Київський університет імені Тараса Шевченка

УДК 582, 287; 577, 156

НIКIТIНА ОЛЬГА ОЛЕКСАНДРIВНА

Регуляцiя активностi екзопротеїназ молокозсiдальної

дії штамiв Hirschioporus laricinus (Karst.) Ryv

Спеціальність - 03.00.04 бiохiмiя

Автореферат

на здобуття наукового ступеня

кандидата бiологiчних наук

Київ – 1999

Дисертацією є рукопис

Дисертація виконана у Донецькому державному унiверситеті

Науковий керівник - Бойко Михайло Iванович, доктор біологічних наук,

професор, завідувач кафедри Донецького державного університету.

Офіційні опоненти - Варбанець Людмила Дмитрiвна, доктор біологічних

наук, Інститут мiкробiології i вiрусології iм.Д.К.Заболотного НАН України.

-

наук, Київський університет імені Тараса Шевченка.

Провідна установа - Харкiвський державний унiверситет, кафедра фізіології

та бiохiмiї рослин, м.Харків.

Захист відбудеться 25 травня 1999 року о 13 годині на зсіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського університету імені Тараса Шевченка за адресою: 252127, пр. акад.Глушкова, 6)

Автореферат розісланий 22 квітня 1999 року.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Київського університету імені Тараса Шевченка (252033, м.Київ, вул.Володиирська, 58)

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальнiсть проблеми. Розробка та освоєння нових високоефективних технологiй, якi сприяють комплексному використанню молока, - важливе нородно-господарське завдання. Впровадження до технологiї виробницьтва ферментних препаратiв мiкробного та грибного походження може суттєво впливати на досить довгi пасивнi схеми одержання молочних продуктiв. Ферменти повиннi широко вивчатися та вживатися з метою пiдвищення якостi продукцiї, отриманя принципово нових продуктiв та пiдвищення рентабельностi виробництва.

Сичужний фермент, за традицєю, виробляють iз сичуга ягнят та телят. При цьому отримується не досить активний фермент з великим вмiстом баластових речовин. Розширення виробництва сирiв та iнших молочних виробiв потребують пошуку замiнникiв сичужних ферментiв.

Ферментнi системи вищих базидiальних грибiв зараз вивчаються бiльш широко та планомiрно, але мiцелiальнi гриби у цьому аспектi вивченi ще не досить добре. Важливiсть подiбних дослiджень безперечна, тому що як фiзiологiчнi, так i ферментативнi характеристики чистих мiцелiальних культур, їх первиннi та вториннi процеси метаболiзму та вiдповiднi продукти явно вказують не тiльки на наукове значення напрямку, але i на його перспективнiсть для практичного використання.

Порiвняльна простота культивування грибiв, їх висока фiзiологiчна та генетична пластичнiсть вiдкривають великi можливостi cтосовно промислової ферментологiї та селекцiї штамiв-продуцентiв.

Отримання цiнних грибних метаболiтiв повязано з оптимiзацiєю умов для їх бiосинтезу пiд час штучного культивування та є однiєю з основних задач, яка потребує вирiшення. Впровадження до сфери промислового використання як можна бiльшої кiлькостi базидiомiцетiв приведе до збiльшення корисних ресурсiв нашої держави.

Мета i завдання дослiджень. Метою роботи було пiдвищення синтезу протеїназ молокозсiдальної дiї штамiв М-81, А-031, А-032 i Р-323 H. laricinus шляхом використання рiзних факторiв.

Для досягнення цiєї мети вирiшувалися такi завдання :

-

-

-

-

-

-

Наукова новизна роботи. Дослiджено понад 120 середовищ. Отриманi новi вiдомостi про рiвень молокозсiдальної активностi й росту штамiв на цих середовищах. Пiдiбранi оптимальнi показники кислотного та температурного режимiв культивування, умов стерилiзацiї середовищ, спосiб аерацiї. Вперше визначено константи iонiзацiї, якi контролюють активнiсть молокозсiдальних протеїназ у кожного з дослiдженних штамiв i тенденції змiнювання молокозсiдальної активностi та кислотностi середовища у динамицi.

Пiд час вивчення азотного та вуглецевого живлення вперше виявлено двовершинний харктер синтезу ферменту з молокозсiдальними властивостями у H. laricinus на джерелах вуглецю, якi легко засвоюються. Доведено, що тiльки присутнiсть бiлка у середовищi культивування сприяє активному синтезу молокозсiдальних протеїназ. Шляхом пiдбору концентрцiй цукрiв у живильному середовищi досягнуто збiльшення активностi молокозсiдального ферменту та збiльшення його виходу в чистому виглядi в 5 разiв. Середовище з пiдвищеним вмiстом цукрiв запатентовано у Держпатентi України.

