Міністерство охорони здоров’я України

ЛьвівськиЙ національний медичний університет імені

Данила Галицького

Заячківська

Оксана Станіславівна

УДК 612.014.4: 612.31/.32:612.6.03

РОЛЬ ЛОКАЛЬНОЇ СТРЕС-ЛІМІТУЮЧОЇ СИСТЕМИ У МЕХАНІЗМАХ ЦИТОПРОТЕКЦІЇ СЛИЗОВОЇ ОБОЛОНКИ CТРАВОХОДУ І ШЛУНКА

14.03.03 – нормальна фізіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Львів – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному медичному університеті імені Данила Галицького.

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор,

член-кореспондент АМН України,

Гжегоцький Мечислав Романович,

Львівський національний медичний

університет імені Данила Галицького,

завідувач кафедри нормальної фізіології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор,

академік АМН України, член-кореспондент

НАН України і Російської АМН,

Kоркушко Олег Васильович,

Інститут геронтології АМН України,

керівник відділу клінічної фізіології та

патології внутрішніх органів, м. Київ

доктор медичних наук, професор

Скляров Олександр Якович,

Львівський національний медичний

університет імені Данила Галицького,

завідувач кафедри біологічної хімії

доктор біологічних наук, професор

Берегова Тетяна Володимирівна,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка МОН України,

завідувач відділу фармако-фізіології

НДІ фізіології імені академіка Петра Богача

Захист дисертації відбудеться „14” вересня 2007 року об 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.600.03 у Львівському національному медичному університеті імені Данила Галицького (79010, м. Львів, вул. Пекарська, 69).

З дисертацією можна ознайомитися у Науковій бібліотеці Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького (79000, м. Львів, вул. Січових стрільців, 6).

Автореферат розісланий „ 14 ” серпня 2007 року.

Вчений секретар

cпеціалізованої вченої ради Томашова С.А

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Проблема ефективної і безпечної цитопротекції проксимального відділу системи травлення набула сьогодні глобального медико-соціального значення, оскільки показники поширеності кислотоасоційованих хвороб (КАХ), за даними ВООЗ, перевищують 20 %. Центральне місце серед них посідають гастроезофагеальна рефлюксна хвороба (ГЕРХ), для якої характерне збільшення темпу приросту показників захворюваності в останнє десятиліття, та виразкова хвороба. Фундаментальні дослідження проблеми ГЕРХ є винятково своєчасними через потенційно небезпечний спектр ускладнень у разі її прогресування: виразково-ерозивні ураження (2-7 %), кровотеча (< 2 %), формування стриктур (4-20 %) та стравоходу Барретта (10-15%) (Modvin I.M., Sachs G., 2005). Дослідженнями П. Місюни (2004), та R.C. Fitzgerald (2005) встановлено, що тривале пептичне ураження сприяє трансформуванню стравоходу Барретта в аденокарциному стравоходу, одне з найнебезпечніших гастроентерологічних злоякісних захворювань. И.В. Маев (2003-2005), Т.В. Майкова (2004), G. Mozsik et al. (2000-2006) серед сучасних особливостей виразкової хвороби, ерозивного гастриту, неерозивної диспепсії виділяють їх хронічний перебіг, багатогранність клінічних проявів, поліморбідність і рефрактерність до лікувальних заходів, що робить дослідження фізіологічних захисних механізмів опірності слизової оболонки стравоходу (СОС) і шлунка (СОШ) пріоритетними. Попри велику кількість наукових публікацій, як вітчизняних (Панасюк Є.М., 1985-2001; Гжегоцький М.Р., 1987-2006; Скляров О.Я., 1998-2006; Берегова Т.В., 1998-2006), так і закордонних (Watanabe T., 1979-2006; Takeuchi K., 1980-2006; Konturek S.J., 1980-2006; Okabe S., 1981-2006; Аrakawa T., 1993-2006; Motilva V., 1994-2001; Филаретова Л.П., 1998-2006), в яких висвітлено досягнення у вивченні фундаментальних засад молекулярно-клітинних механізмів цитопротекції, у фізіології травлення до тепер залишаються остаточно нез’ясованими процеси мобілізації природних захисних сил, що володіють здатністю обмежувати уражувальний вплив на епітеліальних бар’єр стравоходу та шлунка. Відомо, що цілісність СОС і СОШ забезпечується повноцінним функціонуванням механізмів біорегуляції, що включає взаємовплив процесів цитопротекції та нейрогуморального регулювання. Встановлено, що головними індукторами цитоагресії в слизовій оболонці проксимального відділу травної системи є ішемія, хімічні чи інфекційні чинники, як Helicobacter pylori та його токсичні метаболіти, як VacA, CagA. Природними молекулярними факторами ішемічного пошкодження, що викликають вазоконстрикцію, є біорегулятори ендотеліального походження та нестача монооксиду азоту (NO). За ураження хімічного типу визначальним є лавиноподібне нагромадження активних форм кисню (АФК) або безпосередній вплив НСl, жовчних кислот, етанолу чи застосування нестероїдних протизапальних препаратів (НПЗП). Сформульована на початку 90-х років Tarnawski A., Szabo S. et al. (1991); Arakawa T. et al. (1993) концепція біорегуляції на сьогоднішній день трансформувалась у причинно-наслідкову взаємозалежність молекулярних механізмів з залученням широкого кола інших медіаторів у процеси міграції клітин, проліферації, реепітелізації, ангіогенезу, депозиції камбіальних клітин і перерозподілу компонентів матриксу. Незаперечними є включення імунологічних механізмів у ульцерогенез та особливості прематураційної автомодифікації клітинної реактивності, що визначають індивідуальну чутливість, надійність, економічність і резервну потужність стереотипних субклітинних механізмів протидії цитоагресивним чинникам (Резніков О.Г., 1996; Ткачук С.С., 2000). Особливу роль у протидії цитоагресивним чинникам виконують природні захисні сили, до яких належить функціонування локальної стрес-лімітуючої системи (ЛСЛС). Багатокомпонентна ЛСЛС: NO/NOS (Furchgott R.F., 1986; Ignarro L.J., 1987), ПГ/ЦОГ (Vane J.R., 1971; Robert A., 1979-1985), антиоксидантна (Остапченко Л.І., 1998–2006; Ohta Y., 2003), аденозинергічна (Brzozowski T., 2000-2006), білків теплового шоку (Lindquist, S.L., 1996-2007; . 2006) системи є природним засобом мультимодальної дії, що забезпечує стійкість клітин і відновлення їхніх фізіологічних функцій після припинення пошкоджувального впливу та здатна індукувати захисні протекторні дії, володіє властивістю до активування у процесі адаптації, а її екзогенні метаболіти чи їх аналоги підвищують стійкість до стресу (Меерсон Ф.З., 1989; Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., 1999). Саме ці обставини стали вагомим поштовхом для розробки концепції участі ЛСЛС у механізмах цитопротекції СОС, СОШ у взаємодії з механізмами біорегуляції, як актуальної і перспективної проблеми фізіології травлення та гастроентерології, оскільки встановлення за її складовими критеріїв функціональної неспроможності епітеліального бар’єра проксимального відділу травної системи розширить сучасні уявлення про молекулярно-клітинні механізми формування ендогенної резистентності до цитоагресивного впливу, сприятиме розробці профілактичних заходів і методів ранньої діагностики КАХ. Проблема має тісний зв’язок з практичною гастроентерологією, оскільки з’ясування в експериментальних умовах особливостей цілеспрямованого ефекторного впливу ЛСЛС на механізми цитопротекції та біорегуляції стравоходу й шлунка, а також на функціонально пов’язані органи за умов виснаження функціональних резервів ЛСЛС поглибить знання про патогенетичні механізми КАХ, що стало б передумовою створення нових безпечних езофагогастропротекторних засобів противиразкової дії (Dorababu M. et al., 2004; . et al., 2005; . et al., 2005; . et al., 2005) та аргументувало б їх подальше вивчення з метою застосування у лікувальній практиці (Ayada K. еt al., 2003; Gower W.R. et al., 2003).

