ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ
ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
Білявська Людмила Олексіївна
УДК 574:579.87.71:632.951
БіоСинтез антипаразитарних І фітостимулюючих речовин Streptomyces avermitilis УКМ Ас-2179
03.00.07 - мікробіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
КИЇВ-2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у відділі загальної та ґрунтової мікробіології Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної Академії Наук України
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор
Іутинська Галина Олександрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу загальної та ґрунтової мікробіології
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,
Пирог Тетяна Павлівна, Національний університет харчових технологій, завідувач кафедри біотехнології мікробного синтезу
доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Надкернична Олена Володимирівна, Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН України, завідувач лабораторії біологічного азоту
.
Захист відбудеться “19” березня 2008 р. о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680, м. Київ, ДСП, вул. Заболотного, 154
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680, м. Київ, ДСП, вул. Заболотного, 154
Автореферат розісланий “ 15 “ лютого 2008 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук, с.н.с. Пуріш Л. М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. У теперішній час все більше уваги приділяється вивченню екологічної ролі та біосинтетичної активності ґрунтових мікроорганізмів. Підсилення мікробіологічної активності в ґрунті здавна використовують у сільському господарстві для покращання живлення, оптимізації фітогормонального статусу рослин, захисту їх від хвороб і шкідників.
Стрептоміцети – широко розповсюджена група ґрунтових мікроорганізмів, які синтезують ряд біологічно активних речовин, відіграють суттєву роль у трансформації органічних сполук, підтримуванні потенційної і формуванні ефективної родючості ґрунту. Створені на основі стрептоміцетів препарати є перспективною складовою інтегрованої системи захисту сільськогосподарських культур, а в ряді випадків – альтернативою хімічним засобам [Дятлова К.Д., 2001; Иутинская Г.А., 2007].
В останні десятиліття все більшого поширення набувають препарати, на основі макролідного антибіотика авермектину, що продукується ґрунтовим стрептоміцетом Streptomyces avermitilis Burg R.W. et al., 1979. Антибіотик виявляє інсектицидну, нематоцидну, акарицидну та фунгіцидну властивості, характеризується малими нормами витрат, порівняно швидко розкладається у ґрунті і є перспективним для широкого використання. На основі авермектину створено низку препаратів, які застосовують як біопестициди для регулювання чисельності екзо- та ендопаразитів рослин. Відсутність негативного впливу на організми теплокровних тварин, гідробіонтів і бджіл надає авермектину значну перевагу перед хімічними засобами захисту рослин та тварин [Ісаєнко В.М., 2004; Ісаєнко В.М., Патика В.П., 2007; Ikeda T., 2003]. Переважна більшість відомостей щодо S. avermitilis стосується його антипаразитарних властивостей, дані щодо біосинтезу цим продуцентом інших біологічно активних речовин є дуже обмеженими.
Важливим завданням виробництва мікробних препаратів є підвищення біосинтетичної активності продуцентів. Для його вирішення застосовують індукований мутагенез, оптимізацію живильного середовища та внесення у нього попередників біосинтезу певної речовини. Для авермектину такими сполуками є деякі амінокислоти та солі органічних кислот. Проте їхня дія на кожний штам-продуцент є специфічною і потребує додаткових досліджень.
Співробітниками відділу загальної та ґрунтової мікробіології Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (ІМВ НАНУ) у 1999 році було виділено з грунту два штами S. avermitilis Пат. 34390 А, 2001. У результаті селекції шляхом спонтанної мінливості та індукованого мутагенезу ультрафіолетовими променями отримано штам S. avermitilis УКМ Ас-2172 із здатністю утворювати до 120 мкг авермектину в 1 мл етанольного екстракту Петрук Т.В., 2005. Авермектинвмісний комплекс, який синтезує цей штам, отримав назву “аверком”. У нинішній час актуальними залишаються питання вивчення шляхів підвищення продуктивності штаму S. avermitilis, дослідження складу та біологічної активності синтезованого ним авермектинвмісного комплексу і створення на його основі поліфункціональних мікробних препаратів.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з напрямком науково-дослідних робіт Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України у межах бюджетних тематик відділу загальної та ґрунтової мікробіології “Еколого-функціональні особливості мікробних угруповань ґрунту в умовах сучасного розвитку агроекосистем” (номер державної реєстрації 0101U003058/2.3.12.63) та “Дослідити біосинтетичну активність ґрунтових мікроорганізмів з метою їх використання у біологічному землеробстві” (номер державної реєстрації 0106U00524).
Мета і завдання досліджень. Мета роботи полягала у підвищенні біосинтетичної здатності Streptomyces avermitilis УКМ Ас-2172 селекцією, вивченні шляхів регулювання біосинтезу антипаразитарного антибіотику авермектину, дослідженні складу і біологічної активності авермектинвмісного комплексу.
Для реалізації мети дослідження вирішували наступні завдання:
- провести селекцію штаму S. avermitilis УКМ Ас-2172 з використанням хімічних мутагенів N-метил-N?-нітро-N-нітрозогуанідину та рифампіцину для отримання високопродуктивних варіантів;
- дослідити можливі шляхи інтенсифікації синтезу авермектину високопродуктивним варіантом;
- вивчити синтез біологічно активних речовин селекціонованим високопродуктивним варіантом S. avermitilis;
- дослідити нематоцидну дію авермектинового комплексу (аверком), синтезованого високопродуктивним варіантом S. avermitilis;
- визначити дію S. avermitilis та аверкому на тест-культури мікроорганізмів і мікробні угруповання ґрунту;
- вивчити дію аверкому і мікробних композиційних препаратів на нематоди і рослини;
- досліди можливості застосування аверкому та мікробних комплексних препаратів на його основі у рослинництві.
