УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

НІКІТСЬКИЙ БОТАНІЧНИЙ САД – НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР

Зеленіна Галина Артемівна

УДК 582.998.16:57.086.83

МОРФОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРІ IN VITRO СЕГМЕНТІВ СТЕБЛА

І КЛОНАЛЬНЕ МІКРОРОЗМНОЖЕННЯ

ARNICA CHAMISSONIS LESS. SSP. FOLIOSA (NUTT.) MAGUIRE

03.00.20 – біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Ялта – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Південному біотехнологічному центрі у рослинництві УААН і МОН України.

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Ігнатова Світлана Олександрівна,

Південний біотехнологічний центр у рослинництві УААН і МОН України,

завідувач лабораторії культури тканин.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор,

Бугара Олександр Михайлович,

Таврійський національний університет ім.В.І. Вернадського МОН України,

завідувач кафедри фізіології рослин і біотехнології;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Єгорова Наталія Олексіївна,

Інститут ефіроолійних і лікарських рослин УААН,

завідувач лабораторії біотехнології.

Провідна установа:

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться “_12 ” _квітня 2007 р. у _1300_ годин на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 53.369.01 при Нікітському ботанічному саді – Національному науковому центрі за адресою: 98648, Україна, Крим, м. Ялта, Нікітський ботанічний сад–Національний науковий центр

Факс: (0654) 33-65-50 E-mail:

З дисертацією можна ознайомитися в науковій бібліотеці Нікітського ботанічного саду–Національного наукового центру: 98648, Україна, Крим, м. Ялта, Нікітський ботанічний сад – Національний науковий центр.

Автореферат розісланий “_04 ” березня 2007 р.

Учений секретар спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук С. Ю. Садогурський

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В зв’язку з екологічним забрудненням навколишнього середовища та виснаженням ресурсів цінних лікарських рослин стає актуальною проблема їх культивування. Одержання для створення промислових плантацій достатньої кількості садивного матеріалу, однорідного за темпами розвитку та вмістом фармакологічно активних речовин, гарантує метод клонального мікророзмноження рослин.

При розробці способу клонального мікророзмноження рослин кожного виду необхідно визначити стратегію розмноження, вибрати та ввести в культуру in vitro первинний експлант, дібрати умови, які б сприяли реалізації його морфогенетичного потенціалу. Для досягнення високого коефіцієнта розмноження важливим є вивчення процесів, що обмежують виживання рослин-регенерантів в період їх адаптації до природних умов вирощування. Ефективність розробленого способу клонального мікророзмноження лікарських рослин має бути підтвердженою тестуванням їхньої сировини на вміст фармакологічно активних компонентів.

Arnica chamissonis Less. ssp. foliosa (Nutt.) Maguire (арніка облиснена, в подальшому A. foliosa) - вид родини Asteraceae, інтродуцент з Північної Америки, придатний для культивування на півдні України (Собко, Дубенец, 1988). Лікарська сировина A. foliosa за своїми біохімічними властивостями (Муравьева, 1978) здатна ефективно замінювати сировину арніки гірської Arnica montana L., що занесена до Червоної книги (Мінарченко, Тимченко, 2002) та культивування якої поза ареалом виду (альпійською та субальпійською зонами Карпат) неможливе (Пенкаускене, Римкене, 1983). У науковій літературі дані щодо культивування in vitro експлантів A. foliosa поодинокі: Kalynyak Р.Р. et al. (1994) одержали калусні лінії з тканин кореня; дані щодо розробки способу клонального мікророзмноження відсутні. В зв’язку з вищевикладеним вивчення морфогенетичних процесів в культурі in vitro сегментів стебла A. foliosa з метою розробки способу клонального мікророзмноження рослин виду є актуальним і має науковий та практичний інтерес.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дослідження були проведені в лабораторії культури тканин Південного біотехнологічного центру у рослинництві УААН і МОНУ у рамках програми “Сільськогосподарська біотехнологія 2001–2005 рр.”, що затверджена загальним наказом Міністерства аграрної політики України і Української академії аграрних наук від 24.10.2001 р. № 318/92 та Постановою Президії УААН від 29.01.2002 р., протокол № 2 і включена до переліку науково-технічних програм УААН на 2001–2005 рр. Дослідження здійснювались за Підпрограмою 1 “Новітні біотехнології в рослинництві”, напрямком 1.1 “Методи культури тканин і клітин сільськогосподарських рослин” (номер державної реєстрації в Укр. ІНТЕІ – 0104U002695, проблемою 1.1.1. “Створення цінного селекційного матеріалу сільськогосподарських рослин з використанням культури in vitro” (номер державної реєстрації в Укр. ІНТЕІ – 0104U003556).

Мета і завдання досліджень. Мета роботи – визначити шляхи реалізації морфогенетичного потенціалу стеблових експлантів A. foliosa in vitro та розробити спосіб клонального мікророзмноження цієї цінної лікарської культури. Відповідно до поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

- одержати асептичну культуру донорного ювенільного матеріалу та первинних експлантів;

- провести порівняльне гістологічне вивчення сегментів стебла в інтактній ювенільній рослині та при культивуванні на живильному середовищі з цитокініном;

- визначити морфогенетичні потенції стеблових експлантів в залежності від їх місця розташування на пагоні;

- вивчити вплив трофічних та гормональних факторів культивування in vitro на ефективність клонального мікророзмноження;

- визначити умови вкорінення in vitro одержаних мікропагонів;

- порівняти вміст фармакологічно активного компоненту арніфоліну в сировині рослин, що вегетативно розмножені in vitro та in vivo;

- визначити особливості водного обміну рослин-регенерантів в умовах in vitro та при адаптації in vivo;

- розробити спосіб клонального мікророзмноження A. foliosa.

