Інститут біології тварин УААН

Ярошенко Тетяна Ярославівна

УДК 591.477+546.17]-02:616.36-099

роль оксиду азоту в механізмах ураження

печінки ксенобіотиками

03.00.04 – біохімія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2007

Дисертація є рукописом.

Робота виконана в Тернопільському державному медичному університеті імені І.Я. Горбачевського Міністерства охорони здоров’я України

Науковий керівник | доктор медичних наук, професор

Корда Михайло Михайлович,

Тернопільський державний медичний університет імені І.Я. Горбачевського

Міністерства охорони здоров’я України

Офіційні опоненти: |

доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України

Стойка Ростислав Степанович

Інститут біології клітини НАН України,

завідувач відділу регуляції проліферації клітин

доктор біологічних наук,

Столяр Оксана Борисівна

Тернопільський національний педагогічний університет імені Володимира Гнатюка Міністерства освіти і науки України,

професор кафедри хімії

Провідна установа – Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України, лабораторія біохімії коферментів, м. Київ.

Захист відбудеться " 20 " березня 2007 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01. в Інституті біології тварин УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. В.Стуса 38

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. В.Стуса 38

Автореферат розісланий " 19 " лютого 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Віщур О.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Печінка є важливою мішенню для багатьох токсинів: ксенобіотиків, ендотоксинів, спиртів. Людина в процесі життєдіяльності стикається з мільйонами хімічних сполук, багато з яких мають гепатотропні властивості (Губский Ю.И., 1993; Корда М.М., 1998; Гонський Я. І., 2001). Якщо взяти до уваги також поширення алкоголізму, токсико- і наркоманій, стає зрозуміло, чому на сьогодні захворювання печінки є одним з найпоширеніших видів патології в клініці внутрішніх хвороб. Тому важливим завданням біології і медицини є досконале вивчення молекулярних механізмів патогенної дії ксенобіотиків на печінку. Найчастіше різноманітні токсини викликають некротичне ураження гепатоцитів. Зручною моделлю для експериментального відтворення некротичного процесу у печінці є інтоксикація аліловим спиртом. У печінці аліловий спирт (АС) метаболізується до акролеїну (Belinsky S.A., 1985), який здатний окиснювати сульфгідрильні групи, при цьому в процес, в першу чергу, включається відновлений глутатіон, що призводить до різкого зниження його вмісту в клітинах (Harstad E.B., 2002). Алкілування нуклеофільних груп макромолекул, викликане акролеїном, а також активація пероксидації ліпідів внаслідок зниження вмісту відновленого глутатіону є основними причинами, що призводять до некротичного пошкодження клітин аліловим спиртом (Chamulitrat W., 1996., 2001., Moore P.K., 2003).

Оксид азоту (NO) – впливає на фізіологічні і патологічні процеси в кожному органі і тканині, в тому числі і в печінці. Дія NO в печінці є багатовекторною і часто неоднозначною. З одного боку, невелика стабільна кількість NO, що продукується, в основному конститутивна NO-синтаза (eNOS), регулює мікроциркуляцію (2002), має антиоксидні властивості і захищає клітини від цитокін-індукованого ураження та апоптозу (2002), а з іншого боку гіперпродукція NO і його активних похідних, що має місце при інтоксикації рядом ксенобіотиків, призводить до інгібування функції ферментів, ушкодження ДНК, активації процесів ліпопероксидації (Sass G., 2002., Nowicki M.J., 2003). Оскільки існує взаємозв’язок між продукцією NO і ураженням гепатоцитів, було проведено ряд досліджень із вивчення ефективності інгібіторів NO-синтази і донорів NO при різних патологічних станах печінки. Проте дані літератури з цього питання розрізнені і часто суперечливі. Пригнічення NO-синтази, особливо вибіркове блокування індуцибельної NO-синтази (іNOS), при токсин-індукованих ураженнях печінки нівелює патологічний процес, що проявляється в зниженні активності вільнорадикальних процесів, підвищенні системи антиоксидного захисту, запобіганні порушення функціонування ферментів дихального ланцюга мітохондрій і зменшенні ступеня деструкції гепатоцитів (Gardner C.R., 1998; Hierholzer C., et al., 1998). У той же час іншими авторами було продемонстровано, що інгібітори NO-синтази призводять до пригнічення активності не тільки її іNOS, але і eNOS при токсичному ураженні печінки, що призводить до негативних змін вищезгаданих показників (Harstad E.B., Klaassen C.D., 2002; Hinson J.A., 2002; Anaya-Prado R, et al., 2003). Подібні суперечливі результати отримано і при корекції токсичного гепатиту за допомогою донорів NO (Rahman T.M., Hodgson H., 2003). Проте в роботах (Gardner C.R., et al., 1998) було показано, що донори NO не проявляють протективного ефекту на печінку при її токсичному ураженні і, навіть, більше того, можуть погіршувати перебіг патологічного процесу.