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана відповідно до плану наукових досліджень Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького (ЛНМУ) і є фрагментом наукових тем кафедри нормальної фізіології: „Дослідження особливостей функціонально-метаболічних резервів секреторних органів травного тракту та встановлення критеріїв їхньої оцінки за умов впливу екзо- та ендоекологічних факторів” (2000 – 2002 рр., № державної реєстрації 0100U002258); ”Оцінка адаптаційних можливостей функціонально-метаболічних систем організму з метою покращення діагностики ранніх донозологічних станів та підвищення ефективності їх профілактики та корекції” (2003 – 2005 рр., № державної реєстрації 0103U002369 ІН 25.01.0001.03); „Дослідження критеріїв оцінки стану функціонально-метаболічних систем організму з метою виявлення їх адаптаційно-компенсаторних можливостей при зміні ендо- і екзоекологічних умов середовища” (2006 – 2010 рр., № державної реєстрації 0106U012661, ІН 25.01.0001.06), затверджена на засіданні Вченої ради ЛНМУ, протокол № 4-ВР від 28 травня 2003 року.

Мета дослідження – вивчення ролі ЛСЛС у механізмах цитопротекції СОС і СОШ за умов моделювання ульцерогенезу та з’ясування особливостей її активності, пошук нових езофагогастропротекторних засобів, механізм дії яких ґрунтується на активуванні ЛСЛС.

Задачі досліджень:

1. Вивчити органоспецифічну активність ЛСЛС у цитопротекторних механізмах слизової оболонки проксимального відділу травної системи у щурів за умов моделювання уражень різного генезису.

2. Обґрунтувати нові експериментальні моделі геморагічно-деструктивних пошкоджень стравоходу кислотного та алкалічного типів, які б за структурно-функціональними ознаками відповідали клінічним проявам рефлюкс-езофагіту (РЕ), та провести порівняння з іншими експериментальними моделями ураження СОС.

3. Встановити фізіологічні механізми езофагопротекції за діапазоном кількісних й якісних змін параметрів ЛСЛС: локального кровоплину стравоходу (ЛКС), структурно-функціональних еквівалентів резистентності епітеліального бар’єра, цитокінового профілю у базальних умовах, за моделювання РЕ без/з блокуванням активності систем NO/NOсинтази (NOS) і ПГ/циклооксигенази (ЦОГ) і виснаження ресурсів складових природної опірності: передепітеліальної – за сіалоаденоектомії (САЕ) та післяепітеліальної – за фармакологічного виключення іннервації капсаїцином (капсаїцинової денервації, КД).

4. Охарактеризувати зміни ЛСЛС під впливом дисфункції ендотелію, порушення метаболізму арахідонової кислоти, оксидативного стресу за умов моделювання виразкоутворення СОШ топічного (етанолового), нетопічного (стресового) типу, функціональної неспроможності TRPV1-експресованих аферентних капсаїцин-чутливих нервів (КЧН) і екзогенної корекції засобами, що є активаторами компонентів ЛСЛС.

5. Дослідити взаємозв’язок між активністю ЛСЛС і ступенем деструкції СОС, СОШ та у формуванні поєднаних деструктивних уражень у функціонально пов’язаних органах: ротова порожнина–стравохід–шлунок; шлунок–дванадцятипала кишка (ДПК)–печінка; визначити критерії ЛСЛС для обмеження структурно-функціональної неспроможності епітеліального бар’єра проксимального відділу травної системи.

6. Провести порівняльний аналіз взаємозалежності між активністю компонентів ЛСЛС і цитохімічними особливостями міжклітинних і клітинно-матриксних ознак епітеліального бар’єра СОС і СОШ на базальному рівні, за умов моделювання впливу різних пошкоджувальних чинників і корекції цитопротекторними засобами.

7. Обґрунтувати за механізмами дії ЛСЛС розробку нових цитопротекторних засобів, їх ефективність і можливість застосування в лікуванні та профілактиці КАХ.