Використаня методiв математичного планування дозволило докладно вивчити характер залежностi молокозсiдальної активностi й росту H. laricinus вiд концентрації молочної сироватки та пивного сусла. Вирахованi функції дають можливiсть прогнозувати поведiнку продуценту у будь-якiй точцi простору, обмеженого рiвнями факторiв. Завдяки цьому було пiдiбрано найкраще середовище культивування, яке мiстить молочну сироватку та пивне сусло. На це середовище отримано рiшення про видачу патенту на винахiд.

Зясовано, що усi дослiджуванi штами H. laricinus мають здатнiсть утворювати позаклiтиннi протеїнази з високою молокозсiдальною активнiстю. Доведена висока пластичнiсть штамiв. Культура штама А-032 H. laricinus запатентована у Держпатентi України, як активний продуцент протеїназ молокозсiдальної дії. Усi дослiдженi штами не виявили плодоношення у культурi.

Практична цiннiсть роботи. Штами H. laricinus можна використовувати як продуценти молокозсiдальних ферментiв, що можуть знайти застосування у виробництвi сирiв.

Можливiсть культивування H. laricinus на дешевих субстратах дозволяє зробити процес виробництва молокозсiдального ферменту бiльш дешевшим, тому що молочна сироватка, яка є вiдходом виробництва молочних продуктiв, зокрема сиру, може вiдразу використовуватись для отримання молокозсiдального ферменту.

Вiдсутнiсть плодоношення у культурi та висока фiзiологiчна пластичнiсть продуцентiв характеризує їх як важливi обєкти бiотехнології, враховуючи те, що кислi та слабокислi протеолiтичнi препарати у нас взагалi не виробляються.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Представленi дослiдження - це частина роботи, що проводиться на кафедрi фiзiології рослин Донецького державного унiверситету в рамках держбюджетної теми № 97-1вв/16 “Одержати i апробувати новi високоактивнi штами базидiальних грибiв i розробити на їх основi технологiю виробництва цiнних бiопрепаратiв i харчових продуктiв”, яка координується планом науково-дослiдних тем Мiнiстерства освiти Украпни.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана особисто автором пiд керiвництвом док.бiол. наук, професора, С.Ф. Негруцького i док. бiол. наук, доцента М.I. Бойко. Особиста участь дисертанта полягала у плануваннi та проведеннi лабораторних дослiджень, аналiзi, узагальненнi одержанних експериментальних даних, спiвставленнi пх з лiтературними матерiалами. Автор приносить щиру вдячнiсть всiм спiвробiтникам кафедри фiзiологiп рослин Донецького державного унiверситету.

Апробацiя роботи. Про основнi положення дисертації доповiдалося на мiжнароднiй конференції, присвяченiй проблемам кореневих та комлевих гнилей (Францiя, 1997), мiжнароднiй конференції “Методологические основы познания особенностей грибов - продуцентов физиологически активных веществ и пищевых продуктов” (Донецьк, 1997), конференції молодих вчених “Актуальнi проблеми фiзiології рослин та генетики” (Київ, 1996), Х зiздi Украiнського ботанiчного товариства (Полтава, 1997), на наукових конференцiях Дон ДУ (Донецьк, 1994-1997), Всеукраiнських студентських конференцiях (Донецьк, 1992-1997).

У завершеному варiантi дисертацiя доповiдалась на засiданнях кафедри фiзiології рослин Дон ДУ.

Публiкації. За матерiалами дисертації опублiковано 11 наукових праць: 4 статтi в наукових журналах, 2 патенти i 5 тез конференції.

Структура та обсяг роботи. Дисертацiя викладена в 150 сторiнках та складаться з вступу, 7 роздiлiв, висновкiв, рекомендацiй, списку лiтератури ( 198 джерел ). Праця iлюстрована 28 таблицями та 54 малюнками, ма 5 додаткiв.

ЗМIСТ РОБОТИ

Огляд лiтератури

Огляд лiтератури складається iз 3 роздiлiв, в яких висвiтленi питання регуляцiп синтезу позаклiтинних ферментiв мiкроорганизмiв, подана класифiкацiя протепназ та принципи застосування пх у промисловостi, а також охарактеризовано процес ферментної коагуляцiї молока.

