ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

Юкало Володимир Глібович

УДК 577.112.083/122.2

Білки казеїнового комплексу коров’ячого молока та продукти їх протеолізу за дії ферментів молочнокислих бактерій

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Львів – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі харчової біотехнології і хімії Тернопільського державного технічного університету імені Івана Пулюя Міністерства освіти і науки України.

Науковий консультант доктор біологічних наук, професор

Сологуб Леонід Ілліч,

Інститут біології тварин УААН,

головний науковий співробітник

лабораторії обміну речовин

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України

Стойка Ростислав Степанович,

Інститут біології клітин НАН України,

завідувач відділу проліферації клітин

доктор біологічних наук, професор,

Стародуб Микола Федорович,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

головний науковий співробітник відділу молекулярної біології

доктор біологічних наук, професор,

Лущак Володимир Іванович,

Прикарпатський університет ім. В.С. Стефаника Міністерства освіти і науки України,

завідувач кафедри біохімії

Провідна установа Львівський національний університет

імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України, кафедра біохімії, м. Львів

Захист дисертації відбудеться „13” березня 2007 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 Інституту біології тварин УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту біології тварин УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38.

Автореферат розісланий „12” лютого 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Віщур О.І.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. У вивченні білків казеїнового комплексу молока досягнуто значного прогресу. Розшифровано первинну структуру головних фракцій казеїнів, досліджено їхні фізико-хімічні властивості (Fox P., McSweeny P., 1998; Горбатова К.К., 2001; Farrell H. et al., 2004). Проведено роботу зі з’ясування просторової будови нативних казеїнових міцел, субміцел і окремих казеїнових фракцій, запропоновано ряд моделей казеїнових міцел (Walstra P, 1999; Farrell H. et al., 2002; Bauman D. et al., 2006). У більшості наукових робіт підтверджено біологічну функцію казеїну, як харчового білка, здатного швидко розщеплюватись протеолітичними ферментами шлунково-кишкового тракту та забезпечувати організм амінокислотами і деякими мінеральними речовинами (Черников М.П., 1990; Whitney R., 1999; Рогов И.А. и др., 2000). При цьому не зовсім зрозумілою залишалась складність структури, висока гетерогенність казеїну і нижчий ступінь засвоєння казеїнів у порівнянні з іншими білками (Черников М.П., 1975; Горбатова К.К., 1993).

В останні роки інтерес до казеїнів значно зріс завдяки відкриттю пептидів з високою біологічною активністю серед продуктів, які утворюються під час їх протеолітичного розщеплення у шлунково-кишковому тракті людини і тварин. Зокрема, серед цих продуктів було виявлено пептиди з антигіпертензивними властивостями (Meisel1993; FitzGerald R. et al. 2000), пептиди з морфіноподібною активністю (Brantl V., Neubert K., 1986; Brandsch M. et al., 1994; Teschemacher2003), казоплателіни, що попереджують утворення тромбів (Fiat A. et al., 1993; Jolles P. en. al., 1993; Qian Z. et al., 1995), імуноказопептиди, які регулюють функцію імунної системи (Lahov E., Regelson1996; Gill H. et al., 2000), та інші біологічно активні пептиди (Florisa R. et al., 2003; Silva S., Malcata F., 2005; Kohronen H., Pihlanto A., 2006). Є підстави вважати, що здатність казеїнів розщеплюватися з утворенням біологічно активних пептидів виникла у процесі еволюції ссавців і генетично детермінована.

Казеїни є природними субстратами протеолітичних ферментів молочнокислих бактерій, а також молокозгортальних протеолітичних ферментів. Відомо, що протеолітичні ферменти молочнокислих бактерій розщеплюють казеїни з утворенням великої кількості пептидів (Law B., Haandrikman A., 1997; Christensen J. et al., 1999). На основі результатів, отриманих при дослідженні протеолізу казеїнів за дії ферментів різних штамів молочнокислих бактерій, ми в 1991 році висунули гіпотезу про утворення в процесі їх протеолізу біологічно активних пептидів, зокрема антигіпертензивних пептидів (Юкало В.Г., Шуляк Т.Л., 1991). Пептиди з антигіпертензивною активністю, що дістали назву казокінінів, мають важливе значення у профілактиці і лікуванні серцево-судинних захворювань (Meisel H., 1993).

