контрольна група курей одержувала воду, вільну від інсектициду. У хронічному експерименті курям першої групи щоденно згодовували корм із піретроїдом у дозі 5 мг/кг, а другої – у дозі 20 мг/ кг корму протягом шестидесяти діб. Контрольна група птахів одержувала корм, без вмісту препарату.

Під час проведення гострого і хронічного дослідів на курях залишкові кількості дельтаметрину визначали із застосуванням методу газорідинної хроматографії, розробленого співробітниками Центру токсикологічних досліджень ННЦ „ІЕКВМ”. Досліджували кров, головний мозок, серце, легені, селезінку, нирки, внутрішній жир, печінку, білу та червону м'язові тканини, вмістиме м’язового шлунка, дванадцятипалої кишки в гострому досліді – на першу, третю, сьому та чотирнадцяту доби; у хронічному досліді – на шестидесяту добу.

Під час проведення гістоморфологічних досліджень зразки органів фіксували у 10розчині нейтрального формаліну та в рідині Карнуа. Гістологічні зрізи готували з парафінових блоків, фарбували за методом Браше (метиловим зеленим та піроніном G), гематоксиліном та еозином. Також визначали загальний стан органів та окремих їх складових структур, оцінювали характер гістологічних змін, поширення патологічних та інволютивних проявів, довжину складових клітин, їх конфігурацію, густину епітеліального та ступінь розвитку поверхневого мозкового шарів (Саркісов Д.С., Петров Ю.Л.,1996).

У крові визначали число еритроцитів і концентрацію гемоглобіну (Заболоцький В.Т., Поляков Б.Ф., 1965); глюкози – за кольоровою реакцією з орто-толуїдином, піровиноградної кислоти – за модифікованим методом Умбретта (Самохін В.Т., Кондрахін І.П. та ін., 1981; Колб В.Г., Камишніков В.С., 1982), молочної кислоти – за Баркером і Саммерсоном (Кондрахін І.П., 1985); у сироватці крові – активність аланінамінотрансферази (АЛТ) та аспартатамінотрансферази (АСТ) – за кінетичним методом Рейтмана та Френкеля в модифікації Ошерович А.М., Мільнер Б.І. (1965), аденозинтрифосфатази (АТФ-азу) (Прохорова М.І., 1982), лужної фосфатази (ЛФ) – за Бессеєм, Лоурі та Броком (Васільєва Е.А., 1982).

Для визначення активності АЛТ, АСТ, ЛФ у печінці та ЛФ у нирках і стінці дванадцятипалої кишки зразки органів після розтину охолоджували, гомогенізували за допомогою скла і відповідних субстратно–буферних розчинів у співвідношенні 1:50. Для АЛТ використовували 50 мМ трис–НСІ буфер, АСТ – 0,25 М сахарозу на 0,05 М трис–НСІ буфері, для ЛФ – 0,05 М гліциновий буфер з 5,5Ч10–3 розчином р –нітрофенілфосфату. Гомогенізат центрифугували, фільтрували та зберігали в умовах побутового холодильника.

У статистичних підрахунках та обробці даних використовували методи варіаційної статистики та комп’ютерну програму Microsoft Office Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Удосконалення методики визначення залишків дельтаметрину в молоці способом тонкошарової хроматографії. Контроль за залишковими кількостями дельтаметрину в сільськогосподарській продукції є актуальним та потребує розробки нових або вдосконалення існуючих методів визначення.

Для покращання методики визначення залишків пестициду в біологічному матеріалі ми врахували основні вимоги, а саме: підбір екстрагенту, який забезпечує максимальне вилучення препарату із зразка, пробопідготовку (очищення, вивільнення від коекстрактивних речовин, виморожування жирів, тощо) та способи виявлення пестициду на платівці.