Актуальність даного дослідження зумовлена, з одного боку, великим спектром хімічних уражень печінки, а з іншого – недосконалим висвітленням фундаментальних патобіохімічних процесів розвитку токсичного гепатиту, зокрема ролі NO в механізмах дії гепатотропних некрозогенних ксенобіотиків. Робота є також актуальною в плані розробки методів корекції некротичних змін у печінці за допомогою модуляторів системи L-аргінін/ NO-синтази /NO.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є складовою частиною планової наукової міжкафедральної теми Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського, кафедр медичної хімії та загальної гігієни і екології “Порушення метаболічних процесів в організмі тварин некрозогенними ксенобіотиками і способи їх детоксикації” № держ-реєстрації 0101U001311, (2002-2005 рр.) та “Вивчення порушень метаболічних процесів у тварин, отруєних ксенобіотиками, та корекція їх за допомогою антиоксидантів” № держреєстрації 0106U001760, (2005

- 2007 рр.), в яких автор досліджував роль системи NO під час токсичного ураження організму тварин АС і вивчав ефективність застосування неселективного інгібітора іNOS L-NAME і високоселективного інгібітора іNOS – 1400W, а також донора NO FK409 і субстрату для ферментативного утворення NO – L-аргініну.

Тему дисертації затверджено Проблемною комісією МОЗ та АМН України “Біологічна та медична біохімія” від 11.12. 2002 р., протокол № 4.

Мета дослідження: встановити роль NO в патогенезі гострого токсичного гепатиту, індукованого АС, а також дослідити можливість корекції викликаних даним токсином патологічних змін за допомогою інгібіторів NO-синтази і донорів NO.

Для досягнення цієї мети у роботі вирішували наступні завдання:

- дослідити функціональний стан системи синтезу NO у печінці при її ураженні АС;

- встановити взаємозв’язок між змінами функціонального стану конституційної та індуцибельної форм NO-синтази у печінці й інтенсивністю вільнорадикального окиснення, станом антиоксидної системи, функціонуванням ферментів дихального ланцюга мітохондрій та вираженістю деструктивних процесів в гепатоцитах при інтоксикації АС;

- дослідити можливість корекції патобіохімічних змін у печінці при її ураженні АС за допомогою неселективного інгібітора NO-синтази L-NAME і високоселективного інгібітора іNOS 1400W;

- дослідити вплив донора NO FK409 і L-аргініну - субстрату для ферментативного утворення NO на функціональний стан різних форм NO-синтаз, активність вільнорадикальних реакцій, стан системи антиоксидного захисту, активність мітохондріальних ферментів і ступінь некротичних змін в печінці при її гострому ураженні АС;

- обґрунтувати доцільність застосування при токсичному гепатиті, індукованому АС, комбінації засобів, здатних інгібувати іNOS в печінці і, водночас, забезпечувати функціональний стан eNOS в капілярах і синусоїдах печінки.

Об’єкт дослідження – гостре токсичне ураження печінки, викликане некрозогенним ксенобіотиком АС.

Предмет дослідження – роль NO в патогенезі токсичного ураження печінки АС; ефект застосування інгібіторів NO-синтази і донаторів NO при токсичному гепатиті.

Методи досліджень: біохімічний метод визначення загальної активності NO-синтази, вмісту нітратів і нітритів, малонового діальдегіду і модифікованих амінокислот, активності каталази, рівня церулоплазміну і відновленого глутатіону, активності цитохромоксидази і сукцинатдегідрогенази, амінотрансфераз, вмісту молекул середньої маси. Електрохімічний метод визначення активності eNOS; біофізичний метод хемілюмінесцентного (ХЛ) вивчення інтенсивності вільнорадикальних реакцій; статистичні методи обробки одержаних результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. У результаті комплексного дослідження ролі системи синтезу NO у патогенезі ураження печінки АС вперше показано, що інтоксикація АС супроводжується пригніченням ендотеліальної й активацією індуцибельної форми NO-синтази. Показано взаємозв’язок між продукцією NO і активністю вільнорадикальних реакцій, функціональним станом антиоксидної системи і ферментів дихального ланцюга мітохондрій, а також ступенем некротичних змін у гепатоцитах при отруєнні АС.

Одержано нові дані про вплив неселективного інгібітора NO-синтази L-NAME на перебіг токсичного гепатиту. Показано, що тотальне пригнічення NO-синтази посилює показники вільнорадикального та знижує показники мітохондріального окиснення в ураженій токсином печінці, сприяє розвитку деструктивних процесів у гепатоцитах.

Досліджено вплив L-аргініну – субстрату NO-синтази на перебіг гепатиту, індукованого АС. Показано, що підвищення кальційзалежної NO-синтази при застосуванні L-аргініну супроводжується нормалізацією патологічних змін у гепатоцитах. Вперше виявлено позитивний ефект спонтанного донора NO (+-)-(Е)-етил-2-[(Е)гідроксиіміно]-5-нітро-3-гексенаміду (FK409) при токсичному гепатиті.

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень доповнюють знання про механізм дії гепатотропних некрозогенних токсинів, зокрема, їх вплив на функціонування системи синтезу NO в печінці.

Отримані в роботі результати дозволяють науково обґрунтувати доцільність застосування при токсичному гепатиті, викликаному некрозогенними отрутами, препаратів, які були б здатні інгібувати іNOS в печінці. Експериментально доведено також ефективність донорів NO при інтоксикації некрозогенними гепатотоксинами.

Вперше виявлено ефективність селективного інгібітора іNOS

N-(3-(амінометил)бензил)ацетамідину (1400W) при токсичному ураженні печінки, показано, що вибіркове пригнічення даним засобом позитивно коригує патобіохімічні зміни у печінці при її хімічному ураженні.

