АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ

ЦИБУЛІН Олександр Сергійович

УДК 636.52/.58:611.013:612.014.44

ДІЯ МОНОХРОМАТИЧНОГО ЕЛЕКТРОМАГНІТНОГО ВИПРОМІНЮВАННЯ ОПТИЧНОГО ДІАПАЗОНУ НА ЕМБРІОНАЛЬНИЙ РОЗВИТОК ПЕРЕПЕЛА ТА СТАН ЙОГО ЕНЕРГЕТИЧНОЇ СИСТЕМИ

03.00.01 – радіобіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Білоцерківському державному аграрному університеті

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор

Якименко Ігор Леонідович

Білоцерківський державний аграрний університет,

проректор з науково-дослідної роботи,

завідувач кафедри фізики та вищої математики

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Гайченко Віталій Андрійович

Національний аграрний університет,

професор кафедри радіобіології та радіоекології

кандидат біологічних наук

Сваричевська Олена Володимирівна

Інститут ядерних досліджень НАН України,

старший науковий співробітник Центру екологічних

проблем атомної енергетики

Захист відбудеться “_____”____________ 2008 року о ______ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.562.01 Наукового центру радіаційної медицини АМН України за адресою: 03115, м. Київ, просп. Перемоги, 119/121.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Наукового центру радіаційної медицини АМН України за адресою: 04050, м. Київ, вул. Мельникова, 53

Автореферат розісланий “_____”_____________ 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.562.01 Л.О. Ляшенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На сьогодні накопичено значну кількість експериментального матеріалу щодо ефективності терапевтичного застосування монохроматичного електромагнітного випромінювання лазерних та нелазерних джерел у медицині (Гамалея Н.Ф., 1989; Самойлов Н.Г., 1992; Stadler I., 2001; Whelan H., 2003; Колесник В.Я., 2005; Брилль Г.Е., 2006). Виявлена широта біологічних ефектів монохроматичного світла привертає увагу дослідників до вивчення механізмів впливу електромагнітного випромінювання оптичного діапазону на біологічні об’єкти і до можливого широкого практичного використання цього фактора.

Дослідження біологічної ефективності неіонізуючого випромінювання стосовно тваринних організмів є одним з актуальних напрямів у радіобіології. Накопичені протягом останніх років експериментальні дані щодо регуляторного впливу неіонізуючого електромагнітного випромінювання на метаболічні процеси у тваринних організмах дозволяють розглядати цей фактор як м’який регулятор рівня метаболізму у тваринному організмі в цілому (Якименко І.Л., 2000). Актуальним є подальше дослідження проявів біологічної активності монохроматичного електромагнітного випромінювання оптичного діапазону з огляду на виявлені радіопротекторні, імуномодулюючі та гемопоезстимулюючі властивості (Клебанов Г.И. и др., 1997; Адейшвілі-Сиромятнікова М.К., 2003). В якості модельного об’єкта пташиний ембріон, як ізольована система, можливо, найкраще підходить для вивчення біологічної дії електромагнітного випромінювання лазерних та нелазерних джерел, як для оцінки впливу цих факторів на інтегральні показники біологічної системи, що розвивається, так і на окремі ланки метаболічного процесу.

Виявлена (Джикия Л.Г., 1984; Якименко І.Л., 1998–2003) здатність ла-зерного випромінювання стимулювати ембріональний розвиток і збільшувати виводимість птиці за рахунок зниження ембріональної смертності. Останнім часом у клінічних та експериментальних дослідженнях (Desmet K., 2006; Yager R., 2006) поряд з лазерними джерелами, все більше використовуються світлодіоди, які випромінюють некогерентне монохроматичне електромагнітне випромінювання.

Встановлена (Зубкова С.М., 1978; Якименко І.Л., 2000) здатність ключових ферментів антиоксидантного захисту до фотоактивації під впливом ла-зерного випромінювання оптичного діапазону; причетність гідроксилюючої системи ендоплазматичного ретикулума (Якименко І.Л., Сидорик Є.П., 2000), енергетичної системи мітохондрій (Pastore D., 2000; Кару Т.Й., 2001) до фотобіологічних ефектів монохроматичного електромагнітного випромінювання.

Враховуючи значимість дослідження закономірностей ембріогенезу тваринних організмів та вивчення регуляторних можливостей впливу на цей процес, а також ключову роль енергетичної системи в метаболізмі ембріона та потенційну можливість монохроматичного електромагнітного випромінювання оптичного діапазону впливати на функціональний стан енергетичної системи, дослідження впливу цього фактора на ембріогенез птиці, в цілому, та її енергетичну систему, зокрема, є актуальними.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася в рамках науково-дослідної теми за замовленням Міністерства аграрної політики України та Кабінету Міністрів України “Розробка комплексної технології виробництва продукції перепільництва (яєць та м’яса перепелів)”, № держреєстрації 0106U009625.

Мета дослідження. Дослідити вплив монохроматичного електромагніт-ного випромінювання оптичного діапазону нетеплових інтенсивностей на ембріональний і постнатальний розвиток перепела японського за інтенсивністю сомітогенезу, відстежити стан енергетичної системи мітохондрій, ембріональну смертність та кінцеві показники еритропоезу птиці.

У зв’язку з цим були поставлені наступні завдання:

1. Визначити інтенсивності електромагнітного випромінювання червоного (лmax=630 нм), синього (лmax=470 нм) та зеленого (лmax=520 нм) діапазонів та ефективні режими опромінення, що чинять регуляторну (стимулюючу чи пригнічуючу) дію на сомітогенез ембріонів перепелів.

2. Дати порівняльну оцінку впливу монохроматичного електромагнітного випромінювання червоного (лmax=630 нм) та синього (лmax=470 нм) діапазонів на активність ферментів енергетичної системи, рівень АТФ та динаміку пероксидного окиснення ліпідів протягом ембріонального розвитку перепелів.

3. Дослідити вплив монохроматичного електромагнітного випромінювання червоного (лmax=630 нм) діапазону на рівень гемоглобіну та кількість еритроцитів у периферійній крові перепелів.