Під час підбору умов екстракції зразків молока оптимальними виявилися як екстрагент – ацетон у співвідношенні 1:2, так і використання електромеханічного струшувача протягом 30 хвилин. Виморожування впродовж 3 годин за температури 18 –  °С найкраще забезпечувало звільнення зразків від жиру. За цих умов на поверхні охолодженого ексктракту встановлено добре застиглі краплі молочного жиру. У процесі удосконалення системи рухливих розчинників, яка характеризувала положення пестициду на платівці з УФ-індикатором, найкращою виявилася система гексан–ацетон у співвідношенні 5:1, Rf становило 0,67 – ,69. Після обробки платівки 1,5ним розчином бензидину в ацетоні та опромінення УФ-променями дельтаметрин виявлявся у вигляді темно-синіх плям на жовто-коричневому фоні впродовж 1 – хвилин. У наших дослідженнях найбільш придатними виявилися платівки для тонкошарової хроматографії “Реасорб” (алюмінієва підкладка, сорбент – силікагель КСКГ) марки ТХС-КСКГ–УФ 254.

Отримані результати є основою вдосконаленого методу визначення дельтаметрину в молоці способом тонкошарової хроматографії.

Новизна способу детекції дельтаметрину в молоці захищена деклараційним патентом України № від 15 листопада 2006 року „Спосіб визначення дельтаметрину в молоці”.

Експериментальне встановлення валідаційних характеристик методу визначення дельтаметрину в молоці способом тонкошарової хроматографії. Для того, щоб аналітичний метод відповідав своєму призначенню та гарантував вірогідні і точні результати відповідно до стандарту „ІSO 5725–1:1994” та „Європейської інструкції щодо застосування аналітичних методів та інтерпретації результатів ЄС /2002”, усі методи дослідження, що використовуються в лабораторіях, повинні бути валідовані та затверджені. Під час установлення валідаційних характеристик удосконаленої методики визначення дельтаметрину способом тонокошарової хроматографії використали коров’яче молоко 2,5 %  ої жирності, ДСТУ 2661 –94 (табл.1).

Отже, матеріали досліджень, використані під час розробки “Методичних вказівок із визначення дельтаметрину в молоці способом тонкошарової хроматографії”, будуть подані до Державного департаменту ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України для розгляду та прийняття рішення про затвердження.

Таблиця 1

Результати експериментальних досліджень щодо встановлення валідаційних характеристик удосконаленої методики визначення дельтаметрину в молоці способом тонкошарової хроматографії

№ п/п | Параметри валідації | Х сер. | SD | RSD | Результат

1 | Контроль точності та правильності:–

повернення добавки аналіту до матриці, яка не містить аналіту ( |

68,8 |

4,541 |

6,60 |

задовільний–

повернення добавки аналіту до матриці, яка містить визначену його кількість ( |

89,8 |

5,029 |

5,60 |

задовільний

2 | Стабільність аналіту в розчині | >96,08

умови зберігання розчинів аналіту в посуді з темного скла за температури 4єС упродовж двадцяти восьми та більше діб | задовільний

3 | Стабільність аналіту в матриці | максимальний термін зберігання зразків: за –18 °С упродовж 14 діб | задовільний

4 | Лінійність | 2,96 | 0,1459 | 4,9 | лінійний

5 | Межа детектування | 5,3 | 0,9887 | 17,9 | 3 мкг

6 | Межа визначення методу | 0,101 | 0,01 | 9,9 | 0,1 мг/л

Визначення параметрів гострої токсичності децис форте 12,5к.е. для щурів за умов одноразового перорального введення. Проведення досліджень щодо встановлення параметрів гострої токсичності децис форте було пов’язане з тим, що дані про DL50 згаданого вище препарату для ссавців у спеціальній літературі відсутні. Для цього ми провели два досліди – попередній і основний. У попередньому досліді щурам вводили інсектицид у широкому інтервалі доз – від 30 до 210 мг/кг маси тіла. Клінічна картина дослідних тварин характеризувалась ознаками гострого отруєння, що виявлялись спочатку загальним пригніченням, ціанозом видимих слизових оболонок, інтенсивною слинотечею, пітливістю, а потім загальним збудженням – тремором, судомами, плаваючими рухами кінцівок, спробами заритися в підстилку. При патологоанатомічному розтині виявлені такі зміни: у головному мозку – геморагічні крововиливи, розширення судин мозку, наявність рідкої темно-вишневої крові, що не згорнулася; у грудній порожнині – збільшення та кровонаповнення серця, у легенях – крапкові крововиливи, розширення судин порожнини, відсутністю згустків крові, темно-вишневого кольору; у черевній порожнині – збільшення та кровонаповнення печінки і селезінки, указані органи були темного-вишневого кольору; значне здуття шлунка і тонкого відділу кишковика; кровонаповнення судин стінок черевної порожнини і брижі, збільшення нирок. Відзначалися кровонаповнення підшкірних кровоносних судин та осередкові крововиливи у слизовий шар. Усі дослідні тварини загинули протягом 16 годин.