Об’єкт досліджень: механізми цитопротекції СОС і СОШ за умов впливу різних пошкоджувальних чинників, маркери перебігу, засоби корекції геморагічно-деструктивних порушень проксимального відділу травної системи.

Предмет досліджень: роль компонентів ЛСЛС у характеристиці та регулюванні захисних механізмів структурно-функціональної трансформації слизової оболонки проксимального відділу травної системи за умов цитоагресивного впливу, їх участь у підвищенні резистентності епітеліального бар’єра стравоходу, шлунка, а також у формуванні поєднаних деструктивних уражень органів травлення.

Методи дослідження. Для виконання окресленої проблеми проводили in vivo дослідження впливу активності ЛСЛС СОС і СОШ у нормі, за умов моделювання ураження стравоходу кислотно-пепсиновою або біліарно-трипсиновою сумішшю та стресового й етанолового виразкоутворення в СОШ; порушення інтеграційних взаємовідношень паракринних чинників унаслідок блокади того чи іншого компонента ЛСЛС і виснаження ресурсів природної бар’єрної функції; визначення стану мікроциркуляції за допомогою доплерівської лазерної флоуметрії; кількісно-якісна оцінка геморагічно-деструктивних змін на основі застосування візуально-аналогової шкали (ВАШ) і планіметрії (Erbil Y. et al., 2005; Hayakawa T. et al., 2006). Особливості цитолітичних процесів епітеліального бар’єра визначені напівкількісним гістоморфологічним (Автандилов Г.Г., 1990) і цитохімічним аналізом за допомогою лектинового маркування (Луцик А.Д. и др., 1989; Антонюк В.О., 2005), стан про- та антиоксидантних процесів і кінцеві продукти метаболізму NO – біохімічними та молекулярно-біологічними методами; маркери імуномодуляції – імунологічними методами; цитокіновий профіль – імуноферментним аналізом (ІФА); використано статистичні методи.

Наукова новизна і теоретичне значення одержаних результатів. Отримані у роботі результати та їх інтерпретація мають фундаментальне теоретичне значення, оскільки вирішують наукову проблему про природу механізмів цитопротекції СОС та СОШ, що є одним із ключових питань фізіології травлення. На основі отриманих експериментальних даних сформульована концепція участі багатокомпонентної ЛСЛС у механізмах біорегуляції діяльності проксимального відділу травної системи в фізіологічних умовах та ульцерогенезі. Вперше обґрунтовано механізми функціонування ЛСЛС у стравоході, а також розширено знання про них у шлунку, які пов’язані з формуванням опірності епітеліального бар’єра та підтримкою клітинного гомеостазу, а за їх неспроможності доведено невідворотність формування порушень структурно-функціональної цілісності. Обґрунтовано застосування оригінальних експериментальних моделей індукції уражень СОС, які дають змогу відтворити морфо-функціональні зміни стравоходу, що ревалентні макро- та мікроскопічним ознакам уражень СОС ГЕРХ. Уперше продемонстровано, що у разі КД і САЕ за умов моделювання цитолізу СОС, ураження ендогенної резистентності стравоходу виникають унаслідок виснаження ресурсів природної ЛСЛС. У роботі вперше проведено комплексний аналіз впливу мелатоніну (МТ) на структурно-функціональні характеристики трансформації цитопротекторних механізмів СОС в умовах кислотного та алкалічного ураження шляхом активування ендотелійопосередкованого та простаноїдного компонентів ЛСЛС і модифікації цитокінової відповіді. Вперше показано виразний езофагопротекторний ефект МТ в умовах модифікації активності ЦОГ і блокади ендотеліальних механізмів вазорегулювання та потенційні езофагопротекторні властивості урсодезоксихолевої кислоти (УДХК). Уперше вивчено особливості експресії лектинових рецепторів стравоходу за умов моделювання РЕ різного генезису і проаналізована роль глікокон’югатів у підтримці цілісності епітеліального бар’єра СОС. За результатами порівняльного аналізу уражень СОС і СОШ, викликаних блокадою компонентів ЛСЛС і КД, аргументовано провідну роль NO/NOS і ПГ/ЦОГ систем у механізмах цитопротекції епітеліального бар’єра СОС і СОШ. Досліджено особливості вазотропної, антирадикальної та імунотропної дій МТ і можливість його застосування як гастропротектора. Вперше продемонстровано можливість різних шляхів корекції структурно-геморагічних уражень у СОШ через активування компонентів ЛСЛС рослинними проантоцианідинами (ПА) екстракту зернят грейпфрута (ЕЗГ) і калини, а також ?-3 поліненасичених жирних кислот (ПНЖК) і похідних тіазолотіопірану (новий засіб, створений групою вчених ЛНМУ під керівництвом проф. Б.С. Зіменковського та проф. Р.Б. Лесика), поглиблено знання про характер дії екстракту насіння амаранту (ЕНА) та проведено наукове обґрунтування їх впливу. Вперше виявлено зміну експресії глікокон’югатів СОШ за умов екзогенного активування ЛСЛС (МТ і ПА), що доводить їхню важливість у забезпеченості природної резистентності та структурно-функціональної цілісності епітеліального бар’єру шлунка.

Практичне значення отриманих результатів. Сформульована концепція зміцнення захисних функцій проксимального відділу травної системи за рахунок мобілізації природної ЛСЛС демонструє доцільність появи нового напряму у профілактично-лікувальній тактиці ГЕРХ, що полягає у використанні засобів аналогів ЛСЛС. Отримані результати підтвердили гіпотезу, що цитопротекторні механізми залежать від функціонування ЛСЛС проксимального відділу травної системи, а ендотеліальна дисфункція, ураження епітеліальних клітинних мембран, виснаження показників системи антиоксидантного захисту можуть в перспективі слугувати маркерами ранньої діагностики КАХ. Порушення функціонування слинних залоз слід трактувати як фактор ризику розвитку ГЕРХ, що дозволить виявляти ранні стадії захворювання. Запропоновані нові моделі РЕ, однотипні з ГЕРХ за ознаками структурно-функціонального пошкодження СОС, є репрезентативними для застосування у наукових дослідженнях. Виявлені зміни вмісту інтерлейкіну-1? (ІЛ-1?) і фактора некрозу пухлин-? (ФНП-?) треба розглядати як прогностичні ознаки перебігу ГЕРХ. Враховуючи езофагогастропротекторну дію МТ, УДХК, рослинних ПА, ЕНА, ?-3 ПНЖК і похідних тіазолотіопірану, що ґрунтується на противиразковому впливі, їх доцільно рекомендувати для доклінічного дослідження як засоби комплементарної й альтернативної медицини з метою впровадження у практичну гастроентерологію. Встановлення геморагічно-деструктивних змін за ВАШ, модифікації лектин глікопротеїнової кон’югації у СОС і СОШ допоможе оптимізувати діагностику КАХ.