Для експериментального підтвердження гіпотези про утворення казеїнових біологічно активних пептидів необхідною є модельна система, яка б дозволила отримати велику кількість пептидів за дії на казеїни протеолітичних ферментів молочнокислих бактерій та молокозгортальних препаратів. Відомі до цього часу модельні системи є малочутливими, не забезпечують збереження повного складу протеолітичних ферментів у молочнокислих бактерій і не відображають сумісну дію всіх ферментів протеолітичної системи (Busch J., 1989; Visser S., 1993; Farkye N. et al., 1995). Також недоліком цих модельних систем було використання казеїнових міцел і фракцій з порушеною структурою, оскільки виділення казеїнових субстратів проводилося при екстремальних значеннях рН і температури, за умов денатуруючої дії детергентів, органічних розчинників, іонів кальцію (Whitney R., 1999; Крусь Г.Н. и др., 2002). Оскільки специфічність протеолізу залежить від просторової будови білка, актуальною є розробка методів виділення міцел загального казеїну та його фракцій із збереженням їх структури і складу. Важливо також зазначити, що біологічно активні пептиди серед продуктів протеолізу, які утворюються за дії на казеїни протеолітичних ферментів лактококів та молокозгортальних протеолітичних ферментів, не виявлено та не охарактеризовано.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у межах госпдоговірної теми кафедри біомедсистем і апаратів Тернопільського державного технічного університету імені Івана Пулюя “Розробка методики і виділення бS- і в-казеїнів” №234-93 (1993 р.), в якій автор виділяв очищені казеїнові фракції; держбюджетних тем кафедри харчової біотехнології і хімії Тернопільського державного технічного університету імені Івана Пулюя “Дослідження та оптимізація біохімічних та фізико-хімічних процесів у молочно-білкових системах”, № держреєстрації 0196U012986 (1996–1999 рр.), в якій автор проводив протеоліз казеїнових фракцій за дії ферментів молочнокислих бактерій і молокозгортальних ферментів; “Дослідження процесів одержання білкових фракцій молока методами безмембранного осмосу та електроосмосу”, № держреєстрації 0199U003999 (1999–2001 рр.), в якій автор досліджував склад і будову нативних міцел казеїну.

Мета і завдання дослідження. Встановити нові шляхи утворення біологічно активних пептидів з казеїнів коров’ячого молока, з’ясувати їх біологічну дію та дати їм біохімічну характеристику.

Для досягнення поставленої мети було сформовано такі основні завдання:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

Об’єкт дослідження: білки казеїнового комплексу коров’ячого молока та продукти їх протеолізу, які володіють біологічною активністю.

Предмет дослідження: шляхи утворення біологічно активних пептидів у процесі протеолізу казеїнових фракцій ферментами протеїназо-позитивних лактококів та молокозгортальних препаратів.

Методи дослідження: біохімічні, фізико-хімічні, мікробіологічні, фізіологічні, електронна мікроскопія.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше вивчено протеолітичну активність, фагорезистентність, антагоністичну активність та біохімічні властивості (синтез молочної кислоти, діацетилу, ацетоїну, СО2, стійкість до дії NaCl і антибіотиків) 52 штамів молочнокислих бактерій. Встановлено локалізацію протеолітичних ферментів у клітинах лактококів і обґрунтовано критерій їхнього відбору за співвідношенням позаклітинних і внутрішньоклітинних протеаз.

Запропоновано вдосконалену методику ідентифікації фракцій казеїнового комплексу коров’ячого молока відповідно до міжнародної класифікації казеїнів. Розроблено схему, яка дозволяє проводити фракціонування казеїну із максимальним збереженням його складу та структури без використання екстремальних значень рН, температури та інших денатуруючих чинників. При цьому виділено електрофоретично чисті фракції бS2-CN методом іонообмінної хроматографії в об’ємі та фракції в-CN методом гель-хроматографії.

Встановлено утворення біологічно активних пептидів у результаті протеолізу казеїну ферментами молочнокислих бактерій та молокозгортальних препаратів у ферментованих молочних продуктах. Розроблено модельну протеолітичну систему, яка дозволяє отримувати низькомолекулярні продукти протеолізу казеїнів у високій концентрації. Показано утворення казокінінів з S1--CN та -CN фракцій казеїнів за умов модельної протеолітичної системи при дії ферментів окремих штамів лактококів і молокозгортальних ферментів, відібрано за допомогою модельної системи штами, здатні звільняти казокініни під час протеолізу у ферментованому молочному продукті.

У щурів з артеріальною гіпертензією встановлено антигіпертензивну дію пептидних препаратів, виділених з S1--CN та -CN фракцій казеїнів під час модельного протеолізу.

Практичне значення результатів. Запропонована (в результаті проведення досліджень) схема виділення інтактних міцел казеїну та його фракцій рекомендована для використання при промисловому отриманні гомогенних фракцій казеїну. Вдосконалений метод ідентифікації казеїнів запропоновано для контролю виділення казеїнів та його фракцій. Рекомендується враховувати критерій співвідношення позаклітинної і внутрішньоклітинної активності протеолітичних ферментів лактококів у лабораторіях, які створюють стартові культури. Протеолітична модельна система може бути використана для тестування та відбору ферментних препаратів і штамів лактобактерій, здатних розщеплювати казеїни з утворенням казокінінів та інших біологічно активних пептидів. Пропонуються шляхи отримання та використання казокінінів для створення функціональних продуктів з антигіпертензивними властивостями.

Отримані в роботі результати і теоретичні узагальнення використовуються при викладанні курсів “Біохімія”, “Хімія харчових речовин”, “Основи фізіології та гігієни харчування” для студентів за професійним спрямуванням “Харчова технологія та інженерія” і в курсі “Основи біохімії і біофізики” для студентів спеціальності “Біотехнічні та медичні апарати і системи” в Тернопільському державному технічному університеті імені Івана Пулюя.

Особистий внесок здобувача. На основі проведених у 1985-2005 роках досліджень білків казеїнового комплексу та продуктів його протеолізу автором було обґрунтовано концепцію дисертаційної роботи та розроблено стратегію і методологію досліджень. Всі результати отримані автором особисто або за безпосередньої участі, самостійно зроблено пошук та аналіз літературних даних, аналіз та оформлення результатів експериментів, підготовлено до друку наукові публікації. Основні положення і висновки дисертаційної роботи обговорювались із науковим консультантом, професором Сологубом Л.І. Окремі результати експериментів були отримані за участю співавторів публікацій, які були співвиконавцями науково-дослідних тем, участь яких задекларована у списку літератури.