В основному експерименті щурам дослідних груп вводили інсектицид у менших дозах – 10, 15, 20, 25 і 30 мг/кг маси тіла, а контрольної групи – воду. Клінічні ознаки через півтори години після введення дослідного препарту характеризувалися пригніченням, відмовою від корму, інтенсивною салівацією, пітливістю, тремором, крутінням голови. Шерстяний покрив був вологим, скуйовдженим, щури заривалися в підстилку. Через дві з половиною години після введення інсектициду в піддослідних тварин спостерігалися: збудження, салівація та пітливість, судоми, плаваючі рухи кінцівками, скуйовдженість брудної, сірого кольору шерсті, синюшність видимих слизових оболонок. Через чотири години в групах, в яких щури одержували піретроїд у дозах 20 та 25 мг/кг маси тіла, загинуло по одній тварині. У живих щурів дослідних груп клінічні ознаки мали характер, який залежав від дози піретроїду, тобто стабілізація стану спостерігалася швидше в групах тих тварин, яким вводили меншу дозу препарату. При патологоанатомічному розтині встановлені такі ж зміни, що й у тварин, яким задавали дослідний препарат у більших дозах.

Установлено, що тварини загинули в основному в перші дві доби, кількість загиблих тварин щурів залежала від введеної дози інсектициду, а саме: у групах з дозами препарату: 10 і 15 мг/кг маси тіла не загинуло жодної тварини; 20 мг/кг – 2 щури; 25 мг/кг – 4, а у групі 30 мг/кг маси тіла загинули всі тварини. За результатами летальності щурів розрахували пряму графіку для пробіт-аналізу, використовуючи метод Міллера і Тейнтера, встановили величину помилки.

Отже, за нашими розрахунками, величина DL50 децис форте за одноразового перорального введення білим щурам становила 22,15 мг/кг маси тіла, а величина помилки – ±2,27 мг/кг, що дозволяє віднести інсектицид до сильнодіючих токсичних сполук.

Вивчення цитотоксичного ефекту дельтаметрину у формі децис форте в перещеплюваній культурі клітин нирки великої рогатої худоби MDBK. Цитотоксичні властивості децис форте, його здатність впливати на виникнення патологій, пов’язаних із зміною структури і функціонування клітин, вивчали в перещеплюваній культурі клітин нирки великої рогатої худоби МDBК.

Установлено, що концентрації, які відповідають DL50 у дослідах in vivo, та десятикратному розведенні – 22,15 мкг/см3 та 22,15х10-1 мкг/см3 відповідно, викликали повну деструкцію моношару культури, склеювання клітин, грануляцію цитоплазми та руйнування їх морфологічної структури. Мітотичну активність та патологічні мітози культури МDBК були вивчені за дії препарату в менших концентраціях (табл.2).

Таблиця 2

Вплив децис форте на мітотичну активність та кількість патологічних форм мітозу клітин у культурі MDBK

Концентрація

децис форте

в ростовому середовищі, мкг/см3 | Час після внесення препарату в ростове середовище, годин

24 | 48 | 72

мітотич-на актив-ність,

‰ | патоло-гічні мітози,

% | мітотич-на актив-ність,

‰ | патоло-гічні мітози,

% | мітотич-на актив-ність,

‰ | патоло-гічні мітози,

%

Контроль | 19,0±1,4 | 5,0 ±0,7 | 21,6±1,4 | 5,0 ±0,4 | 23,0±0,4 | 12,0±1,2

22,15 х 10-5 | 22,7±

0,6 | 12,2±

1,5** | 18,7±

1,7 | 11,0±

1,7* | 17,2±

1,6* | 10,5±

2,2

22,15 х 10-4 | 22,5±

1,3 | 14,5±

0,6*** | 19,2±

2,3 | 10,5±

2,1* | 20,2±

2,0 | 11,0±

1,6

22,15 х 10-3 | 23,2±

2,1 | 13,0±

1,6** | 24,0±

4,4 | 12,6±

2,7* | 22,0±

3,5 | 15,3±

2,2

22,15 х 10-2 | 33,2±

3,8* | 18,0±

1,0*** | 22,7±

1,4 | 12,5±

1,1*** | 27,5±

4,6 | 17,0±

1,4*

Примітки: * – Р < 0,05; ** – Р < 0,01; *** – Р> 0,001 (відносно контролю).

