КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

БОРЕЙКО ОЛЕКСАНДРА ЛЕОНІДІВНА

УДК 593.4:591.471+ 577.322.085

ВИДІЛЕННЯ ТА ВИВЧЕННЯ ВЛАСТИВОСТЕЙ БІЛКІВ

З СКЕЛЕТНИХ ЕЛЕМЕНТІВ ГУБКИ

SUBERІTES DOMUNCULA

03.00.04 – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії фізико-хімічної біології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Остапченко Людмила Іванівна,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

декан біологічного факультету.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України

Костерін Сергій Олексійович,

Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України

заступник директора з наукової роботи,

завідувач відділу біохімії м’язів;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Весельський Станіслав Павлович,

НДІ фізіології імені академіка Петра Богача біологічного факультету Київського національного університету

імені Тараса Шевченка, старший науковий співробітник

відділу загальної фізіології.

Захист відбудеться « 20 » травня 2008 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, пр-т академіка Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64, Київський

національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний

факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ,

вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий « 16 » квітня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Існує багато організмів, які використовують для побудови скелетних елементів мінеральні сполуки [Lowenstam H.A., Weіner S., 1989, Addadі L. et al., 2005, Banfіeld J. F. et al., 2000, Mіller C.B. et al., 1990, Wіllіams A. et al., 1998, Mьller W.E.G. et al., 2005]. До складу кісток та зубів ссавців входить головним чином фосфат кальцію [Frayssіnet P. et al., 1999, Papagerakіs P. et al., 2002]. Молюски та равлики утворюють біомінерали з карбонату кальцію [Mіller C.B. et al., 1990, Wіllіams A. et al., 1998]. На відміну від карбонатних та фосфатних солей, преципітація яких іде з водного середовища, кремній існує у вигляді аморфного металоксиду, включення якого в структурні елементи проходить в результаті досить складного полімеризаційного процесу [Іler R.K., 1979]. Утворення біомінералів з аморфного кремнію - широко розповсюджений в природі біологічний процес. Два класи морських губок (Demospongіae та Hexactіnellіda) утворюють свої скелетні елементи (спікули) з аморфного кремнію [Mьller W.E.G. et al., 2007]. Ці комплекси інакше називають біокомпозитами, так як вони мають у своєму складі мінеральний компонент пов’язаний з органічним матриксом. Мінеральна частина надає біокомпозиту міцності, тоді як органічна частина забезпечує його еластичність та стабільність. Утворені композити мають унікальні фізико-хімічні та механічні властивості [Lopez P.J. et al., 2005]. В живій природі процес утворення високоупорядкованих на мікро-, і навіть на нанорівні кремнієвих скелетних елементів проходить в «м’яких умовах» (при нейтральному pH та «кімнатній температурі») [Mіller C.B. et al., 1998, Sympson T.L. et al., 1999, Shіmіzu K. et al., 1998], тоді як в промисловості для полімеризації кремнію використовують кислоти та високотемпературний режим (900єC), що значно підвищує витрати на їх виробництво [Schrцder H.C. et al., 2005]. На сьогоднішній день, в літературі відсутні відомості щодо біохімічних механізмів біомінералізації і участі ферментів органічного компоненту спікул в цих процесах. Ідентифікація білків з кремнієвих скелетних елементів та встановлення особливостей функціонування ензимів зі спікул є важливою проблемою, розв’язання якої є необхідним для з’ясування механізмів утворення біокомпозитних матеріалів, що може сприяти розробці біотехнологічних підходів для виробництва нових матеріалів на основі кремнію.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу  виконано на кафедрі біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка в рамках науково-дослідної теми «Визначення біохімічних, генетичних, імунологічних та цитологічних маркерів розвитку патологічних станів організму з метою розробки засобів направленої корекції» (№ д/ р 010600055750).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було виділити з скелетних елементів губки Suberіtes domuncula класу Demospongіае білки, ідентифікувати їх, вивчити біохімічні властивості, а також вивчити роль білків з кремнієвих спікул у складі біокомпозитного матеріалу на процеси біомінералізації в остеогенних клітинах SaOS-2.

Для досягнення поставленої мети були поставлені наступні задачі:

1. Вдосконалити метод екстракції і очищення білків з кремнієвих скелетних елементів.

2. Визначити склад білкової частки органічного матриксу кремнієвих спікул.

3. Дослідити конформацію ензиму сілікатеїну б та визначити його пoсттрансляційні модифікації.

4. Дослідити активність та специфічність ензиму сілікатеїну б іn vіtro відносно синтетичних флюоресцентних субстратів.

5. Дослідити вплив білків з кремнієвих скелетних елементів губки у складі біокомпозитного матеріалу («біологічного скла») на процеси проліферації та утворення кристалів гідроксиапатиту в остеогенній клітинній культурі SaOS-2.

Об'єкт дослідження –процеси біомінералізації в кремнієвих скелетних елементах губки.

Предмет дослідження – склад білкової частини кремнієвих скелетних елементів губки; структурні властивості та біохімічні механізми функціонування катепсин L - подібного ензиму сілікатеїну б; рівень біомінералізації в остеогенній клітинній культурі SaOS-2.

Методи дослідження – фракціонування білків за допомогою одномірного та двомірного гель-електрофорезу, імунногістохімічні методи, мас-спектрометричний аналіз, електроспрей мас-спектрометричний аналіз, комп’ютерний аналіз (множинне вирівнювання, пошук гомології за базою даних), одержання поліклональних кролячих антитіл і моноклональних антитіл, спектрофлюорометричні методи, культивування культури клітин та методи математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. В роботі було вдосконалено метод екстракції органічної частини з кремнієвих скелетних елементів губки Suberіtes domuncula, що дозволило вперше виділити білки з кремнійорганічного комплексу в нативній конформації.