Об’єктами дослідження були: Streptomyces avermitilis УКМ Ас-2172 (№ 288), його продуктивні варіанти 1130 (УКМ Ас-2179) та Rif r 8, тест-культури мікроорганізмів, мікробні угруповання чорноземного ґрунту; нематоди виду Meloidogyne incognitа, аборигенні популяції фітонематод; насіння і рослини сільськогосподарських культур: редису, пшениці озимої та ярої, огірка.
Предметом дослідження була здатність селекціонованого штаму стрептоміцета продукувати авермектиновий комплекс за дії деяких попередників, синтез продуцентом біологічно активних речовин; дія аверкому на мікроорганізми, нематоди і рослини.
Методи дослідження. Для виконання поставлених завдань використовували мікробіологічні, біохімічні, фізіологічні, хіміко-аналітичні методи дослідження у поєднанні з класичними методами ґрунтової мікробіології, нематології та рослинництва.
Наукова новизна одержаних результатів.
- селекціоновано новий високопродуктивний штам S. avermitilis УКМ Ас-2179 методом хімічного мутагенезу N-метил-N?-нітро-N-нітрозогуанідином;
- показано, що максимальне продукування авермектину штамом S. avermitilis УКМ Ас-2179 на синтетичному середовищі відбувається за присутності 1,5 г/л пірувату натрію, що збільшує синтез антибіотику у 2,5 рази (до 3760 мкг/г сухої біомаси);
- визначено позитивний зв'язок між авермектинсинтезуючою здатністю штаму та вмістом в його біомасі ліпідів;
- показано здатність S. avermitilis УКМ Аc-2179 синтезувати de novo комплекс біологічно активних речовин антипаразитарної і фітостимулюючої дії: авермектину, амінокислот, ліпідів, у т. ч. жирних кислот, фітогормонів трьох класів: ауксинів, гіберелінів та цитокінінів;
- отримані нові дані, які свідчать про високу нематоцидну активність аверкому як до галової нематоди Meloidogine incognita, так і до аборигенних популяцій фітонематод: Ditylenchus dipsaci (стеблова), Pratylenchus pratensis, Tylenchobrynchus dubius, Helicotylenchus dihystera, Paratylenchus nanus. Вперше показано, що регулятори росту рослин емістим С та біолан підсилюють нематоцидну дію аверкому;
- виявлено антагоністичну дію S. avermitilis щодо фітопатогенних грибів та відсутність негативного впливу на фітопатогенні та сапрофітні бактерії, у т. ч. Bacillus megaterium і Azotobacter chroococcum, які є основою фосфобактерину і азотобактерину, відповідно. Показано підвищення чисельності педотрофних, амілолітичних, фосфатмобілізувальних, амоніфікувальних мікроорганізмів за умов внесення у ґрунт аверкому, біомаси з культуральною рідиною S. avermitilis та композицій аверкому сумісно з A. сhroococcum УКМ В-6003 і B. megaterium УКМ В-5724.
Практичне значення одержаних результатів. Селекціоновано новий штам S. avermitilis УКМ Ас-2179, на базі якого отримано препарат аверком – комплекс, що містить авермектин, ауксини, гібереліни, цитокініни, амінокислоти, ліпіди, жирні кислоти. Зважаючи на позитивний вплив аверкому на ґрунтову мікробіоту і рослини, які вирощують в умовах закритого ґрунту, а також його активність проти фітонематод, S. avermitilis УКМ Ас-2179 рекомендовано для виробництва екологічно безпечного поліфункціонального препарату з нематоцидною і фітостимулюючою дією.
Особистий внесок здобувача. Автором дисертації самостійно проведено аналіз наукової літератури, особисто виконані представлені експериментальні дослідження, проведена статистична обробка результатів та підготовлено публікації до друку.
Автором самостійно виконані дослідження дії хімічних мутагенів N-метил-N?-нітро-N-нітрозогуанідину та рифампіцину; селекціоновано високопродуктивний варіант S. avermitilis УКМ Ас-2179; досліджено можливі підходи до регулювання біосинтезу авермектину за рахунок внесення у живильне середовище попередників його синтезу; визначено зв'язок між вмістом ліпідів в біомасі продуценту та авермектинсинтезуючою здатністю штаму. Показано наявність біологічно активних речовин в міцелії S. avermitilis УКМ Ас-2179 та аверкомі: амінокислот, ліпідів, в т. ч. жирних кислот, фітогормонів трьох класів: ауксинів, цитокінінів, гіберелінів. Виявлена антагоністична дія проти деяких фітопатогенних грибів та її відсутність щодо сапрофітних ґрунтових бактерій. Показано, що сумісне застосування B. megaterium УКМ В-5724 та A. chroococcum УКМ В-6003 з аверкомом позитивно впливають на мікробні угруповання ґрунту.
Мутагенез проведено за консультативної допомоги к.б.н Муквича М.С. (ІМВ НАНУ).
Створення поліфункціонального препарату аверком, синтезованого S. avermitilis УКМ Ас-2179, проведено спільно з к.б.н. Козирицькою В.Є. та к.б.н. Валагуровою О.В. (ІМВ НАНУ), які є співавторами відповідних публікацій.
Вивчення фітогормонів проведено на базі відділу фізіології росту і розвитку рослин Інституту фізіології рослин і генетики НАН України; нематоцидну активність аверкому досліджено в лабораторії нематології Інституту захисту рослин УААН разом із співробітниками к.б.н. Галаган Т.О. та Болтовською О.В.; вплив на рослини в умовах закритого ґрунту досліджено на базі лабораторії комплексних досліджень ДП “Науково-дослідного агрокомбінату “Пуща-Водиця” разом з к.б.н. Калмиковою Н.А.
Аналіз результатів, їхнє узагальнення, інтерпретацію даних та формулювання основних положень і висновків дисертації здобувачем проведено під керівництвом наукового керівника дисертаційної роботи д.б.н., проф. Г.О. Іутинської.
Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були представлені на міжнародних наукових конференціях “Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии” (Мінськ, Білорусь, 2004); „Сучасні проблеми і тенденції розвитку ґрунтознавства” (Чернівці, 2005); “Фітопатогенні бактерії, фітонцидологія, алелопатія” (Київ, 2005); Міжнародній науково-практичній конференції „Мікробні препарати в землеробстві” (Чернігів, 2006); VII-му з’їзді УТГА “Ґрунти – основа добробуту держави, турбота кожного” (Київ, 2006); I-му Всеукраїнському з’їзді екологів (Вінниця, 2006); з’їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2006); ІІ та ІІІ Міжнародній конференціях студентів та аспірантів „Молодь та поступ біології” (Львів, 2006, 2007); International Scientific Conference “S.P. Kostychev and contemporary agricultural microbiology” (Yalta, 2007); 2nd International symposium “Plant growth substances: intracellular hormonal signaling and applying in agriculture” (Kyiv, 2007), а також на конференціях ІМВ НАН України “Молодь та сучасні проблеми мікробіології і вірусології” (Київ, 2005, 2006, 2007).
Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 16 робіт, з них 6 статтей (3 статті у фахових виданнях), 9 тез доповідей, 1 патент.
Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 166 сторінках друкованого тексту і складається з “Вступу”, розділів “Огляд літератури”, “Матеріали і методи досліджень”, чотирьох розділів результатів власних досліджень, а також “Заключення” та “Висновки”. Список використаних джерел містить 274 посилання, з яких 139 іноземних авторів. Робота включає 26 таблиць та 34 рисунки.
РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
В огляді літератури представлено основні положення щодо синтезу стрептоміцетами біологічно активних речовин – антибіотиків, ліпідів і регуляторів росту рослин. Описані біосинтез макролідного антибіотику антипаразитарної дії – авермектину штамами S. avermitilis і його регуляція. Наведені дані щодо впливу умов культивування на синтез авермектину S. avermitilis. Охарактеризована біологічна активність авермектинвмісних препаратів та їхнє практичне використання.
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА
Розділ 2. матеріали і методи досліджень
Об’єктами дослідження були: S. avermitilis УКМ Ас-2172 (№ 288), його продуктивні варіанти 1130 (УКМ Ас-2179) та Rif r 8, тест-культури мікроорганізмів: Staphylococcus aureus 209, Escherichia coli 028, Proteus vulgaris u-8, Bacillus subtilis BKM 501, Candida albicans 690, B. megaterium УКМ В-5724, A. chroococcum УКМ В-6003, Rizobium leguminozarum УКМ В-6068, R. meliloti УКМ В-6076, Pseudomonas syringae pv. atrafaciens 912, P. syringae pv. coronafaciens 9030, P. syringae pv. panici 7979, P. syringae pv. holci 8300, P. savastanoi pv. 8541, P. savastanoi pv. phaseolicola 7838, Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 8562, Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus 7749, 7754, 7757; фітопатогенні гриби: Alternaria alternata k.36, Fusarium oxysporum n.33, F. sambucinum var. minus 00143 ZQ, Botrytis cinerea k, Verticillium lateritium 00142 ZQS, Trichothecium roseum 00096 ZQS, Cladosporium herbarum n.34, Cylindrocarpon destructans 00617 ZQS; мікробні угруповання чорноземного ґрунту; нематоди виду Meloidogyne incognita, аборигенні популяції фітонематод; насіння і рослини сільськогосподарських культур: редису (Raphanos sativus L.) сорту Червоний з білим кінчиком, пшениці (Triticum aestivus L.) озимої сортів Поліська, Крижинка та ярої сорту Колективна 3, огірка (Cucumis sativus L.) сорту Анжеліна.
Стрептоміцети вирощували на поживних середовищах [Cimburkova E. еt al., 1988; Семенов С.М., 1990; Миронов В.А. и др., 2003]. Культивування S. avermitilis здійснювали періодичним способом в умовах качалок (n = 240 об/хв). Тривалість вирощування складала 1 – 10 діб в залежності від мети досліду. Вивчення впливу на біосинтез авермектину попередників: натрію піровинограднокислого (далі пірувату), D,L-валіну, L-ізолейцину, L-треоніну, L-метіоніну здійснювали на синтетичному середовищі. Зазначені речовини у концентраціях 0,5, 1,0 і 1,5 г/л, вносили у живильне середовище на початку культивування (трофофаза) та у період синтезу антибіотика (ідіофаза).
Динаміку росту S. avermitilis УКМ Ас-2179 характеризували за такими показниками: накопичення біомаси і авермектину, засвоєння глюкози та споживання пірувату, зміна рН культуральної рідини.
Авермектин отримували з міцелію s. avermitilis шляхом екстракції етанолом. Методи тонкошарової хроматографії [Дриняев В.А. и др., 1994] та колориметричний [Мосин В.А., Дриняев В.А., Мирзаев М.Н., 1993] використовували для якісної та кількісної оцінки авермектинового комплексу.
Компонентний склад авермектину та відсоткове співвідношення окремих фракцій визначали методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) та мас-спектрометрії на приладі “SHIMADZU LCMC-2010” [Викторов А.В. и др., 1999].
Біосинтетичну спроможність стрептоміцетів оцінювали у мкг синтезованого авермектину у 1 мл етанольного екстракту; потім перераховували на одиницю сухої біомаси міцелію стрептоміцету [Миронов В.А. и др., 1995].
Вміст глюкози та пірувату у культуральній рідині визначали глюкозооксидазним і модифікованим Умбрайта методами відповідно [Карпищенко А.И., 2002].
Для визначення антимікробних властивостей S. avermitilis застосовували метод агарових блоків, аверкому – метод циліндриків
Суспензію спор стрептоміцету готували за В.Д. Кузнєцовим [Кузнецов В.Д., 1972]. N-метил-N?-нітро-N-нітрозогуанідин (НГ) для обробки спор S. avermitilis застосовували згідно методики [Лаврінчук В.Я., Стрижкова Г.М., Мацелюх Б.П., 1997]. Обробку спор мутагеном у концентрації 2 мг/мл проводили протягом 5, 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 150 хв. Визначали виживання спор культури та проводили відсів ізолятів з подальшим визначенням їхньої здатності синтезувати авермектин.