Об'єкт досліджень – морфогенез та процеси регенерації в культурі вегетативних органів in vitro.

Предмет досліджень – особливості регенерації в культурі in vitro стеблових сегментів і клональне мікророзмноження A. foliosa.

Методи досліджень: методи культури ізольованих органів і тканин рослин in vitro, гістологічні, цитологічні, біометричні, біохімічні, фізіологічні методи та методи статистичного аналізу і планування експерименту.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виявлено формування de novo чисельних меристематичних зон у тканинах стеблових експлантів A. foliosa при їх культивуванні на живильних середовищах МС з цитокініном БАП. Вперше в культурі in vitro виявлено рівень регенераційної здатності стеблових сегментів A. foliosa, що залежав від умов вирощування донорних рослин та місця розташування експланту на пагоні. З використанням матриці планування експерименту та статистичного аналізу визначено значущість окремих компонентів і проведено оптимізацію складу живильного середовища МС для підвищення ефективності клонального мікророзмноження A. foliosa. Вперше показано вплив концентрації мінеральних солей та наявності активованого вугілля в складі живильного середовища для вкорінення регенерантів на рівень біосинтезу основних пігментів у їхніх листях. Вперше встановлено адекватність вмісту арніфоліну в листях і суцвіттях рослин, що вегетативно розмножені in vitro та in vivo. Вперше виявлено особливості водного обміну рослин-регенерантів A. foliosa in vitro і при послідовній адаптації до умов in vivo.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблений спосіб клонального мікророзмноження A. foliosa пропонується для масового одержання садивного матеріалу при створенні багаторічних промислових плантацій цієї цінної лікарської рослини на півдні України. Одержані в результаті досліджень рослини-регенеранти (1000 шт.) передані у ботанічий сад Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова (ОНУ) для збагачення колекції рідкісних видів лікарських рослин. Результати досліджень використовуються у навчальній програмі підготовки студентів кафедр ботаніки, генетики та молекулярної біології біологічного факультету ОНУ.

Особистий внесок здобувача в результати досліджень. Дисертаційна робота є самостійним науковим дослідженням автора. Здобувачем проведено критичний аналіз вітчизняної та іноземної літератури, розроблено структуру дисертації. Здобувачем виконано статистичну обрабку та аналіз одержаних результатів, сформульовані положення та висновки дисертації. Результати спостережень представлені в 11 наукових публікаціях, частина яких написана без співавторів. У спільних роботах здобувачеві належать матеріали щодо культивування експлантів і рослин-регенерантів A. foliosa in vitro.

Апробація результатів досліджень. Матеріали дисертаційної роботи представлені на ІІІ Українській конференції з медичної ботаніки (Київ, 1992), ІІ з'їзді Українського товариства фізіологів рослин (Київ, 1993), на міжнародних конференціях: “Молекулярная генетика, геномика и биотехнология” (Мінськ, 2004), “Генетичні ресурси для адаптивного рослинництва: мобілізація, інвентаризація, збереження, використання” (Оброшино, 2005), “Молекулярная и прикладная генетика” (Мінськ, 2005), на конференції, присвяченій 140-річчю Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова (Одеса, 2005).

Публікації. Матеріали дисертації відображено в 11 публікаціях, у тому числі - в 4 статтях у виданнях, що затверджені ВАК України як спеціалізовані за біологічним напрямком, 6 – у матеріалах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 141 сторінці машинописного тексту, складається зі вступу, 6 розділів, висновків, списку використаних літературних джерел (156 найменувань, з них - 48 іноземних), 2 додатків, включає 18 малюнків, 14 таблиць.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Клональне мікророзмноження як один з напрямків біотехнології лікарських рослин (огляд літератури)

У розділі представлений сучасний стан біотехнологічних досліджень в галузі лікарського рослинництва, зокрема рослин роду Arnica. Особливу увагу приділено клональному мікророзмноженню, розглянуті його принципи та теоретичні основи. Виділено шлях активації існуючих меристем як основний при одержанні генетично однорідного рослинного матеріалу. Розглянуто вплив основних факторів морфогенезу in vitro на ефективність клонального мікророзмноження рослин. Показано особливості рослин-регенерантів, що виникають при культивуванні in vitro. На основі критичного аналізу вітчизняної та іноземної літератури зроблено висновок щодо актуальності власних досліджень.

Матеріали і методи досліджень

Дослідження з клонального мікророзмноження A. foliosa проведені на базі лабораторії культури тканин Південного біотехнологічного центру у рослинництві УААН і МОН України (м. Одеса).

У дослідженнях використовували ювенільні рослини, вирощені in vitro з насіння A. foliosa, люб'язно наданого науковим співробітником лабораторії медичної ботаніки Тернопільської медичної академії Марчішин С.М.