Обєкти i методи дослiджень

Обєктами наших дослiджень були штами H. laricinus М-81, А-031, А-032 i Р-323. Використовувались чистi культури, видiленi з плодових тiл на кафедрi фiзiології рослин ДонДУ. Штам А-032 та М-81 задепоновано у колекцiю Iнституту Ботанiки iм. М.Г. Холодного НАН Украiни. На штам М-81 H. laricinus спiвробiтниками кафедри отримано патент Украiни ( Бойко, Негруцкий, Мирошниченко та iн., 1994 ).

Гриби вирощували на рiдких живильних середовищах при температурi 300С (Бойко,1996). Основним середовищем було глюкозо-пептонне з додатком мiнеральних речовин (Федорова, Шиврина, 1974). Iнокулювали середовища 7-ми добовим мiцелiєм, який зростав на сусло-агарi.

Молокозсiдальну активнiсть (МЗА) визначали за методом Кавап та Мукап (Kawai, Mukai, 1970). Розрахунок МЗА проводили згiдно з формулою:

40 . 100 . К

МСАКФ= ––––––––––– од/мл,

П

де: К - коефiцiєнт разведення культурального фiльтрату; П - час, за який зi 10 мл молока при додаваннi 1 мл культурального фiльтрата утворються щiльний сгусток, у хвилинах; 40 - середнiй час зсiдання молока при виробництвi сирiв, у хвилинах.

Кислотнiсть середовища реєстрували потенцiометричним методом, накопичення бiомаси - ваговим (Петербургский, 1966). Залишкову кiлькiсть цукрiв визначали за методом Швецова та Лукяненко (Ермаков, 1987), а кiлькiсть амiнокислот - фотометричним методом за визначенням амiнного азоту (Ермаков, 1987). Вмiст бiлку визначали за методом Бредфорда (Bredford, 1976).

Одержання ферментного препарату сичужної дії здiйснювали шляхом додавання у культуральну рiдину сiрчанокислого амонiю у кiлькостi, яка вiдповiдає 80% насичення (Бойко, 1996).

Статистичну обробку результатiв здiйснювали за допомогою однофакторного дисперсiйного аналiзу порiвняння середнїх арифметичних величин методом множинних порiвнянь за критерiями Дункана та Тьюки, та критерiю Стьюдента (Лакин, 1980; Негруцкий, Фильчаков, 1984).

Оптимiзацiю середовища з пивним суслом та молочною сироваткою здiйснювали за допомогою повного факторного екcперименту ПФЕ - 52 (Максимов, Пименова, Гречушкина, 1976). Аналiз даних проводили згiдно з алгоритмом Йєйтса. За допомогою компютерних програм здiйснювали побудову поверхней вiдгуку.

Усi эксперименти виконувалися неменш нiж у 3-х повторностях.

Результати дослiджень та пх обговорення

1.Фiзико-хiмiчнi умови культивуваня Hirschioporus laricinus

В роботi було проведено вивчення впливу температури зовнiшнього середовища, рН, аерації, а також режимiв cтерилiзації середовища на рiвень МЗА та накопичення бiомаси штамами H. laricinus.

Встановлено, що змiна температури в межах 28 0С-32 0С не вiдбивається на характерi синтезу молокозсiдального фермента у дослiджуваний перiод (30 дiб) (рис.1), а також на накопиченнi бiомаси. Для культивування H. laricinus можна використовувати температуру 28 0С-32 0С.

Рис. 1. Показники МЗА штаму М-81 H. laricinus пiд час культивування

в рiзних температурних режимах.

Зроблено припущення, що короткочасова дiя пiдвищених та знижених температур на мiцелiй H. laricinus перед реєстрацiєю показникiв МЗА та бiомаси буде викликати порушення напiвпроникностi мембран та обмiнних процесiв у клiтинах, що приведе до збiльшення виходу ферменту в культуральну рiдину.

Вперше встановлено, що дiя температур 40 0С i 45 0С протягом двох годин викликає пiдвищення активностi ферменту. Температура 450С збiльшує МЗА в 3,5 разiв, а температура 40 0С - у 1,9 разiв. Дiя температури 550С пртягом двох годин знижує активнiсть ферменту. Iмовiрно, молокозсiдальна протеiнза H. laricinus не термостабiльна, як бiльшiсть грибних протеїназ. Вплив зниженних температур також пiдвищує МЗА.

Порiвняльне вивчення ферментативнiй активностi H. laricinus в умовах глибинного i поверхневого культивування вказує, що у рiзнi сроки культивування перемiшування по-рiзному вiдбивається на МЗА (рис.2). Зясовано, що при кiмнатнiй температурi краще здiйснювати культивування глибинним способом.