Визначення чутливості продуценту до антибіотиків проводили методом дисків з різними антибіотиками та вимірюванням діаметрів зон відсутності або пригнічення його росту.
Рифампіцин-стійкі (Rif r) варіанти S. avermitilis отримували за методикою [Безбородов А.М., 1991].
Амінокислоти визначали на амінокислотному аналізаторі ААА-339 “Мікротехна” (Чехословаччина) [Simpson R.F., Neyberger M.R., 1976.].
Якісний і кількісний склад ліпідів S. avermitilis УКМ Ас-2179 вивчали методом Фолча, модифікованим в лабораторії “Produsi microbieni” Інституту мікробіології АН республіки Молдова [Rastimesina I.О., 2001].
Аналіз жирнокислотного складу міцелію S. avermitilis УКМ Ас-2179 та аверкому проводили на газовому хроматографі НР 6890 [ГОСТ Р 1486-99, 2001].
Вміст фітогормонів у міцелії S. avermitilis УКМ Ас-2179 та аверкомі визначали методом кількісної спектроденситометричної тонкошарової хроматографії на приладі “Camag TLC Scanner” (Швейцарія) [Савинский С.В., Драговоз И.В., Педченко В.К., 1991]. Кількісне визначення вмісту гіберелінів проводили фотоелектроколориметричним методом на КФК-3-1 при довжині хвилі 730 нм [Муромцев Г.С., Агнистикова В.Н., 1984].
Дію аверкому на нематоди вивчали згідно “Методики дослідної справи в овочівництві і баштанництві” [2001]. Тест-об’єктом для вивчення антипаразитарної активності препарату були галові нематоди Meloidogyne incognita.
У дослідах із визначення дії регуляторів росту рослин (РРР) на нематоцидну активність аверкому було використано емістим С і біолан у розведенні 1·10-5.
Лабораторний дослід із вивчення дії аверкому на нематоди, мікроорганізми і рослини, вирощені у зараженому нематодами ґрунті був проведений з використанням черноземного ґрунту, люб’язно наданого нам керівництвом Приватного Інституту Radostim (Німеччина).
Наважки ґрунту (200 г) вміщували у пластикові стаканчики, вносили аверком у концентрації 2,0 мкг/мл, а також обробляли ним насіння пшениці ярої сорту Колективна 3. На 20-у добу відбирали зразки ґрунту для мікробіологічного аналізу, визначали кількість нематод і враховували фізіологічні показники розвитку рослин.
Чисельність мікроорганізмів основних еколого-функціональних груп у ґрунті визначали за загальноприйнятим у ґрунтової мікробіології методом [Звягинцев Д.Г., 1991; Whipps J.M., 2001].
Лабораторні досліди проводили у триразовому повторенні.
Для обробки насіння рослин використовували: аверком, культуральні рідини S. avemitilis УКМ Ас-2179 (7-добова культура), A. сhroococcum УКМ В-6003 (5-добова культура) і B. megaterium УКМ В-5724 (1-добова культура) та РРР – емістим С, біолан. Обробку насіння проводили відповідно до методики [Регулятори росту в рослинництві рекомендації по застосуванню, 2007].
В умовах закритого грунту в гідропонних теплицях обробку насіння огірка сорту “Анжеліна” проводили згідно Методика дослідної справи в овочівництві і баштанництві, 2001. Урожайність культури огірка встановлювали, збираючи плоди на дослідних ділянках протягом усього періоду їх дозрівання.
Розрахунки і статистичну обробку даних виконували за допомогою комп’ютерних програм Statistica 6.0 та Microsoft Excel ”00.
РОЗДІЛ 3. СЕЛЕКЦІЯ STREPTOMYCES AVERMITILIS УКМ AC-2172 ЗА ПІДСИЛЕННЯМ СИНТЕЗУ АВЕРМЕКТИНУ
Для того, щоб виробництво препаратів на основі авермектину було економічно доцільним, необхідно перш за все мати конкурентоспроможний продуцент з високою здатністю до синтезу кінцевого продукту.
Для отримання варіантів S. аvermitilis з підвищеною авермектинсинтезуючою здатністю, нами було використано хімічні мутагени N-метил-N’-нітро-N-нітрозогуанідин і рифампіцин, якими обробляли S. avermitilis УКМ Ac-2172 (варіант 288) із здатністю утворювати 120 мкг авермектину в 1 мл етанольного екстракту.
В результаті проведеної роботи відібрали перспективні варіанти S. avermitilis під робочими номерами: № 1130, який синтезував 1400-1800 мкг/мл авермектину (з 40%-вмістом фракції В, рис. 1) та Rif r 8 – 1000-1020 мкг/мл (з 94%-м вмістом фракції В). Найбільш сталим продукуванням антибіотику характеризувався варіант 1130, а Rif r 8 втратив здатність до синтезу авермектину з високим вмістом В-компонентів. Тому у подальшій роботі ми використали варіант № 1130, запатентований як S. avermitilis УКМ Ас-2179, рівень біосинтетичної спроможності якого перевищував вихідний у 13,3 рази [Пат. 69639 UA, 2006]. |
Рис. 1 Компонентний склад авермектинового комплексу Streptomyces avermitilis УКМ Ас-2172 (варіанти після НГ-мутагенезу, ТШХ)
РОЗДІЛ 4. ВПЛИВ ПОПЕРЕДНИКІВ НА БІОСИНТЕЗ АВЕРМЕКТИНУ STREPTOMYCES AVERMITILIS УКМ AC-2179
Для підвищення продуктивності штаму-продуценту авермектину ми вивчали вплив певних попередників його синтезу. Відомо, що піруват відіграє роль посередника в утворенні “стартових” попередників макролідних антибіотиків – ацетил-КоА та метилмалоніл-КоА. Можливими джерелами метилмалоніл-КоА можуть бути також амінокислоти, зокрема валін, ізолейцин, треонін та метіонін. Загальна схема участі попередників у синтезі макролідних антибіотиків різними штамами-продуцентами матиме певні відмінності. Стосовно продуценту S. avermitilis УКМ Ас-2179 такі дослідження не проводились.