Установлено, що концентрація 22,15х10-2 мкг/см3 викликала незначну грануляцію цитоплазми та порушення морфоструктури клітин. Розведення 22,15х10-3, 22,15х10-4 та 22,15х10-5 мкг/см3 помітних порушень структури клітин не виявили. Дані таблиці свідчать, що розведення децис форте 22,15·102 мкг/см3 протягом 24 годин підвищувало мітотичну активність у 1,5 раза. Через 48 і 72 годин експозиції піретроїду встановлено зниження мітотичної активності.

Підвищення рівня мітотичної активності супроводжувалося збільшенням кількості патологічних мітозів. На 24 та 48 години у всіх концентраціях піретроїду встановлено вірогідне збільшення кількості патологічних мітозів у 2 – 2,5 раза. Патологічні мітози були пов’язані з пошкодженням мітотичного та хромосомного апаратів клітин. Найбільша кількість патологічних форм ділення клітин під дією децис форте була виявлена на першу добу і характеризувалася:–

колхіциновим (К-) мітозом у концентраціях 22,15х10-5 мкг/см3 – 37; ,15х10-4 – 36; 22,15х10-3 – 29та у 22,15х10-2 мкг/см3 – 41у порівнянні з контролем – 23;–

хромосомами, що злиплися – високий рівень яких, у порівнянні з контролем, виявляли впродовж трьох діб досліджень у всіх концентраціях децис форте: контроль – 10; 22,15х10-5 мкг/см3 – 41; 22,15х10-4 – 59; 22,15х10 -3 – 73та у  ,15х10-2 мкг/см3 – 58; –

утворенням „мікроядер”: контр. – 7; у 22,15х10-5мкг/см3 – 3; 22,15х10-4 – 9; 22,15х10-3 – 12та у 22,15х10-2 мкг/см3 – 23

Отже, підвищення мітотичної активності культури клітин указує на стимулювальні властивості інсектициду, а утворення зазначених патологій ділення (К– мітозу, хромосом, що злиплися та „мікроядер”) свідчать про незначні мутагенні властивості децис форте.

Вивчення токсикокінетики та токсикодинаміки дельтаметрину у формі децис форте 12,5 % к.е. у курей за умов гострого експерименту.

Для визначення впливу та механізму дії децис форте в токсичних дозах на курей за одноразового внутрішнього введення ми провели дослід, який передбачав вивчення специфіки клінічних проявів після застосування піретроїду, особливостей впливу на гематологічні показники та активності ферментів, розподілу в тканинах та швидкості виведення з організму, визначення патологоанатомічних змін тканин та органів.

Клінічні ознаки отруєння децис форте у курей обох дослідних груп характеризувалися симптомами впливу на центральну нервову систему – відзначали збудження, лякливість, реагування на голосні звуки та світло з навколишнього середовища, крутіння головою, збентеження, збільшення спонтанної рухової активності, некоординованість рухів. У деяких курей спостерігалася блювота, тьмяність та вологість пір’я, синюшність гребеня, сережок та видимих слизових оболонок, відмова від корму та спрага. Більш виражені ознаки інтоксикації спостерігалися у групі курей, які отримували препарат у дозі 100 мг/кг маси тіла. На третю добу після введення інсектициду згадані вище клінічні ознаки гострого отруєння не спостерігалися і в загальному стані курей визначилася тенденція до нормалізації.

Для встановлення характеру розподілу дельтаметрину проводили забій курей і відбір крові та внутрішніх органів через одну, три, сім та чотирнадцять діб після введення препарату.