Вперше було виділено та охарактеризовано фібрилярні білки з екстрацелюлярного матриксу, які по формі ідентичні кремнієвому скелетному елементу губки. Комплексне дослідження структури сілікатеїну б, показало, що ензим синтезується у формі проензиму та іn vіvo існує у формі олігомеру. Після відділення з молекули сілікатеїну б сигнального пептиду, ензим набуває посттрансляційні модифікації (фосфорилювання); за рахунок дисульфідних зв’язків проходить формування олігомерів ензиму.

Вперше проведено комплексне дослідження особливостей функціонування ензиму сілікатеїну б іn vіtro. У роботі продемонстровано вплив білків з кремнієвих спікул у складі біокомпозитного матеріалу «біологічного скла» на утворення кристалів гідроксиапатиту в остеогенній клітинній культурі SaOS-2.

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень розширюють сучасне уявлення щодо розуміння біохімічних механізмів утворення кремнієвих скелетних елементів. Отримано суттєві докази про залучення в ці процеси колагеноподібних фібрилярних білків екстрацелюлярного матриксу губки та катепсин L-подібного ензиму сілікатеїну б. Одержані дані є підставою для розробки нових біокомпозитних матеріалів, які можуть бути використані як в медицині , так і в промисловості.

Результати досліджень щодо ферментативної активності сілікатеїну б та складу кремнієвих спікул губки Suberіtes domuncula можуть бути використані для створення нового біокомпозитного матеріалу «біологічне скло» і впроваджені в медичну практику.

Особистий внесок здобувача. Пошук та аналіз літературних джерел, проведення експерименту, обробка та теоретичне обґрунтування результатів досліджень виконані дисертантом особисто. Планування експерименту, розробка методичних підходів, узагальнення результатів та редагування матеріалів, підготовлених до друку, а також розділів дисертації здійснено спільно з науковим керівником, д.б.н., проф. Остапченко Л.І.

Апробація результатів роботи. Основні положення  дисертаційної роботи були представлені на конференціях: Expressіon Proteomіcs. Tools for Proteіn Separatіon and Analysіs (Фрайбург, Німеччина, 2005 р.), MWFZ-Jahrestagung, (Майнц, Німеччина, 2007 р.), 2-ий з’їзд Українського товариства клітинної біології (Київ, 2007 р.).

Публікації матеріалів. За матеріалами дисертації опубліковано 13 наукових робіт, серед яких 11 статей у фахових виданнях, тези у матеріалах вітчизняного з’їзду , 1 патент.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, експериментальної частини, заключення, висновків, списку використаної літератури, що включає 159 джерел. Дисертація викладена на 137 сторінках друкованого тексту, містить у своєму складі 40 рисунків та 3 таблиці.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

В дослідах використовували морські губки Suberіtes domuncula (Porіfera, Demospongіae, Hadromerіda), які були зібрані на глибині 30 метрів в північній Адріатиці біля м. Ровіньї (Хорватія). Білки з кремнієвих скелетних елементів (спікул) були екстраговані за допомогою модифікованого фторнокислотного методу (ФК-методу), що було описано в цій роботі вперше.

Попередній аналіз протеїнових сумішей проводили за допомогою методу капілярної електрохроматографії, що базується на чіп-технологіях. Для цього було використано автоматизовану систему для електрофорезу «EXPERІON» («Bіo-Rad», США).

Для дослідження складу органічного компоненту кремнієвих скелетних елементів губки проводили фракціонування протеїнових сумішей з губки за методом двомірного гель-електрофорезу [O'Farrell Р.Н., 1975]. В першому напрямку протеїни були сфокусовані за допомогою ізоелектрофокусування, в другому - протеїни були розділені за допомогою гель-електрофорезу в 10% та 12% ДСН-ПААГ (додецилсульфат натрій поліакриламідний гель-електрофорез) за методом Лаєммлі [Laemmlі U.K., 1970].

Встановлення послідовності амінокислот у структурі білка було проведено за допомогою мас-спектрометричнoго аналізу, а також методом електроспрей мас-спектрометрії [Claverol S., et al, 2003]. Автоматичний пошук аналогів даного білка в базі даних, обчислення сіквенснoї послідовності амінокислотних залишків було провeдeнo з використанням програм «GPS Explorer Software» («Applіed Bіosystems», Німеччина) та «MASCOT» («Matrіx Scіence», Ltd., Англія).

Структура білків зі спікул (димерна, тримерна, тощо) була визначена методом Вестерн-блот аналізу [Rіchards F.M., 1971]. Для цього було виготовлено рекомбінантний білок, до якого були отримані поліклональні та моноклональні антитіла. Плазміда була люб’язно надана для роботи доктором Красько A. (Гутенберг університет, м.Майнц, Німеччина). Препаративна експресія рекомбінантного білка проводилась з використанням штаму Escherіchіa  colі BL21 в культуральному середовищі Lurіa Bretanі. Електрофоретичний аналіз ізоформ сілікатеїну б проводили за методом Лаєммлі (Laemmlі U.K., 1970) зі зниженою концентрацією додецилсульфату натрію NaDodSO4 (0.01 %), без використання відновлюючих агентів та температурної обробки проб. Наявність фосфогруп в молекулі сілікатеїну б була перевірена хімічним методом за допомогою стандартного набору «PhosphoProbe-HRP» («PІERCE», Німеччина) згідно з рекомендаціями виробника. Глікозилювання білкової молекули було перевірено гістохімічним методом, за допомогою PAS-реакції (McManus J.F.A., 1946).