Нами було встановлено, що екзогенні D,L-валін та L-ізолейцин, внесені до синтетичного середовища у концентраціях 0,5, 1,0, 1,5 г/л пригнічували синтез авермектину (до 47 % від контролю); водночас спостерігали збільшення біомаси S. avermitilis УКМ Ас-2179 (на 40 та 60 % від контролю відповідно). Відомо, що синтез авермектину, який не містить у своєму складі азоту, відбувається за умови майже повного вичерпання його у середовищі. Імовірно, що внесення в живильне середовище екзогенного амінного азоту у вигляді D,L-валіну та L-ізолейцину призводить до спрямування біосинтетичних процесів у бік утворення біомаси, а не авермектину.
Натомість L-треонін та L-метионін збільшували синтез авермектину (на 60 та 26 % відповідно), але водночас і підвищували вміст біомаси (на 60 та 50 % відповідно). Можна припустити, що у біосинтезі лактону авермектину треонін може бути джерелом пропіоніл-КоА, а також 2-метилмасляної кислоти, а метионін - бути донором метильних груп.
Поряд з амінокислотами не менш важливою у метаболізмі мікроорганізмів є роль пірувату. Показано, що піруват у концентраціях 1,0 та 1,5 г/л позитивно впливав на синтез авермектину, збільшуючи накопичення антибіотика майже у 2,0-2,5 рази. Біомаса при цьому зростала несуттєво порівняно з контролем (рис. 2). |
Рис. 2 Синтез авермектину та накопичення біомаси Streptomyces avermitilis УКМ Ас-2179 за дії пірувату
Виходячи з позитивного впливу пірувату у концентрації 1,5 г/л нами були проведені дослідження динаміки накопичення продуцентом авермектину за дії пірувату (рис. 3). На 1-у добу культивування відбувалось зменшення його вмісту в середовищі у 23 рази. Споживання глюкози в цей період теж відбувалося інтенсивно – її вміст зменшувався майже на 50%. У подальшому піруват та глюкозу в середовищі виявляли у слідових кількостях. рН культуральної рідини після нетривалого зниження з 7,0 до 6,8 до початку ідіофази зростало до 7,2 та до завершення ферментації становило 7,5. Максимальне накопичення біомаси відбувалось на 6-у добу та становило майже 4 г/л. Інтенсивний синтез авермектину культурою S. аvermitilis розпочинався на початку ідіофази, сягав максимуму на 7 - 9-у добу і становив 3760-2905 мкг/г, тобто додавання пірувату сприяло збільшенню синтезу авермектину у 2,5 рази.
Визначення компонентного складу авермектину методом ВЕРХ показало, що за присутності різних концентрацій пірувату відсоткове співвідношення окремих компонентів (А:В) залишалось впродовж культивування більш-менш стабільним і коливалось в межах 60-61%:39-40% (табл. 1).
А |
Б
Рис. 3 Зміни рН, вмісту глюкози і пірувату (А), накопичення авермектину та біомаси (Б) у перебігу культивування Streptomyces avermitilis УКМ Ас-2179 на синтетичному середовищі за внесення пірувату (1,5 г/л)
Таблиця 1
Компонентний склад авермектинового комплексу Streptomyces avermitilis УКМ Ас-2179 при культивуванні на синтетичному середовищі за внесення пірувату*
Концентрація пірувату, г/л | Вміст окремих фракцій авермектинового комплексу, % від загального складу | Співвідношення фракцій А:В
A1a | A2a | A2b | B1a | B2a
0 | 9,3 | 46,8 | 0 | 19,6 | 24,3 | 56:44
0,5 | 11,9 | 49,6 | 0 | 18,7 | 19,7 | 61:39
1,0 | 10,7 | 49,8 | 0 | 19,3 | 20,2 | 60:40
1,5 | 10,3 | 49,1 | 1,48 | 19,8 | 19,1 | 60:40
* - за даними ВЕРХ
Для визначення зв’язку між синтезом авермектину і ліпідогенезом було досліджено динаміку накопичення загальних ліпідів в міцелії штаму S. аvermitilis УКМ Ас-2179 при його вирощуванні на синтетичному середовищі за присутності пірувату (1,5 г/л) та без нього (рис. 4). Отримані дані співставляли із синтезом авермектину.
Виявлено, що за умови внесення у живильне середовище пірувату загальна кількість ліпідів на 7-у добу культивування становила 50,3% від сухої біомаси, що майже у 2 рази було більше за таку в контролі, при цьому авермектинсинтезуюча здатність зростала теж більш, ніж у 2,5 рази.
Рис. 4 Динаміка накопичення загальних ліпідів та авермектину в міцелії штаму Streptomyces аvermitilis УКМ Ас-2179 у перебігу культивування на синтетичному середовищі (контроль, А) та за внесення пірувату (1,5 г/л, Б)
Можна припустити, що ліпіди можуть бути використані культурою як додаткові джерела ацетил-КоА для синтезу авермектину. Не виключено також, що збагачення міцелію ліпідами, забезпечує розчинення і компартменізацію антибіотика в ліпідній фракції.
РОЗДІЛ 5. СИНТЕЗ БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ РЕЧОВИН
STREPTOMYCES AVERMITILIS УКМ Ас-2179
Відомо, що стрептоміцети здатні утворювати широкий спектр різноманітних продуктів метаболізму. Дослідження біологічної активності аверкому методами специфічного біотестування показали, що він стимулює проростання насіння, ріст коренів і стебел пшениці, редису, огірка.