При визначенні коефіцієнта мас внутрішніх органів після одноразового введення децис форте встановлено його зменшення на 10для маси серця у групі з дозою 100 мг/кг; у обох дослідних групах зменшення цього показника для нирок на 38,89У показниках коефіцієнтів маси дванадцятипалої кишки спостерігалося зменшення на 22у першій групі та збільшення на 12,19у другій. Показники коефіцієнта маси печінки та селезінки істотно не відрізнялися від курей контрольної групи.

Особливості токсикокінетики децис форте в організмі курей знаходяться у прямій залежності від дії препарату в дослідних дозах та структури тканин, тобто розподіл та рівень накопичення залишкових кількостей дельтаметрину відбувався переважно в органах травного каналу та жировмісних тканинах (табл.3).

Таблиця 3

Вміст залишкових кількостей дельтаметрину у внутрішніх органах і тканинах курей після одноразового внутрішнього введення децис форте (n=7)

Досліджені

органи і тканини |

Групи курей залежно від дози дельтаметрину, мг/кг маси тіла

50,0 | 100,0

Терміни відбору зразків, діб

1 |

3 |

7 |

14 |

1 |

3 |

7 |

14

концентрація дельтаметрину, у мг/кг

Кров | <м.в. | <м.в. | <м.в. | <м.в. | <м.в. | <м.в. | <м.в. | <м.в.

Мозок | <м.в. | <м.в. | <м.в. | <м.в. | 0,130 | 0,069 | 0,033 | 0,010

Серце | <м.в. | 0,011 | 0,010 | <м.в. | <м.в. | 0,380 | 0,010 | <м.в.

Легені | 0,021 | 0,010 | <м.в. | <м.в. | <м.в. | 0,160 | 0,054 | <м.в.

Селезінка | <м.в. | <м.в. | <м.в. | <м.в. | <м.в. | 0,110 | 0,050 | <м.в.

Нирка | <м.в. | 0,030 | 0,010 | <м.в. | 0,130 | 0,040 | 0,011 | 0,030

Жир внутрішній | <м.в. | 0,030 | <м.в. | 0,01 | <м.в. | 0,034 | 0,031 | 0,010

Печінка | <м.в. | <м.в. | <м.в. | <м.в. | 0,270 | <м.в. | 0,090 | <м.в.

М’язи червоні | <м.в. | 0,075 | 0,010 | <м.в. | <м.в. | 0,083 | 0,023 | <м.в.

М’язи білі | <м.в. | <м.в. | <м.в. | <м в. | <м.в. | 0,038 | <м.в. | <м.в.

Шлунок м’язовий | 0,250 | 0,030 | <м.в. | <м.в. | 0,370 | 0,120 | 0,030 | <м.в.

Кишка дванадцятипала | 0,080 | 0,040 | 0,010 | <м.в. | 0,160 | 0,039 | 0,030 | <м.в.

Примітка. < м. в. – концентрація менше від межі визначення 0,01 мг/кг

Найбільша кількість інсектициду в групі з дозою 50 мг/кг через одну добу була встановлена в м’язовому шлунку – 0,25 мг/кг, дванадцятипалій кишці – 0,08 мг/кг та легенях – 0,021 мг/кг. А через три доби – у червоній м’язовій тканині (0,075 мг/кг), дванадцятипалій кишці (0,04 мг/кг), внутрішньому жирі, нирках, м’язовому шлунку (відповідно по 0,03 мг/кг) та в серці (0,011 мг/кг).

На сьому та чотирнадцяту доби досліджень залишкові кількості дельтаметрину в зразках органів і тканин були нижчими від межі величин визначення (0,01 мг/кг). У мозку, печінці та селезінці залишків інсектициду не виявляли впродовж всього терміну досліджень.