Запропоновано ефективну і експериментально обґрунтовану комбінацію засобів селективний інгібітор iNOS – 1400W – і субстрат NO-синтази – L-аргінін для корекції токсичного гепатиту, які впливають на ключові ланки патогенезу захворювання.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно розроблено програму дослідження, проведено біохімічні дослідження. Експерименти, в яких досліджували інтенсивність вільнорадикальних реакцій методом ХЛ виконано за допомогою співробітників кафедри біохімії Тернопільського медичного університету імені І.Я. Горбачевського, досліди з вивчення функціонального стану кальційзалежної NO-синтази виконано за участю співробітників відділу хімії і біохімії Університету Огайо (США), за що автор висловлює їм щиру подяку. Формулювання мети і завдань роботи та інтерпретацію отриманих результатів і їх узагальнення здійснено спільно із науковим керівником. Статистична обробка матеріалу і оформлення роботи виконано дисертантом.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, включених до дисертації, оприлюднено на науково-практичній конференції “Сучасний стан і проблеми експериментальної та клінічної біохімії” (Тернопіль, 2004), на VIII, ХХ Міжнародному медичному конгресах студентів і молодих учених (Тернопіль, 2006), на XLVIII та XLIХ підсумкових науково-практичних конференціях „Здобутки клінічної і експериментальної медицини” (Тернопіль, 2005, 2006), у матеріалах 78-ої науково-практичної конференції студентів і молодих учених “Теоретические и практические аспекты современной медицины” (Симферополь, 2006), на міжнародній науково-практичній конференції “Біологічне окиснення в нормі і патології” (Тернопіль, 2006), на IV Львівсько-Люблінській конференції „Експериментальної та клінічної біохімії” (Люблін, 2006).

Публікації. Результати дисертації опубліковані у 12 працях, у тому числі 7 статей (з них у фахових виданнях – 5, без співавторів – 3), 5 – матеріали і тези доповідей на конференціях та симпозіумах.

Структура обсяг і дисертації. Дисертаційна робота викладена на 141 сторінках комп’ютерного набору, за відповідною структурою: вступ, огляд літератури, опис методів і об’єкту дослідження, 4 розділи власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаної літератури, додатків. Робота містить 35 таблиць (22 сторінки) та ілюстрована 1 рисунком (0,5 сторінки.). Бібліографічний список складається із 287 джерел, з них 145 латиницею, та дев’яти додатків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури проаналізовано дані про роль NO за умови хімічного ураження печінки. Особлива увага приділена біохімічним механізмам дії інгібіторів NO-синтаз та донорів NO при інтоксикаціях ксенобіотиками різних груп.

Матеріали і методи дослідження. Дослiди виконано на лабораторних безпородних білих щурах-самцях масою тiла 180-200 г, якi утримувалися на стандартному рацiонi вiварiю. У процесі роботи всього використано 198 тварин.

Моделлю токсичного ураження печінки слугувала інтоксикація тварин АС, який вводили внутрішньочеревно одноразово в дозі 30 мг/кг ( et al., 2001). Всі піддослідні тварини були поділені на такі групи: І - інтактні тварини, яким вводили фізіологічний розчин; ІІ – тварини, що отримували АС (контроль); ІІІ – щури, що отримували АС, а також донор NO L-аргінін; ІV – щури, що отримували АС, а також донор NO (+-)-(Е)-етил-2-[(Е)гідроксиіміно]-5-нітро-3-гексенамід (FK409); V - тварини з гепатитом, яким вводили неселективний інгібітор NO-синтази метиловий ефір N-нітро-L-аргінін (L-NAME); VI – уражені токсином щурі, яким вводили селективний інгібітор іNOS – N-(3-(амінометил)бензил)ацетамідин (1400W); VIІ – щурі, що отримували АС, яких лікували поєднанням препаратів селективного інгібітора іNOS 1400W і субстрату синтази NO L-аргініну.

L-аргінін ("Sigma", USA) вводили в дозі 0,2 г/кг протягом 15 днів перед призначенням АС, в день інтоксикації і в наступні дні, включно з днем декапітації тварин (Anaya-Prado R, et al., 2003). FK409 ("Sigma", USA) вводили одноразово орально в дозі 10 мг/кг маси щура за 30 хв до інтоксикації і дворазово на наступний день після інтоксикації (Kita Y., 1994). L-NAME ("Sigma", USA) вводили внутрішньочеревно в дозі 10 мг/кг за 30 хв перед токсичним ураженням і на наступний день після інтоксикації (Farghali H., et al., 2003). 1400W ("Sigma", USA) – вводили одноразово внутрішньочеревно за 30 хв до ін’єкції гепатотоксину у дозі 1,5 мг/кг і дворазово на наступний день після інтоксикації в аналогічній дозі (Souza M.P., 2004).

Щурів декапітували під тіопентал-натрієвим наркозом на пешу і третю добу з моменту інтоксикації. У дослідженні використовували тканину печінки і кров.

Усі експерименти на тваринах проводили відповідно з “Правилами використання лабораторних експериментальних тварин”(Кожем’якін Ю.М. та ін. 2002.)

Стан еNOS у печінці досліджували за допомогою електрохімічного визначення NO після стимуляції тканини іонофором кальцію (Malinski T. et al., 1996). Поріг чутливості наносенсора становив приблизно 1 нмоль/л. Сумарну активність NO-синтази печінки визначали колориметрично за її здатністю окиснювати НАДФН у присутності L-аргініну як субстрату (Stuehr D. et al., 1991). Загальний вміст нітратів і нітритів у печінці і крові визначали за методом Гріса після відновлення нітратів до нітритів за допомогою кадмію (Ridnour L., 2000). Концентрацію загального білка визначали з використанням наборів реактивів АТ “Реагент” (Україна).