Отримані дані свідчать про здатність штаму S. avermitilis УКМ Аc-2179 синтезувати de novo одночасно з продукуванням авермектину комплекс біологічно активних речовин, серед яких чільне місце займають амінокислоти.
В міцелії продуценту, культуральній рідині, а також у аверкомі виявлено 21 амінокислоту (табл. 2). Серед них у значних кількостях переважали в міцелії глутамінова кислота, аланін, аспарагінова кислота, лейцин, у культуральній рідині окрім них ще й цистин і таурин; у аверкомі – глутамінова кислота, аланін, лейцин, валін. Щодо амінокислот, які вважають попередниками у синтезі авермектину (валін, ізолейцин, треонін та метионін), то навіть на 7-у добу культивування вони містилися в значних кількостях як в біомасі, так і в культуральній рідині. Тобто, S. avermitilis УКМ Ас-2179 здатний самостійно забезпечити свої потреби в цих амінокислотах.
Нами вперше показана здатність S. avermitilis продукувати -аміномасляну кислоту, яка є хімічним агентом, що перешкоджає передаванню нервових імпульсів у синапсах шкідників, чим зумовлює нервово-паралітичну дію авермектинвмісних препаратів.
Таблиця 2
Амінокислотний склад Streptomyces avermitilis УКМ Ас-2179
№ пп | Амінокислота | Вміст амінокислот, % від загальної суми площ піків
Біомаси, | Культуральної рідини | Аверкому
1 | Глутамінова кислота | 21,05 | 13,7 | 28
2 | Аланін | 8,4 | 6,4 | 11,8
3 | Аспарагінова кислота | 8,2 | 7,8 | 3,68
4 | Лейцин | 7,2 | 5,7 | 9,3
5 | Гліцин | 6,96 | 4,8 | 4,7
6 | Треонін | 5,86 | 3,9 | 3,2
7 | Валін | 5,5 | 3,6 | 7,5
8 | Лізин | 5,08 | 3,5 | 1,9
9 | Цистин | 4,9 | 9,3 | 2,3
10 | Аргінін | 4,8 | 4,8 | 1,0
11 | Серин | 4,46 | 3,5 | 2,2
12 | Ізолейцин | 3,6 | 2,4 | 4,5
13 | Метионін | 3,4 | 0,9 | 2,3
14 | Фенілаланін | 2,99 | 2,3 | 4,0
15 | Пролін | 2,5 | 3,6 | 3,6
16 | Тирозин | 2,4 | 3,3 | 6,8
17 | Гістидин | 1,9 | 1,0 | 1,3
18 | Орнітин | 0,3 | 0,2 | 0,36
19 | Цистеїнова кислота | 0,2 | 2,5 | 0,8
20 | г-аміномасляна кислота | 0,16 | 0,3 | 0,36
21 | Таурин | 0,14 | 16,5 | 0,4
Серед біологічно активних речовин мікробного походження ліпіди займають важливе місце.
Встановлено, що S. avermitilis УКМ Ас-2179 здатний утворювати до 263,3 мг ліпідів на 1 г абсолютно сухої біомаси. У складі ліпідів як біомаси S. avermitilis УКМ Ас-2179, так і аверкому переважали такі фізіологічно активні фракції: фосфоліпіди (22,1-28%), стерини (24-34%) та жирні кислоти (10-8%); крім того були присутні: моно-, ди- та тригліцериди, ефіри стеринів, воски та неідентифіковані фракції (рис. 5). |
Рис. 5 Компонентний склад ліпідів біомаси Streptomyces avermitilis та аверкому
У жирнокислотному складі ліпідів, виділених з міцелію S. avermitilis УКМ Ас-2179, були присутні кислоти з кількістю вуглецевих атомів від С4 до С24 насичені (нерозгалужені, ізо- та антеізо-) і ненасичені, з парним і непарним числом атомів вуглецю (табл. 3).
Таблиця 3
Жирнокислотний склад Streptomyces avermitilis УКМ Ас-2179
№ пп | Жирна кислота | Число атомів вуглецю | Вміст жирних кислот, % від загальної суми площ піків
Біомаси | Аверкому
1 | Масляна | С4:0 | 0,3624 | 0
2 | Валеріанова | С5:0 | 0,5094 | 0
3 | Капронова | С6:0 | 0,2093 | 0
4 | Каприлова | С8:0 | 0,0641 | 0
5 | цис-Децен-3-ова | С10:1 | 0,3836 | 0
6 | Лауринова | С12:0 | 0,2859 | 2,8855
7 | Дентицетова | С12:1 | 0,2463 | 7,9211
8 | Ізо-миристинова | Ізо- С14:0 | 1,8511 | 0
9 | Миристинова | С14:0 | 0,4873 | 5,6880
10 | 13-метилтетрадеканова | Ізо- С15:0 | 2,7552 | 0
11 | 12-метилтетрадеканова | Антеізо- С15:0 | 6,8510 | 16,2476
12 | Пентадеканова | С15:0 | 0,6384 | 0
13 | Пентадеценова | С15:1 | 0,1204 | 0
14 | Ізопальмітинова | Ізо- С16:0 | 3,7912 | 6,4110
15 | Пальмітинова | С16:0 | 17,2618 | 10,8327
16 | Пальмітоолеїнова | С16:1 | 2,9818 | 0
17 | 15-метилгексадеценова | Ізо- С17:0 | 1,1475 | 0
18 | 14-метилгексадеканова | Антеізо- С17:0 | 3,1349 | 6,2191
19 | Гептадеценова | С17:1 | 0,3097 | 0
20 | Стеаринова | С18:0 | 5,4303 | 3,5838
21 | Олеїнова | С18:1 | 20,9717 | 22,1480
22 | Лінолева | С18:2 | 25,9173 | 4,5526
23 | Ліноленова | С18:3 | 2,5709 | 1,4413
24 | Арахінова | С20:0 | 0,4057 | 0
25 | Галдолеінова | С20:1 | 0,1515 | 2,8970
26 | цис-цис-Ейкозадієн-11,14-ова | С20:2 | 0,1322 | 0
27 | Арахідонова | С20:4 | 0,0552 | 2,3569
28 | цис-Ейкозапентаєн-5,8,11,14,17-ова | С20:5 | 0,0385 | 0
29 | Хенейкозанова | С21:0 | 0,0489 | 0
30 | Бегенова | С22:0 | 0,4593 | 0
31 | Трикозанова | С23:0 | 0,0875 | 0
32 | Лігноцеринова | С24:0 | 0,3397 | 6,8154
Окрім низькомолекулярних жирних кислот С4 – С10 , що є попередниками в синтезі авермектину, у значній кількості були представлені лінолева (до 26%), олеїнова (до 21%) та пальмітинова (до 17%). Вперше була виявлена арахідонова кислота (0,05%), яка не синтезується вищими рослинами, є для них чужерідним об’єктом та сприймається як “вторгнення інфекції”. Арахідонова кислота є біогенним еліситором, який запускає хибний “сигнал тривоги” та активізує захисні реакції рослин. Жирнокислотний склад препарату аверком відрізнявся від складу міцелію (див. табл. 3). Було виявлено усього 14 кислот, з них найбільшого вмісту сягали кислоти: олеїнова (до 22%) та 12-метилтетрадеканова (до 16%). Кількість арахідонової кислоти в аверкомі була вищою, ніж в міцелії і становила 2,4%, при цьому знижувався вміст лінолевої кислоти до 4,6%, з якої, як відомо, утворюється арахідонова.