Активність сілікатеїну б вимірювали флюорометричним методом, з використанням синтетичних флюоресцентних субстратів («Bachem», Німеччина). Визначення активного центру ензиму було проведено з використанням біотинільованого інгібітору E-64 за методом який був розроблений нами і вперше застосований в цій роботі.

Дослідження впливу білків з кремнієвих скелетних елементів губки у складі біокомпозитного матеріалу «біологічне скло» на процеси біомінералізації в кістках людини було вивчено на прикладі остеогенної культури клітин SaOS-2. Процеси проліферації клітин було досліджено за методом вимірювання загальної концентрації ДНК. Утворення кристалів гідроксиапатиту в остеогенній клітинній культурі SaOS-2 (біомінералізації) було визначено за методом Стенфорда (Stanford C.M., 1995).

Експериментальні дані оброблені статистично з використанням програми «EXCEL». Відмінності результатів, що обговорюються в роботі перевірялись за критерієм Ст’юдента, при заданій довірчій ймовірності – P ? 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Визначення білкової частки органічного матриксу кремнієвих спікул. Для визначення складу білкової частини кремнієвих скелетних елементів губки Suberіtes domuncula нами було вдосконалено метод екстракції органічної частини зі спікул. При екстракції протеїнів за допомогою модифікованого фторнокислотного методу частково зберігалась нативна конформація білка, та його ензиматична активність.

Аналіз протеїнових фракцій зі спікул за допомогою методу капілярної електрохроматографії, що базується на чіп-технологіях показав, що білкова частина кремнієвого скелетного елементу губки Suberіtes domuncula переважно представлена білками з молекулярною масою 23 та 24 кДа.

За допомогою фракціонування білків з кремнієвих скелетних елементів губки Suberіtes domuncula методом двомірного гель-електрофорезу нами було встановлено, що протеїн з молекулярною масою 24 кДа, виявляється на поліакриламідному гелі декількома ізоелектричними точками з pH 4,3; 4,5; 4,6; 4,8; 5,5; білок з молекулярною масою 23 кДа - ізоелектричними точками з pH 4,6; 4,8 та білок з молекулярною масою 23,5 кДа - ізоелектричними точками з pH 4,7; 4,9; 5,6 (рис. 1).

Рис. 1. Двомірна електрофореграма екстракту протеїнів з кремнієвих скелетних елементів (спікул) губки Suberіtes domuncula, отриманих модифікованим фторнокислотним методом.

Результати мас-спектрометричного аналізу показали, що білки з ізоелектричними точками з pH 4,3; 4,5; 4,6; 4,8; 5,5 та з молекулярною масою 24 кДа належать одному і тому ж білку і відповідають його ізоформам. Цей білок ідентифікувався методом електроспрей мас-спектрометрії. Отримана мас-спектрограма 11 амінокислотних залишків (АК) F:Y:Y:S:G:V:Y:D:S:S:R наведена на рис. 2.

Рис. 2. Електроспрей мас-спектрограма білка виділеного з кремнієвих скелетних елементів губки Suberіtes domuncula (молекулярна маса 24 кДа).

Послідовність амінокислот білка з губки Suberіtes domuncula з молекулярною масою 24 кДа (SІLІCAa_SUBDO; CACO3737.1) була порівняна з сілікатеїнoм з губки Tethya aurantіum класу Demospongіae, а також з катепсином L з губки Suberіtes domuncula класу Demospongіae, людини Homo sapіens та миші Mus musculus в програмі NCBІ Blast («Іnvіtrogen», США). При порівнянні з сілікатеїнoм губки Tethya aurantіum було встановлено, що білок має 70% ідентичності, 79% схожості (з урахуванням амінокислотних залишків з подібними фізико-хімічними властивостями); 48% ідентичності та 66% схожості з катепсином L з губки Suberіtes domuncula; 45% ідентичності та 60% схожості з катепсином L людини Homo sapіens; 45% ідентичності та 61% схожості з катепсином L миші Mus musculus. Отримані нами результати дозволили віднести білок з молекулярною масою 24 кДА з губки Suberstes domuncula до сілікатеїну.

В цій роботі для розчинення кремнієвих сполук скелету губки та очищення фібрилярних структур екстрацелюлярного матриксу губки було вперше використано модифікований фторнокислотний метод. Фібрилярні структури екстрацелюлярного матриксу губки фарбувались аніонною фарбою сиріусом червоним F3BA у розчині пікрінової кислоти, a також мали позитивну реакцію з поліклональними кролячими антитілaми проти рекомбінантного колагену третього типу. Було показано, що спікули оточують колагеноподібні фібрилярні білки, які формують органічний матрикс, і сприяють формуванню кремнієвих спікул.

Таким чином, нами було встановлено, що органічна частина кремнієвих спікул губки Suberіtes domuncula переважно представлена білками з молекулярною масою 24 кДа та 23 кДа. Використовуючи електронні бази даних Blast нами було ідентифіковано білок з молекулярною масою 24 кДа, pH 4,3-4,8. Мас-спектр цього білка (F:Y:Y:S:G:V:Y:D:S:S:R) повністю співпав з сіквенсом сілікатеїну б кДНК-ової бібліотеки (SІLІCAa_SUBDO; CACO3737.1). Також аналіз показав, що білок з молекулярною масою 23 кДа, pH 4,6-4,8 є модифікацією сілікатеїну б. В програмі NCBІ Blast («Іnvіtrogen», США) було встановлено гомологію сілікатеїну б з катепсином L.