Про активність вільнорадикальних реакцій в крові і печінці судили за інтенсивнiстю спонтанної та ініційованої перекисом водню ХЛ (Журавлев А.К., 1985; Веселовский В.А., 1987). Активність процесів ліпопероксидації оцінювали за вмістом в тканинах малонового діальдегіду (МДА), який визначали за його реакцією з тіобарбітуровою кислотою (Андреева Л.И., 1988). Про інтенсивність окиснювальної модифікації білків (ОМБ) судили за утворенням альдегідних і кетонних груп, які взаємодіють з

2,4-динітрофенілгідразином з утворенням забарвленого комплексу (Мещишен І.Ф., 1998). Для характеристики функціонального стану антиоксидної системи визначали активнiсть каталази (КТ) (Королюк М.А., и др., 1988), вміст церулоплазмiну (ЦП) в сироватці крові (Колб В.Г., Камышников В.С., 1982) і відновленого глутатіону SH- груп (Дж. Елман, 1959) в сироватці крові та печінці.

Для оцінки патогенетичної ролі алкогольдегідрогенази (АДГ) в розвитку гепатиту, індукованого АС, визначали її активність за здатністю окиснювати етиловий спирт у присутності НАД+ з утворенням НАДН (Aasmoe L., 1999).

Стан мітохондріального окиснення оцінювали за показниками активності сукцинатдегiдрогенази (СДГ) (Ещенко Н.Д., 1982) та цитохромоксидази (ЦО) (Кривченкова Р.С., 1977).

Для характеристики ступеня деструктивних процесів в сироватці крові та печінці судили за вмістом молекул середньої маси (МСМ) згідно з методикою (Осипович В.К., 1987) в модифікації (Луговец Л.Е., 1990). Визначали також активність ферментів-маркерів цитолізу гепатоцитів – аланін- і аспартатамінотрансфераз (“Lachema Diagnostica”).

Отриманий цифровий матеріал опрацьований за допомогою методів варіаційної статистики із використанням критерію Стьюдента (Гублер Е.В., 1978). Розраховували середню арифметичну величину, похибку середніх арифметичних, коефіцієнт варіації, а також середнє квадратичне відхилення. Зміни вважали достовірними при Р<0,05. У діаграмах та таблицях основної частини дисертації рівень значимості вказували тільки для достовірних відхилень. Для розрахунків використовували спеціальну комп’ютерну програму Research Electrochemistry Software, Ver. 4.30; EG&G Princeton Applied Research й аналізували за допомогою програми Origin 6.0., Excel (Microsoft, USA).

Результати досліджень та їх обговорення.

Визначення активності еNOS показало, що швидке звільнення NO спостерігалося через декілька секунд після індукції ферменту іонофором кальцію. Стимуляція eNOS печінки здорових щурів призводила до утворення NO зі швидкістю 150,15±8,55 нмоль/(л?с). У тварин з гепатитом на першу добу після отруєння зареєстровано зниження швидкості продукції NO в 3,5 раза, на третю добу – приблизно в 3 рази.

Пікова концентрація NO після стимуляції печінки здорових щурів іонофором кальцію становила 160,01±12,21 нмоль/л. Як і швидкість утворення NO, максимальна концентрація різко знижувалася в отруєних АС щурів, в 1,9 і 1,6 раза відповідно в період розпалу некрозу і регенерації – перша, третя доби досліду.

На основі вищенаведених фактів можна зробити висновок, що АС викликає значне пригнічення функціонального стану еNOS у печінці.

Введення отруєним тваринам неселективного інгібітора L-NAME викликало ще різкіше зниження пікової концентрації NO. Даний показник у щурів, яких піддавали дії інгібітора, був в 5,8 раза нижчим, ніж у здорових тварин, і в 2,8 раза нижчим, ніж в отруєних щурів, яким корекція цим препаратом не проводилася. На відміну від L-NAME, введення отруєним АС тваринам високоселективного інгібітора іNOS - 1400W – суттєво не вплинуло на кінетику продукції NO після стимуляції тканини печінки іонофором кальцію.

Застосування L-аргініну значно покращувало функціональний стан eNOS (максимальна продукція NO підвищилася приблизно на 30 % в обидва

терміни дослідження). Підвищувалися під впливом L-аргініну також показники швидкості утворення NO (рис.1.).

Примітка. * - зміни достовірні (Р<0,05) відносно відповідних показників у групі інтактних тварин; ** - зміни достовірні (Р<0,05) відносно відповідних показників у групі контрольних тварин, що отримували АС; # - зміни достовірні (Р<0,05) відносно відповідних показників у групі тварин, що отримували АС, яким проводили корекцію 1400W; ## - зміни достовірні (Р<0,05) відносно відповідних показників у групі тварин, що отримували АС, яким проводили корекцію L-аргініном.

Одноразове введення отруєним АС тваринам спонтанного донора NO FK409 не викликало змін активності eNOS, в той же час при дворазовому застосуванні препарату спостерігалася чітка тенденція до зростання показників як швидкості утворення NO, так і максимальної його кількості.

Найвиразнішого ефекту в плані позитивної корекції функціонального стану eNOS вдалося домогтися при поєднаному використанні L-аргініну і 1400W. У цьому випадку кальційстимульована швидкість утворення NO і максимальна його концентрація збільшувалися на 35-40 %, порівняно з нелікованими щурами.