4. Оцінити регуляторний вплив різних доз монохроматичного електро-магнітного випромінювання червоного (лmax=630 нм) діапазону на виводимість молодняку та динаміку живої маси перепелів.

Об’єкт дослідження – вплив електромагнітного випромінювання оп-тичного діапазону на організм птиці.

Предмет дослідження – дія монохроматичного некогерентного електромагнітного випромінювання червоного, синього та зеленого діапазонів нетеп-лових інтенсивностей на темпи сомітогенезу, активність ферментів енергетичної системи мітохондрій, рівень АТФ, пероксидне окиснення ліпідів, ембріональну смертність та показники еритропоезу перепелів.

Методи дослідження – морфометричні (підрахунок кількості сомітів), біохімічні (визначення вмісту пероксидів ліпідів, активності ферментів енергетичної системи мітохондрій), біолюмінесцентні (визначення АТФ), цито- та спектрометричні (вміст еритроцитів та гемоглобіну) і статистичні методи дослідження. Ембріональну смертність перепелів та продуктивні показники птиці оцінювали біометричними методами.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показана стимулююча дія монохроматичного некогерентного електромагнітного випромінювання червоного (лmax=630 нм) та синього (лmax=470 нм) діапазонів інтенсивністю 0,1 мВт/см2 на сомітогенез за триразового опромінення (по 60 с) перепелиних ембріонів через 2, 17 та 32 год після початку інкубації (патенти України № 13507 та 15500).

Встановлена пригнічуюча дія монохроматичного некогерентного електромагнітного випромінювання червоного (лmax=630 нм) та синього (лmax=470 нм) діапазонів інтенсивністю 1 мВт/см2 на сомітогенез за умов триразового опромінення по 60 с перепелиних ембріонів через 2, 17 та 32 год після початку інкубації (патенти України № 13507 та 15501).

Показана відсутність регуляторної дії на сомітоутворення випромінювання зеленого діапазону (лmax=470 нм).

Показана участь енергетичної системи мітохондрій клітин у виявлених фоторегулюючих ефектах, про що свідчить достовірне зростання активності цитохром-с-оксидази, зниження активності сукцинатдегідрогенази та тенденції щодо зміни кількості АТФ у клітинах ембріонів перепела, опромінених монохроматичним електромагнітним випромінюванням червоного (лmax=630 нм) та синього (лmax=470 нм) діапазонів.

Виявлено достовірне зростання вмісту ТБК-реагуючих сполук в гомогенатах тканин перепелиних ембріонів за умов триразового опромінення їх по 60 с через 2, 17 та 32 год після початку інкубації монохроматичним електро- магнітним випромінюванням червоного (лmax=630 нм) діапазону інтенсивністю 0,1 мВт/см2.

Встановлено достовірне збільшення виводимості перепелів та покращення гематологічних показників молодняку за умов триразового опромінення по 60 с перепелиних ембріонів через 2, 26 та 50 год після початку інкубації монохроматичним електромагнітним випромінюванням червоного (лmax=630 нм) діапазону інтенсивністю 0,1 мВт/см2.

Практичне значення. Отримані результати доповнюють і розширюють знання щодо біологічних ефектів та механізмів дії монохроматичного електромагнітного випромінювання оптичного діапазону на тваринні організми.

Використання триразового опромінення по 60 с перепелиних ембріонів через 2, 26 та 50 год після початку інкубації монохроматичним некогерентним електромагнітним випромінюванням червоного діапазону (лmax=630 нм) інтенсивністю 0,1 мВт/см2 дозволяє знизити ембріональну смертність перепела, що збільшує виводимість молодняку.

Результати роботи використовуються у навчальному процесі на кафедрі фізики та вищої математики, біологічної хімії та кафедрі технології виробництва і переробки продукції птахівництва БДАУ.

Результати досліджень представлені в методичних рекомендаціях з оцінки інтенсивності ембріогенезу, стану антиоксидантної та енергетичної систем птиці у лабораторних та виробничих умовах “Методи оцінки ембріонального розвитку птиці (за умов фоторегуляторного впливу на ембріогенез)” затверджених науково-технічною радою Міністерства аграрної політики України.

Особистий внесок здобувача. Визначення методик та схема дослід-жень відпрацьовані дисертантом разом із науковим керівником. Експериментальні дослідження, статистична обробка та аналіз отриманих даних проведені здобувачем особисто.

Апробація результатів дисертації. Результати експериментальних досліджень доповідались на Міжнародних науково-практичних конференціях “Применение лазеров в медицине и биологии” (Миколаїв, 2005; Ялта, 2005; Луцьк, 2006; Харків, 2007), ІІІ Міжнародному конгресі спеціалістів ветеринарної медицини (Київ, 2005), Міжнародній науково-практичній конференції “Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики” (Львів, 2006), Державних науково-практичних конференціях “Наукові пошуки молоді у ІІІ тисячолітті” (Біла Церква, 2004, 2005, 2006, 2007), V Державній науково-практичній конференції “Аграрна наука – виробництву” (Біла Церква, 2006), Державній науково-практичній конференції “Вплив фізичних факторів на біологічні об’єкти” (Біла Церква, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 18 друкованих праць: з них 6 статей у фахових виданнях, 8 тез доповідей у матеріалах конференцій, 1 методичні рекомендації, отримано 3 патенти України.

Обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень та їх обговорення, висновків і практичних рекомендацій. Загальний об’єм дисертації складає 154 сторінки комп’ютерного тексту, що містить 22 таблиці, 5 рисунків. Список використаної літератури налічує 320 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи досліджень. Експериментальні дослідження проведені протягом 2003–2006 років у Білоцерківському державному аграрному університеті. Для кожного досліду формували контрольні та дослідні групи-аналоги інкубаційних яєць перепела японського (Coturnix сoturnix japonica), що були однакові за усіма ознаками (вага, термін зберігання, вік та умови утримання птиці тощо).