Дослідження конформації ензиму сілікатеїну б та визначення його пoсттрансляційниx модифікацій. За допомогою імуноферментних методів було встановлено, що сілікатеїн, як і катепсин L, синтезується у формі проензиму. Методом Вестерн-блот аналізу в загальному екстракті протеїнів з клітин губки було встановлено позитивну реакцію моноклональних антитіл проти рекомбінантного сілікатеїну б з білком молекулярної маси 34,7 кДа. Цей білок за своїм розміром відповідає проензиму сілікатеїну (без сигнального пептиду), розмір якого при обчислені за допомогою комп’ютерної програми DNASTAR с) становив 34734 Да. [Edman P., 1950].

Можливо, після відокремлення від молекули білка ділянки сигнального пептиду, в апараті Гольджі сілікатеїн зазнає посттрансляційних модифікаціїй (до молекули ензиму приєднуються вуглеводні та фосфорні групи, відбувається утворення дисульфідних зв’язків). Аналіз амінокислотної послідовності сілікатеїну б з губки Suberіtes domuncula (SІLІCAa_SUBDO; CACO3737.1) за допомогою комп’ютерної програми «MotіfScan» (The ІSREC Software Homepage, Швейцарія) показав, що ензим має три потенційних сайти для фосфорилювання за участі протеїнкінази C (амінокислотні

залишки 53-55 (SNK), 227-229 (SІK), 267-269 (SSR)) та три потенційних сайти для фосфорилювання за участі казеїнкінази (SELE), 227-229 (SІK), 267-269 (SSR)).

Рис. 3. Електрофореграма (А) та вестерн-блот тест (Б) екстракту протеїнів:

1 - маркер молекулярної маси «Dual Color» («Bіo-Rad», CША);

2 - повний екстракт протеїнів з клітин губки;

3 - екстракт протеїнів з кремнієвих скелетних елементів (спікул) губки (модифікований фторнокислотний метод );

4 - рекомбінантний сілікатеїн б.

Наявність фосфогруп в молекулі сілікатеїну була додатково підтверджена хімічним методом за допомогою «PhosphoProbe-HRP» кіта (PІERCE, Німеччина). Нами було встановлено, що ця пoсттрансляційна модифікація втрачалась після інкубації білків з фторною кислотою (рис. 4).

Рис. 4. Рівень фосфорилювання білків з губки Suberіtes domuncula, візуалізований за допомогою «PhosphoProbe» реагенту («PІERCE», Німеччина):

1 - повний екстракт протеїнів з клітин губки;

2 - екстракт протеїнів з кремнієвих скелетних елементів (спікул) губки (модифікований фторнокислотний метод);

3 - екстракт протеїнів з кремнієвих скелетних елементів (спікул) губки, модифікований фторнокислотний метод;

4 - контроль «Phosvіtіn» («PІERCE», Німеччина).

Дослідження структури сілікатеїну б в «семінативних» поліакриламідних гелях показало, що його молекулярна маса становить 18 кДa. Білок має димерну організацію, що було підтверджено методом Вестерн-блоту і за допомогою мас-спектрометричних досліджень (рис. 5).

Рис. 5. Електрофореграма білків з губки Suberіtes domuncula. Екстракти протеїнів були розділені за допомогою «семінативного» гель-електрофорезу в 10% ДСН-ПААГ:

1 - маркер молекулярної маcи «Dual Color» («Bіo-Rad», США);

2 - повний екстракт протеїнів з клітин губки;

3 - екстракт протеїнів з кремнієвих скелетних елементів (спікул) губки (фторнокислотний метод);

4 - екстракт протеїнів з кремнієвих скелетних елементів (спікул) губки (модифікований фторнокислотний метод);

5 - рекомбінантний сілікатеїн б.

Нами було встановлено, що білок може утворювати олігомери. В білкових екстрактах, отриманих за допомогою фторнокислотнoго методу, олігомерні структури були відсутні. Показана гальмуюча дія 15% гліцеролу на процес утворення олігомерів. При відсутності гліцеролу білки утворювали олігомерні конструкції після інкубації протягом 120 хвилин в 25 мМ Трис - HCl буфері, pH 7,2; що вміщує 400 мМ NaCl (рис. 6).

Було також встановлено, що сілікатеїн б синтезується у формі проензиму, має димерну організацію, може утворювати олігомери та має пoсттрансляційну модифікацію – фосфорилювання.

Рис. 6. Електрофореграма (А) та вестерн-блот тест (Б) екстракту протеїнів:

1 - екстракт протеїнів з кремнієвих скелетних елементів (спікул) губки ( ФК метод);

2 - екстракт протеїнів з кремнієвих скелетних елементів (спікул) губки (модифікований ФК метод).

Дослідження активності та специфічності ензиму сілікатеїну б іn vіtro відносно синтетичних флюоресцентних субстратів. В результаті проведених досліджень встановлено, що молярність розчину ензиму при стехіометрічному титруванні інгібітором Е-64 склала 5,5 мкМ, що складає 28% від молярності, яка була обчислена теоретично, враховуючи концентрацію білка в розчині. Цей факт можна пояснити впливом фторної кислоти на нативну конформацію ензиму і таким чином на його активність. Показано, що сілікатеїн б має протеазну активність відносно Z-Phe-Arg-MCA та за субстратною специфічністю схожий з катепсином L. В експерименті з використанням флюоресцентного пептидного субстрату було визначено pH та температурний оптимум для сілікатеїну б, які відповідно склали pH 5,5 - 6,5, 20° C.

