МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ ПІСЛЯДИПЛОМНОЇ ОСВІТИ імені П.Л. ШУПИКА

Черенько Тетяна Макарівна

УДК616.831-005.4:[612.017.3:616-008.6]:616.8

КЛІНІКО-ПАТОГЕНЕТИЧНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ КОРЕКЦІЇ ЗАПАЛЬНО-НЕЙРОІМУННИХ ПОРУШЕНЬ У ХВОРИХ НА ІШЕМІЧНИЙ ІНСУЛЬТ

14.01.15 – нервові хвороби

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі нервових хвороб Національного медичного університету імені. О.О.Богомольця МОЗ України

Науковий консультант

доктор медичних наук, професор

Віничук Степан Мілентійович,

Національний медичний університет імені О.О.Богомольця,

кафедра нервових хвороб, завідувач кафедри

Офіційні опоненти:

Доктор медичних наук, професор

Западнюк Богдан Віталійович

Київський національний університет внутрішніх справ,

кафедра судової медицини, начальник кафедри

Доктор медичних наук, професор,

Кузнєцова Світлана Михайлівна

Інститут геронтології АМН України, відділ судинної патології головного мозку, завідуюча відділом

Доктор медичних наук, професор

Міщенко Тамара Сергіївна

Інститут неврології, психіатрії та наркології АМН України,

відділення судинної патології головного мозку, керівник відділення

Захист відбудеться 30.05.2008 р. о 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.613.01 у Національній медичній академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика МОЗ України за адресою: 04112, м. Київ, вул. Дорогожицька, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика МОЗ України за адресою: 04112, м. Київ, вул. Дорогожицька, 9.

Автореферат розісланий 26.04. 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Т.М.Каліщук-Слободін

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема інсульту беззаперечно визнається однією з найактуальніших в сучасній світовій медицині. Статистика інсульту дотепер залишається незадовільною: у світі щорічно виявляється інсульт у понад 7 млн. осіб, для майже 4,5 млн. пацієнтів судинна катастро-фа закінчується фатально [Leys D. et al., 2004]. Частота захворюваності на мозковий інсульт в Україні істотно перевищує таку у розвинених країнах і у 2006 р. становила 281,2 випадку на 100 тис. населення. Показник смертності, хоча і має тенденцію до зниження, проте майже вдвічі вищий за такий у розвинених країнах Європи [Міщенко Т.С., 2006, 2007].

Дослідження останніх років дали змогу визначити певну послідовність та взаємозв’язок між етапами багатоланцюгового процесу церебрального ішемічного пошкодження, розкрити основні механізми змін морфології мозкової тканини та її функціонального стану при ішемії та в післяішемічний період [Волошин П.В., 2001; Боброва В.І., 2003; Віничук С.М 2003, 2006; Кузнецова С.М., 2003; Зозуля І.С., 2006; Ткаченко О.В., 2006; Astrup J., 1981; Fisher M. et al., 1996; Siesjo B.K. et al., 1996]. Незважаючи на наявність універсальних закономірностей ішеміч-ного пошкодження мозку, процес церебральної ішемії індивідуалізований, особливості його перебігу та наслідки визначаються не тільки розміром необоротного пошкодження мозку, а й станом церебрального метаболізму, реактивністю імунно-ендокринної системи, півкульними, віковими та гендерними особливостями тощо [Гусев Е.И., 2001; Медведева С.Л., 2003; Кузнецова С.М., 2006;]. Патогенетично обґрунто-ване ведення гострого періоду інсульту також великою мірою впливає на перебіг захворювання [Євтушенко С.К., 2001; Головченко Ю.І., 2003, 2004; Западнюк Б.В., 2003; Самосюк І.З., 2006; Яворская В.А., 2006; Московко С.П., 2007; Шевага В.М., 2007].