Дослідження дії монохроматичного електромагнітного випромінювання оптичного діапазону на сомітогенез перепелиних ембріонів в інкубаційному яйці проводили за допомогою світлодіодів L7113PDC/H (лmax=630 нм), L7143PDC/H (лmax=470 нм), L7143VGC/H (лmax=520 нм). Опромінення здійснювали в цілковитій темряві триразово по 60 с (через 2, 17 та 32 год після початку інкубації). Інтенсивність падаючого випромінювання, яку змінювали, варіюючи площу світлової плями після розфокусування лінзою, для електромагнітного випромінювання червоного діапазону становила 0,01; 0,1; 1 та 20 мВт/см2. Інтенсивність випромінювання синього та зеленого діапазонів – 0,1 та 1 мВт/см2, які були обрані у зв’язку з тим, що дані інтенсивності електромагніт-ного випромінювання виявилися найбільш ефективними у дослідах з випромінюванням червоного діапазону. Вимірювання інтенсивності електромагнітного випромінювання, що падало на поверхню інкубаційних яєць, виконували за допомогою приладу “Измеритель лучевых потоков” (Україна). Контрольні групи-аналоги ембріонів не опромінювали.

У процесі вивчення впливу електромагнітного випромінювання червоного діапазону різної інтенсивності на ранній ембріональний розвиток інкубацію проводили в 3-х режимах: за умов оптимальної температури для перепелиного ембріона – 38,5 °С (Рольник В.В., 1989), а також зниженої – 36,5 °С та підвищеної – 41,2 °С. У дослідах з синім та зеленим світлом були використані два температурних режими – оптимальна та знижена температури інкубації. Інкубацію груп-аналогів (nі=10) здійснювали у лабораторному інкубаторі ИЛУ Ф-03 з дотриманням стандартних вимог (Рольник В.В., 1989). У ході дослідження було проаналізовано 390 перепелиних ембріонів.

Для оцінки впливу опромінення на ранній ембріональний розвиток птиці використовували морфометричний метод підрахунку диференційованих пар сомітів, що сформувались на 38-у годину інкубації (Мельник М.А., Якименко І.Л., 2003).

У другій серії дослідів вивчали вплив монохроматичного електромагніт-ного випромінювання червоного і синього діапазонів інтенсивністю 0,1 та 1 мВт/см2 на функціональний стан енергетичної системи мітохондрій, рівень АТФ та анаеробний гліколіз. Для виконання досліду було сформовано 5 груп-аналогів інкубаційних яєць (nі=28). Для дослідження на 5-ту добу інкубації ембріони звільняли від зародкових оболонок, декапітували, заморожували та готували гомогенати тканин ембріонів у 0,25 М розчині сахарози (розведення 1:10). Для визначення кількості АТФ у тканинах ембріонів замість 0,25 М розчину сахарози використовували бідистильовану воду. У 10 – 15-добових ембріонів та добових перепелят досліджували гомогенати печінки (розведення 1:100). Функціональний стан енергетичної системи ембріонів оцінювали за активністю цитохром-с-оксидази (Кривченкова В.І., 1977) та сукцинатдегідрогенази (Прохорова М.И., 1982), вмістом АТФ (Угарова Н.Н., Фрунджян В.Г., 2003), лактатдегідрогенази, рівнем пероксидного окиснення ліпідів (Андреева Л.И. и др., 1988). Виведений молодняк оцінювали за кінцевими показниками еритроцитопоезу. З цією метою формували групи-аналоги птиці, по 30 голів у кожній. Умови утримання та годівля для усіх груп були стандартні.

Для оцінки ефективності опромінення перепелиних ембріонів монохроматичним електромагнітним випромінюванням та дослідження його впливу на ембріональну смертність перепелів формували групи-аналоги інкубаційних яєць. Дослідні групи загальною кількістю 901 яйце опромінювали монохроматичним червоним світлом інтенсивністю 0,1 та 1 мВт/см2 тричі на 2, 26 та 50-ту години інкубації. Ембріональну смертність оцінювали за стандартними методиками (Солонина О.С. и др., 1990).

Результати досліджень обробляли за стандартними статистичними методами у програмі Microsoft Excel. Достовірність різниць між групами оцінювали, використовуючи критерії Фішера та Стьюдента (Плохинский Н.Д., 1969).

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив монохроматичного електромагнітного випромінювання оптичного діапазону різних довжин хвиль на ранній ембріональний розвиток перепела. На момент закладання яєць у інкубатор пташиний ембріон перебуває на стадії ранньої гаструли. У перші години інкубації завершується стадія гаструляції, тобто відбувається додаткове утворення ентодермальних клітин та кінцеве диференціювання ентодермального зародкового шару. Приблизно у добовому віці мезодерма ембріона починає диференціюватись на соміти, нефротоми та спланхнотоми. Соміти та нефротоми сегментовані, їх диференціювання відбувається спереду назад, причому перша пара сомітів утворюється у 18–20-годинного пташиного ембріона (Dupuy V., 2002).

Під час опромінення інкубаційного яйця монохроматичне світло поглинається усіма структурами, що входять до його складу, – шкаралупою, підшкаралупною оболонкою, білковою оболонкою, жовтком, клітинами ембріона. Зокрема встановлено (Иванов Н.З. и др., 1988), що світлопроникність неушкодженого яйця курки для видимого світла складає 0,7–5,7 % (на гострому кінці яйця) та 0,4–2,4 % (в ділянці тіні жовтка). Після проходження через шкаралупу світло рівномірно розсіюється на структурах інкубаційного яйця, що спричиняє відносно рівномірне опромінення всіх його внутрішніх структур (Якименко І.Л., 2001).

У зв’язку зі стабільним часом утворення сомітів їх кількість є найбільш об’єктивним критерієм розвитку пташиного ембріону (Рольник В.В., 1968). Дослідження перепелиних ембріонів на 38-у годину інкубації дозволило встановити як достовірну стимулюючу, так і пригнічуючу дію монохроматичного електромагнітного випромінювання залежно від довжини хвилі та інтенсивності потоку.