Результати дисертаційної роботи впроваджено у наукову діяльність і навчальний процес ЛНМУ імені Данила Галицького, НДІ фізіології ім. акад. Петра Богача Київського національного університету ім. Тараса Шевченка, Львівського національного університету ім. Івана Франка, Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського, Буковинського державного медичного університету, використовуються у Львівському обласному діагностичному центрі МОЗ України.

За результатами досліджень отримано деклараційні патенти України на корисну модель: „Застосування екстракту насіння амаранту багряного як гастропротекторного засобу” Пат. № 9192. UA, A61K35/78, № заявки u2005 01374; Заявлено 15.02.2005; Опубл. 15.09.2005, Бюл. № 9; „Застосування екстракту зернят грейпфрута (Citrus paradise) як гастропротекторного засобу” Патент № 10166. UA, A61K35/78, № заявки u2005 01385; Заявлено 15.02.2005; Опубл. 15.11.2005, Бюл. №11; ”9-(4’-флуорофеніл)-3,7-дитіа-5-азатетрацикло [9.2.1.02,10.04,8] тетрадецен-4(8)-ону-6, який виявляє гастропротекторну дію” Пат. № 17828. UA, А61К 31/38; А 61Р 1/00, № заявки u200604181; Заявлено 14.04, Опубл. 16.10.2006. Бюл. №10.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно визначені мета і задачі наукового дослідження, проаналізовано актуальність і ступінь дослідженості тематики роботи, розроблено методичні підходи і дослідницьку програму роботи, опрацьовано моделі, згідно з якими особисто виконані експериментальні дослідження. Автор власноруч здійснила обробку отриманих даних стосовно репрезентативності виявлених в організмі змін, розкритті їх механізмів за допомогою комплексу фізіологічних, морфологічних, біохімічних, імунологічних і молекулярно-біологічних показників. Написання всіх розділів, аналіз і теоретичне узагальнення результатів, визначення наукової новизни, формулювання висновків належать особисто автору. Гістологічні дослідження проведено сумісно з к. мед. н., доцентом кафедри патологічної анатомії О.М. Гаврилюк (зав. – проф. Ю.О. Поспішіль), лектиногістохімічні (ЛГХ) – д. мед. н., професором кафедри гістології, цитології та ембріології А.М. Ященко (зав. – проф. О.Д. Луцик), імунологічні – за допомогою співробітників ЦНДЛ (зав. – д. мед. н., с. н. с. Б.П. Кузьмінов) ЛНМУ. Експериментальний фрагмент роботи, що стосувався дослідження ролі ЛСЛС за умов моделювання деструктивних уражень СОС, СОШ і коригувальної дії МТ, ЕНА і ЕЗГ, імуноферментні, молекулярно-біологічні дослідження здобувач виконала спільно зі співробітниками кафедри фізіології Ягелонського університету, м. Краків, Польща (керівник – проф. В.В. Павлік). У дисертації не використовувались теоретичні ідеї і практичні розробки співавторів опублікованих робіт.

Апробація результатів дисертації. Основні положення та результати роботи були представлені та обговорені на міжнародній конференції „Механизмы функционирования висцеральных систем”, присвяченій 75-річчю від дня народження А.М. Уголєва (14–16 березня 2001р., Санкт-Петербург), конференції „Механізми фізіологічних функцій в експерименті та клініці”, присвяченій 100-річчю від дня народження заслуженого діяча науки України проф. Я.П. Склярова (4–5 жовтня 2001 р., Львів), 7-му Конгресі Європейської асоціації клінічних фармакологів і терапевтів (25-29 травня 2005 р., Познань, Польща), міжнародній конференції „Neuro-humoral and cellular regulatory mechanism of digestion processes” (5–7 жовтня 2005 р., Київ), 44-му щорічному зібранні канадської асоціації гастроентерологів та гастроентерологічній школі (Canadian Digestive Disease Week, 24 – 27 лютого 2006 р., Банфф, Канада), XVII з’їзді Українського фізіологічного товариства з міжнародною участю (18–20 травня 2006 р., Чернівці), всеукраїнській науково-практичній конференції „Проблеми сучасної морфології” (18–20 травня 2006 р., Полтава), XХIII конгресі Польського фізіологічного товариства „Physiology without limits” (14–16 вересня 2006 р., Варшава, Польща), ІV Національному конгресі АГЕТ України (21–23 вересня 2006 р., Сімферополь), науково-практичній конференції з міжнародною участю „Хронобіологія і хрономедицина: теоретичні та клінічні перспективи” (12 – 13 жовтня 2006 р., Чернівці), міжнародній науковій конференції, приуроченій до 60-ліття новоствореної кафедри фізіології людини і тварин Львівського національного університету імені Івана Франка ”Механізми функціонування фізіологічних систем” (8 – 11 листопада 2006 р., м. Львів).