Рис.2. Молокозсiдальна активнiсть H. laricinus пiд час вирощування

поверхневим та глибинним способом

Дослiдження кислотного режиму культивування продуцента у динамицi дозволили зясувати, що всi дослiджуванi штами прявляють здатнiсть до регулювання кислотностi середовища. Пiд час вирощування продуцентiв на середовищi з рН 2,5 молокозсiдальної активностi невстановлено. Характерно те, що оптимальнi значення рН для накопичення бiомаси та синтезу молокозсiдального ферменту не збiгаються, що свiдчить про доцiльнiсть використання комбiнованного кислотного режиму: спочатку пiдтримувати кислотнiсть, яка сприяє росту грибiв, а потiм - ферментації. Оптимальною кислотнiстю середовища для росту штамiв М-81, А-031, А-032 i Р-323 є значення рН 5,0 i вище. Для бiосинтезу молокозсiдальних ферментiв вихiдне значення кислотностi повинно складати рН 3,5.

Концентрацiя iонiв водню може регулювати iонний стан субстрату. Змiна кислотної рiвноваги до значень, якi виходять за межi значення рКа, викликає змiну концентрації субстрату i швидкiсть синтезу ферменту.

Спосiб подання експериментальних даних у логарифмiчних координатах дає змогу визначити рКа. На рис. 3 у логарифмiчних координатах подано кiнетику синтезу молокозсiдального фермента штамом М-81 H. laricinus у залежностi вiд рН культивування. Згiдно з теорiєю дії ферментiв - приєднання одного протону до активного центру вiдображається у рН залежностi швидкоcтi у логарифмiчних координатах змiною тангенсу кута нахилу дотичної до вiток сигмоід на одиницю. Оскiльки перехiд тангенсу кута нахилу на рис. 3 вiд 1,38 до 0, то синтез молокозсiдальної протеїнази, за нашими даними, контролюється однiєю iоногенною групою з рКа менше нiж 3,5 та iншою з рКb близько 3,85.

Концентрацiя iонiв водню у зовнiшньому середовищi й усерединi компартменту, де синтезується фермент, повязанi лiнiйним спiввiдношенням:

H+внутр = / . H+зовн ,

де i - кiнетичнi коефiцiєнти (Варфоломеев, Калюжный, 1990).

Рис. 3. Теоретична залежнiсть логарифма уяв вiд рН, штама М-81

H. laricinus.

Звiдси, коли (рис. 3), то можна з увпевненiстю стверджувати, що у клiтинах штаму M-81 H. laricinus пiдтримується бiльш кисле середовище. Теж саме стосується й iнших штамiв.

Таким чином активнiсть молокозсiдальної протеїнази пiд час культивування на глюкозо-пептонному середовищi для усїх штамiв контролюється однаково - двома iоногенними групами. Взагалi рН зовнiшнього середовища 3,5 одиниць входить в усi плато логарифмiчного профiлю утворення молокозсiдального ферменту штамiв Н. laricinus i може бути визначена, як оптимальна концентрацiя iонiв водню для синтезу молокозсiдальної протеїнази.

2. Культивування Hirschioporus laricinus на середовищах з

вуглеводами

Пiд час культивування штаму А-032 на середовищах з рiзними цукрами виявлено двовершинний характер синтезу молокозсiдальних протеаз на середовищах з глюкозою (рис. 4), крохмалем та iнулiном, якi легко споживаються продуцентом. У динамiцi накопичення бiомаси на середовищах з цими цукрами вiдмiчається дiауксичний характер росту (рис. 5). Схожа картина росту i синтезу ферменту спостерiгається також при культивуваннi штаму Р-323 на сахарозi та мальтозi.

Рис. 4. Динамiка молокозсiдальної активностi штамiв

H.

Рис. 5. Динамiка накопичення бiомаси штамами H. laricinus

на средовищi з глюкозою.

У цих випадках має мiсце катаболiтна репресiя, коли висока концентрацiя цукрiв на початковому етапi культивування стримує синтез ферментiв, якi асимiлюють iнше джерело живлення. Зменшення кiлькоcтi цукру дозволяє органiзму продукувати нову ферментну систему, що атакує другий субстрат, можливо продукти власного метаболiзму, або джерела азотного живлення.

Щодо штаму А-031, можна довести, що пiсля досягнення високих значень МЗА у 10-ти добовому вiцi вона мало змiнюється до кiнця перiоду культивування.

Таким чином, можна сказати, що всi вивченi цукри, крiм арабiнози, добре використовуються штамами H. laricinus для синтезу молокозсiдальних протеїназ.