Частина експериментів з відпрацювання методів протеолізу проведена в лабораторії біотехнології Технологічного інституту м’яса і молока УААН (м. Київ) та в лабораторії біополімерів Інституту елементорганічних сполук РАН (м. Москва). Електронно-мікроскопічні дослідження казеїнових міцел проведені на кафедрі біохімії та в лабораторії електронної мікроскопії Інституту прикладної біотехнології (м. Москва) за участю інженера Єрохова С.Б. Дослідження фагорезистентності й антагоністичних властивостей лактококів проведені в лабораторії мікробіології Білоруського науково-дослідного і конструкторсько-технологічного інституту м’ясної і молочної промисловості (м. Мінськ) за участю наукового співробітника Парнюк Т.О. Виготовлення та окремі дослідження експериментальних ферментованих молочних продуктів проведені на кафедрі технології молока і молочних продуктів та кафедрі біохімії і мікробіології Могильовського технологічного інституту (Білорусь).

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідалися і були представлені на вітчизняних і міжнародних конференціях, симпозіумах і з’їздах: Всесоюзній конференції „Свойства и использование биополимеров в пищевых продуктах” (Могильов, 1990); Всесоюзній конференції „Химические превращения пищевых полимеров” (Калінінград, 1991); Міжнародній конференції „Проблемы микробиологии и биотехнологии” (Мінськ, Білорусь, 1998); Міжнародній конференції молодих вчених „Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии” (Москва, Росія, 2001); VІІІ Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002); Українському фізіологічному з’їзді (Вінниця, 2002); Міжнародній конференції „Микробиология и биотехнология ХХІ столетия” (Мінськ, Білорусь, 2002); 4-й Парнасівській конференції „Молекулярні механізми активації клітин” (4th Parnas conference “Molecular mechanisms of cell activation: Biological signals and their target enzymes”), Вроцлав, Польща, 2002; 27-у Європейському пептидному симпозіумі (27th European peptide symposium), Соренто, Італія, 2002; ІІ Львівсько-Люблінській конференції з експериментальної та клінічної біохімії (ІІ Lviv-Lublin Conference of experimental and clinical biochemistry), Люблін, Польща, 2002; І Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених, студентів, аспірантів „Біотехнологія. Наука. Освіта” (Київ, 2003); Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); Міжнародній конференції „Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии” (Мінськ, Білорусь, 2004); ІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції „Біотехнологія. Наука. Освіта” (Львів, 2004); ІІІ Львівсько-Люблінській конференції з експериментальної та клінічної біохімії (ІІІ Lviv-Lublin Conference of experimental and clinical biochemistry), Львів, 2004; 2-й Європейській конференції по фільтрації і сепарації (2nd European conference on filtration and separation), Комп’єнь, Франція, 2006; ІХ Українському біохімічному з’їзді (Харків, 2006); щорічних наукових конференціях викладачів ТДТУ імені Івана Пулюя (Тернопіль, 1997-2005).

Публікації. За темою роботи опубліковано 45 робіт, у тому числі 27 статей у наукових журналах (з них 14 одноосібних), одержано одне авторське свідоцтво і один патент.

Структура та обсяг роботи. Робота викладена на 359 сторінках комп’ютерного тексту, складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, результатів досліджень, підсумків, висновків, списку використаної літератури та трьох додатків. Робота містить 100 рисунків, 51 таблицю. Бібліографічний список складає 638 джерел, з них 527 іноземних. Загальний обсяг ілюстрацій і таблиць – 83 сторінки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Огляд літератури. В огляді літератури проаналізовано сучасні дані про класифікацію, будову і властивості білків казеїнового комплексу коров’ячого молока, про склад і властивості протеолітичних ферментів молочнокислих бактерій та молокозгортальних препаратів, які беруть участь у процесах протеолізу казеїнів. Особлива увага в огляді літератури акцентується на аналізі відкритих в останні роки пептидів казеїнового походження, які володіють різними видами біологічної активності.

Матеріали та методи дослідження. У дослідженнях використано 114 білих щурів-самців однакового віку та маси. Тварини були розділені на три групи. Перша група включала 23 інтактні щурі, які знаходились у звичайних умовах віварію. Другу групу (24 тварини) становили щурі з експериментальною артеріальною гіпертензією. Третю групу складали тварини (67 щурів) з експериментальною гіпертензією, яким внутрішньошлунково щоденно вводили казеїнові пептидні препарати протягом 14-ти днів після операції, коли у тварин розвивалась стійка гіпертензія. Всі оперативні втручання в експериментальних тварин проводились із дотриманням правил асептики і антисептики в умовах тіопенталового наркозу.

Для виконання завдань, що випливали із мети дисертаційної роботи, було використано 52 штами молочнокислих бактерій, зокрема мезофільні молочнокислі лактококи, які відносяться до різновидностей Lcc. lactis subsp. lactis (19 штамів), Lcc. lactis subsp. cremoris (14 штамів), Lcc. lactis biovar. diacetylactis (17 штамів) та 2 штами термофільних стрептококів Streptococcus salivarius subsp. thermophilus. Штами лактококів були отримані з лабораторії мікробіології Литовського харчового інституту (м. Каунас), лабораторії біотехнології Технологічного інституту м’яса і молока УААН (м. Київ), центральної лабораторії мікробіології Всесоюзного науково-дослідного інституту молочної промисловості (м. Москва), лабораторії фізіології мікроорганізмів Інституту мікробіології НАН Білорусі (м. Мінськ) та лабораторії мікробіології Білоруського науково-дослідного конструкторсько-технологічного інституту м’ясної і молочної промисловості (м. Мінськ).