У другій групі з дозою препарату 100 мг/кг показники залишкових кількостей установлено на першу та третю доби, які утримувалися до сьомої доби. Імовірно, це пов’язано з введеням дози препарату, яка була збільшена вдвічі. Найбільший вміст піретроїду через одну добу після введення був виявлений в м'язовому шлунку – 0,37 мг/кг, печінці – 0,27 мг/кг, дванадцятипалій кишці – 0,16 мг/кг, мозку інирках – по 0,13 мг/кг. Через три доби після введення найвищі залишкові кількості пестициду були встановлені в серці (0,38 мг/кг), легенях (0,16 мг/кг), м’язовому шлунку (0,12 мг/кг), селезінці (0,11 мг/кг) тощо. На сьому добу вміст дельтаметрину в тканинах виявлено на достатньо значущому рівні, особливо в зразках органів, які беруть участь у трансформації іевакуації препарату з організму, а саме в печінці – 0,09 мг/кг, м'язовому шлунку – 0,03 мг/кг, дванадцятипалій кишці – 0,03 мг/кг, нирках – 0,011 мг/кг та селезінці – 0,05 мг/кг.

Децис форте є ліпотропною отрутою, тому залишки інсектициду в жировій тканині були встановлені на всіх етапах дослідження (на третю добу – 0,034 мг/кг; на сьому – 0,031 мг/кг та на чотирнадцяту добу – 0,01 мг/кг). Через чотирнадцять діб після введення в обох дослідних групах дельтаметрин визначався на рівні межі величин визначення (0,01 мг/кг). Під час дослідження крові залишкові кількості дельтаметрину були нижчими від межі визначення методу.

Введення децис форте вплинуло на гематологічні показники. Зокрема, вірогідні зміни вмісту гемоглобіну спостерігали лише в групі з дозою 50 мг/кг маси тіла. Через одну добу після введення інсектициду встановлено зменшення показника на 11,4а через сім діб – незначне збільшення. На чотирнадцяту добу досліджень відзначена нормалізація показників, що вивчалися. Рівень гемоглобіну в групі з дозою 100 мг/ кг маси тіла, порівняно з контролем, на всіх термінах досліджень був без істотних змін. Число еритроцитів у обох експериментальних групах вірогідно зменшилася через одну добу після введення – у першій групі на 9,76у другій – на 8,79на третю добу відповідно – на 3,95та 13,31

На третю добу встановили зміну рівня показників обміну вуглеводів. Зокрема, вміст глюкози порівняно з контролем зменшився в першій групі на 21,3а в другій – на 18,52Рівень піровиноградної кислоти був нестабільним. Якщо на третю добу цей показник значно знизився у першій групі – на 44,76у другій – на 30,25то на сьому добу спостерігалося підвищення рівнів, особливо в групі з дією препарату в дозі 100 мг/кг маси тіла. А саме, рівень пірувату у першій групі підвищився на 14,76а в другій – на 63,25На чотирнадцяту добу була виявлена тенденція зниження вмісту піровиноградної кислоти у крові до контролю в групі з дозою 50 мг/кг маси тіла на 16,58а у групі з дозою 100 мг/кг маси тіла – на 9,08Також установили, що вміст молочної кислоти, в порівнянні дослідних і контрольної груп змінювалась тільки в другій групі: на першу добу збільшився на 17,8 %, на чотирнадцяту – зменшився на 13,3 % відповідно. Значення вище вказаного показника не виходила за межі статистично значущих величин.

У процесі встановлення гепатотоксичного впливу децис форте на курей визначали активність індикаторних ферментів – АЛТ, АСТ, ЛФ та АТФ-ази.

Коливання активності ферментів ЛФ і АТФ-ази у сироватці крові курей виявили на першу, третю та сьому доби. Вірогідне зниження активності ЛФ встановлено на сьому добу в першій групі – на 18,16у другій – на 32,3Пригнічення АТФ-ази на першу добу після введення препарату в першій групі зафіксовано на 36,72у другій – на 16,66Зміна показників активності ферментів залежала від доз, що вводилися, та мала тимчасовий характер – тенденція до стабілізації спостерігалася на чотирнадцяту добу після введення інсектициду.