Публікації. Положення дисертації викладено у 43 публікаціях автора, з них 28 статей (в тому числі 24 – у провідних вітчизняних фахових виданнях, 4 – в іноземних часописах), 3 патенти, 12 робіт у збірниках матеріалів вітчизняних і міжнародних конференцій, конгресів і з’їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, розділу, в якому описані матеріали, об’єкти та методи досліджень, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел, що містить 535 літературних джерел (200 вітчизняних і країн СНД та 335 іноземних авторів), чотирьох додатків. Роботу викладено на 312 сторінках, з яких основний текст займає 240 сторінок, та проілюстровано 77 рисунками і 18 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи досліджень. Дослідження проведені в експериментах in vivo на 708 шурах-самцях згідно з правилами „належної лабораторної практики” (GLP) з дотриманням загальних етичних принципів проведення експериментів на тваринах, ухвалених І національним конгресом з біоетики (Київ, 2000) та з урахуванням стандартів комітету з біоетики Ягелонського університету відповідно до міжнародних принципів “Європейської конвенції про захист хребетних тварин, яких використовують для експериментів і в інших наукових цілях” (Страсбург, 1986) шляхом виявлення функціональних, біохімічних, імунологічних, морфологічних і молекулярно-біологічних змін за умов моделювання РЕ та виразкоутворення у СОШ. Прилади, що використовувалися в експериментах, пройшли метрологічний контроль.

Для отримання достовірних даних у дослідженнях тварин поділили на групи: інтактних, контрольної групи, тих, що піддаються впливу ульцерогенного фактора і плацебо (фізіологічний розчин) чи одночасної корекції засобом, що є потенційним активатором ЛСЛС. Особливості стресреактивності визначали за поведінковими реакціями тварин у тесті „відкрите поле”, виокремлюючи високорезистентних (ВСР) та низькорезистентних (НСР).

Для відтворення уражень СОС використовували оригінальні моделі індукції РЕ кислотного та алкалічного типів за допомогою внутрішньостравохідного перфузування кислотно-пепсинової суміші, що складалась з 0,25 N HCl з пепсином (0,1 мг/мл перфузату) та жовчі (1 мл), або біліарно-трипсинової, що містила дезоксихолеву кислоту (ДХК, 10 мг/мл розчину), трипсин (1 мл), фосфатний буфер та жовч (1 мл). Для виразкоутворення СОШ застосовували широковживані моделі: стресового ульцерогенезу за Takagi K.Y. et al., 1964 та етанолові ураження стандартним способом (Стефанов О.В., 2001).

У дослідженнях для моделювання активності ЛСЛС використовували МТ (віта-мелатонін, „Київський вітамінний завод”, Україна, і мелатонін, Sigma Chemical Co., США) у дозі 20 мг/кг (Reiter R.J. et al., 2003; Jaworek J. et al., 2005), в/о, ?-3 ПНЖК (епадол, „Київський вітамін-ний завод”, Україна) у дозі 30 мг/кг (Шиш А.М. і співавт., 2004), в/ш протягом 8 тижнів, УДХК (урсохол, „Дарниця”, Україна) в дозі 5 мк/кг (Lapenna D. et al., 2002), в/ш, засоби рослинного походження в дозозалежний спосіб для встановлення ефективної дози: ЕНА (НВЦ „Даніка”, Україна), виготовлений шляхом екстрагування з амаранту багряного (Amarantus hypochondricus), в дозах 0, 125; 0,25; 0,5 мл/100 г маси тіла, в/ш; ЕЗГ Citrus paradise („Citro-kvapky”, HERB-PHARMA, Словаччина) – в дозах 8; 16; 32; 64 мг/кг, в/ш; екстракт калини (Viburnum opulus) – в дозах 25; 50; 75 мг/кг і новостворений засіб 9-(4’-флуорофеніл)-3,7-дитіа-5-азатетрацикло[9.2.1.02,10.04,8] тетрадецен-4 (8)-ону-6), лабораторний шифр Les-2104, синтез якого здійснено на кафедрі органічної хімії та фармакосинтезу ЛНМУ (зав. – проф. Б.С. Зіменковський), – у дозі 20 мг/кг (Лесик Р.Б., 2004-2006), в/ш, протягом 7 днів.