При проведенні експериментальних робіт використовували загальноприйняті методи культури ізольованих тканин та органів рослин in vitro (Калинин и др., 1992; Митрофанова, 1997). Для одержання асептичної культури первинних експлантів зі зрілого насіння A. foliosa розроблений оптимальний режим поверхневої стерилізації насіння. Насіння та стеблові експланти культивували на модифікованих живильних середовищах МС (Murashige, Skoog, 1962). Оптимізацію складу живильних середовищ проводили з використанням методу планування експерименту (Малышев, 1977). У роботі використовували синтетичні регулятори росту та агар фірм “Sigma” і “Serva”. Культуральні посудини з експлантами інкубували в умовах термостатованого приміщення при 22-240С, з освітленням 3000-4000 лк, 16-годинним фотоперіодом і відносною вологістю повітря 60-70 %.

Гістологічні і цитологічні дослідження проводили на постійних та тимчасових препаратах, що були приготовлені загальноприйнятими методами (Паламарчук, Веселова, 1965; Паушева, 1988).

Хроматографічне визначення вмісту арніфоліну проводили за методикою, запропонованою Євстратової Р.І. та ін. (1964).

Статистичний аналіз експериментальних даних проводили з використанням пакету прикладних програм Microsoft Office для Windows за алгоритмами Рокицького П. Ф. (1973).

Введення в культуру in vitro експлантів A. foliosa

В якості вихідного матеріалу в наших експериментах використовували зріле насіння A. foliosa. У результаті проведених дослідів встановлений оптимальний режим поверхневої стерилізації насіння – обробка 15-% пероксидом водню протягом 15 хв. з наступним дворазовим промиванням стерильною водою. Культивування насіння in vitro на агаризованому живильному середовищі МС дозволило підвищити низьку лабораторну схожість насіння у 1,8 разу і протягом 30 діб одержати ювенільні рослини, що були донорами експлантів для подальших досліджень.

Гістологічне вивчення поперечних зрізів експлантів (рис. 1) показало, що сегменти стебла в області вузла містять по дві симетрично розташовані пазушні бруньки розміром 150-200 мкм, а верхівка – апікальну бруньку розміром близько 100 мкм.

Рис. 1. Поперечні зрізи верхівки (1) та сегмента (2) стебла донорної ювенільної рослини A. foliosa: АБ – апікальна брунька; ПБ – пазушна брунька. Збільшення: 1 – 100х; 2 – 50х

Встановлено, що середня кількість мікропагонів на експлант, що характеризує його регенераційну здатність, залежала від місця розташування сегмента на стеблі. Так, сегменти базальної частини регенерували у два рази більше мікропагонів, ніж верхівка, й у 1,5 рази більше, ніж сегменти середньої частини стебла. Слід відмітити, що верхівка стебла містила одну бруньку, таким чином, її регенераційна здатність порівнювалася із здатністю експлантів базальної частини стебла, але життєздатність експлантів верхівки була значно меншою. Таким чином, використання стеблових експлантів було доцільним при клональному мікророзмноженні рослин дослідженого виду A. foliosa, причому сегменти базальної частини стебла мали найбільший регенераційний потенціал у культурі in vitro.

Гістологічне вивчення сегментів стебла А. foliosa після 14 діб культивування на живильному середовищі МС з доданням 2 мг/л БАП (рис.2) дозволило виявити утворення de novo численних меристематичних зон за периметром експланту, з яких у подальшому розвивалися мікропагони, тоді як на живильному середовищі МС без додання фітогормонів відмічали тільки розвиток існуючих бруньок.

Рис. 2. Поперечний зріз сегмента стебла A. foliosa після 14 діб культивування на живильному середовищі МС з 2 мг/л БАП. Стрілками вказано меристематичні зони. Збільшення 200х

Таким чином, в стеблових сегментах рослин A. foliosa в присутності цитокініну БАП у складі живильного середовища морфогенез експлантів in vitro відбувався двома шляхами – активацією існуючих меристем бруньок та формуванням de novo меристематичних зон у тканинах експлантів.

Вивчення можливості попередньої активації меристем донорних рослин

З метою вивчення можливості попереднього стимулювання процесів закладки нових меристематичних зон у тканинах стебла ще на етапі вирощування донорних ювенільних рослин, звільнене від поверхневої інфекції насіння A. foliosa висаджували на живильні середовища МС з доданням БАП або ГК (1-2 мг/л). Стеблові експланти від вирощених на даних живильних середовищах донорних рослин використовували для подальшого клонального мікророзмноження. Як видно з представлених даних (табл. 1), додання в живильне середовище для пророщування насіння БАП або ГК, по-перше, викликало підвищення його схожості. Так, БАП, в залежності від концентрації, стимулював схожість насіння в 1,3-1,8; ГК – в 1,6 разу в порівнянні з контролем. По-друге, виявлено позитивну післядію фітогормонів, що використовували у живильних середовищах для вирощування донорних рослин, на регенераційну здатність експлантів при подальшому культивуванні. В результаті, середня кількість мікропагонів на експлант при використанні БАП достовірно зростала у 5,5 та 10,8 разів залежно від концентрації, а при використанні ГК – у 5,8 разів, у порівнянні з контролем (вирощування рослин та культивування експлантів на безгормональному середовищі МС). При доданні 2 мг/л БАП як в середовище для пророщування насіння, так і в середовище для подальшого клонального мікророзмноження, кількість мікропагонів на експлант зросла ще більше (у 13,8 разів).