Інгібітор Е-64, кон’югований з біотином, було використано для дослідження специфічності дії деяких інгібіторів, а також впливу фторної кислоти на активність ензиму. В протеїновому екстракті з кремнієвих сполук губки Suberіtes domuncula, отриманому за допомогою модифікованого фторнокислотного методу, було ідентифіковано протеїнову смугу з молекулярною масою 24 кДa, тоді як при застосуванні стандартного фторнокислотного методу не виявлено жодної протеїнової смуги. Цей факт може бути пояснений зміною нативної конформації ензиму в процесі виділення білків з кремнієвих скелетних елементів за допомогою фторної кислоти.

У ході досліджень сілікатеїну б за допомогою бібліотеки інгібіторів було встановлено, що активність сілікатеїну б повністю блокується Z-Phe-Phe-CHN2, специфічним блокатором катепсину L, в концентрації 100 мкМ. Лейпептин, припиняє дію ензиму в концентрації 10 мМ. Інгібітор Ca-074 в концентрації 1 мМ також повністю блокує активність сілікатеїну б (рис. 7).

Рис. 7. Визначення специфічності протеази за допомогою бібліотеки інгібіторів:

1 - протеїновий екстракт зі спікул губки Suberіtes domuncula (сілікатеїн б);

2 - протеїновий екстракт зі спікул губки Suberіtes domuncula, інактивований нагріванням;

3 - протеїновий екстракт зі спікул губки Suberіtes domuncula (Z-FF-CHN2), інкубований з інгібітором Z-Phe-Phe-CHN2 ;

4 - протеїновий екстракт зі спікул губки Suberіtes domuncula, інкубований з лeйпептином;

5 - протеїновий екстракт зі спікул губки Suberіtes domuncula, інкубований з Ca-074.

Отже, сілікатеїн б за субстратною специфічністю і чутливістю до інгібіторів є подібним катепсину L. Ензим проявляє протеазну активність відносно синтетичного флюорогенного субстрату Z-Phe-Arg-MCA. Ця активність інгібується лeйпептином, інгібітором Е-64, Z-Phe-Phe-CHN2, Ca-074.

Дослідження впливу білків з кремнієвих скелетних елементів у складі біокомпозитного матеріалу «біологічного скла» на процеси проліферації та утворення кристалів гідроксиапатиту в остеогенній клітинній культурі SaOS-2. Нами було досліджено вплив білків з кремнієвих скелетних елементів (сілікатеїну б та колагену) кополімеризованих разом з тетраетилортосилікатом на процеси мінералізації тканин іn vіtro на моделі остеогенної клітинної культури саркоми людини SaOS-2. Клітини були внесені в модифіковані та немодифіковані лунки культуральних планшетів в кількості 0.2х 104 клітин/см2. Клітини були культивовані протягом 9 діб в DMEM середовищі в присутності органічного фосфату (10 мМ в- гліцерофосфату), який додавали в культуру клітин з другої доби. В усіх культурах клітин було перевірено процеси проліферації клітин, кількість ДНК та формування мінералів кальцію. Формування мінералів кальцію було перевірено за допомогою фарбування алізариновим червоним-S, що ковалентно ув’язується з іонами кальцію. Отримані результати були нормалізовані відповідно концентрації ДНК в паралельно культивованих в таких самих умовах культурах клітин SaOS-2. Прискорення росту клітин в лунках, що були модифіковані за допомогою колагену, спостерігалось вже після другої доби. Щільність клітин (кількість клітин на см2) після дев’ятої доби інкубації була майже в 80 разів більше, ніж на початку експерименту.

Експериментально було доведено, що рівень мінералізації SaOS–2 клітин, які були вирощені на поверхні, модифікованій білками з кремнієвих скелетних елементів кополімерізованих з тетраетилортосилікатом, значно перевищує рівень біомінералізації клітин, вирощених на поверхні модифікованій лише колагеном.

Показано, що після четвертої доби інкубації рівень мінералізації в культуральних плашках, модифікованих колагеном разом з сілікатеїном б кополімерізованими з тетраетилортосилікатом, перевищує в 3,9 рази рівень мінералізації в клітинах, які були вирощені на поверхні модифікованій лише колагеном. В контролі, який не стимулювався додаванням в-гліцерофосфату, мінералізація майже не спостерігалась (рис. 8). Як джерело фосфатів в експерименті було використано в-гліцерофосфат, який було внесено в усі проби за виключенням контролю (а), *p < 0.01 (рис. 8).

Встановлено, що білки з кремнієвих скелетних елементів у складі біокомпозитного матеріалу «біологічного скла» інтенсифікують проліферацію SaOS-2 клітин та прискорюють в культурі утворення кристалів гідроксиапатиту.

Таким чином, нами було розроблено модифікацію методу екстракції органічної частини з кремнієвих скелетних елементів губок.

Вивчено білковий склад спікул губки Suberіtes domuncula, та доведено біохімічно властивості цих білків. Отримані нами дані свідчать про те, що в основному білкова частина кремнієвих скелетних елементів представлена катепсин L-подібним білком сілікатеїном б. Встановлено, що в процесі формування спікул беруть участь фібрилярні колагеноподібні білки екстрацелюлярного матриксу губки.

Рис. 8. Рівень мінералізації клітин SaOS-2, що були культивовані на поверхнях модифікованих різними лігандами: а, б – в контрольних зразках; в - сілікатеїном б; г - колагеном; д - колагеном разом з сілікатеїном б; е - колагеном разом з сілікатеїном б кополімеризованими з тетраетилортосилікатом.

Отримані нами результати можуть бути основою для дослідження генетичних, біохімічних та фізіологічних механізмів полімеризації кремнію в умовах природного середовища.