При пересіванні штамів лактококів як поживне середовище використовували свіже стерилізоване знежирене молоко. Лактококи зберігали при температурі 40С. Пересіви штамів проводили через кожні 20 днів. При довготривалому зберіганні штами ліофілізували у спеціальних скляних ампулах.

Всі використані в дослідженнях реактиви, крім нижчеописаних, були фірми “Реахим“ (“ХЧ” або “ОСЧ”).

Диск-електрофорез проводили в нативних умовах анодної диск-ПААГ системи для кислих і нейтральних білків (Остерман Л.А., 1981). Електрофорез казеїнів у присутності додецилсульфату натрію проводили за методом, запропонованим раніше (Шелудько Н.С., 1975). Диск-електрофорез казеїнових фракцій у присутності додецилсульфату натрію здійснювали в пластинках гелю за методикою (Казьмін С.Д., Шербан С.Д., 1978). При цьому градієнт розділяючого гелю (4-20%) створювали, використовуючи дві сполучені посудини однакового об’єму і мікронасос фірми LKB (Швеція). Для електрофорезу в трубочках з ПААГ використовували апарат фірми “Reanal” (Угорщина), а електрофоретичний аналіз у пластинках ПААГ проводили на апараті, виготовленому в нашій лабораторії (Юкало В.Г., 2000). При визначенні молекулярної маси білків і пептидів використовували маркери фірми “Serva”.

Фракційний склад білків казеїнового комплексу та продуктів їх протеолізу досліджували шляхом гель-фільтрації на сефадексах G-75, G-100, G-150 і G-200 фірми “Pharmacia”. Калібрування колонок при цьому проводили з допомогою маркерів фірми “Serva”. Підготовку сефадексів та хроматографічної колонки до гель-фільтрації проводили відповідно до методичної інструкції фірми “Pharmacia”. Вміст білків у об’єднаних хроматографічних фракціях визначали в окремих випадках гравіметрично після осадження казеїнів в ізоелектричній точці або спектрофотометрично за поглинанням при 280 нм. Для розрахунку концентрацій використовували встановлені раніше коефіцієнти поглинання (): 10,1 – для бS1-казеїну; 4,6 – для в-казеїну; 9,6 – для к-казеїну; 10,1 – для бS2-казеїну і 8,2 – для препаратів загального казеїну (Rebadeau-Dumas B., Grappin R, 1989). Для фракціонування й очистки казеїнових фракцій використовували іонообмінну хроматографію на колонках з мікрокристалічною ДЕАЕ-целюлозою (ДЕ-52) фірми “Serva”. Лінійний градієнт концентрацій NaCl формували у змішувачі 500/500 мл фірми “Reanal”.

Електронно-мікроскопічні дослідження казеїнів проводили на кафедрі біохімії та в лабораторії електронної мікроскопії Інституту прикладної біотехнології (м. Москва). Фіксовані зразки казеїнових міцел попередньо розводили. Ступінь розведення встановлювали експериментально. Далі зразки наносили на гальванічну сітку, покриту нітроцелюлозною підкладкою. Сітки із зразками висушували при кімнатній температурі і після цього зразки відтінювалися у вакуумі паладієм під кутом 300. У роботі використовували електронний мікроскоп TESLA BS-613 (Чехія). Фотографували зразки на електронографічні фотопластинки при збільшенні 31000. При цьому один сантиметр на негативі відповідав 323 нм на підкладці. Розрахунок середнього частинкового діаметру проводили за методами, описаними раніше (MсGann T.C. et al., 1980).

Вміст білків на різних етапах виділення нативних міцел казеїну визначали за К’єльдалем (Крусь Г.Н. и др., 2002). В окремих серіях дослідів під час підготовки електрофоретичних і хроматографічних зразків, а також в елюаті після розділення на сефарозі 2В концентрацію білків визначали за методом О.H.et al. (1951). В якості стандарту використовували альбумін сироватки крові (“Sigmа”).

Фракціонування міцел казеїну проводили на колонках з сефарозою 2В (“Pahrmacia”). Зразки перед фракціонуванням діалізували проти 0,01М імідазольного буферу (рН 6,7), який містив 0,01 М CaCl2. Фракціонування загального казеїну іонообмінною хроматографією в об’ємі проводили на ДЕАЕ-целюлозі (ДЕ-52, “Serva”). При цьому використовували 0,02 М ацетатний буфер (рН 6,45), який включав 3,3 М сечовину, 0,03 М ЕДТА і 0,01 М 2-меркаптоетанол. Для витіснення білків застосовували ступінчатий градієнт концентрації CaCl2. Тестування штамів молочнокислих бактерій на наявність приклітинних протеїназ проводили за методом Exterkate F.A. (1985).