Кiнетичнi показники росту та МЗА рiзняться (табл.1). Як правило, для штамiв А-031 и А-032 максимальна швидкicть пiдвищення МЗА вища, нiж швидкiсть збiльшення сухої речовини. Для штаму Р-323 - навпаки. Час подвоєння показникiв бiомаси перевищує час подвоєння показникiв МЗА. Iндивiдуальним для кожного середовища та цукру є час найвищого економiчного коефiцiєнту культури. На середовищi з арабiнозою економiчнi коефiцiєнти усїх грибiв вищi, нiж на середовищах з iншими цукрами.

Таблиця 1

Кiнетичнi показники росту i бiосинтезу молокозсiдального ферменту пiд час культивування штамiв H. laricinus на середовищi з глюкозою.

Штам |

Макси-

мальна

швидкiсть

росту

max, год-1 |

Час под-

воєння

показникiв бiомаси

g, год |

Макси-

мальна

швидкiсть

МЗА

max, год-1 |

Час под-

воєння

показникiв

МЗА

g, год |

Економi-

чний

коефi-

цiєнт

Y |

Метабо-

лiчний

коефi-

цiєнт

qmax, год-1

А-031

А-032

Р-323 |

0,0139

0,0179

0,0149 |

49,86

38,72

46,51 |

0,0212

0,0235

0,0128 |

32,69

29,49

54,14 |

0,450

0,588

0,980 |

0,046

0,030

0,029

Дослiдження показали, що пiдбором джерел вуглецевого живлення можна регулювати вiдповiднiсть процесiв росту та змiни МЗА як у бiк прискорення синтезу молокозсiдального ферменту, так i в бiк збiльшення швiдкоcтi росту. Максимальнi швидкоcтi росту та МЗА виявляються на раннїх стадiях розвитку культури.

У випадку пiдвищення концентрації цукрiв у два рази в порiвняннi з стандартним середовищем вiдбувається збiльшення МЗА на усїх середовищах з протягом 30-добового культивування. Пiдвищення концентрації глюкози, мальтози i крохмалю викликає зниження значень бiомаси наприкiнцi перiоду культивування. Це, мабуть, повязано зi здатнiстю цих цукрiв у зазначенiй концентрації стимулювати синтез ферментiв, що викликають руйнування клiтинних оболонок мiцелiю H. laricinus.

Пiдвищення вмiсту цукрiв у середовищi культивування у 2 рази доцiльно, тому що це збiльшує вихiд молокозсiдального ферменту у 5 разiв i пiдвищує його активнiсть

3. Роль джерел азоту для культивування штамiв

Hirschioporus laricinus

Пiд час дослiдження джерел азотного живлення ( NH4NO3, (NH2)2CO, (NH4)2SO4, CH3COONH4, NaNO3, KNO3 та пептон ) рiст продуцентiв виявлено на всїх речовинах, що мiстять азот (рис.6). Добре використовуються для накопичення бiомаси H. laricinus сечовина й сiрчанокислий амонiй, але показники бiомаси в обох випадках нижчi, нiж на середовищi, яке мiстить пептон.

Рис.6. Накопичення бiомаси штамом А-031 пiд час вирощування на

рiзних джерелах азоту.

Стосовно МЗА можна вiдзначити, що нiтрат натрiю та калiю, а також ацетат амонiю цiлком iнгiбують синтез молокозсiдального ферменту. На рештi джерел рiвень МЗА нижчий, нiж на середовищi з пептоном в 5-27 разiв. Таким чином, штами H. laricinus для росту та синтезу молокозсiдального ферменту краще використовують азот пептону. Нiтрат- iон непридатний до культивування штамiв H. laricinus.

Вивчення впливу амiнокислот: DL-триптофан, DL-фенiлаланiн, DL-лiзинмоногiдрохлорид, DL-лейцин, DL-метiонiн, L-iзолейцин, L-гiстидингiдрохлорид, DL-валiн, L-аргiнiнгiдрохлорид, DL-треонiн, проводили шляхом додавання їх у середовище у кiлькостi, еквiвалентнiй 3 г пептону по амонiйному азоту.

На середовищах з триптофаном, лiзинмоногiдрохлоридом, валiном та треонiном МЗА не виявлена. На середовищах, де була МЗА, рiвень ії складав близько 2500 од/мл. Для росту H. laricinus краще використовувати лiзинмоногiдрохлорид. Використання амiнокислот штамами проходить неоднаково. Краще з усїх амiнокислот використовуються триптофан та аргiнiн, слабко - метiонiн та валiн.