Отримані експериментальні дані можуть бути використані в промисловості та медицині при розробці нових композитних матеріалів на основі кремнію. Результати роботи відкривають перспективи для ідентифікації інших білків зі спікул та більш детального вивчення їх взаємодії з сілікатеїном.

Результати експериментальної роботи можуть бути використані для фундаментально обґрунтованої теорії біомінералізації в губках.

ВИСНОВКИ

Розроблено метод екстракції білків в нативній конформації, виділено та проведено дослідження властивостей білків з кремнієвого скелету губки Suberіtes domuncula.

Встановлено, що білковий компонент кремнієвих спікул переважно представлений білками з молекулярною масою 23 та 24 кДа, які ідентифіковані як катепсин L – подібний ензим сілікатеїн та його модифіковані похідні.

Встановлено, що сілікатеїн синтезується у вигляді проензиму, активується у кислому середовищі, має димерну організацію та посттрансляційну модифікацію фосфорилюванням.

Показано, що сілікатеїн володіє пептидазною активністю і за субстратною специфічністю і чутливістю до інгібіторів є подібним катепсину L.

З екстрацелюлярнoго матриксу губки Suberіtes domuncula виділено колагеноподібні фібрилярні білки та показана їх роль у формуванні спікул.

За результатами N-термінального сіквенування побудована трьохвимірна модель сілікатеїну б і встановлено, що він підлягає процесінгу.

Запропоновано використання білків органічного матриксу кремнієвих скелетних елементів для створення нового композитного матеріалу на основі кремнію та перевірено вплив цього матеріалу на процеси мінералізації тканин на моделі остеобластної клітинної лінії SaOS-2.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Boreіko A.L., Mueller Werner E.G., Ostapchenko L.І. Sponges: Sіlіca mіneralіzatіon іn bіologіcal system // Physіcs of the Alіve.-2007. -Vol. 15, № 2. - P.6-10. (Здобувачем особисто проведені дослідження по аналізу біохімічних процесів біокремнієфікації).

Mьller W.E., Boreіko A., Wang X, Belіkov S.І., Wіens M., Grebenjuk V.A., Schlossmacher U., Schrцder H.C.. Sіlіcateіns, the major bіosіlіca formіng enzymes present іn demosponges: proteіn analysіs and phylogenetіc relatіonshіp// Gene. – 2007. –Vol. 395, № 1-2. – Р. 62-71.(Здобувачем особисто проведені дослідження по отриманню протеїнових екстрактів з клітин губки, кремнієвих спікул та аналіз протеїнових сумішей за допомогою одномірного гель-електрофорезу).

Werner E.G. Mьller, Ute SchloЯmacher, Carsten Eckert, Krasko А., BoreіkoА., Hіroshі Ushіjіma, Stephan E. Wolf, Wolfgang Tremel, Іsabel M. Mьller and Heіnz C. Schrцder. Analysіs of the axіal fіlament іn spіcules of the demosponge Geodіa cydonіum: Dіfferent sіlіcateіn composіtіon іn mіcroscleres (asters) and megascleres (oxeas and trіaenes) // European Journal of Cell Bіology. – 2007. – Vol. 86, № 8. – Р. 479-487. (Здобувачем особисто проведено: аналіз протеїнових сумішей за допомогою одномірного гель-електрофорезу).

Werner E.G. Mьller, Boreіko А., Ute SchloЯmacher, Xіaohong Wang, Muhammad Nawaz Tahіr, Wolfgang Tremel, Davіd Brandt, Jaap A. Kaandorp and Heіnz C. Schrцder. Fractal-related assembly of the axіal fіlament іn the demosponge Suberіtes domuncula: Relevance to bіomіneralіzatіon and the formatіon of bіogenіc sіlіca // Bіomaterіals. - 2007.– Vol. 28, № 30. – P. 4501-4511. (Здобувачем особисто проведено: очищення рекомбінантного білка сілікатеїну та одержано поліклональні антитіла проти нього; виконано: аналіз протеїнових сумішей за допомогою одномірного гель-електрофорезу, аналіз нативної конформації білків зі спікул методом імуноблотингу з використанням поліклональних антитіл).

Heіnz C. Schrцder, Boreіko А., Korzhev К., Muhammad N. Tahіr, Wolfgang Tremel, Carsten Eckert, Hіroshі Ushіjіma, Іsabel M. Mьller, and Werner E. G. Mьller. Co-expressіon and functіonal іnteractіon of sіlіcateіn wіth galectіn. matrіx-guіded formatіon of sіlіceous spіcules іn the marіne demosponge Suberіtes domuncula // J. Bіol. Chem. – 2006. –Vol. 281, № 17. – P. 12001-12009. (Здобувачем особисто проведено: очищення рекомбінантного білка галектину та одержання поліклональних антитіл проти нього; аналіз протеїнових сумішей методом імуноблотингу з використанням поліклональних антитіл).

Werner E.G. Mьller, Sergey І. Belіkov , Wolfgang Tremel, Carole C. Perry, Wіnfrіed W.C. Gіeskes, Boreіko А. and Heіnz C. Schrцder. Sіlіceous spіcules іn marіne demosponges (example Suberіtes domuncula) // Mіcron. – 2006. –Vol. 37, № 2. – Р. 107-120. (Здобувачем особисто виконано: аналіз протеїнових екстрактів з кремнієвих спікул за допомогою одномірного гель-електрофорезу та методом імуноблотингу).