Кислотоутворюючу активність лактококів, здатність утворювати діацетил, ацетоїн та СО2, стійкість до дії NaCl та антибіотиків, фагорезистентність та антагоністичну активність визначали загальноприйнятими методами (Банникова Л.А. и др., 1987). Протеолітичну активність лактококів визначали за методом Залашка М.В. и др. (1970). Крім того, протеоліз казеїнів досліджували з допомогою 2,4,6-тринітробензо-1-сульфокислоти (ТНБС) методом, що застосовується у лабораторії біополімерів Інституту біоорганічних сполук РАН (м. Москва), а також методом формольного титрування карбоксильних груп, які звільняються в процесі протеолізу (Абрамов Д.В. и др., 1985). Кількість життєздатних клітин лактококів визначали шляхом посіву на чашки Петрі з агаризованим молоком. При проведенні протеолізу у модельній системі кількість клітин бактерій визначали турбідиметрично за методом Thomas T.D., Turnar K.W. (1977), який може застосовуватись у присутності білків казеїнового комплексу.

Продукти протеолізу молока (загальний розчинний азот, розчинний білковий азот, розчинний небілковий азот, амінний азот) у дослідних ферментованих продуктах визначали за методом (Крусь Г.Н., 2002). Утворення гірких пептидів під час протеолізу білків казеїнового комплексу визначали за методом, описаним раніше (Мюнх Б.Д. и др. 1985). Молокозгортальну активність ферментних препаратів визначали за методом, описаним раніше Теплы М. и др., 1980). При цьому використовували стандартний молокозгортальний фермент з активністю 100 одиниць.

Інгібіторну дію пептидних фракцій на ангіотензинперетворюючий фермент (КФ 3.4.15.1) визначали за модифікованим методом (Nakamura Y. et al., 1995). При цьому використовували АПФ з легень кролика (“Sigma”) та синтетичний субстрат – гіпурил-L-гістидил-L-лейцин (“Sigma”). Субстрат розчиняли в 0,1 М боратному буфері (рН 8,3) з 0,3 М NaCl. До 200 мкл розчину субстрату додавали 80 мкл пептидної фракції, після чого вносили 20 мкл водного розчину АПФ (0,1 од/мл). Реакцію, яка проходила при 370С протягом 30 хв, зупиняли додаванням у середовище 250 мкл 1 М НCl. Гіпурову кислоту, яка утворюється за участю АПФ, екстрагували етилацетатом, котрий випаровували при 1200С. Залишок розчиняли у воді і оптичну густину вимірювали на спектрофотометрі СФ-46 (довжина хвилі 228 нм). Ступінь інгібування активності ферменту (І) визначали за формулою:

,

де А – оптична густина гіпурової кислоти, виділеної за участю АПФ після закінчення реакції у присутності інгібіторів;

В, С – оптична густина зразків при відсутності в реакційному середовищі інгібіторів та АПФ відповідно.

Моделювання артеріальної гіпертензії проводили на нелінійних самцях білих щурів шляхом звуження ниркової артерії над місцем її відходження від черевної аорти і субкапсулярного введення у передню поверхню нирок 0,05 мл концентрованої оцтової кислоти, яка викликає стійку артеріальну гіпертензію (Гнатюк М.С. и др., 1991). Операцію проводили за умов тіопенталового наркозу (50 мг/кг).

Артеріальний тиск у хвостовій артерії тварин вимірювали за допомогою плетизмометричного апарату з автоматичним підігрівом. При цьому артеріальний тиск можна вимірювати одночасно у чотирьох тварин. Перед початком вимірювання (за 3 дні) артеріального тиску, щурів два рази на день поміщали у камери плетизмометричного апарату для звикання.

Всі експерименти повторювали 3-5 разів. У роботі наведені середні значення величин і стандартні похибки (M±m). Статистичний аналіз проводили користуючись критерієм Стьюдента (t). Статистичну обробку даних проводили за допомогою програми MS97. Дані вважались вірогідними у разі р<0,05.

Результати дослідження та їх обговорення

Ідентифікація казеїнових фракцій молока. При виділенні, очищенні та дослідженні фракцій казеїну, враховуючи його високу гетерогенність (Fox P., McSweеny P., 1998), необхідний простий і надійний метод ідентифікації білків казеїнового комплексу відповідно до їх сучасної класифікації (Farrell H. et al., 2004). Для цих цілей використовували різні види хроматографії та електрофорезу (Лапшинская Н.А., Іванов В.А., 1989; Strange E., 1992; Крусь Г.И, 2002). Відтворення з певними модифікаціями в нашій лабораторії ряду методів рідинної хроматографії показало, що найбільш ефективною може бути іонообмінна хроматографія на ДЕАЕ-целюлозі. Вона дозволяє ідентифікувати основні фракції казеїну (бS1-CN і в-CN), а також відділити їх. Проте мінорні фракції казеїну при цьому утворюють суміші, які важко ідентифікувати. Іншим недоліком цього методу є його довготривалість. Казеїни також аналізували методом гель-фільтрації на колонках з сефадексами G-75, G-100, G-150 і G-200. Цей метод виявився малоефективним для ідентифікації білків казеїнового комплексу у зв’язку з подібністю їхньої молекулярної маси. Лише в окремих випадках вдавалося виділити к-CN, який здатний утворювати агрегати з великою молекулярною масою (Groves M., 1998). У всіх випадках хроматографічні методи не дозволяли провести ідентифікацію казеїнів під час аналізу білків знежиреного молока, що узгоджується з літературними даними (Ribadeau-Dumas B., Grappin. R, 1989). Методи високоефективної рідинної хроматографії (HPLC) дозволяють ідентифікувати всі фракції казеїну за виключенням мінорних бS2-CN. Проте ці методи складні і не можуть бути використані для проведення масових аналізів (Visseret al., 1995).