Значення МЗА на середовищах з амiнокислотами на порядок нижче, нiж на середовищi з пептоном, але значення бiомаси на цих середовищах незначно поступаються значенням бiомаси на глюкозо-пептонному середовищi. Це свiдчить, що амiнокислоти використовуються продуцентом переважно для росту органiзму.

Таким чином, для синтезу молокозсiдального ферменту штамами H. laricinus необхiдна наявнiсть у середовищi культивування бiлкового азоту, який серед усїх вивчених джерел азотного живленя тiльки у пептонi.

4. Культивування Hirschioporus laricinus на середовищах з

молочною сироваткою.

Додавання молочної сироватки у середовище культивування викликає збiльшення швидкостi росту та продукування молокозсiдального ферменту (max), до того ж, чим бiльше сироватки у середовищi, тим вище max, отже скорочується час подвоєння показникiв (табл.2).

Таблиця 2

Параметри, що характеризують динамiку змiни бiомаси та МЗА

H.

сироваткою.

Кiлькiсть

молочної

сироватки, % |

Показник | Максимальна

швидкiсть, max

год-1 | Час подвоєння

g, дiб

40

20

10

0 |

МЗА

бiомаса

МЗА

бiомаса

МЗА

бiомаса

МЗА

бiомаса |

0,023

0,016

0,011

0,016

0,008

0,015

0,007

0,012 |

1,3

1,8

2,6

1,8

3,9

1,9

4,1

2,4

Звертає на себе увагу i те, що додавання сироватки збiльшує тривалiсть експоненцiйної фази росту та бiосинтезу ферменту до 10-ти дiб, коли при ії вiдсутностi експоненцiйна фаза складає 5 дiб. Слiд вiдзначити, що пiд час додавання максимальної концентрації молочної сироватки у випадку з МЗА вiдбувається подовження лаг-перiоду.

Таким чином, змiнюючи кiлькiсть молочної сироватки у середовищi можна досягти прискорення як процесiв росту, так i продукування молокозсiдальних протеаз у H. laricinus та регулювати швидкiсть цих процесiв за власним бажанням.

З метою оптимiзації живильного середовища культивування H. laricinus, яке мiстить молочну сироватку i пмвне сусло, було проведено серiю модельних експериментiв згiдно з повним факторним експериментом 52 (ПФЕ 52). Для кожного експерименту на 5-ту та 10-ту добу культивування складалися рiвняння регресії, вiдповiдно яким за допомогою компютерних програм будувалися поверхнi вiдгуку бiомаси та МЗА. ПФЕ 52 дозволив нам докладно дослiдити характер залежностi, визначити значення функції в будь-якiй точцi простору, обмеженого рiвнями факторiв.

Що стосується вдосконалення середовища, то для виключення ефектiв високого порядку та узагальнення отриманих даних нами було зменшено кiлькiсть рiвнiв факторiв вiдповiдно ПФЕ 32. В результатi експерименту отриманi данi, якi описуються рiвняннями регресії (1) i (2).

y = 48,983 - 1,051х1+3,548х2 - 4,026х12 - 7,86х22-3,269х1х2 + 3,138х1х22 (1)

у = 107,36 + 1,34х1 - 12,32х2 - 8,85х12 - 24,87х22 - 7,755х1х2 (2)

Рiвняння (1) описує данi з МЗА, рiвняння (2) - данi з бiомаси, де х1 - кодованi значення концентрації пивного сусла, а х2 - кодованi значення концентрації молочної сироватки.

Характер залежностi МЗА i бiомаси вiд дослiджуванних факторiв подiбний. Мiнiмальнi значення функції зсунутi до краю, а плато оптимальних значень знаходиться у центрi поверхнi вiдгуку. Високi значення МЗА знаходяться в iнтервалi, де х1 [ -0,2 ; 0,5 ], а х2 [ -0,4 ; 0,5 ] (мал. 7). Що стосується бiомаси, то плато оптимуму обмежується значеннями х1 [ -0,2 ; 0,4 ] та x2 [-0,3 ; 0,5] .

Таким чином, високi значення МЗА i бiомаси були одержанi на середовищах, у яких спiввiдношення молочної сироватки i пивного сусла складає 1:1, до того ж кiлькiсть води, яка додається у середовище, також є важливою, тому що у випадку високих концентрацiй дослiджуваних факторiв значення МЗА та бiомаси зменшуються. Частка води повинна складати третю частину субстрату, отож, удосконалене середовище включає молочну сироватку, пивне сусло та воду в спiввiдношеннi 1:1:1. За результатами цих дослiджень Держпатентом Украiни прийнято рiшення про видачу патенту.