На відміну від eNOS, в період гострих некротичних змін загальна активність NO-синтази печінки зросла приблизно у 2 рази (з (0,75±0,08) до (1,35±0,20) нмоль/(мг білка?хв)). Оскільки, як було показано вище, eNOS під впливом АС зазнає пригнічення, то можна стверджувати, що таке зростання загальної активності ферменту відбувалося завдяки стимуляції його індуцибельної форми.

Одноразове введення L-NAME перед інтоксикацією щурів АС повністю запобігало активації загальної NO-синтази, призводило до зниження її активності нижче рівня здорових тварин. Застосування селективного інгібітора iNOS – 1400W також ефективно запобігало підвищенню активності загальної NO-синтази. Ні одноразове, ні дворазове застосування L-аргініну чи FK409 достовірного впливу на загальну активність NO-синтази не справило. Проте, в цей же час, поєднане використання інгібітора iNOS 1400W і субстрату для NO-синтази L-аргініну суттєво пригнічувало загальну активність NO-синтази.

Концентрація вмісту нітратів і нітритів (NOx) у плазмі крові уражених АС тварин через 1 добу після інтоксикації зросла вдвічі (з (14,30±1,18) до (28,30±1,14) мкмоль/л) і залишалася достовірно підвищеною протягом трьох днів. У печінці вміст нітритів і нітратів підвищувався (з (2,51±0,14) до (3,15±0,14) мкмоль/г). Як застосування неселективного інгібітора L-NAME, так і селективного – 1400W – призводило до достовірного зниження в крові і печінці щурів вмісту нітратів і нітритів. При цьому L-NAME знижував дані показники більше, ніж 1400W. Суттєві зміни з боку NOx спостерігалися у печінці і плазмі крові щурів з гепатитом, яким вводили донори NO. Обидва препарати підвищували вміст кінцевих продуктів обміну NO. Поєднане застосування інгібітора iNOS – 1400W і субстрату для NOS L-аргініну достовірно знижувало вміст нітратів і нітритів в тканинах щурів з інтоксикацією АС.

Подальші результати наших досліджень показали, що порушення в системі NO при інтоксикації АС супроводжується суттєвою активацією процесів вільнорадикального окиснення в плазмі крові та печінці, про що свідчить зафіксоване нами збільшення інтенсивності спонтанної та iнiцiйованої перекисом водню ХЛ цих тканин. На наступну добу після введення тваринам АС інтенсивність спонтанної ХЛ плазми кровi i тканини печiнки зростала, відповідно, в 2,2 i 2,8 раза, суми індукованої ХЛ – в 4,1 і 3 рази (при цьому в тканині печінки пiдвищенi показники зберiгалися на статистично достовірному рівні протягом першої доби). Зареєстроване нами різке зростання ХЛ в тканинах щурів свiдчить, що за умов iнтоксикацiї АС в печiнцi та кровi підвищується рiвень вiльних радикалiв i/або знижується вмiст ендогенних антиоксидантiв. Про взаємозв’язок між метаболізмом NO і вільнорадикальними процесами свідчить той факт, що інгібітори NO-синтази і донори NO впливали на активність вільнорадикальних реакцій в тканинах тварин. Так, через

одну добу iнтенсивнiсть спонтанної ХЛ тканини печiнки щурів, яким вводили L-NAME, була на 30 % вищою, нiж така печiнки щурiв, яким інгібітор не призначали. Ще більшою мірою (на 48 %) даний показник підвищувався через одну добу від початку досліду. На відміну від L-NAME, корекція селективним інгібітором призводила до часткової або повної нормалізації показників ХЛ. При одноразовому введенні 1400W спостерігалося достовірне зниження суми ХЛ в плазмі крові і печінці (відповідно в 1,3 і 1,7 раза) та інтенсивності спонтанної ХЛ у печінці (в 1,8 раза).

Призначення отруєним АС тваринам L-аргініну призвело до поліпшення показників активності вільнорадикальних реакцiй у печiнцi (сума ХЛ знижувалася на 27 %, порівняно з тваринами, яким L-аргінін не призначався). Одноразове введення спонтанного донора NO FK409 достовірного ефекту на показники активності вільнорадикальних реакцій у печінці і плазмі крові не справило. При дворазовому застосуванні даного препарату інтенсивність ініційованої перекисом водню ХЛ тканини печінки була достовірно нижчою (на 40 %), порівняно з нелікованими тваринами.

Комбіноване призначення отруєним АС тваринам 1400W і L-аргініну призвело до достовiрного зниження активності вільнорадикальних реакцiй у плазмі крові і печiнцi.

Вважають, що вміст МДА в біологічних зразках адекватно відображає активність процесів ліпопероксидації, що є однією з форм вільнорадикального окиснення. Ми спостерігали синхронність змін рівня МДА і інтенсивності ХЛ в тканинах щурів з гепатитом, індукованим АС (максимальні показники вмісту МДА в обох тканинах були зафіксовані на 1-у добу після введення токсину). Введення L-NAME статистично достовірно підвищувало вміст МДА у печінці отруєних АС щурів в обидва строки дослідження (на 44 і 70 % відповідно на першу і третю доби експерименту). В той же час селективний інгібітор, навпаки, знижував інтенсивність перекисних реакцій у ліпідах. L-аргінін достовірно (на 36 %) знижував вміст МДА у печінці лише на третю добу експерименту, тоді як спонтанний донор оксиду азоту FK409 не справив достовірного впливу на показники інтенсивності ліпопероксидації в тканинах щурів з токсичним гепатитом. Комбінація препаратів 1400W і L-аргініну, як і у випадку з ХЛ, ефективно пригнічувала процеси ліпопероксидації як в плазмі крові, так і в печінці щурів, уражених АС (через 24 год після інтоксикації концентрація МДА в плазмі крові знизилася в 2,2 раза, а в печінці – в 1,9 раза).