Для аналітичних цілей при дослідженні казеїнових фракцій використовувались різні варіанти електрофорезу: диск-електрофорез, електрофорез у присутності ДСН, диск-електрофорез у градієнтному гелі з ДСН, анодна система електрофорезу в неперервному ПААГ. Перевірка цих методів електрофорезу в нашій лабораторії показала, що методи, які основані на розділенні білків за молекулярною масою (з використанням ДСН в однорідному і градієнтному гелі), мало придатні для ідентифікації казеїнів, які мають дуже близькі молекулярні маси (рис. 1.1 і 1.4). Особливо це стосується мінорних фракцій бS0-CN та бS2-CN. Проведені нами дослідження показали, що диск-електрофорез у нативних умовах дозволяє надійно ідентифікувати білки сироватки молока (рис. 1.3) та головні фракції казеїну бS1-CN і в-CN (рис. 1.2), внаслідок чого він може бути використаний для аналізу суміші цих білків. При цьому необхідно враховувати подібність електрофоретичної рухливості фракції бS1-CN та б-лактальбуміну. Запропонований нами варіант анодної електрофоретичної системи з неперервним гелем у присутності сечовини дозволяє провести повне розділення казеїнових фракцій відповідно до сучасної класифікації казеїнів (рис. 1.5). Тривалість електрофорезу становить близько однієї години. Одержане співвідношення фракцій при розділенні загального казеїну добре узгоджується з літературними даними (Fox P., Sweеny1998). Запропонований нами метод електрофорезу застосовується при дослідженні казеїнів в Інституті м’яса і молока ААН України (м. Київ), Могильовському університеті продуктів харчування (Білорусь), Інституті елементорганічних сполук та інституті біохімічної фізики РАН (м. Москва).

Виділення міцелярного казеїну в системі „вода – білки молока – кислий полісахарид”. При дослідженні протеолітичних процесів у казеїні як субстрат найчастіше використовували загальний казеїн за Гамарстеном, який незворотно денатурований при його осадженні в ізоелектричній точці (Whitney R., 1999). З урахуванням того, що на специфічність протеолізу може впливати нативна структура казеїну (міцел казеїну), ми провели виділення казеїнових міцел із знежиреного молока. При цьому за основу був взятий метод, який базується на термодинамічній несумісності кислих полісахаридів та білків, здатних до асоціації. За класифікацією В.Б. Толстогузова – це система четвертого типу „білок – кислий полісахарид – вода” (Толстогузов В.Б., Антонов Ю.А., 1988; Tolstoguzov V.B., 2000). Оскільки виділення міцел казеїну при цьому відбувається при низьких температурах (40С), без використання дезагрегуючих факторів, то можна було сподіватися, що отримані казеїнові міцели за своїм складом і властивостями будуть подібні до міцел, що знаходяться в молоці. У результаті розшарування системи “вода – білки молока – пектин” було отримано дві фази – полісахаридну (82,6 %) і білкову (17,4 %). Електрофоретичний аналіз фракційного складу білків кожної фази (рис. 2) показав, що білкова фаза включає в основному нативний казеїн. На електрофореграмах також видно, що у полісахаридній фазі знаходяться всі білки сироватки молока, а також ще одна фракція, яка відповідає за електрофоретичною рухливістю в-казеїну і зникає після осадження в ізоелектричній точці казеїнів. Наявність у полісахаридній фазі в-казеїну не протирічить положенню про термодинамічну несумісність кислих полісахаридів і казеїнів, оскільки відомо, що саме в-CN здатний виходити із казеїнових міцел при 40С у вигляді мономерів (Famelart M. et al., 1989). Тому в умовах експерименту вихід в-CN не змінює нативну структуру казеїнових міцел. Встановлено, що виділені міцели аналогічні до нативних міцел за низкою показників (повна розчинність у воді, ферментативна коагуляція, денатурація у кислому середовищі). Методом електронної мікроскопії досліджували форму, розміри, а також середній діаметр виділених міцел. Проведені дослідження показали, що казеїнові міцели у знежиреному молоці і білковій фазі мало відрізняються за формою і розмірами (рис. 3). Середній діаметр виділених міцел становив 23,6 нм (досліджено 997 міцел), середній діаметр міцел молока – 24,84 нм (досліджено 1016 міцел). Крім того, для оцінки розподілу казеїнових міцел був використаний метод гель-фільтрації на колонці з сефарозою 2В. У результаті гель-фільтрації встановлена подібність хроматографічних профілів казеїнових міцел білкової фази і знежиреного молока. Відмінності не виявлені у розподілі міцел, що не перевищують за масою 40•106 Да. Загалом, одержані результати дозволяють зробити висновок, що казеїнові міцели у системі “вода – білки молока – пектин” близькі до нативних міцел за розміром, білковим складом, властивостями і можуть бути використані при дослідженнях протеолізу казеїну.