Формування мозкового інфаркту відбувається переважно протягом 3-6 год. Серед механізмів, що беруть участь у “доформуванні” інфаркт-ного вогнища, поглиблюють післяішемічні порушення, а у 25-40% хворих, можливо впливають на прогресування неврологічних розладів у перші години після мозкової катастрофи [Castellanos M. et al., 2002; Vila N. et al., 2003; Rallidis L.S., 2006], значне місце відводиться післяішеміч-ному запаленню [Цимбалюк В.І. та співавт., 2005; Хама-Мурад А.Х. и соавт., 2007; De Graba T.J. et al., 1998; del Zoppo G. et al., 2000].

Доведено, що відстрочена загибель тканини мозку зумовлена широким колом регуляторних пептидів, до яких відносять медіатори запалення, цитокіни, нейротрофічні фактори [Скворцова В.И. и соавт., 2001; Жданов Г.Н. и соавт., 2006; Iadecola C. et al., 2001; Wen Y.D. al., 2006]. Саме вони визначають пошкодження мозку і захисні функції. Проте, не з’ясовано, як пов’язані локальні запальні події з перебігом ішемічного інсульту, розвитком ускладнень, погіршенням неврологічних функцій, чи всі маркери однаково інформативні щодо відображення пошкоджувальної дії післяішемічного запалення.

Патогенез гострих порушень мозкового кровообігу значною мірою пов’язаний зі змінами проникності гемато-енцефалічного бар’єру (ГЕБ), надійним показником порушення якого вважається поява в крові та лікворі нейроспецифічних білків (НСБ) [Чехонин В.П., 2000; Barone F.C. et al., 1995; Butterworth R.J. et al., 1998; Wu Y.C. et al., 2004]. Внаслідок порушення ГЕБ відбувається контакт НСБ з імунокомпетентними кліти-нами, індукція автоімунних реакцій, зокрема синтез нейроавтоантитіл, який може мати саногенний характер, або у разі неадекватності процесів авторегуляції спричиняти імунне пошкодження мозку шляхом включення у комплекс нейроімунно-запальних процесів. У літературі наводяться різні дані стосовно патогенетичної ролі НСБ – маркерів глії, мієліну, нейронів та антитіл до них, а також зв’язку показників автосенсибілізації з перебі-гом ішемічного інсульту, його наслідками [Лисяный Н.И и соавт., 1996; Ганнушкина И.В., 2000; Цимбалюк В.І. та співавт., 2006; da Rocha A.B. et al., 2006; Wunderlich M.T. et al., 2006], проте чітко не визначена їхня роль у складній системі нейроімунно-запальних процесів.

Хоча низка показників (лейкоцитоз, підвищення температури тіла, рівень С-реактивного протеїну (С-РП) в крові, фібриногену, глюкози, прозапальних цитокінів тощо) вважаються інформативними та використо-вуються з прогностичною метою під час моніторингу запальної відповіді [Дзяк Л.А., 1995; Скворцова В.И. и соавт., 1999; Григорова І.А., 2006;
Vila N. et al., 2000, 2003; Castellanos M. et al., 2002] не визначена значущість кожного з них в їхній сукупності, не розроблена математична модель прогнозу, яка б консолідувала найбільш важливі показники місцевого запалення та нейроавтосенсибілізації і давала можливість використати їх для індивідуального прогнозу наслідків гострого періоду інсульту.