Надмірне утворення вільних радикалів призводить не тільки до перекисної деградації ліпідів, але й до модифікації амінокислотних залишків у білках. Введення тваринам АС викликало окисну модифікацію як нейтральних, так і лужних амінокислот. Через одну добу після інтоксикації вміст 2,4-динітрофенілгідразонів, що визначалися при 310 нм (відображає концентрацію альдегід- і кетонопохідних нейтрального характеру) підвищився в 1,6 раза, порівняно зі здоровими тваринами, а таких, що визначалися при 430 нм (альдегід- і кетонопохідні нейтрального характеру) зріс в 1,7 раза. Селективний інгібітор призводив до поліпшення показників окисної модифікації білків. Через одну добу після введення 1400W вміст альдегід- і кетонопохідних нейтрального (ОМБ310) характеру достовірно (в 1,4 раза) зменшився, порівняно з тваринами, яким інгібітор не вводили. Застосування L-аргініну також призводило до деякого пригнічення пероксидного окиснення білків (через 24 год після введення L-аргініну вміст ОМБ знижувався на 16 % (Р<0,05)). Поєднане застосування 1400W і L-аргініну викликало поліпшення показників вмісту в крові альдегід- і кетонопохідних нейтрального і основного характеру більшою мірою, ніж введення кожного з препаратів окремо (через одну добу після використання комбінації препаратів вміст ОМБ зменшився, порівняно з тваринами, яким корекція не проводилася, в півтора раза).

Активність радикальних реакцій у біологічних тканинах залежить не тільки від швидкості формування вільних радикалів, але і від здатності захисних систем їх перехоплювати і нейтралізувати. Як показали результати наших експериментiв, ураження печiнки АС супроводжується глибокими порушеннями антиоксидної системи. Це проявляється в зменшенні в печінці більше, ніж у 2 рази активності одного з основних антиоксидних ферментів організму – КТ, що відповідає за знешкодження перекису водню і тим самим блокує ланцюг лiпопероксидацiї ще на стадiї iнiцiацiї. На відміну від печінки, в плазмі крові спостерігалося підвищення активності ферменту після інтоксикації. Вiдомо, що велика кiлькiсть КТ мiститься в гепатоцитах. Можливо, що підвищення активності ферменту в крові є результатом його посиленого виходу з печінки внаслiдок цитолiзу гепатоцитiв пiд впливом АС (Григор'єва Н.П., Яремій І.М., Мещишен І.Ф., 2000). L-NAME достовірно (на 20 %) пригнічував активність КТ в печінці. Як було раніше показано, використання при токсичному гепатиті 1400W викликає деяке пригнічення активованих токсином вільнорадикальних процесів. Можливо, це призводить до запобігання виснаження антиоксидної системи. Так, вже при одноразовому введенні даного селективного інгібітора нами зафіксовано достовірне поліпшення показників активності КТ в тканинах щурів з токсичним гепатитом. Призначення L-аргініну ураженим АС тваринам також призвело до півторакратного (Р<0,05) підвищення активності КТ в печінці, порівняно з тваринами, яким препарат не вводився. Корекція спонтанним донором NO – FK450 викликала покращення показників активності КТ в печінці уражених тварин в меншій мірі, ніж L-аргініном. Найкращі результати спостерігалися при призначенні 1400W разом з L-аргініном. У цьому випадку активність КТ в печінці уражених АС тварин підвищувалася на 80 %.

Цікаві результати отримано нами при дослідженні в плазмі крові тварин з токсичним гепатитом концентрації мідьвмісного білка, якому притаманні ферментативні антиоксидні властивості – ЦП. Виявилося, що незважаючи на той факт, що ЦП повністю синтезується мембранозв’язаними полісомами гепатоцитів, його вміст в плазмі крові при ураженні печінки АС зростає. Через добу з моменту введення токсину вмiст ЦП становив 135 % вiд рiвня здорових щурiв, через три доби –

132 %. Після застосування 1400W рівень ЦП у плазмі знизився на 20 % (Р<0,05). Введення L-аргініну не призвело до суттєвої зміни вмісту ферменту. При використанні FK409 змін концентрації даного антиоксиданта в крові також не спостерігалося. В той же час при поєднаному застосуванні 1400W і L-аргініну ми спостерігали достовірне зниження вмісту ЦП як на першу, так і на третю добу експерименту. Через одну добу з моменту інтоксикації концентрація ЦП в крові тварин, яким вводили комбінацію засобів, була на 26 % нижчою від такої у нелікованих щурів, а через три доби – на 23 %.