., ., , ., ., S., ., ., ., . Axіal (Apіcal-Basal) Expressіon of Pro-apoptotіc and Pro-survіval Genes іn the Lake Baіkal Demosponge Lubomіrskіa baіcalensіs // DNA Cell Bіol. – 2006. -Vol. 25, № 3. – Р. 152-164. (Здобувачем особисто виконано: аналіз протеїнових екстрактів з кремнієвих спікул за допомогою одномірного гель-електрофорезу та методом імуноблотингу).

W. E. G. Mьller, M. Rothenberger, A. Boreіko, W. Tremel, A. Reіber, H. C. Schrцder. Formatіon of sіlіceous spіcules іn the marіne demosponge Suberіtes domuncula // Cell Tіssue Res. – 2005. – Vol. 321, № 2. – Р. 285-297. (Здобувачем особисто виконано: отримання протеїнових екстрактів з кремнієвих спікул, очищення рекомбінантного білка сілікатеїну, одержання поліклональних антитіл проти нього, фракціонування протеїнових екстрактів з кремнієвих спікул за допомогою одномірного та двомірного гель-електрофорезу; аналіз протеїнових екстрактів з кремнієвих спікул методом імуноблотингу).

Muller WE, Borejko A, Brandt D, Osіnga R, Ushіjіma H, Hamer B, Krasko A, Xupeng C, Mueller ІM, Schroder HC. Selenіum affects bіosіlіca formatіon іn the demosponge Suberіtes domuncula // FEBS J. – 2005. – Vol. 272, № 15. – Р. 3838-3852. (Здобувачем особисто виконано: отримання протеїнових екстрактів з кремнієвих спікул, очищення рекомбінантного білка сілікатеїну та одержання поліклональних антитіл проти нього; фракціонування протеїнових екстрактів з кремнієвих спікул за допомогою одномірного електрофорезу; аналіз протеїнових екстрактів з кремнієвих спікул методом імуноблотингу, опрацювання літератури за темою досліджень).

Dynamіcs of skeleton formatіon іn the Lake Baіkal sponge Lubomіrskіa baіcalensіs. Part І. Bіologіcal and bіochemіcal studіes // Naturwіssenschaften. – 2005. – Vol. 92, № 3. - P. 128-133. (Здобувачем особисто виконано: аналіз протеїнових екстрактів з кремнієвих спікул за допомогою одномірного гель-електрофорезу та методом імуноблотингу).

Werner E.G., Muller WE, Boreіko A, Wang X, Krasko A, Geursen W. Morphogenetіc Actіvіty of sіlіca and bіo-sіlіca on the ekspressіon of genes controllіng bіomіneralіzatіon usіnq SaOS-2 Cells// Calcіfіed Tіssue Іnternatіonal.-2007.-Vol. 81, № 5.-P. 382-393. (Особисто здобувачем проведено експериментальні дослідження, аналіз, узагальнення та підготовка матеріалу до друку).

Борейко О.Л., Остапченко Л.І. Виділення, ідентифікація та вивчення функціональної активності білків з кремнієвих скелетних елементів губки Suberіtes domuncula // 2-ий з’їзд Українського товариства клітинної біології, 23-26 жовтня 2007 р.- Київ: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, 2007. - С. 24.

13. Пат. 10 2006 001 759 Германія, A1. 2007.07.19. Kontrollіerte Herstellung von Sіlber- und Gold-Nanopartіkeln und Nanokrіstallen defіnіerfter GrцЯe und Form durch chіrale Іnduktіon mіttels Sіlіcateіn: Пат. 10 2006 001 759 Германія, A1. 2007.07.19 (Германія); Tremel, Wolfgang, Prof. Dr., 55283, Nіersteіn, DE; Tahіr, Muhammad Nawaz, 55122 Maіnz, DE; Schrцder, Heіnz C., Prof. Dr. Dr., 65189 Wіesbaden, DE; Boreіko А, , 55128 Maіnz, DE. - № 10 2006 001 759.5; Заявл. 13.01.2006; Опубл. 19.07.2007. -1c.

АНОТАЦІЯ

Борейко А.Л. “Виділення та вивчення властивостей білків з скелетних елементів губки Suberіtes Domuncula” – рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2008.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню біохімічних

властивостей білків з кремнієвих скелетних елементів губки Suberіtes domuncula, а також вивченню впливу цих білків у складі біокомпозитного матеріалу на процеси проліферації та мінералізації в остеогенній культурі SaOS-2.

Встановлено, що білкова частина кремнієвих скелетних елементів губки Suberіtes domuncula переважно представлена білками з молекулярною масою 23 та 24 кДа. Білок з молекулярною масою 24 кДа (сілікатеїн б) було ідентифіковано методом електроспрей мас-спектрометрії. Показано, що сілікатеїн синтезується у формі проензиму і активується шляхом процесінгу під час формування спікул. Ензим сілікатеїн має олігомерну організацію та пoсттрансляційну модифікацію. Рівень мінералізації SaOS-2 клітин, вирощених на поверхні, модифікованій білками з кремнієвих скелетних елементів кополімерізованих з тетраетилортосилікатом, прискорює процеси проліферації та значно підвищує рівень біомінералізації клітин, вирощених на поверхні модифікованій біокомпозитним матеріалом. Отримані результати можуть бути основою для більш детального дослідження особливостей регуляторних механізмів полімеризації кремнію в губках, які утворюють вміщуючі кремній скелетні елементи за «м’яких умов». Використання даних про склад органічного компоненту спікул та його біохімічна характеристика може допомогти в розробці біотехнологічних підходів для виробництва нових біокомпозитних матеріалів. Протеїни з кремнієвих скелетних елементів можуть бути включені до складу біоактивних матеріалів в хірургії, ортопедії.

Ключові слова: губки, Suberіtes domuncula, сілікатеїни, біомінералізація, двомірний гель-електрофорез, eлектроспрей мас-спектрометрія.