Для вивчення NO/NOS системи використовували моделювання генерації і/або активності NO за допомогою інгібітору – L-NNA (від англ. – NG-nitro-L-arginine) у дозі 20 мг/кг (Konturek P.C., et al., 2004-2006), в/о, а також комбінували введення L-NNA у поєднанні з донором NO/NOS системи L-аргініном у дозі 200 мг/кг (Stern J. E., 2004), в/ш. Для модуляції активності системи ПГ/ЦОГ вживали, за рекомендаціями Cho C.-H., Wang J.-Y., 2002, неселективний та селективний блокатори ЦОГ: індометацин (ІНДО) в дозі 5 мг/кг, в/о та рофекоксиб (РОФ) у дозі 10 мг/кг, в/о, а також синтетичний аналог ПГЕ2 – 16,62-діметил-ПГЕ2 5 мкг/кг (Terano A., 1984), в/о. Для дослідження ролі TRPV1-експресованих аферентних нервів у механізмах пошкодження СОС і СОШ застосовували тварин з КД, яким попередньо, за 2 тижні до індукування ураження, вводили п/ш капсаїцин в дозі 125 мг/кг (Brzozowski., 2004). Для встановлення функціональної ролі біологічно активних регуляторів (БАР) слини у механізмам цитопротекції СОС використовували тварин, яким попередньо проводили білатеральну САЕ підщелепних і привушних залоз звиклим способом, а також застосовували додаткове введення епідермального фактора росту (EGF) в дозі 20 мкг/кг (Konturek S.J., 1991), в/о, на тлі САЕ. Усі препарати були виробництва „Sigma Chemical Co.”, США. Для визначення функціонального стану локального кровоплину стравоходу (ЛКС) і шлунка (ШКП) застосовували лазерну доплерівську флоуметрію („Biotechnical Science”, Model RGF-2, Японія). Для оцінювання макроскопічних уражень стравоходу використовували рекомендації Всесвітньої організації ендоскопії травної системи, які становлять основу клінічного ендоскопічного діагностування ГЕРХ. Для інформативності вираження кількісно-якісних проявів деструкції СОС використовували макроскопічний індекс уражень стравоходу (МІС) від 0 до 3 балів: 0 – без змін; 1 – гіперемія, поодинокі ерозії; 2 – множинні ерозії з петехіями, наявність невеликих виразок; 3 – виразка значних розмірів або декілька виразок, некротичні зміни, перфорація (Li. et al., 2005). Площу уражень СОШ визначали методом планіметрії. Для гістологічних досліджень матеріал фіксували в 10 % забуференому розчині формаліну. Подальше проведення матеріалу виконували за загальноприйнятою методикою, фарбування гематоксиліном та еозином (ГЕ). Вивчення препаратів проведено за допомогою мікроскопа Olympus BX 41 з цифровою камерою Olympus С4040Z із програмним забезпеченням Olympus DP-Soft. Для аналізу гістоморфологічних змін СОС застосовували чотирибальну ВАШ з урахуванням стану епітеліального шару (0 – без змін; 1– часткова десквамація рогового шару (РШ); 2 – ерозія; 3 – виразка), регенеративних змін (0 – без змін; 1 – базальна гіперплазія; 2 – мітози, акантоз; 3 – утворення акантотичних тяжів), інтенсивності лейкоцитарної інфільтрації (0 – відсутня, 1 – помірна, 2 – середня, 3 – виражена). Альтеративні зміни (АЗ) СОШ оцінювали так: 0 – норма; 1 – дистрофічні зміни та моноцелюлярний некроз поверхневого епітелію; 2 – вогнищеві некрози та невеликі поверхневі ділянки десквамації епітелію; 3 – виразки. Стромально-судинні зміни (ССЗ): 0 – норма; 1 – набряк, стази; 2 – лейкостази, периваскулярні поодинокі лейкоцити; 3 – периваскулярні крововиливи, лейкоцитарні інфільтрати, гіалінові мікротромби. Цитотопографію рецепторів лектинів вивчено набором лектинів (НПК „Лектинотест”, ЛНМУ) різної вуглеводної специфічності: лектин арахісу, Аrachis hypogaea, PNA (специфічний до ?DGal-Н>3DGalNAcDGal); лектин виноградного слимака, Helix pomatia, НРА (специфічний до ?NAcDGal); лектин бузини чорної, Sambucus nigra, SNA (специфічний до Neu5Ac/2 6Gal); лектин зародків пшениці, Triticum wulgare, WGA (специфічний до NAcDGlc>NAc Neu); їх відеоаналіз здійснювали ліцензованою системою AVerMedia.

Стан про- та антиоксидантної системи оцінювали за вмістом малонового діальдегіду (МДА) у плазмі крові за методикою Р.А. Тимурбулатова, Е.С. Селезнева, 1981, експресію супероксиддисмутази (СОД) у гомогенатах СОШ за полімеразною ланцюговою реакцією (ПЛР) з використанням набору СОД 525 (виробництва ОXIS International, Inc., США), активність у плазмі крові СОД – за методом В.А. Костюк (1990), каталази (КАТ) – за методом М.А. Королюк (1988), глутатіонпероксидази (ГПО) – за методом В.М. Моіна (1986), вміст кінцевих метаболітів NO – нітрит аніона (NO2-) за методом Green L.C. (1982), ліпопротеїнів низької щільності (?-ЛП) – методом Бурштейна, Самай (Горячковський А.М., 1994), лужної фосфатази (ЛФ) – турбідиметричним методом по гідролізу фенілфосфату (Чернушенко Е.Ф., Колосова Л.С., 1978). Для встановлення напруженості адаптивно-захисних змін організму розраховували інтегральний гематологічний прогностичний показник (ІГПП) за методикою О.З. Масної-Чалої, 2005. Стан клітинної ланки імунітету оцінювали за вмістом Т- і В-лімфоцитів тестом комбінованого розеткоутворення за методом Mendes et al., 1974, а також за вмістом 0 (NK)-лімфоцитів, Т-активних лімфоцитів – за Beanko et al., 1971 та Kerman et al., 1976, Т-теофілінрезистентних клітин (хелперів) i Т-теофілінчутливих клітин (супресорів) – за Limatibul et al., 1978. Визначення ІЛ-1? і ФНП-? проводили за допомогою ІФА, використовуючи набір „BioSourse Cytoscreen” згідно з інструкцією виробника („BioSource International”, США). Статистична обробка результатів виконувалася за допомогою пакета програм “STATISTICA FOR WINDOWS 5.0” (Statsoft, USA). Розподіл параметричних показників у вибірках був нормальним (гаусівським) – перевірка за W критерієм Шапіро–Вілка (Shapiro–Wilk’s W-test). У зв’язку з наявністю більш ніж двох груп дослідження порівняння параметричних характеристик здійснювали шляхом апостеріорного аналізу (блок ANOVA – дисперсійний аналіз) з попарним порівнянням середніх значень з допомогою критерію Ньюмен–Кейлса (Neuman–Keuls) (Боровиков В.П., 2001; Гланц С., 1999).

Результати досліджень та їх обговорення. У наших дослідженнях вивчено вплив компонентів ЛСЛС на ефекторні елементи СОС і СОШ, що забезпечують можливість оптимізації цитопротекторних механізмів відповідно до змін внутрішніх і зовнішніх умов. Для експериментального моделювання порушень природних захисних механізмів СОС і СОШ на різних рівнях біорегуляції (особливо міжклітинних і міжтканинних взаємозв'язків) використовували спотворення стереотипу динамічної відповіді на пошкодження шляхом блокади тієї чи іншої складової ЛСЛС, що зумовлювало функціональну неспроможність епітеліального бар’єра проксимального відділу органів травлення, віддзеркалюючи функціональне напруження та недостатність фізіологічних механізмів цитопротекції.

Роль ЛСЛС за умов моделювання деструктивних уражень СОС та коригувальної дії цитопротекторів. Перфузія кислотно-пепсинового розчину викликала виразні макроскопічні ушкодження на СОС, які характеризувались утворенням геморагічних ерозій та виразкових уражень на тлі масивного набряку й гіперемії CОС, тоді як особливістю езофагодеструктивного ефекту трипсину та ДХК – дегідратація та коагуляційний некроз CОС (рис. 1), що стали результатом значного інгібування біосинтезу ПГ та погіршення локального кровопостачання.