Серед речовин з рістрегулюючими властивостями важливе місце також займають фітогормони. Нами вперше отримані результати, які свідчать, що авермектинсинтезуючий штам S. avermitilis УКМ Аc-2179 здатний до синтезу трьох класів фітогормонів: ауксинів, гіберелінів та цитокінінів.
Хроматографічні дослідження підтверджують наявність в міцелії стрептоміцету та аверкомі індолілоцтової кислоти (IОК), зеатину (З), зеатин-рибозиду (ЗР), абсцизової кислоти (АБК) та ізопентиладеніну (IПA) (рис. 6).
Рис. 6 Тонкошарова хроматографія фітогормонів: ауксинів (А) та цитокінінів (Б)
Streptomyces avermitilis УКМ Аc-2179: 2, 3, 10 – аверком, 4, 5, 9 – біомаса; 1, 6, 7, 8, 11, 12 – стандарти ауксинів (ІОК), цитокінінів (З, ЗР, IПA і АБК).
Ауксини були представлені індолілоцтовою кислотою, синтез якої становив 2095 нг/1 г сухої біомаси та 217 нг/1 мл аверкому; цитокініни були представлені ізопентиладеніном (838 нг/1 г та 428 нг/1 мл), зеатином (169 нг/1 г та 149 нг/1мл) та зеатин-рибозидом (4228 нг/1 г та 118 нг/1 мл) відповідно.
Штам також утворював гіберелову кислоту в досить високих кількостях: 23123 нг/1 г міцелію та 4500 нг/1 мл аверкому.
Отже, згідно отриманих даних, S. avermitilis УКМ Аc-2179, окрім антибіотику авермектину, утворює амінокислоти, ліпіди, в т. ч. жирні кислоти та фітогормони. Вказані продукти метаболізму входять також до складу препарату аверком.
розділ 6. біологічнІ ВЛАСТИВОСТІ аверкому І ЙОГО ПРОДУЦЕНТУ
Селекціонований штам S. avermitilis УКМ Аc-2179 виявляє антагоністичну дію щодо деяких фітопатогенних грибів і не пригнічує ріст сапрофітних ґрунтових бактерій. Більш того, продуцент, а також препарат аверком стимулюють ріст бактерій, які є основою фосфобактерину – B. megaterium УКМ В-5724 і азотобактерину – A. chroococcum УКМ В-6003. Їхнє сумісне застосування з аверкомом сприяло збільшенню чисельності у ґрунті педотрофних, амоніфікувальних, амілолітичних та фосфатмобілізувальних бактерій (рис. 7). |
I – контроль
II – аверком
III – аверком +
B. megaterium +
A. chroococcum
Рис. 7. Чисельність мікроорганізмів основних еколого-функціональних груп у ризосфері пшениці ярої: 1 – педотрофні, 2 – амілолітичні, 3 – амоніфікувальні, 4 – фосфатмобілізувальні
Препарати на основі авермектину відомі як засоби боротьби з комахами, кліщами, нематодами. В Україні на сьогодні не зареєстровано жодного нематоцидного препарату біологічного походження.
У лабораторних умовах нами підтверджено високу нематоцидну активність аверкому щодо галової нематоди Meloidogine incognita — збудника мелоідогинозу кореневої системи овочевих культур, поширеного у тепличних господарствах України.
LD50 аверкому становила 2,0 мкг/мл за 0,5 год. дії (рис. 8). Вперше було показано, що у присутності регуляторів росту рослин (біолану і емістиму С) антинематодна дія аверкому підсилюється.
Внесення живої культури S. avermitilis і аверкому у ґрунт, заражений фітогельмінтами, сприяло його очищенню від паразитів. |
За 20 діб досліду чисельність фітогельмінтів Ditylenchus dipsaci, Pratylenchus pratensis, Tylenchobrynchus dubius, Helicotylenchus dihystera, Paratylenchus nanus знизилась при застосуванні аверкому та S. avermitilis на 90% – 93%, відповідно.
Аверком, що містить у своєму складі комплекс ідентифікованих нами речовин, виявляє значну фітостимулюючу дію.
Рис. 8 Нематоцидна дія аверкому окремо та за сумісного застосування його з регуляторами росту рослин
Випробовування за лабораторних умов S. avermitilis УКМ Ас-2179 і аверкому на насінні редису, пшениці озимої та ярої різних сортів продемонстрували їх позитивну дію: у рослин збільшувались довжина коренів, висота стебел, сира маса проростків.