АС, метаболізуючись у печінці, призводить до утворення активного метаболіту акролеїну (Логинов А.С., 1997; K. 2001; Зейц Г., 2001; Паламарчук О.В., 2002). Зниження вмісту відновленого глутатіону, яке ми спостерігаємо після введення токсину, може бути наслідком токсичного впливу акролеїну на сульфгідрильні групи. Зменшення концентрації відновленого глутатіону призводить до послаблення антиоксидантного захисту клітини до такого рівня, що NO, який продукується iNOS печінкових макрофагів у відповідь на інтоксикацію, може викликати пошкодження паренхіми печінки. Через одну добу вiд початку дослiду рівень сульфгідрильних груп знизився в 2,2 раза в плазмі крові і в 1,7 раза у печінці. Згодом вміст SH-груп в обох тканинах дещо зростав, проте на 3-ю добу експерименту все ще залишався достовірно нижчим, порівняно зі здоровими тваринами. Корекція гепатиту неселективним інгібітором NO-синтази L-NAME негативно відобразилася на показниках концентрації SH-груп. В той же час, інгібування iNOS за допомогою 1400W призводило до покращення показників концентрації SH-груп. Незначне підвищення вмісту відновленого глутатіону в печінці спостерігалося також після застосування L-аргініну. При поєднаному введенні даних засобів рівень SH-груп підвищився більш виражено (в 1,6 раза).

Важливе значення у патогенезі токсичних уражень печінки належить порушенню біоенергетичних процесів у мітохондріях (Brent J.A., 1993; Shiratori Y., Okano K., 1994; Кучменко О.Б., 2001;). Очевидно, що активовані процеси лiпопероксидацiї призводять до порушення дiяльностi ферментів, які локалiзованi в плазматичних та цитоплазматичних мембранах, зокрема, в мембранах мiтохондрiй, що негативно вiдобразиться на процесах окиснення субстратiв дегiдрогеназами, транспорту електронiв по дихальному ланцюгу, синтезу АТФ. На порушення під впливом АС електронного транспорту в дихальному ланцюгу вказують і отримані нами факти, що свідчать про пригнічення активності СДГ в мiтохондрiях печiнки в 1,7 рази, порiвняно iз здоровими тваринами, і ЦО майже вдвічі. При введенні неселективного інгібітора L-NAME спостерігалася тенденція до ще більшого зниження активності даних ферментів. L-аргінін, навпаки, збільшував активність СДГ (на 42 % через одну добу після інтоксикації). У цей же час активність термінального ферменту дихального ланцюга – ЦО – під впливом L-аргініну збільшувалася на 34 %. Як і в попередніх випадках, ефективним виявилося комбіноване використання інгібітора iNOS 1400W і попередника NO L-аргініну (активність СДГ і ЦО зростала в 1,4 раза).

Дія некрозогенних ксенобіотиків супроводжується посиленням процесів катаболізму в тканинах з утворенням нових токсичних продуктів. Маркерами ступеня інтоксикації можуть бути так звані молекули середньої маси (МСМ). Вміст МСМ в організмі зростає при деструктивних, некротичних процесах в різних органах і, зокрема, у печінці. Також класичними маркерами цитолізу гепатоцитів є ферменти аланін- і аспартатамінотрансферази. З метою оцінки ступеня тяжкості некрозу печінки ми визначали активність АлАТ і АсАТ та вміст МСМ у плазмі крові. Як показали результати наших досліджень, через одну добу пiсля введення пiддослiдним тваринам 30 мг/кг АС спостерігається виражений цитоліз гепатоцитів і вихід ферментів в кров. Так, активність АлАТ в цей період зросла в 9 разів, а АсАТ – майже у 8 разів, порівняно із здоровими тваринами. Очевидно, що розпал токсичного гепатиту припадав на першу добу експерименту, оскільки в подальшому відбувалося зниження активності маркерів цитолізу в плазмі крові. Так, через три доби активність АлАТ зменшилася до 70 % від рівня першої доби, а активність АсАТ – до 35 %. Незважаючи на таку тенденцію, активність обох ферментів на третю добу досліду все ще залишалася статистично достовірно вищою порівняно з інтактними щурами, що свідчить про ще неповну регенерацію тканини печінки у цей термін дослідження. Одноразове введення тваринам з гепатитом неселективного інгібітора достовірно (на 40 %) підвищувало активність АлАТ в плазмі крові. У цей же термін спостерігалася тенденція до зростання активності іншого маркера цитолізу – АсАТ. Двократне введення L-NAME (третя доба експерименту) щурам, отруєним АС, викликало збільшення активності АлАТ у 1,6 раза і АсАТ – вдвічі. Отже, загальне блокування активності NO-синтази при гострому отруєнні АС загострює процеси цитолізу в печінці. В той же час одноразове застосування блокатора iNOS 1400W призводило до зниження активності АлАТ у плазмі крові в 1,8 раза і до зниження активності АсАТ в 1,9 раза. Достовірно (на 33 %) знижувалась активність АлАТ і АсАТ в плазмі крові і при використанні L-аргініну. Введення тваринам з гепатитом комбінації 1400W+L-аргінін вдвічі знижувало активність маркерів цитолізу в плазмі крові.