а б в

Рис. 1. Макроскопічні зміни СОС під час внутрішньостравохідного перфузування: кислотного розчину (а, б); алкалічного розчину (в).

Дослідження стану слизової оболонки, мікроциркуляції стравоходу та цитокінового профілю проведено із плацебо та МТ на тлі моделювання РЕ – кислотного та алкалічного типів уражень СОС (рис.2).

Рис. 2. Зміни СОС і ЛКС за умов моделювання РЕ без/з корекцією МТ (*– p<0,05 до контролю для ЛКС; + – p<0,05 до контролю для МІС); M±m, n=8–10.

Встановлено виразнішу ангіотоксичну дію кислотно-пепсинового пошкодження порівняно з дією трипсину та ДХК. У тварин, що отримували МТ, виявлено достовірне зменшення площі уражень СОС: МІС зменшився на 48 % у випадку моделювання кислотно-пепсинового та на 31 % – у випадку трипсино-біліарного пошкодження щодо відповідних показників з плацебо (рис.2).

Односпрямовані гіперемічні зміни ЛКС, індуковані МТ, занотовано в кислотній (збільшення на 11 %) і алкалічній (на 27 %) моделях РЕ, відповідно до аналогічних значень з плацебо.

При аналізі гістологічних змін стравоходу тварин за ВАШ, яким моделювали ураження і не застосовували корекцію МТ, встановлено АЗ паренхіматозних елементів і ССЗ порівняно з тваринами контрольної групи (рис.3).

Рис. 3. Порівняльний аналіз змін епітеліального шару (ліворуч) і ступеня лейкоцитарної інфільтрації (праворуч) СОС за ВАШ в умовах кислотного (2 і 3 групи) і алкалічного (4 і 5 групи) РЕ без/з корекцією МТ (3 і 5 групи).

У поверхневому шарі зареєстровано паракератоз, вогнищеву або дифузну десквамацію мас кератогіаліну; в епітеліальних елементах виражені АЗ, акантолізис з відшаруванням поверхневих частин епітеліального шару. Виявлено також множинні фокальні некрози, ерозії, виразки. За коригувального впливу МТ для епітеліального шару СОС характерні ознаки паракератозу, локального витончення РШ, вакуолізація епітеліоцитів, водночас ССЗ менш інтенсивні. У прилеглій до СОС сполучній тканині простежено периваскулярні крововиливи та різного ступеня лейкоцитарні інфільтрати. Виразне зменшення лейкоцитарної інфільтрації у групах тварин, які отримували МТ можна пояснити імуномоделювальними і протизапальними властивостями МТ, що відомо з результатів досліджень О.В. Коркушко (2003) та Э.Б. Арушанян (2006).

При вивченні динаміки вмісту ІЛ-1? та ФНП? встановлено, що у тварин контрольної групи концентрація ІЛ-1? у сироватці крові становила 24,31±0,54 пг/мл, ФНП? – 1,04±0,21 пг/мл. Моделювання кислотно-пепсинового РЕ призвело до достовірного збільшення ІЛ-1? до 55,35±11,53 пг/мл, ФНП? – 6,08±0,94 пг/мл. При введенні МТ простежено зменшення вмісту ІЛ-1? на 42,2 %, а концентрації ФНП? – на 23,4 % порівняно з даними групи, що отримувала плацебо (р<0,05). За умов алкалічного РЕ встановлено збільшення вмісту ІЛ-1? удвічі і ФНП? утричі порівняно з контролем (p<0,05), а введення МТ давало таку ж односпрямовану тенденцію, як у моделі кислотного ураження: зменшення ІЛ-1? на 11,4 % (p<0,05) і ФНП? – на 54 % порівняно з тваринами, що не отримували корекції.

Корекція цитолітичного впливу, індукованого кислотно-пепсиновим та біліарно-трипсиновим перфузуванням, за рахунок стимулювання локального кровопостачання та зменшення геморагічно-деструктивних проявів СОС з урахуванням встановленого феномена протизапальної дії за динамікою змін вмісту ІЛ-1? і ФНП?, та наукові дані (Кононов А.В., 2006; Орловський О.В., 2006; Sjoblom M., Felmstrom G., 2003; Reiter R.J. et al., 2003) про те, що молекулярні механізми цитопротекції тісно пов’язані з функціональним станом органів (повноцінність слизоутворення, інтенсивність оновлення клітинного пулу, васкуляризація, які забезпечують потрапляння ПГ, EGF, TGF-? до регенеруючих клітин, і сигнальних молекул, що продукуються стовбуровими клітинами і міофібрилами), підтверджують активувальний вплив МТ на NO/NOS і ПГ/ЦОГ компоненти ЛСЛС стравоходу.

Для перевірки участі NO/NOS і ПГ/ЦОГ компонентів ЛСЛС у формуванні езофагопротекції проведено дослідження в умовах модифікації їхньої активності та впливу МТ на опірність епітеліального бар’єра під час цитолізу, насамперед, кислого типу, що відповідає природній шлунковій секреції (рис. 4). Застосування L-NNA достовірно збільшувало площу ураження СОС (МІС збільшився удвічі), що проявлялось масивними геморагічними змінами та виразним зменшенням ЛКС – на 19,7 % (p<0,05) стосовно тварин, яким вводили плацебо.

Рис 4. Зміни ЛКС і МІС за умов моделювання кислотного РЕ та модифікування активності NO/NOS і ПГ/ЦОГ компонентів ЛСЛС без/з корекцією МТ (*– p<0,05 до контролю для ЛКС; + – p<0,05 до контролю для МІС); M±m, n=8–10.