Таблиця 1

Залежність схожості насіння in vitro і регенераційної здатності експлантів

A. foliosa від гормонального складу живильних середовищ

Середовище для пророщування

насіння (І етап) | Схожість

насіння, % | Середовище для культивування експлантів

(ІІ етап) | Загальна кількість мікро-пагонів,

шт. | Середня кількість мікропагонів на експлант, шт.

Контроль (МС) | 32,71,6 | МС | 12 | 0,6 0,1

МС + 2 мг/л БАП | 41 | 4,7 1,4

МС + 1 мг/л БАП | 59,52,9 | МС | 22 | 3,3 0,5

МС + 2 мг/л БАП | 55 | 5,8 0,8

МС + 2 мг/л БАП | 43,32,2 | МС | 82 | 6,5 1,2

МС + 2 мг/л БАП | 126 | 8,3 1,3

МС + 1 мг/л ГК | 52,62,6 | МС | 30 | 3,5 + 0,7

МС + 2 мг/л БАП | 47 | 5,5 0,8

НСР 3,9 2,2

Вплив фактору, 97 68

Таке збільшення регенераційної здатності експлантів відбувалося, на нашу думку, в результаті накопичення екзогенних фітогормонів у тканинах донорних рослин та, як наслідок, закладки нових зон меристематичної активності в тканинах досліджених рослин і взятих від них експлантів.

Таким чином, встановлена можливість попередньої активації меристем донорних рослин A. foliosa при вирощуванні їх з насіння in vitro. При цьому ефективність клонального мікророзмноження зростала в 1,8 разу у порівнянні з використанням експлантів від донорних рослин, що були одержані на безгормональному живильному середовищі, і стимуляція меристематичної активності в них не відбулася.

Вплив гормональних компонентів живильного середовища

на реалізацію регенераційного потенціалу експлантів

З метою підвищення ефективності клонального мікророзмноження A. foliosa вивчали вплив на цей процес різних цитокінінів, що широко використовуються в практиці розмноження рослин in vitro: кінетіну, БАП, 2-iР, зеатину (похідних пуринів), тідіазурону (похідного сечовини). Встановлено, що кожний з цитокінінів, що додано у живильне середовище МС, достовірно підвищував рівень регенераційної здатності стеблових експлантів у порівнянні з культивуванням сегментів на безгормональному середовищі. Однак, додання у живильне середовище 2 мг/л БАП було більш ефективним тому, що сприяло регенерації експлантами більшої кількості (у середньому 4-5 шт.) морфологічно нормальних мікропагонів. Використання тідіазурону в даній концентрації приводило до утворення мікропагонів з аномальною морфологією.

Оптимізація складу живильного середовища

з використанням методу планування експерименту

Одним із визначальних факторів, від яких залежить ефективність клонального мікророзмноження, є склад живильного середовища. Причому, на процес впливають не тільки концентрації компонентів середовища, але й їх співвідношення. Визначення оптимальних співвідношень живильних речовин для культивування дібраних експлантів доцільно проводити за допомогою методу планування експерименту. Оптимізацію складу живильного середовища МС для культивування стеблових експлантів A. foliosa проводили за методом В. П. Малишева (1977), що базується на одержанні графічних залежностей критерію оптимізації від концентрації окремих компонентів живильного середовища. Використання цього методу дозволило відібрати кращий склад середовища за шістьма факторами (компонентами) на 5 рівнях (концентраціях). Для цього була розроблена матриця експерименту з 25 варіантів живильних середовищ МС, в складі яких кожний рівень будь-якого фактору зустрічався один раз з кожним рівнем інших факторів. Критеріями оптимізації були обрані такі показники, як середня кількість мікропагонів на експлант і коефіцієнт розмноження (загальна кількість мікропагонів від однієї рослини) за пасаж, що характеризували регенераційний потенціал стеблових експлантів A. foliosa. Статистична обробка даних показала високу позитивну кореляцію (r = + 0,94) обох критеріїв оптимізації.

Графічні відображення залежності регенераційної здатності експлантів A. foliosa від вмісту окремих компонентів живильного середовища (рис. 3) дозволили встановити їх оптимальні концентрації. Так, вплив концентрації сахарози в живильному середовищі МС на регенераційну здатність експлантів графічно представлений у вигляді кривої з достовірними максимумом і мінімумом. Причому, перехід від максимальної регенераційної активності експлантів до мінімальної відбувався різко при підвищенні концентрації сахарози в живильному середовищі з 3 до 4 %.

Графічно залежність регенераційної здатності експлантів від концентрації цитокініну БАП представлена у вигляді плавної кривої з оптимумом дії при 3 мг/л. Менші концентрації БАП лімітували, а більші - інгібували регенераційні процеси в тканинах експлантів. Крім того, кореляційний аналіз одержаних даних показав, що концентрація БАП у живильному середовищі для культивування експлантів і кількість утворених коренів у рослин-регенерантів знаходились у зворотній залежності.

Рис. 3. Рівень регенераційної здатності стеблових експлантів А. foliosa в залежності від концентрації компонентів живильного середовища

Графік впливу концентрації нітрату амонію на регенераційну здатність експлантів мав вигляд складної кривої з двома максимумами і мінімумами. Причому, максимальний ефект відзначався як при відсутності нітрату амонію в живильному середовищі, так і при його концентрації 1 г/л. Мінімальний ефект зафіксовано при концентраціях 0,5 і 2 г/л. Таким чином, чіткого впливу присутності цього компоненту на реалізацію морфогенетичного потенціалу експлантів не виявлено. Однак, при культивуванні експлантів на живильних середовищах без нітрату амонію спостерігали виражений хлороз одержаних пагонів при високій активності меристем експлантів.