На 38-у годину інкубації за оптимальної температури кількість диференційованих пар сомітів у контрольній групі становила 10,33±0,56. За використання електромагнітного випромінювання червоного діапазону (лmax=630 нм) інтенсивністю 0,1 мВт/см2 спостерігали збільшення кількості сомітів на 20,43 % (р<0,01) порівняно з контролем (рис. 1). Збільшення інтенсивності випромінювання до 1 мВт/см2 призводило до пригнічення ембріонального розвитку, про що свідчить зменшення кількості диференційованих пар сомітів на 24,61 % (р<0,01) порівняно з контролем. За інтенсивності електромагнітного випромінювання 0,01 та 20 мВт/см2 не виявлено достовірного впливу опромінення на сомітогенез, що, ймовірно, пов’язано з існуванням лише певних ефективних доз опромінення, які будуть мати відображення у зміні розвитку ембріона.

Зниження температури інкубації до 36,5 єС уповільнювало розвиток перепелиного ембріона, на що вказує зменшення кількості диференційованих пар сомітів, що сформувались на 38-у годину інкубації в контрольній групі до 6,88±0,44. За зниженої температури інкубації електромагнітне випромінювання червоного діапазону інтенсивністю 0,1 мВт/см2 також стимулювало інтенсивність сомітогенезу, що проявлялось у збільшенні кількості сомітів на 27,62 % (р<0,001) порівняно з контрольною групою. Електромагнітне випромінювання інтенсивністю 0,01 мВт/см2 збільшувало на 9,88 %, а 1 мВт/см2 ? знижувало на 9,55 % кількість диференційованих пар сомітів. Проте різниця в обох групах не була достовірною.

За підвищеної температури інкубації до 41,2 єС у контрольній групі від-мічали зростання кількості диференційованих пар сомітів до 13,88±0,48, що на 37,37 % більше, порівняно з групою, розвиток якої відбувався за оптимальної температури. Опромінення у вказаних режимах не чинило достовірної дії на сомітоутворення.

Рис. 1. Вплив триразового опромінення перепелиних ембріонів монохроматичним випромінюванням червоного діапазону (лmax=630 нм) на кількість диференційованих пар сомітів на 38-у годину інкубації: n=10; M±m

Примітка: тут і далі * – р<0,05; ** – р<0,01, *** – р<0,001 порівняно з контролем

За оптимальної температури інкубації триразове опромінення інкубаційних яєць електромагнітним випромінюванням як червоного, так і синього діапазону проявляло стимулюючу або пригнічуючу дію на ембріональний розвиток перепела залежно від інтенсивності випромінювання. Електромагнітне випромінювання синього діапазону інтенсивністю 0,1 мВт/см2 збільшувало на 15,18 % (р<0,01) кількість диференційованих пар сомітів порівняно з контролем (при рівні у контролі 11,0±0,31). За інтенсивності потоку електромагнітного випромінювання синього діапазону 1 мВт/см2 спостерігали зменшення на 31,26 % (р<0,001) кількості пар сомітів ембріона порівняно з контролем (рис. 2а).

За зниженої температури інкубації електромагнітне випромінювання синього діапазону інтенсивністю 0,1 мВт/см2 приводило до збільшення кількості сомітів на 38,48 % (р<0,001), порівняно з контролем, де цей показник склав 6,8±0,37. Інтенсивність електромагнітного випромінювання синього діапазону 1 мВт/см2 практично не впливала на сомітогенез.

Впливу на сомітогенез монохроматичного електромагнітного випромінювання зеленого діапазону інтенсивністю 0,1 та 1 мВт/см2 не було виявлено. Обидві величини інтенсивності електромагнітного випромінювання цього діапазону практично не впливали на ранній ембріональний розвиток птиці як за оптимальної, так і зниженої температури інкубації (рис. 2б).

Рис. 2. Вплив триразового опромінення перепелиних ембріонів монохроматичним випромінюванням синього (лmax=470 нм (а)) та зеленого (лmax=520 нм (б)) діапазонів на кількість диференційованих пар сомітів на 38-у годину інкубації за різних температурних режимів інкубації: n=10; M±m

Отримані нами результати можуть бути розцінені як результат м’якої режимозалежної регуляції проліферативних процесів у період раннього ембріонального розвитку птиці внаслідок дії на ембріони монохроматичного електромагнітного випромінювання. Цей ефект залежить від довжини хвилі та інтен-сивності електромагнітного випромінювання, і не пов’язаний з тепловою дією світла, оскільки інтенсивності електромагнітного випромінювання, використані в експерименті, вважаються нетепловими (Илларионов В.Е., 1992). Виявлені ефекти вказують на можливе існування певних фотоакцепторів у структурі інкубаційного яйця, які, поглинаючи світлову енергію, ймовірно, приводять до певної модифікації фізико-хімічних та біологічних процесів, що відбуваються у ембріоні, який розвивається.

Активність ферментів енергетичного метаболізму за опромінення ембріонів монохроматичним електромагнітним випромінюванням. У деяких роботах (Morimoto Y., 1994; Eells J., 2003) показано, що потенційним фотоакцептором за активації клітинного дихання монохроматичним електро-магнітним випромінюванням є цитохром-с-оксидаза. Наші дослідження зміни її активності у тканинах 5-добових та печінці 10-, і 15-добових ембріонів, а також добових перепелят за дії на ембріони електромагнітного випромінювання оп-тичного діапазону підтверджують причетність цього ферменту до механізмів реалізації біологічної дії досліджуваного фактора. Так, за опромінення ембрі-онів монохроматичним електромагнітним випромінюванням червоного діапазону інтенсивністю 0,1 мВт/см2 спостерігали достовірне (р<0,05) збільшення активності цитохром-с-оксидази на 9,0 % у 5-добових ембріонів (рис. 3а). На 10-ту добу не було відмічено різниці активності ферменту між контрольною та дослідною групами. Проте на 15-ту добу знову спостерігали збільшення активності цитохром-с-оксидази в дослідній групі на 9,22 % (р<0,05) відносно контролю. Добовий молодняк дослідної та контрольної групи мав приблизно однакову активність ферменту у тканинах печінки.

Електромагнітне випромінювання червоного діапазону інтенсивністю 1 мВт/см2 практично не впливало на активність цитохром-с-оксидази у тканинах 5-ти та печінці 10-добових ембріонів. 15-добові ембріони та добові перепели дослідної групи мали дещо нижчу активність ферменту, порівняно з контролем, але різниця між групами не була достовірною.