5. Введення у середовище культивування Hirschioporus laricinus

бiологiчних додаткiв

Введення високих концентрацiй екстрактiв росткiв картоплi скорочує стацiонарну фазу росту, про що свiдчить зниження бiомаси наприкiнцi перiоду культивування. Екстракт росткiв картоплi пiдвищує МЗА тiльки в експоненцiйнiй фазi росту (таб.3), при подальшому культивуваннi на всїх середовищах рiвень активностi ферменту не вiдрiзняється вiд рiвня МЗА контрольного глюкозо-пептонного середовища, але при максимальнiй концентрації экстракту значення МЗА нижче, нiж у контролi.

Таблиця 3

Вплив вмiсту екстракту росткiв картоплi на

молокозсiдальну активнiсть штама М-81 H. laricinus.

Вмiст

екстракту

мл/л |

Вiк, доба

5 |

10 |

15 |

20

Молокозсiдальна активнiсть, од/мл

00,00

61,54

124,62

189,23 |

5904,4

6887,2

8650,6

8335,2 |

15738,4

14572,5

16565,4

10051,2 |

17719,6

18176,1

16530,9

2118,4 |

15015,4

17158,0

15175,6

659,5

Додавання у середовище культивування соєвого брошна у концентрації 0,5% i 1,0% стимулює, як накопичення бiомаси, так i бiосинтез молокозсiдального ферменту.

Введення гiберелiну у середовище стимулює МЗА. При концентрації 4 мг/л активнiсть вища, нiж при 2,5 мг/л. Така ж залежнiсть спостерiгається i стосовно бiомаси. Додавання ауксину на раннїх стадiях культивування знижує МЗА, одночасно вiдбувається пригнiчення росту, але пiзнiше активнiсть ферменту рiзко збiльшується та досягає рiвня контрольного глюкозо-пептонного середовища, а значення бiомаси навiть перевищують значення iнших середовищ.

Таким чином, для пiдтримування високих значень МЗА H. laricinus виправдано введення у середовище культивування гiберелiна у кiлькостi 4 мг/л, яка збiльшує МЗА в 2-2,5 разiв.

Ауксин краще використовувати у концентрації 4 мг/л з метою збiльшення бiомаси пiд час тривалого культивування.

ВИСНОВКИ

На пiдставi дослiджень регуляції молокозсiдальних протеїназ штамiв Hirschioporus laricinus ( Karst ) Ryv. можна зробити такi висновки :

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

Головнi публикації за темою дисертації :

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

Нiкiтiна О.О. Регуляцiя активностi екзопротеїназ молокозсiдальної дії штамiв Hirschioporus laricinus (Karst.) Ryv. - Рукопис.

Дисертацiя на здобуття наукового ступеня кандидата бiологiчних наук за спецiальнiстю 03.00.04 - бiохiмiя. - Київський унiверситет iменi Тараса Шевченка, Київ, 1999.

Дисертацiя присвячена дослiдженню впливу рiзних фiзiологiчних факторiв: температури та способу культивування, кислотностi середовища, вуглецевого та азотного живлення, а також бiологiчних додаткiв на молокозсiдальну активнiсть та накопичення бiомаси штамами Hirschioporus laricinus М-81, А-031, А-032 i Р-323 - продуцентами молокозсiдальних протеїназ. В дисертації дослiджено понад 120 живильних середовищ. Вивчено динамiку та кiнетику синтезу молокозсiдальних протеїназ на цих середовищах. Шляхом пiдбору концентрацiй цукрiв досягнуто збiльшення виходу молокозсiдального фермента в 5 разiв. Дослiджено характер залежностi молокозсiдальної активноcтi та росту гриба вiд концентрації молочної сироватки та пивного сусла - дешевих та доступних складових живильного середовища, завдяки чому було пiдiбрано оптимальне середовище культивування. Дано рекомендації щодо промислового культивування штамiв H. laricinus. За основними результатами працi одержано патент на винахiд та двi прiоритетнi довiдки.

Ключовi слова: сичужнi ферменти, складовi середовища, оптимiзацiя, по-

верхня вiдгуку, молокозсiдальна активнiсть

Никитина О. А. Регуляция активности экзопротеиназ молокосвертывающего действия штаммов Hirschioporus laricinus ( Karst. ) Ryv. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03. 00. 04 - биохимия. - Киевский университет имени Тараса Шевченко, Киев, 1999.