Достовірного впливу присутності ІОК, вітамінів, мезо-інозиту в складі живильного середовища на регенераційну здатність експлантів та, як наслідок, на ефективність клонального мікророзмноження не встановлено. Таким чином, значущими факторами оптимізації живильного середовища для оцінювання регенераційної здатності стеблових експлантів A. foliosa виявилися сахароза і БАП. В результаті експерименту спрощений варіант живильного середовища МС зі зменшеним до 1 г/л вмістом нітрату амонію, виключенням мезо-інозиту, вітамінів і доданням 3 мг/л БАП був оптимальним для клонального мікророзмноження рослин A. foliosa. На живильному середовищі даного складу регенераційна здатність експлантів зростала у 1,5 рази в порівнянні з показниками до проведення оптимізації (МС з 2 мг/л БАП) і складала 7-8 мікропагонів на експлант.

Вплив факторів культивування in vitro на реалізацію морфогенетичного потенціалу експлантів

На прикладі культивування сегментів стебла A. foliosa вперше було зроблено спробу оцінити вплив окремих факторів морфогенезу in vitro на реалізацію регенераційного потенціалу експлантів (рис. 4).

Рис. 4. Реалізація морфогенетичного потенціалу сегментів стебла A. foliosa в культурі in vitro

Максимальна реалізація морфогенетичного потенціалу експлантів in vitro в наших дослідженнях (до 32 мікропагонів за пасаж) була досягнута при оптимальних параметрах всіх досліджених факторів: попередньої активації меристем донорних рослин, культивування експлантів на живильному середовищі оптимального складу, збільшення тривалості пасажу до 45 діб. Однак, життєздатність одержаних за таких умов регенерантів при подальшому культивуванні in vitro була низькою і складала всього 10,60,8%, замість 88,72,5% в контрольному варіанті (відмінності достовірні при Р<0,02). Таким чином, теоретично можливо реалізовувати регенераційний потенціалу експлантів дослідженого виду в широкому діапазоні. Проте, на практиці необхідно одержувати життєздатні регенеранти, для чого доцільно обмежувати тривалість пасажів та концентрації фітогормонів при культивуванні in vitro.

ПІДбір складу живильного середовища для вкорінення регенерантів

in vitro

Для вкорінення одержних мікропагонів A. foliosa оптимізували склад живильного середовища МС. При цьому вивчали вплив концентрації мінеральних солей і додавання активованого вугілля у живильне середовище на показники росту та розвитку рослин-регенерантів (табл. 2, 3).

Таблиця 2

Ефективність вкорінення та інтенсивність росту рослин-регенерантів

А. foliosa в залежності від складу живильного середовища

Варіанти живильних середовищ | Кількість листя на рослину, шт. | Висота надземної частини,

мм | Кількість корінців на рослину, шт. | Сумарна довжина корінців, мм | Сира маса надземної частини, мг

МС | 7,2 0,2 | 28,3 2,1 | 0 | 0 | 67 5

Ѕ концентрація солей за МС | 10,8 0,2 | 71,5 3,3 | 2,5 0,2 | 102 10 | 150 14

Ѕ концентрація солей за МС + 1 г/л активованого вугілля | 11,5 0,3 | 98,8 3,7 | 3,4 0,2 | 222 11 | 122 13

НСР 0,5 6,3 0,3 17 23

Вплив фактору, % 99 94

З представлених результатів (табл. 2) видно, що зменшення концентрації мінеральних солей вдвічі та наявність активованого вугілля в складі живильного середовища сприяли значному посиленню ростових процесів як у надземній, так і у підземній частинах регенерантів. На стандартному живильному середовищі МС вкорінення мікропагонів взагалі не відбувалося, а на оптимальному за нашою модифікацією середовищі відмічали 98-100% вкорінення регенерантів. Значні поліпшення ростових процесів відбувалися вже при зменшенні вдвічі концентрації мінеральних солей, додання активованого вугілля посилювало позитивний ефект. Так, висота та кількість листя у рослин-регенерантів зростали в 1,5; біомаса – у 1,8; сумарна довжина корінців – у два рази. Крім того, завдяки присутності активованого вугілля в складі оптимального для вкорінення живильного середовища зменшувався вміст води в тканинах регенерантів, що дозволяло уникнути вітріфікації, яка, в багатьох випадках, має місце в культурі in vitrо та знижує життєздатність отриманних рослин-регенерантів. Концентрація мінеральних солей і наявність активованого вугілля в складі живильного середовища для укорінення також в значній мірі впливали на вміст основних пігментів у листі рослин-регенерантів (табл. 3).

Таблиця 3

Вміст пігментів в листях регенерантів А. foliosa в залежності

від складу живильного середовища (мг/г сирої маси листків)

Варіанти живильного середовища | Хлорофіл “а” | Хлорофіл “в” | “а” + “в” | “а” : ”в” | Каротиноїди | (“а”+”в”):

кароти-ноїди

МС | 0,14 0,03 | 0,07 0,01 | 0,21 0,02 | 2,0 0,03 | 0,09 0,02 | 2,3 0,1

Ѕ МС | 0,74 0,08 | 0,28 0,05 | 1,02 0,06 | 2,6 0,02 | 0,36 0,09 | 2,8 0,3

Ѕ МС + 1 г/л активованого вугілля | 1,15 0,10 | 0,53 0,08 | 1,68 0,09 | 2,2 0,01 | 0,59 0,11 | 2,8 0,5

НСР 0,15 0,11 0,13 0,04 0,17 0,7

Вплив фактору, % 90 – 98 42

Так, використання оптимального складу живильного середовища сприяло збільшенню концентрації каротиноїдів, хлорофілів “а” та “в” в листках рослин-регенерантів в 7-10 разів. Однак при значних коливаннях абсолютних показників співвідношення хлорофілів “а” та “в залишалося на рівні 2,0-2,5, який властивий для рослин, що вирощуються in vivo.