У вивченні активності амінотрансфераз у печінці було встановлено зниження показників упродовж усього експериментального періоду. Активність АЛТ на першу добу зменшилась в групі з дією препарату в дозі 50 мг/кг – на 26,85у групі 100 мг/кг – на 61,97а показник АСТ на третю добу відповідно – на 5,27та на 13,16

Піретроїд виявив деякі особливості впливу на активність ферменту ЛФ у печінці, нирках та дванадцятипалій кишці. У печінці менша доза препарату упродовж усіх термінів визначення викликала підвищення показників у межах від 3,0 до 7,48а більша – пригнічення активності ЛФ від 10,43 до 14,91У нирках найвищий рівень активності встановили через одну добу після введення: в групі з дозою 50 мг/кг маси тіла показник збільшився на 25у групі з дією препарату в дозі 100 мг/кг – на 18,75На третю та сьому доби значення активності ЛФ у обох групах були підвищені, але визначалась тенденція щодо зниження активності. На чотирнадцяту добу активність ферменту у порівнянні з контролем нормалізувалася. У дванадцятипалій кишці активність ЛФ була значно вищою в усі терміни визначення: у першій групі в межах 79,49 – 104,25у другій 30,00 – 42,35Значне підвищення активності ферменту було встановлене на чотирнадцяту добу в обох групах на 144,48 та на 58відповідно.

Гістоморфологічні дослідження внутрішніх органів і тканин курей засвідчили, що введення децис форте викликало деяку зміну будови і функціонування клітинних структур, а вплив препарату мав залежний від дози характер. Піретроїд у меншій дозі (50 мг/кг маси тіла) не виявив значної декомпенсаційної дії на стан органів, що досліджували. Виникнення більш глибоких структурних та функціональних патологічних відхилень в органах курей установлено за дози 100 мг/кг. Дельтаметрин викликав морфо–функціональні зміни в печінці, залозистому шлунку, тонкій кишці та виявив супресивну дію на лімфоїдні клітини фолікулів селезінки.

Вивчення токсикокінетики та токсикодинаміки дельтаметрину у формі децис форте 12,5 % к.е. у курей за умов хронічного експерименту. Вивчення особливостей прояву хронічної інтоксикації децис форте на курей при згодовуванні з кормом ґрунтувалося на визначенні характеру змін клінічних, гематологічних, біохімічних показників та встановленні специфіки розподілу препарату в тканинах, швидкості процесів метаболізму та виведення його з організму, патологоанатомічних змін тканин і органів.

Загальний клінічний стан курей, яким згодовували корм з препаратом у дозі 5 мг/кг, не виявив ознак інтоксикації – птахи добре споживали корм та воду, були активними. У курей другої групи (доза 20 мг/кг корму) у перші сім діб досліду встановлено пригнічення, невелику спрагу. На восьму добу ці ознаки були відсутніми. Кури обох груп адекватно реагували на подразники з навколишнього середовища (звуки, світло). Гребінь, сережки були еластичними, пір’я гладеньке, щільне, не вологе. Видимі слизові оболонки мали природний рожевий колір. Тремор, судоми, зміна спонтанної рухової активності були відсутніми.

На шестидесяту добу проводили забій курей та визначали коефіцієнти маси внутрішніх органів. Коефіцієнт маси серця збільшився відносно контролю в першій групі на 15,9у другій – на 20,45Коефіцієнт маси печінки в першій групі не відрізнявся від контрольного, у другій – зменшився на 15,4Коефіцієнт маси селезінки збільшився в обох групах на 63,6та 18,1відповідно.

Розподіл залишкових кількостей дельтаметрину в органах і тканинах відбувався залежно від введених доз та органів можливого накопичення (табл.4).

Зокрема, у першій групі залишкові кількості дельтаметрину в білих та червоних м’язах, селезінці, мозку були нижчими від межі визначення (0,01 мг/кг), а в другій групі залишкова концентрація препарату в перелічених зразках перевищувала у 2 – 4 рази, у червоних м’язах – навіть у 10 разів.

Найбільша концентрація препарату була виявлена за обох доз у внутрішньому жирі – 0,613±0,02 та 1,25±0,03 мг/кг, нирках – 0,16±0,03 та 0,29 ±0,03 мг/кг, серці – 0,039±0,0013 та 0,27±0,02 мг/кг маси відповідно. Накопичення препарату спостерігали також у м’язовому шлунку та дванадцятипалїй кишці, у першій групі концентрація становила 0,039±0,001 мг/кг. У другій групі концентрація інсектициду також була майже однакова – 0,226 ±0,03 та 0,225± 0,02 мг/кг відповідно. При дослідженні крові залишкові кількості дельтаметрину були нижчими від межі визначення методу.

Таблиця 4

Вміст