Диссертация посвящена вопросам исследования влияния различных физиологических и биохимических факторов: температуры и способа культивирования, кислотности среды, углеродного и азотного питания, а также биологических добавок на молокосвертывающую активность и накопление биомассы штаммами Hirschioporus laricinus М-81, А-031, А-032 и Р-323 . H. laricinus - новый перспективный продуцент молокосвертывающих протеиназ, которые могут использоваться в производстве сыров как заменители сычужного фермента. Получение ценных грибных метаболитов связано с оптимизацией условий культивирования в условиях искусственных культур и является одной из основных задач, требующих решения. В работе исследовано более 120 питательных сред. Изучена динамика и кинетика синтеза молокосвертывающих протеиназ на этих средах. Выяснено, что штаммы H. laricinus способны регулировать рН среды культивирования, оптимальные значения кислотности для накопления биомассы и продуцирования молокосвертывающего фермента не совпадают. Изменение температуры в пределах от 280С до 320С не сказывается на характере синтеза молокосвертывающего фермента и росте H.laricinus. Сравнительное изучение ферментативной активности продуцента в условия глубинного и поверхостного культивирования показывает, что в разные сроки культивирования перемешивание по-разному сказывается на молокосвертывающей активности, при комнатной температуре лучше использовать культивирование глубинным способом. Исследования роли различных углеводов показали, что подбором источника углеродного питания штаммов H.laricinus можно регулировать сопряженность процессов роста и молокосвертывающей активности, как в сторону увеличения активности молокосвертывающего фермента так и в сторону увеличения скорости роста продуцента. Путем подбора концентраций сахаров достигнуто увеличение выхода молокосвертывающего фермента в 5 раз. При изучении роли источников азотного питания (NH4NO3, (NH2)2CO, (NH4)2SO4, CH3COONH4, NaNO3, KNO3, пептона и 10-ти аминокислот: DL-триптофан, DL-фенилаланин, DL-лизинмоногидрохлорид, DL-лейцин, DL-метионин, L-изолейцин, L-гистидингидрохлорид, DL-валин, L-аргинингидрохлорид, DL-треонин ) выяснено, что H. laricinus использует для роста мицелия все исследованные источники органического и неорганического азота, но для активного синтеза молокосвертивающих протеиназ необходимо наличие в среде культивирования белкового азота, который среди всех изученных веществ содержится только в пептоне. Введение молочной сыворотки в культуральную среду H. laricinus вызывает повышение скорости роста и продуцирования молокосвертывающего фермента, а также увеличение длительности экспоненциальной фазы роста. При использовании методов математического планирования детально изучен характер зависимости молокосвертывающей активности и биомассы продуцента от концентрации молочной сыворотки и пивного сусла - дешевых и доступных компонентов питательной среды. Вычисленные функции позволяют прогнозировать поведение продуцента в любой точке пространства, ограниченного уровнями факторов. Введение гиббереллина в среду культивирования H.laricinus стимулирует образование молокосвертывающего фермента. Добавление ауксина на ранних стадиях культивирования подавляет синтез молокосвертывающего фермента и биомассы. Даны рекомендации для промышленного культивирования штаммов H. laricinus. По результатам работы получен патент на изобретение и две приоритетные справки на изобретение.

Ключевые слова: сычужные ферменты, компоненты среды, оптимизация, поверхность отклика, молокосвертывающая активность

Nikitina O. A. Regulation of the activity of milk coagulating exoproteases of Hirschioporus laricinus ( Karst.) Ryv. cultures. - Manuscript.

The thesis of Candidate of sciences ( Biology) on speciality 03.00.04. - biochemistry. - Kyiv state University named after Taras Shevchenko, Kyiv, 1999.

The thesis is devoted to the problems of different physiological factors - temperature and means of cultivation, the acidity of the medium, carbon and nitrogen nutrition and also some biological additions - influencing milk coagulating activity and the accumulation of biomass by M-81, A-031, A-032 and P-323 Hirschioporus laricinus - the producents of milk coagulating proteases. There have been investigated more then 120 nutrition mediums in the present paper. The 5 times increasing of milk coagulating ferments output is achieved by means of sugars concentrations selection.

The character of dependence of milk coagulating activity and grows on milk serums and beer wort - cheap and easy-of-access components of nutrition medium is investigated in detail; on the basis of this the optimal cultivation medium was selected. Some recommendation concerning industrial cultivation of Hirschioporus laricinus cultures are given. As a result of the work carried out the invention patent and 2 priority certificates of invention are obtained.

Key words: rennet ferments, medium components, optimization, response surface, milk coagulating activity