Таким чином, концентрація мінеральних солей та наявність активованного вугілля в складі живильного середовища для вкорінення регенерантів A. foliosa мали рішуче значення для росту та розвитку рослин-регенерантів, а також для їх переходу до автотрофного живлення.

Регламент способу клонального мікророзмноження

A. foliosa

В результаті проведених досліджень розроблено спосіб клонального мікророзмноження A. foliosa, що складається з 4 послідовних етапів: І – вирощування донорних ювенільних рослин з насіння in vitrо, ІІ – культивування стеблових експлантів та одержання від них чисельних адвентивних мікропагонів (коефіцієнт розмноження in vitrо 1:27), ІІІ – вкорінення in vitrо одержаних мікропагонів, IV – двоступенева адаптація рослин-регенерантів до умов природного вирощування. Повний цикл культивування in vitrо та адаптації регенерантів складає 120 діб. Даний спосіб дозволяє одержувати від однієї вихідної рослини в середньому 24 вкорінені та адаптовані до умов in vivo рослини-регенеранти, що за рік може становити більше 2 млн. шт. однорідного садивного матеріалу. Для порівняння коефіціент розмноження виду вегетативним способом in vivo (шляхом поділу кореневищ) складає 1:20 за вегетаційний період.

Стабільність плоїдності хромосом у рослин-регенерантів

В зв’язку зі складністю дослідження хромосом у рослин-регенерантів A. foliosa (для роду Arnica n=19) внаслідок низької частоти мітозів при культивуванні in vitrо не вдалося провести повний каріометричний аналіз регенерантів. Результати проведених цитологічних досліджень дозволили зробити висновок щодо відсутності поліплоїдних форм серед донорних рослин та рослин-регенерантів, одержаних у результаті замкнутих циклів клонального мікророзмноження протягом двох років.

Вміст арніфоліну в рослинах A. foliosa

Для підтвердження ефективності розробленого способу клонального мікророзмноження було проведене порівняльне оцінювання вмісту діючої речовини - сесквітерпенового оксикетолактону арніфоліну в сировині рослин A. foliosa, які були розмножені нами як в культурі in vitrо, так і шляхом поділу кореневищ in vivo. На другий рік культивування в польових умовах рослини обох досліджених груп цвіли. Хроматографічний аналіз показав, що вміст арніфоліну в листях і квіткових кошиках рослин, що розмножені in vitrо, достовірно не відрізнявся від показників у рослин, що розмножені традиційним вегетативним шляхом, і складав 0,1–0,2 % відповідно від сухої маси сировини.

Особливості водного обміну рослин–регенерантів A. foliosa

Стресові умови, що неминуче виникають при культивуванні рослин in vitrо (Геринг,1991), створюють специфічний водний режим рослин-регенерантів, що призводить до зниження їхньої життєздатності та, як наслідок, ефективності клонального мікророзмноження. Подолати вказані порушення дозволяє адаптація рослин-регенерантів до умов природнього зростання, метою якої, в першу чергу, є відновлення функціонування у рослин водного обміну.

Вивчання показників даного процесу в листях рослин-регенерантів A. foliosa проводили послідовно на всіх етапах культивування (табл. 4).

Таблиця 4

Особливості водного обміну рослин-регенерантів A. foliosa

Етапи культивування | Інтенсивність транспірації, мг води/ см2 за годину | Вміст води в тканинах листка, % від сирої маси | Загальна площа продихових отворів, % від площі листка

Розмноження

in vitro | 0,1±0,05

(360±14)* | 95 ± 2 | 0,74 ± 0,1

Адаптація в умовах теплиці | 21,0 ± 1,1 | 91 ± 2 | 0,26 ± 0,03

Адаптація в польових умовах | 4,6 ± 0,2 | 76 ± 1 | 0,73 ± 0,1

Різниці достовірні при: Р<0,05;

*- при вилученні рослин-регенерантів з посудин для культивування

При культивуванні в закритих культуральних посудинах за умовами 100-% вологості (І етап) інтенсивність транспірації у рослин-регенерантів A. foliosa була близькою до нуля та вміст води в тканинах сягав граничних показників. Такі особливості характерні, як свідчать літературні дані (Kubova, Kamenicka, 2002), для більшості рослин, що культивуються in vitrо, і виникають внаслідок відсутності градієнту температури між повітрям і субстратом.