Рис. 3. Активність цитохром-с-оксидази у гомогенаті тканин ембріонів (5е?) та печінці (10е, 15е, добові) за опромінення перепелиних ембріонів монохроматичним випромінюванням червоного (лmax=630 нм (а)) та синього (лmax=470 нм (б)) діапазонів: n=7; M±m, нмоль окисненого диметил-п-фенілендіаміну

Застосування монохроматичного електромагнітного випромінювання синього діапазону (лmax=470 нм) інтенсивністю 0,1 мВт/см2 також приводило до збільшення у тканинах 5-добових ембріонів активності цитохром-с-оксидази в дослідній групі на 12,65 % (р<0,05) порівняно з контролем (рис. 3б). 10-, 15-добові ембріони та добовий молодняк не відрізнялись за активністю цитохром-с-оксидази порівняно з контрольною групою.

За дії на перепелині ембріони у перші доби інкубації монохроматичного електромагнітного випромінювання синього діапазону (лmax=470 нм) інтенсивністю 1 мВт/см2 не було відмічено суттєвих змін активності цитохром-с-оксидази у гомогенатах тканин ембріонів дослідної та контрольної груп протягом усього дослідного періоду.

Отже, отримані результати вказують на незначну активацію цитохром-с-оксидази внаслідок дії монохроматичного електромагнітного випромінювання червоного та синього діапазонів на ембріони перепела, що, можливо, відбувається за рахунок збудження реакційних центрів ферменту (цитохрому а, цитохрому а3, CuA, CuB) внаслідок опромінення, яке приводить до зміни окисно-відновних властивостей цих центрів та, як наслідок, до зміни швидкості перенесення електронів на кисень (Karu T., 2001).

У тканинах ембріонів, що були опромінені монохроматичним електромагнітним випромінюванням червоного діапазону інтенсивністю 0,1 мВт/см2, активність сукцинатдегідрогенази на 5-ту добу інкубації була на 10,51 % нижчою, ніж у контролі (рис. 4а). Тканини печінки 10-добових ембріонів мали на 9,82 % нижчою стосовно контролю активність ферменту. У 15-добових ембріонів та добового молодняку сукцинатдегідрогеназна активність печінки була на рівні контролю. В усіх випадках різниця з контролем не була достовірною.

За інтенсивності монохроматичного електромагнітного випромінювання червоного діапазону 1 мВт/см2 активність сукцинатдегідрогенази у 5-добових ембріонів була на 66,56 % (р<0,001) нижчою, ніж у контрольній групі. У нас-тупні періоди дослідження також було відмічено низький відносно контролю рівень активності сукцинатдегідрогенази.

Рис. 4. Активність сукцинатдегідрогенази у гомогенаті тканин ембріонів (5е?) та печінці (10е, 15е, добові) за опромінення перепелиних ембріонів монохроматичним випромінюванням червоного (лmax=630 нм (а)) та синього (лmax=470 нм (б)) діапазонів: n=7; M±m, нмоль сукцинату/хв*мг

За опромінення перепелиних ембріонів монохроматичним випромінюванням синього діапазону інтенсивністю 0,1 мВт/см2 було відмічено зниження активності сукцинатдегідрогенази у тканинах 5-добових ембріонів на 30,34 % (р<0,05) порівняно з контрольною групою (рис. 4б). У подальшому активність ферменту у 10- та 15-добових ембріонів була дещо вищою, ніж у контролі. Збільшення сукцинатдегідрогеназної активності тканин печінки перепелів на 13,09 % спостерігали і в добового молодняку.

У другій групі, де інтенсивність випромінювання синього діапазону була 1 мВт/см2 у 5-добових ембріонів, також спостерігали зниження активності сукцинатдегідрогенази на 25,0 % порівняно з контролем. У 10-добових ембріонів цей показник був на рівні контрольної групи. Тканини печінки 15-добових ембріонів мали сукцинатдегідрогеназну активність на 14,47 % більшу, ніж у контролі, а в добового молодняку – на рівні контролю.

Враховуючи те, що зниження активності СДГ за опромінення ембріонів електромагнітним випромінюванням відбувається на фоні підвищення активності цитохром-с-оксидази, такий ефект можна пояснити активацією саме термінального ферменту дихального ланцюга за дії на ембріони електромагнітного випромінювання, що, можливо, відбувається за рахунок зростання активності комплексу І: НАДН-дегідрогенази електронтранспортного ланцюга мітохон-дрій.

Кінцевим показником ефективності функціонування енергетичної системи мітохондрій є кількість АТФ, що накопичується внаслідок активного транспорту електронів дихальним ланцюгом.

У групі ембріонів, які були опромінені монохроматичним електромаг-нітним випромінюванням червоного діапазону інтенсивністю 0,1 мВт/см2, кількість АТФ у тканинах ембріонів зростала на 21,76 % порівняно з контролем. Збільшення інтенсивності випромінювання до 1 мВт/см2 призводило до зниження кількості АТФ на 16,69 % порівняно з контролем. За застосування монохроматичного електромагнітного випромінювання синього діапазону інтенсивністю 0,1 мВт/см2 не було відмічено суттєвої різниці між дослідною та конт-рольною групами. Натомість у другій дослідній групі, де інтенсивність випромінювання була 1 мВт/см2, спостерігали зниження кількості АТФ на 25,08 % порівняно з контрольною групою. Різниця між дослідними та контрольною групами не була достовірною.

Таким чином, можна говорити про тенденцію зміни рівня АТФ – підвищення чи зниження, залежно від інтенсивності випромінювання, у тканинах внаслідок опромінення ембріонів монохроматичним електромагнітним випромінюванням червоного та синього діапазонів. Цей ефект, можливо, виникає внаслідок зміни активності цитохром-с-оксидази за опромінення перепелиних ембріонів.

За опромінення інкубаційних яєць перепела електромагнітним випромінюванням червоного діапазону (лmax=630 нм) інтенсивністю 0,1 та 1 мВт/см2 не було відмічено суттєвої різниці в активності лактатдегідрогенази між дослід-ними та контрольними групами (рис. 5а).