У випадку спотворення синтезу ПГ екзогенною дією неселективного блокатора ЦОГ ІНДО простежено появу некротичних змін на СОС з перфораціями та достовірне зменшення ЛКС (на 23,2 %) щодо показників контролю. Введення МТ спричиняло виразний цитопротекторний та вазодилятаторний ефекти: достовірне збільшення показників ЛКС на 10-15 % порівняно з тваринами, що не отримували корекції. За умов поєднаного впливу МТ і L-NNA встановлено зменшення ознак деструкції та езофагальну гіперемію порівняно з результатами тварин, що отримували плацебо. На підставі аналізу типових гістологічних езофагодеструктивних змін за ВАШ, виявлено, що екзогенний вплив МТ сприяв регресу значних проявів цитоагресії: послабилися ознаки епітеліальних АЗ, поліпшилася мікроциркуляція та зменшився ступінь лейкоцитарної інфільтрації СОС. Вплив МТ сприяв репаративній регенерації навіть за умов моделювання зміни активності NO/NOS і ПГ/ЦОГ компонентів СОС.

Аналіз динаміки ІЛ-1? та ФНП? показав, що корекція кислотно-пепсинового впливу та блокади NO/NOS системи призвела до зменшення ІЛ-1? на 43,3 % (p<0,05), ФНП? – на 65,5 %. При гальмуванні активності ПГ/ЦОГ системи встановлено достовірне збільшення ІЛ-1? до 53,98±3,67 пг/мл, ФНП? – 9,47±0,70 пг/мл, тоді як МТ спричиняв зменшення ІЛ-1? 52,91±3,34 пг/мл, ФНП? – 9,15±0,88 пг/мл. Наш висновок про те, що один із механізмів езофаго-протекторної дії МТ обумовлений його властивостями імуномодулятора синтезу прозапальних цитокінів, підтверджуються даними . (2006), який повідомляє про участь ІЛ-1? і ФНП-? в ініціації дисфункцій стравоходу.

Отже, нами експериментально встановлено провідну роль компонентів ЛСЛС NO/NOS та ПГ/ЦОГ у формуванні природної резистентності СОС, про що повідомляють також Hayakawa T., et al. (2006). Можливість моделювання якості, тривалості цитоагресивного навантаження сприяє стандартизації отримання геморагічно-деструктивних уражень СОС, що максимально наближені до клінічних морфо-функціональних ознак РЕ ГЕРХ і є виправданою моделлю для вивчення резистентності епітеліального бар’єру СОС in vivo. Застосування спеціально розробленої ВАШ та вміст ІЛ-1? і ФНП? можуть бути маркерами інтенсивності геморагічно-деструктивних уражень стравоходу, а раціональне активування ЛСЛС сприяє стабілізації мікроцирку-ляції стравоходу, а отже, трофіки тканин, зменшенню стромальних геморагічних проявів, лейкоцитарної інфільтрації власної пластинки, інтенсифікації регенерації та зменшенню вмісту прозапальних цитокінів.

Для встановлення особливостей впливу КЧН, які, утворюючи щільні сплетення волокон навколо судин підслизової основи, вивільняють ряд потужних нейропептидів, серед яких важливе місце посідає кальцитонін генспоріднений пептид (СGRP) і БАР слини, проведені дослідження при різних варіантах модуляції про- та антиульцерогенних чинників. Показано, що спричинена КД дезінтеграція складних молекулярних механізмів природних захисних реакцій викликала підвищену уразливість епітеліального бар’єра до впливу йонів водню та пепсину, що продемонстровано збільшенням МІС на
50 %. Ушкодження СОС за індукції КД за природою нейродистрофічні, а за деструктивними характеристиками належать до типу некротичних. Зауважено, що зміни регіонального кровопостачання СОС були односпрямованими з морфологічними трансформаціями епітеліального шару (рис. 5).

На основі даних Ward S.M. (2003) про поширеність TRPV1-рецепторів у стравоході змодельоване пригнічення синтезу CGRP призвело до зменшення ЛКС на 30 % (p<0,05), що зумовлює порушення обмінно-трофічних процесів і кровопостачання, а отже, погіршення локального забезпечення важливими матриксними факторами, які детермінують виразкозагоєння (Dickman R., 2006; Wada N., 2006).

Рис 5. Зміни ЛКС і МІС за умов моделювання кислотного РЕ та модифікування природної опірності СОС під час КД і САЕ (* – p<0,05 до контролю для ЛКС; + – p<0,05 до контролю для МІС); M±m, n=8–10.

У тварин з САЕ констатовано чіткі ознаки цитоагресії, що виявились у зростанні МІС до трибальних пошкоджень і зменшенні ЛКС на 34 % стосовно контролю, тоді як корекція EGF поліпшувала кровопостачання СОС і зменшувала деструктивні прояви порівняно з групою, яка не отримувала EGF. Аналіз мікроскопічних уражень СОС виявив спільні характерні зміни у тварин з КД і САЕ, що охарактеризовано як множинні геморагічні, виразково-ерозивні ураження. У прилеглих до епітеліального шару структурах виявлено крововиливи і мікротромби у судинах мікроциркуляторного русла. Екзогенна дія EGF зменшувала ознаки ерозивно-виразкового пошкодження, що пояснюється структурною реорганізацією мембран епітеліального клітин. Аналіз цитокінового профілю показав, що КД спричиняє достовірне збільшення вмісту ІЛ-1? – 71,96±4,54 пг/мл, та зменшення ФНП-? – 0,46±0,16 пг/мл порівняно з показниками тварин з інтактними КЧН. Завчасно проведена CАЕ призвела до збільшення ІЛ-1? 56,00±2,95 пг/мл і ФНП-? 6,11±1,79 пг/мл (p<0,05), що суттєво не відрізнялись від показників групи зі збереженими слинними залозами (55,35±11,5 і 34,66±1,63 пг/мл, відповідно). Екзогенна дія EGF у тварин з CАЕ під час моделювання уражень СОС спричинила достовірне зменшення ІЛ-1? до 47,65±3,47 пг/мл, ФНП-? – 2,98±0,37 пг/мл (удвічі менше, ніж у щурів з САЕ), що потрактовано як протизапальний ефект. Отримані результати засвідчують важливу