При переході до наступного ІІ етапу культивування, тобто при вилученні з культуральних посудин та перенесенні рослин-регенерантів в умови теплиці, інтенсивність транспірації рослин різко зростала, що свідчило про їхню уразливість до втрати води, особливо в перші години. У цей період для підвищення життєздатності рослин-регенерантів необхідно підтримувати підвищену вологість повітря і субстрату. В таких умовах відбувалося поступове зменшення інтенсивності транспірації, вмісту води у тканинах рослин-регенерантів, що свідчило про відновлення функціонування водного обміну. За період адаптації в теплиці кількість продихів на одиницю площі листка зменшилась у 2,9 рази в порівнянні з їх кількістю при культивуванні in vitro та в польових умовах (ІІІ етап). Даний ефект, на нашу думку, може бути пов’язаний з повною зміною листя на даному етапі, а також з можливою післядією цитокінінів живильного середовища, що призупиняють розвиток продихового апарату.

Створення умов підвищеної вологості повітря і субстрату при адаптації в теплиці дозволило поступово нормалізувати водний обмін рослин-регенерантів A. foliosa. Поступове зниження вологості наприкінці вирощування в теплиці дало змогу провести загартування рослин-регенерантів до умов природного зростання.

ВИСНОВКИ

1. Вперше в результаті вивчення гістогенезу і регенераційного потенціалу стеблових сегментів A. foliosa in vitrо та оцінювання вмісту арніфоліну в рослинах-регенерантах розроблено ефективний спосіб клонального мікророзмноження цієї цінної лікарської рослини.

2. Визначені умови одержання асептичної культури донорного ювенільного рослинного матеріалу і первинних експлантів.

3. Виявлено два шляхи морфогенезу стеблових експлантів при культивуванні in vitrо: активація існуючих та формування de novo меристематичних зон.

4. Показана залежність регенераційної здатності стеблових експлантів від їхнього місця розташування на пагоні. Найбільш значущий рівень регенерації встановлено у сегментів базальної частини стебла.

5. Виявлено вплив трофічних та гормональних факторів культивування експлантів на ефективність клонального мікророзмноження. Встановлено можливість попередної активації меристем ювенільних рослин при їх вирощуванні з насіння на модифікації живильного середовища Мурасиге і Скуга з бензиламінопурином або гібереловою кислотою в концентраціях 1-2 мг/л, що дозволяло підвищити рівень регенерації мікропагонів стебловими експлантами в 1,2-1,8 разу, відповідно, в порівнянні з вирощуванням рослин на безгормональному середовищі.

6. З використанням методу планування експерименту модифіковано склад живильного середовища Мурасиге и Скуга за вмістом БАП, ІОК, нітрату амонію, сахарози, мезо-інозиту і вітамінів, що дозволяло одержувати 8-9 мікропагонів на експлант протягом 30 діб.

7. Встановлено, що збільшення тривалості пасажу від 30 до 90 діб сприяло підвищенню регенераційної здатності стеблових експлантів у середньому в 2,7 рази.

8. Визначено оптимальний склад живильного середовища для вкорінення мікропагонів in vitrо. На живильному середовищі Мурасиге і Скуга з половинною концентрацією мінеральних солей і доданням 1 г/л активованого вугілля частота вкорінення складала 98-100%. Висота та кількість листя у рослин-регенерантів зростали в 1,5, біомаса – в 1,8, сумарна довжина корінців – в 2, вміст загальних пігментів в 7-10 разів у порівнянні з показниками на стандартному живильному середовищі, де вкорінення регенерантів не відбувалося.

9. Встановлено, що вміст арніфоліну в листях та суцвіттях рослин-регенерантів і рослин, що розмножені традиційним вегетативним шляхом, достовірно не відрізнявся і складав у середньому, відповідно, 0,1-0,2 % від сухої маси сировини.

10. Виявлено відновлення функціонування водного обміну у рослин-регенерантів по закінченні двохетапної адаптації їх in vivo в теплиці та польових умовах.

11. Розроблено ефективний спосіб клонального мікророзмноження A. foliosa, що складається з чотирьох етапів і дає змогу за один цикл тривалістю 120 діб одержувати від однієї вихідної рослини в середньому 24 вкорінені адаптовані до умов in vivo рослини-регенеранти.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Розроблений спосіб клонального мікророзмноження рекомендується для одержання однорідного садивного матеріалу цінного виду-інтродуценту A. foliosa, що має вирівнений вміст діючої лікарської речовини арніфоліну.

2. Попередня активація меристем донорних ювенільних рослин при вирощуванні їх з насіння на живильному середовищі МС з доданням фітогормонів (БАП і ГК) дозволяє рекомендувати даний спосіб для видів, що погано розмножуються в умовах in vitro.

3. Використання сегментів стебла як експлантів з високим регенераційним потенціалом може бути рекомендовано для клонального мікророзмноження рослин родини Asteraceae.

4. Метод планування експерименту рекомендується для широкого використання при оптимізації складу синтетичних живильних середовищ.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Зеленіна Г.А. Мікроклональне розмноження та фізіологічні особливості регенерантів Arnica foliosa Nutt. // Вісник Одеського національного університету (сер. Біологія). – 2004. – Т. 9, № 2. – С. 63–66.

2. Зеленина Г.А., Шестопал О.Л., Игнатова С.А. Оптимизация состава питательной среды для микроразмножения Arnica foliosa методом математического планирования эксперимента // Бюлл. Никит. ботан. сада. – 2005.– Вып. 91. - С. 104–108.

3. Зеленіна Г.А. Вплив компонентів живильного середовища на ефективність мікророзмноження Arnica foliosa Nutt. in vitro // Вісник Харківського національного аграрного університету (сер. Біологія). – 2005. – Вип. 2 (7). – С. 89–93.