Виділення і очистка головних фракцій білків казеїнового комплексу. Методи, які застосовувались для виділення казеїну і його фракцій включають дію екстремальних значень рН, іонної сили, високих температур, денатуруючих агентів, що може призвести до глибоких змін структури і складу білків казеїнового комплексу. Нами розроблено схему виділення основних фракцій казеїну (бS1-CN і в-CN) у відносно “м’яких” умовах без використання денатуруючих факторів. В її основі лежать близькі до природних умов процеси диференційного осадження казеїнів соляною кислотою з урахуванням розчинності казеїнових фракцій. Такий підхід дозволяє отримати препарати бS1-CN і в-CN з високим ступенем очищення (>95 %) і з виходом відповідно 16,0 та 12,5% від використаного для фракціонування загального казеїну. За запропонованою нами схемою після відділення ліпідів і вуглеводів проводиться інактивація природних протеаз молока. Виділення бS1-казеїну можна розділити на два етапи. На першому етапі відділяли фракції в-CN та к-CN за рахунок їх різної розчинності у присутності сечовини та іонів кальцію. Отриманий ліофілізований бS1-CN містив незначні домішки фракції бS2-CN (рис. 5). Подальшу очистку бS1-CN (другий етап) проводили шляхом іонообмінної хроматографії на ДЕАЕ-целюлозі у градієнті концентрацій NaCl (рис. 4.1). Вихід бS1-CN при цьому становив 77,3% (табл. 1). Повторна хроматографічна очистка зменшує вихід бS1-CN, проте, вона мало впливає на ступінь очистки і, на нашу думку, є недоцільною. Враховуючи подібність у розчинності фракцій бS1-CN, бS2-CN та к-CN у присутності сечовини, ми першу стадію виділення бS1-CN одночасно використовували для отримання в-CN. В основі диференційного осадження в-CN є його висока гідрофобність, а також здатність розчинятися при значеннях рН 4,6, що відповідають ізоелектричній точці бS1-CN. Ізоелектрична точка самого в-CN становить 4,9. Електрофоретичний аналіз ліофілізованого препарату в-CN після диференційного осадження показав наявність слідів фракцій бS2-CN і к-CN (рис. 5.8). Подальшу очистку в-CN проводили на колонці з ДЕАЕ-целюлозою. У випадку з в-CN більш виправдана повторна хроматографічна очистка, що зумовлено подібністю зарядів к-CN і в-

Таблиця 1

Вихід бS1-казеїну на різних стадіях виділення і очистки із загального казеїну

Стадія виділення бS1-казеїну | Концентрація, % | Об’єм фракції, мл | Кількість білка, г | Вихід, %

1. Розчин загального казеїну | 1,29 | 1000 | 11,9

2. Розчин осаду бS1-казеїну ІІ | 2,85 | 200 | 5,7 | 47,9

3. Розчин осаду бS1-казеїну VI | 2,01 | 200 | 4,02 | 33,8

4. Розчин осаду бS1-казеїну Х | 1,24 | 201 | 2,5 | 21,0

5. Кінцевий розчин бS1-казеїну | 1,96 | 97 | 1,9 | 16,0

6. Іонообмінна хроматографія на ДЕАЕ целюлозі (нанесено на колонку 300 мг білка) 1 | 120 | 0,232 | 77,3

7. Повторна іонообмінна хроматографія на ДЕАЕ-целюлозі (нанесено на колонку 300мг) 1 | 120 | 0,259 | 86,3

Примітка. Узагальнену фракцію бS1-казеїну діалізували, ліофільно висушували і зважували.

CN при слабколужних значеннях рН. При ретельному відборі об’єднаної фракції в-CN достатньо однієї хроматографічної очистки. Вихід в-казеїну при цьому становить 59,7% від кількості внесеного у колонку білка (табл. 2). Виділені електрофоретично гомогенні фракції бS1--CN і в-CN були використані для дослідження протеолітичних процесів.

Таблиця 2

Вихід в-казеїну на різних стадіях виділення й очистки

Стадія виділення в-казеїну | Концент-рація, % | Об’єм фракції, мл | Кількість білка, г | Вихід, %

1. Розчин загального казеїну | 1,19 | 1000 | 11,9

2. Розчин в-казеїну І | 0,54 | 937 | 5,06 | 42,5

3. Розчин осаду в-казеїнуІІ | 1,58 | 203 | 3,21 | 27,0

4. Розчин осаду в-казеїну ІІІ | 1,37 | 153 | 2,1 | 17,6

5. Розчин в-казеїну ІІІ | 0,99 | 151 | 1,49 | 12,5

6. Іонообмінна хроматографія на ДЕАЕ-целюлозі (нанесено на колонку 300 мг білка) 1 | 60 | 1,79 | 59,7

7. Повторна іонообмінна хроматографія на ДЕАЕ-целюлозі (нанесено на колонку 300мг) 1 | 72 | 218 | 72,7

Примітка. Узагальнену фракцію в-казеїну діалізували, ліофільно висушували і зважували.