Опромінення електромагнітним випромінюванням синього діапазону (лmax=470 нм) перепелиних ембріонів інтенсивністю 0,1 мВт/см2 не призводило до зміни активності лактатдегідрогенази відносно контролю у 5-, 10- та 15-добових ембріонів (рис. 5б). У добових перепелів активність лактатдегідрогенази була більшою на 12,8 % (р<0,05) порівняно з контрольною групою.

Рис. 5. Активність лактатдегідрогенази у гомогенаті тканин ембріонів (5е?) та печін-ці (10е, 15е, добові) за опромінення перепелиних ембріонів монохроматичним випромінюванням червоного (лmax=630 нм (а)) та синього (лmax=470 нм (б)) діапазонів: n=7; M±m, ум. од.

За дії (рис. 5б) на перепелині ембріони у перші доби інкубації монохроматичним електромагнітним випромінюванням синього діапазону інтенсивністю 1 мВт/см2 спостерігали зростання активності лактатдегідрогенази у гомогенатах тканин печінки добових перепелів на 18,66 % (р<0,05) порівняно з кон-тролем, що, можливо, пов’язано зі зростанням інтенсивності анаеробного гліколізу, який супроводжує період виведення молодняку (Ливак И.И., Скворук В.И., 1985) та активізується під дією монохроматичного електромагнітного випромінювання синього діапазону.

Дія монохроматичного електромагнітного випромінювання червоного та синього діапазонів на пероксидне окиснення ліпідів у тканинах ембріонів перепела. Враховуючи те, що активація роботи дихального ланцюга мітохондрій призводить до підвищення рівня утвореного супероксидного аніона та, відповідно, продукту його дисмутації – перекису водню (Dalton T. et al, 1999), було досліджено вплив триразового опромінення монохроматичним електромагнітним випромінюванням червоного та синього діапазонів перепелиних ембріонів на рівень пероксидного окиснення ліпідів.

Опромінення перепелиних ембріонів електромагнітним випромінюванням червоного діапазону (лmax=630 нм) інтенсивністю 0,1 мВт/см2 сприяло незначному, але достовірному (р<0,05) зростанню вмісту пероксидних ліпідних сполук у тканинах ембріонів на 5-ту добу інкубації, що відображалось у різниці з контролем на 5,53 % (рис. 6а). У процесі дослідження гомогенатів печінки 10-добових ембріонів було відмічено зростання досліджуваного показника на 30,11 % (р<0,05) порівняно з контрольною групою. На 15-ту добу інкубації інтенсивність пероксидного окиснення ліпідів у печінці ембріонів дослідної групи була на 36,27 % (р<0,05) більшою порівняно з контрольною групою. Вміст ТБК-реагуючих сполук у добового молодняку був на 45,81 % (р<0,001) більшим, ніж у птиці контрольної групи. Такий ефект може бути пов’язаний із зростанням інтенсивності проліферації внаслідок опромінення ембріонів, адже показано (Grossman J. et al., 1998), що пероксид водню відіграє важливу роль при проліферації клітин.

Рис. 6. Вміст продуктів пероксидного окиснення ліпідів у гомогенаті тканин ембріонів (5е?) та печінці (10е, 15е, добові) за опромінення перепелиних ембріонів монохроматичним випромінюванням червоного (лmax=630 нм (а)) та синього (лmax=470 нм (б)) діапазонів: n=7; M±m, мкмоль/г

У другій групі, де інтенсивність електромагнітного випромінювання була 1 мВт/см2, також спостерігали зростання інтенсивності пероксидного окиснення ліпідів у тканинах 5-добових ембріонів на 13,29 % (р<0,05) порівняно з контролем. У наступні періоди дослідження різниця між контрольними та дослідними групами була недостовірною. У 10-добових ембріонів вміст ТБК-реагуючих сполук був нижчим на 8,64 %. У подальшому відмічали зростання інтенсивності ліпопероксидації у тканинах печінки ембріонів дослідної групи на 6,86 % на 15-ту добу інкубації та на 8,94 % у добових перепелят порівняно з контролем.

Опромінення перепелиних ембріонів у перші доби інкубації електро-магнітним випромінюванням синього діапазону (лmax=470 нм) інтенсивністю 0,1 мВт/см2 знижувало інтенсивність пероксидного окиснення ліпідів на 28,88(р<0,05) порівняно з контрольною групою у 5-добових ембріонів (рис. б). Але вже на 10-ту добу інкубації вміст ТБК-реагуючих сполук у печінці птиці дослідної групи перевищував цей показник у контролі на 12,5 %. У 15-добових ембріонів дослідної групи вміст пероксидів ліпідів наближався до контрольного рівня. У добового молодняку відмічено зростання рівня перок-сидного окиснення ліпідів на 11,73 % відносно контролю.

Збільшення інтенсивності потоку електромагнітного випромінювання до 1 мВт/см2 сприяло зростанню на 10,78 %, порівняно з контролем, вмісту ТБК-реагуючих сполук, що спостерігали у печінці дослідної птиці на 15-ту добу розвитку. Дещо більша різниця (12,85 %) зберігалась і в добових перепелят.

Слід відмітити, що достовірне зростання рівня пероксидного окиснення ліпідів відмічали у дослідній групі, яка характеризувалась достовірним зростанням кількості диференційованих пар сомітів.

За встановлення кореляційних зв’язків між аналізованими показниками дослідних та контрольних груп була виявлена висока позитивна кореляція (r=0,91; р<0,001) у контрольній групі між активністю цитохром-с-оксидази та лактатдегідрогенази.

У перепелиних ембріонів, опромінених монохроматичним червоним світлом інтенсивністю 0,1 мВт/см2, також була висока позитивна кореляція (r=0,96; р<0,001) між динамікою активності цитохром-с-оксидази та лактат-дегідрогенази.