4. Зеленіна Г.А. Мікророзмноження та особливості водного обміну регенерантів Arnica foliosa Nutt. // Вісник Одеського національного університету (сер. Біологія). – 2005. – Т. 10, № 5. – С. 7–11.

5. Деревинська Т.І., Зеленіна Г.А., Любимова Н.С. Проблеми і перспективи вирощування арніки на півдні України з використанням мікроклонального розмноження // Збірн. наук. праць „Фальцфейнівські читання”. – Херсон: Терра, 2005. – Т. 1. - С. 117–118.

6. Зеленина Г.А. Изучение возможности микроклонирования горицвета весеннего и арники облиственной // ІІІ Укр. конф. по мед. ботан. (Київ, 1992). – К., 1992. – С.118.

7. Зеленіна Г.А., Азарова Л.В. Розмноження арніки облисненої методом культури рослинних тканин // ІІ з’їзд Українського товариства фізіологів рослин (Київ, 1993).– К., 1993. – Т. 1. – С. 76–77.

8. Зеленина Г.А., Коваль В.Т. Физиологические особенности регенерантов Arnica foliosa Nutt. при микроклональном размножении // Междунар. научн. конф. „Молекулярная генетика, геномика и биотехнология” (Минск, 2004). – Минск, 2004.- С. 232–233.

9. Зеленіна Г.А. Вплив компонентів живильного середовища на ефективність мікророзмноження in vitrо Arnica foliosa Nutt. // ІІ Междунар. научн. конф. студ., аспир. и молод. ученых, посвященная 140-летию Одесского национального университета им. И. И. Мечникова (Одесса), 2005. – Одесса, 2005. - С. 30.

10. Зеленина Г.А., Игнатова С.А. Оптимизация питательных сред для микроразмножения in vitrо Arnica foliosa Nutt. методом математического планирования эксперимента // Междунар. науч. конф. „Современные проблемы генетики” (Минск, 2005). – Минск, 2005. – С. 225.

11. Зеленіна Г.А., Ігнатова С.О. Попередня активація пазушних меристем для підвищення ефективності мікророзмноження in vitrо Arnica foliosa Nutt. // Міжнар. наук.-практ. конф. “Генетичні ресурси для адаптивного рослинництва: мобілізація, інвентаризація, збереження, використання” (Оброшино). – Львів, 2005. – С. 262 – 263.

АНОТАЦІЯ

Зеленіна Г. А. Морфогенез в культурi in vitro сегментів стебла та клональне мікророзмноження Arnica chamissonis Less. ssp. foliosa (Nutt.) Maguire.– Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія. Нікітський ботаничний сад –Національный науковий центр, Ялта, 2007.

У дисертаційній роботі розглядаються результати досліджень морфогенезу в культурі in vitro стеблових експлантів Arnica chamissonis Less. ssp. foliosa (Nutt.) Maguire (A. foliosa), метою яких була розробка способу клонального мікророзмноження цінних лікарських рослин виду-інтродуценту. Морфогенез експлантів in vitro відбувався двома шляхами: активацією існуючих та формуванням de novo меристематичних зон у тканинах експлантів. Встановлено, що регенераційна здатність стеблових експлантів залежала від їхнього місця розташування на пагоні і була найбільшою у сегментів базальної частини. Виявлена можливість збільшення регенераційного потенціалу експлантів шляхом попередньої активації меристем донорних рослин при їх вирощуванні з насіння на живильному середовищі МС з фітогормонами БАП чи ГК. Методом планування експерименту знайдено спрощений варіант живильного середовища МС, що був оптимальним для клонального мікророзмноження A. foliosa. Для оцінювання регенераційної здатності експлантів компонентами живильного середовища значущими були цитокінін БАП і сахароза.

Плоїдність регенерантів була стабільною при чисельних циклах клонального мікророзмноження протягом двох років. Вміст арніфоліну в листях та суцвіттях рослин-регенерантів достовірно не відрізнявся від аналогічних показників у рослин, розмножених традиційним вегетативним шляхом. Водний обмін рослин-регенерантів відновлювався за умов підвищеної вологості субстрату і повітря в теплиці. На підставі одержаних даних розроблено спосіб клонального мікророзмноження in vitro A. foliosa, що рекомендується для масового одержання садивного матеріалу цієї культури.

Ключові слова: морфогенез експлантів, сегменти стебла, клональне мікророзмноження, оптимізація складу живильного середовища, метод планування експерименту, рослини-регенеранти.

АННОТАЦИЯ

Зеленина Г. А. Морфогенез в культуре in vitro сегментов стебля и клональное микроразмножение Arnica chamissonis Less. ssp. foliosa (Nutt.) Maguire. – Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 – биотехнология. Никитский ботанический сад – Национальный научный центр, Ялта, 2007.

В диссертационной работе рассматриваются результаты исследований морфогенеза в культуре in vitro стеблевых эксплантов Arnica chamissonis Less. ssp. foliosa (Nutt.) Maguire (A. foliosa), целью которых была разработка способа клонального микроразмножения ценных лекарственных растений вида-интродуцента. Изучение гистогенеза сегментов стебля при культивировании на питательной среде МС с цитокинином БАП (2 мг/л) позволило выявить, что морфогенез стеблевых сегментов A. foliosa in vitro протекал двумя путями: активацией имеющихся меристем почек и формированием в тканях экспланта меристематических зон de novo. Установлено, что регенерационная