Вміст МСМ змінювався пропорційно до змін активності амінотрансфераз. У перiод найбiльш виражених некротичних змiн (перша доба) концентрація МСМ1 і МСМ2 у крові підвищувалася, відповідно, в 3,4 і 2,5 раза. Застосування L-NAME призводило до ще більшого зростання обох фракцій МСМ в крові. Селективний інгібітор NO-синтази 1400W, навпаки, знижував вміст МСМ. Після одноразового застосування 1400W рівень МСМ1 у плазмі крові зменшувався на 60 %, а МСМ2 - на

40 %. Нами виявлено, що тільки вміст в плазмі крові МСМ, визначених при довжині хвилі 280 нм, достовірно змінювався (зменшувався на 20 %) при одноразовому введенні L-аргініну. Такою ж мірою даний показник зменшувався у печінці при одноразовому застосуванні FK409. На третю добу експерименту вміст МСМ2 достовірно поліпшувався при введенні обох засобів тільки в плазмі крові (в 1,3 раза при застосуванні L-аргініну і в 1, 2 раза при введенні FK409). Ефект від поєднаного застосування 1400W і L-аргініну був вищим, ніж при окремому введенні препаратів. На першу добу після інтоксикації і застосування комбінації препаратів вміст МСМ, визначених при довжині хвилі 254 нм, знижувався достовірно як у плазмі крові (в 1,7 раза), так і в печінці (в 1,5 раза). Застосування комбінації 1400W+L-аргінін також призводило до ефективного зниження МСМ, які визначалися при довжині хвилі 280 нм (ароматичні амінокислоти). Так, на першу добу експерименту вміст МСМ2 знижувався у плазмі крові в 1,3 раза (P<0,05), а в печінці – в 1,7 раза (P<0,05).

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукового завдання, що полягає в комплексному дослідженні регуляторної ролі оксиду азоту в патогенезі токсичного ураження печінки. Вперше показано, що некротичні зміни у хворому органі пов’язані з дисбалансом між конституційною (ендотеліальною) та індуцибельною формами NO-синтази у печінці. Запропоновано нові підходи до корекції патологічних змін у печінці при її хімічному ураженні аліловим спиртом за допомогою інгібіторів NO-синтази і донорів NO.

1. Експериментальне ураження печінки аліловим спиртом супроводжується пригніченням в 3,5 раза активності ендотеліальної NO-синтази із одночасною активацією її індуцибельної форми на першу добу після отруєння. При цьому зростає в 1,8 раза загальна активність NO-синтази і в 2 рази вміст нітритів і нітратів у крові.

2. Системні порушення синтезу оксиду азоту при токсичному ураженні печінки аліловим спиртом тісно корелюють із інтенсифікацією вільнорадикальних реакцій: зростання більше ніж у 2 рази показників спонтанної та індукованої хемілюмінесценції тканин печінки і плазми крові, посилення процесів ліпопероксидації (рівень малонового діальдегіду в тканинах печінки зростав у 2,7-3,2 раза) і посилення окисної модифікації білків (концентрація альдегід- і кетонопохідних амінокислот збільшувалася в 1,6-1,7 раза). Одночасно з цими змінами відбувається пригнічення

активності системи антиоксидантного захисту гепатоцитів (активність каталази зменшувалася більше, ніж у 2 рази, а рівень SH-груп – в 1,7 раза у печінці контрольної групи тварин, яким вводили аліловий спирт).

3. Порушення процесів синтезу NO і окиснювальних реакцій при експериментальному ураженні печінки аліловим спиртом супроводжується розвитком деструктивних процесів у гепатоцитах, на що вказує пригнічення активності мембранозв’язаних ферментів мітохондрій (активність сукцинатдегідрогенази і цитохромоксидази знижувалася в 1,7 і 2,0 рази відповідно) з одночасним підвищенням в плазмі крові активності ензиматичних маркерів цитолізу - АлАТ і АсАТ - в 9 і 8 разів, відповідно, та із достовірним зростанням у 2 рази вмісту маркерів ендогенної інтоксикації – молекул середньої маси.

4. Пригнічення активності NO-синтази за допомогою неселективного інгібітора L-NAME при некротичному ураженні печінки ускладнює перебіг патологічного процесу, що проявляється у посиленні активованих аліловим спиртом вільнорадикальних реакцій, ще більшому пригніченні функціонування системи антиоксидного захисту, інгібуванні активності ферментів дихального ланцюга мітохондрій і зростанні ступеня деструкції гепатоцитів, який оцінювали за збільшенням активності амінотрансфераз і концентрації молекул середньої маси.

5. Вибіркове пригнічення активності індуцибельної форми NO-синтази за допомогою високоселективного інгібітора N-(3-(амінометил) бензил)ацетамідину (1400W) ефективно запобігає порушенню окиснювальних процесів і розвитку некротичних змін у печінці при гострому отруєнні тварин аліловим спиртом.

6. Введення тваринам із токсичним гепатитом попередника оксиду азоту L-аргініну, або новітнього спонтанного донатора оксиду азоту

(+-)-(Е)-етил-2-[(Е)гідроксиіміно]-5-нітро-3-гексенаміду (FK409), сприяє поліпшенню функціональної спроможності ендотеліальної форми NO-синтази, частково запобігає активації вільнорадикальних процесів, позитивно позначається на функціонуванні мітохондріальних ферментів – сукцинатдегідрогенази і цитохромоксидази і частково перешкоджає розвитку деструктивних процесів у печінці. Позитивний ефект L-аргініну виявився більш вираженим, ніж такий ефект FK409.

7. Вибіркове пригнічення активності індуцибельної форми NO-синтази за допомогою високоселективного інгібітора 1400W із одночасним поліпшенням функціонального стану ендотеліальної форми NO-синтази за допомогою L-аргініну є ефективною комбінацією засобів корекції хімічного ураження печінки. Таке поєднання препаратів суттєво поліпшує показники