Гель-фільтрація вважалася малопридатною для розділення казеїнів, оскільки вони мають близькі молекулярні маси (Farrell H. et al., 2004). Єдина фракція, яка може бути виділена гель-фільтрацією, є к-CN, який у нативному стані у складі міцел утворює агрегати за рахунок сульфгідрильних зв’язків (Groves M. et al., 1998). Враховуючи те, що гель-фільтрація є більш „м’яким” методом, ніж диференційне осадження, і краще забезпечує збереження нативної структури білків, ми провели фракціонування загального казеїну в різних умовах з використанням сефадексів G-75, G-100, G-150 і G-200. Найкращі результати були отримані при розділенні загального казеїну на сефадексі G-150 з наявності сечовини (рис. ). Електрофоретичний аналіз відібраних фракцій (заштриховані сектори) показав, що за цих умов має місце характерне відділення к-CN у складі піку І (рис. 7). Для отримання інших очищених казеїнів нами було запропоновано об’єднувати і відбирати хроматографічні фракції, які утворюють певні сектори на хроматограмі (сектори ІІ і ІІІ на рис. 6), а також проводити повторну гель-фільтрацію відібраних секторів. У результаті цієї процедури були отримані очищені фракції к-CN і в-CN, а також фракція бS1-CN з незначними домішками в-CN (рис. 7). При проведенні гель-фільтрації загального казеїну без дезагрегуючих агентів найбільш ефективним виявився сефадекс G-100. На колонці з сефадексом G-100 в умовах часткової дезагрегації міцел внаслідок підвищення pH вдалося відділити лише к-CN, який після повторної гель-фільтрації не містив домішок інших казеїнів (рис. 7). Розроблені способи фракціонування загального казеїну на сефадексах дозволяють швидко виділити гомогенні фракції к-CN і в-CN без багаторазового переосадження та довготривалого впливу різних денатуруючих факторів. Проте відбір фракцій, що утворюють окремі сектори на хроматограмах, призводить до зменшення виходу казеїнових фракцій. Одержаний після гель-фільтрації бS1---CN може бути використаний для доочистки методом іонообмінної хроматографії.

Серед казеїнів найменш вивченим залишається бS2-CN, який становить близько 10% від загального казеїну, і може бути попередником ряду біологічно активних пептидів (Meisel H., 1998). Методи, які використовувались для виділення бS2-CN, включають обробку їх 96 % етанолом, концентрованим розчином ацетату амонію, нагрівання до 800С. При цьому виділений препарат містив значні домішки бS1-казеїнів ( Vreeman H.et al., 1990). Для виділення бS2- CN нами була взята за основу методика іонообмінної хроматографії на ДЕAЕ-целюлозі в об'ємі, яка раніше використовувалась для виділення фракцій к-CN і в-СN (Wei T. et al., 1985). У методику були внесені зміни. Для формування градієнту іонної сили NaCl було замінено на CaCl2. Хлорид кальцію є значно ефективнішим під час іонообмінної хроматографії фосфопротеїдів на аніонообмінниках, що дозволило зменшити його концентрацію. Крім того, іони кальцію є природними компонентами казеїнових міцел (Fox P., McSweеny P. 1998). Вказані зміни, а також використання малого кроку при формуванні ступінчатого градієнту дозволило отримати у трьох фракціях із п’яти електрофоретично чисті білки (рис. 8). У двох випадках (фракція 2 і 3) був виділений гомогенний бS2-CN, фракція 5 включала гомогенний бS1-CN, а фракція 4 складалася з бS1-CN з незначними домішками бS2-CN. При типовому фракціонуванні загального казеїну вихід електрофоретично чистих бS1-CN і бS2-CN становив близько 57 і 70% від їхнього вмісту у складі загального казеїну (табл. 3). На нашу думку цей метод іонообмінної хроматографії може бути використаний також для ефективного фракціонування суміші бS1-CN і бS2-CN. Така суміш може утворюватися під час диференційного осадження бS1-CN, а також у результаті гель-фільтрації загального казеїну на сефадексах. Для зберігання всі отримані казеїни ліофільно висушували. При цьому необхідно відзначити, що під час зберігання казеїн легко розпадається з утворенням постійних продуктів розщеплення. Не виключено, що поява нових фракцій є наслідком особли-востей будови цих казеїнів (ослаблення певних зв’язків) або протеолітичної активності самого казеїну. Подібне явище спостерігали також в інших лабораторіях (Gaucheron F., 2001).

Таблиця 3

Вихід білкових фракцій при розділенні

загального казеїну (2000 мг) на ДЕАЕ-целюлозі в об’ємі

Номер фракції | Концентрація CaCl2 в буфері, М | Фракція казеїну

(за результатами електрофорезу) | Вихід

мг1 | %2

1 | 0 | г-CN, в-CN, к-CN | 735

2 | 0,01 | бS2-CN | 72 | 5,1

3 | 0,02 | бS2-CN | 26 | 1,9

4 | 0,035 | бS1-CN,бS2-CN | 267

5 | 0,05 | бS1-CN | 304 | 21,7

Всього отримано ліофілізованого казеїну | 1404 | 70,2

Примітки:

1. Вага ліофілізованої фракції після діалізу.

2. Визначали для гомогенних фракцій.

З метою максимального збереження структури і складу казеїнів, та враховуючи отримані нами результати, пропонуємо наступну схему фракціонування білків казеїнового комплексу (рис. 9).

Характеристика біохімічних процесів за участі молочнокислих бактерій. Всі штами молочнокислих бактерій, які використовувались в подальших дослідженнях, були відібрані в результаті тестування на здатність розщеплювати білки молока та на активність приклітинних протеїназ (протеїназо-позитивні штами або prt+). Протеїназо-позитивні штами лактококів підвидів Lcc. lactis subsp. lactis, Lcc. lactis subsp. cremoris та різновидності Lcc.

lactis biovar. diacetylactis відбирали за рівнем протеолізу у молочному поживному середовищі. П’ять штамів із 52 досліджуваних виявилися протеїназо-негативними (prt –). Решта штамів