У виробничих умовах гідропонних теплиць господарства “Пуща-Водиця” було показано, що обробка аверкомом огірків сорту Анжеліна сприяє подовженню тривалості продуктивної вегетації рослин, зменшенню їхнього ураження фітопатогенами, збільшенню врожайності на 20% порівняно з контролем.
Отже, аверком є перспективним для розвитку біологічних технологій вирощування овочевих культур у закритому ґрунті і отримання чистої органічної продукції. S. avermitilis УКМ Ас-2179 може бути рекомендованим для виробництва екологічно безпечного поліфункціонального препарату з нематоцидною і фітостимулюючою активностями.
ВИСНОВКИ
1. Селекціоновано новий високопродуктивний штам Streptomyces avermitilis УКМ Ас-2179 авермектинсинтезуюча здатність якого перевищує активність вихідного штаму у 13,3 рази. На його основі розроблений антипаразитарний препарат аверком з вмістом авермектину 1400 - 1800 мкг в 1мл етанольного екстракту.
2. За умови внесення у середовище культивування S. avermitilis УКМ Ас-2179 пірувату, L-треоніну і L-метионіну біосинтез авермектину збільшується відповідно у 2,5, 1,6 і 1,3 рази. За додавання D,L-валіну та L-ізолейцину продукування антибіотику зменшується.
3. Авермектинсинтезуючий штам S. avermitilis УКМ Аc-2179 здатний продукувати, окрім авермектину, комплекс фізіологічно активних речовин — ауксинів, гіберелінів та цитокінінів, а також амінокислот, ліпідів, в т.ч. жирних кислот.
4. S. avermitilis УКМ Ас-2179 виявляє антагоністичну дію щодо фітопатогенних грибів і не впливає на бактерії. Вперше продемонстровано його стимулюючий вплив на Bacillus megaterium УКМ В-5724 та Azotobacter chroococcum УКМ В-6003, які є основою фосфобактерину і азотобактерину, відповідно. S. avermitilis УКМ Аc-2179, аверком та його комбінації із зазначеними мікроорганізмами позитивно впливають на мікробні угруповання ґрунту.
5. Аверком проявляє високу нематоцидну активність щодо фітонематод: Meloidogine incognita, Ditylenchus dipsaci, Pratylenchus pratensis, Tylenchobrynchus dubius, Helicotylenchus dihystera, Paratylenchus nanus. Вперше показано, що регулятори росту рослин (емістим С, біолан) підсилюють нематоцидну дію аверкому.
6. Фітостимулююча дія аверкому проявляється у підвищенні проростання насіння, стимуляції розвитку коренів, росту стебел проростків пшениці та редису. В умовах закритого ґрунту препарат подовжує тривалість продуктивного періоду вегетації рослин огірка, зменшує ураження їх фітопатогенами та збільшує урожайність на 20 %.
СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДЕСЕРТАЦІЇ
1. Петрук Т.В., Білявська Л.О., Козирицька В.Є., Муквич М.С. Підвищення біосинтетичної активності Streptomyces avermitilis УКМ Ac-2161 під впливом N-метил-N-нітро-N-нітрозогуанідину // Мікробіол. журн. – 2004. – Т.66, № 6. – С. 24-30. (Здобувачем самостійно проведено вивчення впливу нітрозогуанідину на продуцент авермектину S. avermitilis та підготовлена стаття до друку).
2. Білявська Л.О., Муквич М.С., Іутинська Г.О. Рифампіцинрезистентні мутанти штаму Streptomyces avermitilis // Науковий вісник Чернівецького університету, Серія: Біологія. – 2005. – Т.259. – С. 132-139. (Здобувачем самостійно отримано рифампіцинрезистентні мутанти Streptomyces avermitilis, досліджено їх біосинтетичну здатність та підготовлена стаття до друку).
3. Білявська Л.О., Козирицька В.Є., Валагурова О.В., Іутинська Г.О. Вплив пірувату і валіну на біосинтез авермектину Streptomyces avermitilis УКМ Ас-2179 // Мікробіол. журн. – 2007. – Т.69, № 4. – С. 10-17. (Здобувачем самостійно проведено вивчення впливу попередників пірувату та валіну на авермектин- синтезуючу здатність S. avermitilis та підготовлена стаття до друку).
4. Козирицька В.Є., Валагурова О.В., Петрук Т.В., Іутинська Г.О., Білявська Л.О. Биологические свойства авермектинового комплекса Streptomyces avermitilis УКМ Ас-2179 // Agrarian Science. – 2007. – №1. – Р. 17-20. (Здобувачем особисто досліджено антипаразитарні та фітостимулюючі властивості авермектинового комплексу, вплив його на проростання та розвиток проростків пшениці).
5. Пат. 69639 UA, МПК C12N 1/20, C12P 17/02, C12P 17/18, C12P 19/62 (2006.01),C12R 1/465 (2006.10). Штам Streptomyces avermitilis – продуцент авермектинів, речовин антипаразитарної дії / Іутинська Г.О., Козирицька В.Є., Валагурова О.В., Муквич М.С., Білявська Л.О., Петрук Т.В. // Опубл. 2006. – Бюл. № 8. (Здобувачем особисто селекціоновано авермектинсинтезуючий штам S. аvermitilis УКМ Ас-2179 з підвищеною біосинтетичною здатністю).
6. Білявська Л.О., Козирицька В.Є., Валагурова О.В., Іутинська Г.О. Вплив композиційних мікробних препаратів на мікрофлору ризосфери пшениці ярої // Сільськогосподарська мікробіологія: Зб. наук. праць. – Чернігів: ЦНТЕІ, 2006. – Вип. 4. – С. 159-168. (Здобувачем особисто проведено дослідження впливу композиційних мікробних препаратів на мікробні угруповання ризосферного ґрунту та рослини,