Висока позитивна кореляція відмічена між активністю цитохром-с-оксидази та лактатдегідрогенази (r=0,86; р<0,001) у групі перепелиних ембріонів, опромінених електромагнітним випромінюванням червоного діапазону інтенсивністю 1 мВт/см2, а також встановлена висока позитивна кореляція між активністю цитохром-с-оксидази та сукцинатдегідрогенази (r=0,82; р<0,001), сукцинатдегідрогенази та лактатдегідрогенази (r=0,86; р<0,001), і помірна позитивна кореляція між активністю сукцинатдегідрогенази та рівнем ПОЛ (r=0,65; р<0,001), активністю цитохром-с-оксидази та ПОЛ (r=0,57; р<0,001).

У дослідній групі, де опромінення здійснювали монохроматичним електромагнітним випромінюванням синього діапазону інтенсивністю 0,1 мВт/см2, визначена висока позитивна кореляція між активністю цитохром-с-оксидази та сукцинатдегідрогенази (r=0,79; р<0,001), цитохром-с-оксидази та лактатдегідрогенази (r=0,9; р<0,001). Помірна позитивна кореляція виявлена між активністю сукцинатдегідрогенази та лактатдегідрогенази (r=0,64; р<0,001), активністю сукцинатдегідрогенази та рівнем ПОЛ (r=0,66; р<0,001).

Встановлена висока позитивна кореляція (r=0,9; р<0,001) між активністю цитохром-с-оксидази та лактатдегідрогенази у групі, що була опромінена монохроматичним електромагнітним випромінюванням синього діапазону інтенсивністю 1 мВт/см2. Висока позитивна кореляція відмічена між активністю сукцинатдегідрогенази та лактатдегідрогенази (r=0,87; р<0,001), активністю цитохром-с-оксидази та сукцинатдегідрогенази (r=0,75; р<0,001). Між активністю цитохром-с-оксидази та рівнем ПОЛ встановлена помірна позитивна кореляція (r=0,56; р<0,001), яка також відмічена між активністю сукцинатдегідрогенази та ПОЛ (r=0,65; р<0,001).

Вплив електромагнітного випромінювання оптичного діапазону на ембріональну смертність перепелів. Регулюючий вплив монохроматичного електромагнітного випромінювання червоного діапазону, що був виявлений на ранніх етапах ембріогенезу, підтверджується аналізом інкубації перепелиних ембріонів. За опромінення їх монохроматичним електромагнітним випромінюванням (лmax=630 нм) інтенсивністю 0,1 мВт/см2 спостерігали зростання виведення на 9,57 % (р<0,05), а виводимості – на 9,26 % (р<0,05), порівняно з контролем, де ці показники склали відповідно 77,39 та 81,65 % . Кількість загиблих ембріонів протягом 1–5-ї доби інкубації у дослідній групі була у 2,5 рази меншою, ніж у контрольній групі. У 7 разів зменшувалась кількість ембріонів, що загинули на 16–17-у добу інкубації.

Інтенсивність потоку електромагнітного випромінювання 1 мВт/см2 не призводила до достовірних змін ембріональної смертності птиці. Виявлені ефекти корелюють з даними щодо впливу різних інтенсивностей випромінювання на ембріогенез. Це означає, що регуляція ембріогенезу монохроматичним електромагнітним випромінюванням на ранніх етапах характеризується зміною (стимуляцією чи пригніченням) інтенсивності сомітогенезу, у подальшому – зміною функціонування енергетичної системи мітохондрій, що й впливає на ембріональну смертність птиці.

Економічна ефективність застосування монохроматичного червоного світла для стимуляції ембріонального розвитку перепела. Враховуючи, що застосування триразового опромінення монохроматичним електромагнітним випромінюванням червоного діапазону (лmax=630 нм) інтенсивністю 0,1 мВт/см2 по 60 с у перші доби інкубації (через 2, 26 та 50 год після початку інкубації) перепелиних ембріонів збільшує виводимість на 9,26 %, тобто додатково дає 92 перепелят на 1000 шт. проінкубованих перепелиних яєць. Вартість одного добового перепеляти складає 1,5 грн. Загальна вартість на 1000 проінкубованих яєць буде складати 138 грн.

При цьому витрати будуть полягати у придбанні матриці світлодіодів, вартість якої становить 1000 грн. Додаткові витрати на оплату праці практично відсутні, тому що розроблений режим опромінення достатньо простий у застосуванні та не порушує технології інкубації перепелиних яєць.

За середньомісячного обсягу інкубації у фермерських господарствах до 30 тис. шт. перепелиних яєць додатковий дохід буде складати 4140 грн на місяць (у перший місяць, у зв’язку з придбанням обладнання, дохід буде складати 3140 грн, тобто 104,7 грн на 1000 шт. проінкубованих перепелиних яєць).

Показники крові перепелів за опромінення ембріонів на початку інкубації монохроматичним електромагнітним випромінюванням червоного діапазону. Кількість еритроцитів, рівень гемоглобіну та вміст гемоглобіну в одному еритроциті є важливими показниками для оцінки загального стану організму птиці.

Опромінення ембріонів на ранніх етапах розвитку монохроматичним електромагнітним випромінюванням червоного діапазону (лmax=630 нм) інтенсивністю 0,1 мВт/см2 не викликало змін у кількості еритроцитів крові виведеного молодняку у першу добу життя порівняно з контрольною групою (табл. 1).

Рівень гемоглобіну у цій групі був вищим на 19,99 % (р<0,01) відносно контрольних показників. Вміст гемоглобіну в одному еритроциті був на 19,47вищим, ніж у птахів контрольної групи. У 3-тижневої птиці відмічали зниження кількості червоних клітин крові на 10,78 % (р<0,05) порівняно з контролем (див. табл. 1). Кількість еритроцитів, рівень гемоглобіну та вміст гемоглобіну в одному еритроциті у птиці 6-тижневого віку цієї дослідної групи практично не відрізнялися від контрольних показників (див. табл. 1).