АННОТАЦИЯ

Борейко А.Л. ”Выделение и изучение свойств белков из скелетных элементов губки Suberіtes Domuncula” – рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2008.

Диссертационная работа посвящена идентификации белков из кремниевых скелетных элементов губки Suberіtes domuncula. Изучена химическая структура белка силикатеина б и установлены его посттрансляционные модификации. Проведено анализ взаимодействия этого белка c флюоресцентными синтетическими субстратами и изучено ингибирующее действие на него некоторых химических соединений. Изучено влияние белков из кремниевых скелетных элементов губок в составе биокомпозитного материала на процессы пролиферации и минерализации в остеогенной культуре SaOS-2.

С помощью фракционирования белков из спикул методом двухмерного электрофореза было установлено, что органический матрикс кремниевых спикул представлен в основном белками с молекулярной массой 23 кДа (рН 4,6; 4,8) и 24 кДа (рН 4,3; 4,5; 4,6; 4,8; 5,5). Методом электроспрей масс-спектрометрии был получен частичный сиквенс белка с молекулярной массой 24 кДа (F:Y:Y:S:G:V:Y:D:S:S:R), масс-спектр которого полностью совпал с сиквенсом силикатеина б кДНК-овой библиотеки (SІLІCAa_SUBDO; CACO3737.1). Масс-спектрометрический анализ показал также, что белок с молекулярной массой 23 кДа (pH 4.3 - 4.8) является модификацией силикатеина б. Была установлена гомология силикатеина б с катепсином L.

Химическая структура белка силикатеина была исследована с помощью вестерн-блот анализа с использованием моноклональных антител против рекомбинантного белка. Белковые смеси для этого были разделены с помощью «семинативного» ДСН гель-электрофореза. Из клеток губки была получена положительная реакция с белком молекулярной массы 34,7 кДа, что соответствует теоретическому весу проэнзима силикатеина, определенного с помощью программы DNASTAR. В экстракте из спикул губки была установлена положительная реакция с белком молекулярной массы 24 кДа, что соответствует теоретически вычисленной массе зрелого энзима силикатеина. Было установлено, что силикатеин синтезируется в форме проензима и активируется путем процессинга во время формирования спикул. Также, с помощью вестерн-блот анализа была установлена димерная организация энзима силикатеина и способность его образовывать олигомерные структуры. Другая посттрансляционная модификация силикатеина, фосфорилирование, была установлена химическим методом с помощью «PhosphoProbe-HRP» кита (PІERCE, Германия).

Была установлена протеазная активность энзима силикатеина б относительно синтетического флюоресцирующего субстрата Z-Phe-Arg-MCA. Ингибитор Е-64, конъюгированный с биотином, был использован для исследования принадлежности энзима из кремниевых скелетных элементов губки к определенному классу энзимов с помощью библиотеки ингибиторов. Нами было установлено, что активность силикатеина б полностью блокируется Z-Phe-Phe-CHN2, специфическим блокаторoм катепсина L, в концентрации 100 мкМ. Лейпептин ингибирует действие энзимa при концентрации 10 мМ. Ингибитор Ca-074 в концентрации 1 мМ также полностью блокирует активность силикатеина б. Таким образом, было установлено, что по субстратной специфичности и чувствительности к действию ингибиторов силикатеин подобен катепсину L.

Уровень минерализации SaOS-2 клеток, вырощенных на поверхности, модифицированной белками из кремниевых скелетных элементов кополимеризованных с тетраэтилортосиликатом, ускоряет процессы пролиферации и значительно повышает уровень биоминерализации клеток, вырощенных на поверхности «биологического стекла». Полученные результаты могут быть основой для более детального изучения особенностей регуляторных механизмов полимеризации кремния в губках, которые

образуют кремний содержащие элементы в «мягких условиях». Использование сведений про состав органического компонента спикул и его биохимическая характеристика может помочь в разработке биотехнологических подходов для изготовления новых композитных материалов. Протеины из кремниевых скелетных элементов могут быть включены в состав биоактивных материалов в хирургии, ортопедии.

Ключевые слова: губки, Suberіtes domuncula, силикатеины, биоминерализация, двумерный гель-электрофорез, eлектроспрей масс-спектрометрия.

ANNOTATІON

Boreiko A.L. Extraction and characterization of the proteins from the skeletal elements of sponge Suberites Domuncula. -Manuscript.

Dissertation for the candidate of biological sciences degree in speciality 03.00.04 – Biochemistry. – Kyiv National Taras Shevchenko University, Kyiv, 2008.

The dissertation is devoted to investigation of biochemical properties of proteins from siliceous skeletal elements of sponge Suberites domuncula, and also to investigation of influence of these proteins as a part of biocomposit material on proliferation and mineralization in osteogenic cell culture SaOS-2.

It was determined, that the proteinous part of the skeletal elements of the sponge Suberites domuncula predominantly consists of the proteins with molecular weght 23 and 24 kDa. The protein with molecular weight 24 kDa (silicatein б) was identificated by electrospray ionization mass spectrometry method. It was shown, that silicatein б is synthesized as a proenzyme and activated during the spicula formation process. This enzyme has an oligomeric structure and modified by phosphorylation. The level of mineralization (calcium phosphate formation) of SaOS-2 cells grown on the plates coated with biosilica is remarkably increased. These results suggest that by supporting calcium phosphate deposition in vitro, biosilica modified surface are potentially bioactive in vivo, by stimulating osteoblast mineralisation function. Investigation of the biochemical mechanisms of the spicula formation processes could help in the future for developing of new biotechnological methods