Аналізуючи показники крові птиці, що була опромінена на ранніх стадіях ембріогенезу монохроматичним електромагнітним випромінюванням інтенсивністю 1 мВт/см2, було відмічено достовірне (р<0,001) зниження відносно контролю на 34,12 % кількості еритроцитів крові. Зменшувався й рівень гемоглобіну крові на 9,45 %. Проте вміст гемоглобіну в одному еритроциті зростав на 22,51 %. У 3-тижневої птиці кількість еритроцитів крові наближалась до контрольних показників. Рівень гемоглобіну крові був нижчим на 16,17 % (р<0,05). У той же час вміст гемоглобіну в одному еритроциті також був на 8,39меншим, ніж у контрольній групі. У 6-тижневої птиці дослідної групи нижчим був рівень гемоглобіну крові. Контрольний показник перевищував його на 15,18 % (р<0,05). Вміст гемоглобіну в одному еритроциті, хоча й недостовірно, але також був нижчим на 6,73 % порівняно з контролем.

Таблиця 1

Показники крові перепелів за триразового опромінення ембріонів монохроматичним електромагнітним випромінюванням червоного діапазону (лmax=630 нм, t=180 с): (n=7; M±m)

Показники

Інтенсивність електромагнітного випромінювання, мВт/см2 | контроль | 0,1 | 1 | контроль | 0,1 | 1 | контроль | 0,1 | 1

Вік птиці | 1 доба | 3 тижні | 6 тижнів

Кількість еритроцитів, Т/л | 2,28

±0,12 | 2,29

±0,69 | 1,70

±0,04*** | 2,98

±0,08 | 2,69

±0,07* | 2,84

±0,09 | 3,45

±0,09 | 3,49

±0,12 | 3,33

±0,18

Вміст гемоглобіну, г/л | 54,69

±3,02 | 65,62

±1,37** | 49,97

±1,39 | 87,35

±3,27 | 82,95

±5,0 | 75,19

±3,65* | 130,71

±3,35 | 131,52

±6,73 | 113,48

±5,64*

Вміст гемоглобіну в еритроциті, пг | 23,99

±2,01 | 28,66

±1,31 | 29,39

±1,41 | 29,08

±0,78 | 30,09

±2,35 | 26,83

±1,52 | 36,45

±1,19 | 36,37

±1,64 | 34,15

±1,26

Гемоглобін у пташиному ембріоні з’являється вже на 33-ю годину інкубації, а початок кровообігу припадає на 36-у годину ембріогенезу (Danchakoff D., 1918). Враховуючи те, що встановлені нами зміни щодо гемоцитопоезу відповідають змінам, викликаним монохроматичним електромагнітним випромінюванням на ранніх стадіях ембріогенезу, можна припустити, що регулюючий вплив опромінення на кровотворення реалізується вже на початку інкубації.

ВИСНОВКИ

1. У дисертаційній роботі наведено нове вирішення конкретного наукового завдання – шляхи стимуляції ембріонального розвитку птиці монохроматичним електромагнітним випромінюванням оптичного діапазону. Дослід-жено вплив триразового (по 60 с) опромінення інкубаційних яєць перепела японського монохроматичним випромінюванням червоного (лmax=630 нм, р'=0,01–20 мВт/см2) та синього (лmax=470 нм, р'=0,1–1 мВт/см2) діапазонів на ембріональний розвиток, що виражається у зміні швидкості сомітогенезу, ак-тивності ферментів енергетичної системи мітохондрій, анаеробного гліколізу, рівні АТФ, інтенсивності пероксидного окиснення ліпідів, кінцевих показників еритропоезу та ембріональної смертності птиці. Електромагнітне випромінювання зеленого діапазону (лmax=520 нм, р'=0,1–1 мВт/см2) не чинить такої дії.

2. Триразове опромінення перепелиних ембріонів монохроматичним електромагнітним випромінюванням червоного (лmax= 630 нм) та синього (лmax=470 нм) діапазонів інтенсивністю 0,1 мВт/см2 по 60 с справляє стимулюючий вплив на їх ранній ембріональний розвиток, про що свідчить достовірне (р<0,01) збільшення на 15,18 – 20,43 % кількості диференційованих пар сомітів на 38-у годину інкубації порівняно з контролем. Ефект пригнічення сомітогенезу на 24,61–31,26 % (р<0,01) спостерігається за триразового опромінення ембріонів монохроматичним електромагнітним випромінюванням червоного (лmax=630 нм) та синього (лmax=470 нм) діапазонів інтенсивністю 1 мВт/см2 по 60 с.

3. Встановлено зростання активності цитохром-с-оксидази у тканинах 5-добових (на 9,0 %, р<0,05) та печінці 15-добових ембріонів (на 9,22 %, р<0,05) порівняно з контролем за їх триразового опромінення електромагнітним випромінюванням червоного діапазону (лmax=630 нм) інтенсивністю 0,1 мВт/см2 по 60 с. Монохроматичне електромагнітне випромінювання синього діапазону (лmax=470 нм) викликає збільшення на 12,65 % (р<0,05) активності ферменту у тканинах 5-добових ембріонів порівняно з контролем.

4. Показано зниження активності сукцинатдегідрогенази на 66,56 % (р<0,001), порівняно з контролем у тканинах 5-добових ембріонів, що були опромінені монохроматичним електромагнітним випромінюванням червоного діапазону (лmax=630 нм) інтенсивністю 1 мВт/см2. Електромагнітне випромінювання синього діапазону (лmax=470 нм) знижує активність сукцинатдегідрогенази на 30,34 % (р<0,05) у тканинах 5-добових ембріонів за інтенсивності 0,1 мВт/см2.

5. Встановлено, що у тканинах 5-добових ембріонів, які були опромінені монохроматичним електромагнітним випромінюванням червоного діапазону (лmax=630 нм) інтенсивністю 0,1 мВт/см2 рівень АТФ зростає на 21,76 % порівняно з контролем. Збільшення інтенсивності випромінювання до 1 мВт/см2 призводить до зниження рівня АТФ на 16,69 %. Це можна розцінювати як режимозалежний вплив опромінення на продукцію АТФ, що корелює зі спрямованістю впливу опромінення на сомітогенез.

6. Відмічається збільшення активності лактатдегідрогенази у добового молодняку, виведеного з інкубаційних яєць, які були опромінені електро-магнітним випромінюванням синього діапазону (лmax=470 нм) інтенсивністю 0,1 та 1 мВт/см2 відносно