Інтенсивне вивчення цитокінових механізмів локального запалення у разі ішемічного ураження мозку, а також успіх в умовах експерименту щодо застосування антагоністів молекул клітинної адгезії, антагоністів та блокаторів рецепторів до цитокінів, який проявлявся у обмеженні вогнища фокальної ішемії [Barone F.C. et al., 2000; Krams M. et al., 2003; Sughrue M.E. et al., 2004], створили передумову для формування нового перспективного напряму у лікуванні ішемічного інсульту, суть якого полягає у гальмуванні та/або усуненні постішемічного локального запалення. Потенційні терапевтичні агенти – протизапальний цитокін
IЛ-10, анти-ІСАМ-1-антитіла, а також антитіла до лейкоцитарних адгезивних молекул – інтегрінів СD11-СD18, селективні інгібітори індуцибільної NO-синтази, циклоксигенази-2 (ЦОГ-2). Розробка стратегії протизапальної терапії триває, шляхи терапевтичного впливу на місцеве запалення потребують додаткових досліджень; не розроблено диференційованого комплексного підходу до обмеження місцевого післяішемічного запалення у хворих з інсультом, яке б ґрунтувалося на результатах попередніх експериментальних досліджень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана згідно з планами наукових досліджень кафедри нервових хвороб Національного медичного університету імені
О.О. Богомольця, є фрагментом наукових тем: “Вивчення клініко-гемоднамічних та біохімічних критеріїв оцінки прогнозу ішемічного інсульту в різні періоди розвитку” (№ держреєстрації 0194U017978); “Вивчення ефективності застосування деяких енцефалотропних та дезагрегантних засобів у лікуванні хворих на гострі та повільно прогресуючі порушення мозкового кровообігу” (№ держреєстрації 0101V000628); “Вивчення впливу деяких несприятливих чинників на перебіг та вихід ішемічного інсульту” (№ держреєстрації 0198U0032978).

Мета роботи. Підвищити ефективність лікування хворих на ішемічний інсульт шляхом клініко-нейроімунобіохімічного та експери-ментального обґрунтування доцільності корекції запально-нейроімунних порушень, визначення показань до її проведення та удосконалення існуючих методів лікування.

Завдання дослідження:

1. Вивчити взаємозв’язок найвагоміших показників локальної запальної відповіді з клінічним перебігом гострого ішемічного інсульту та його наслідками.

2. Дослідити динаміку вивільнення нейроспецифічних антигенів – маркерів нейронів та глії – у ранні строки після інсульту та їхню інформативність щодо перебігу гострого періоду.

3. Вивчити стан нейроавтоімунних реакцій на специфічні мозкові антигени у хворих на ішемічний інсульт в гострий період та встановити клініко-патогенетичні кореляції.

4. Оцінити особливості перебігу найгострішого періоду інсульту залежно від стану запально-нейроімунних порушень та його вплив на наслідки гострого періоду.

5. Визначити корелятивні зв’язки між запально-нейроімунними, клініко-гемодинамічними та нейрорентгенологічними показниками у хворих в гострий період ішемічного інсульту.

6. Вивчити морфофункціональні прояви постішемічного запалення в експерименті та можливості його фармакологічної корекції.

7. Дослідити клінічні прояви впливу неспецифічної протизапальної терапії в експерименті на щурах.

8. Оцінити інформативність показників запально-нейроімунних порушень для прогнозу ішемічного інсульту.

9. Створити математичну модель прогнозу наслідків інсульту в гострому періоді з урахуванням основних показників запально-нейроімунних порушень.

10. Розробити спосіб терапевтичної корекції локальних запальних порушень у гострому періоді ішемічного інсульту на основі порівняльної характеристики неспецифічних протизапальних препаратів та визначити показання для її призначення.

Об’єкт дослідження. Гостре порушення мозкового кровообігу: ішемічний інсульт в гострому періоді; експериментальна фокальна перманентна ішемія.

Предмет дослідження. Післяішемічне запалення та нейроавто-сенсибілізація – гуморальні та морфофункціональні прояви, співставлення з неврологічним статусом (на тлі традиційної базисної та неспецифічної протизапальної терапії), показниками нейровізуалізації та мозковим кровотоком.

Методи дослідження: клініко-неврологічне дослідження, магнітно-резонансна томографія, комп’ютерна томографія, ультразвукове дослідження стану гемодинаміки в екстра- та інтракраніальних судинах каротидного та вертебрально-базилярного басейнів, метод імунофермент-ного аналізу маркерів запалення та нейроавтосенсибілізації, метод створення експериментальної церебральної фокальної ішемії у щурів, світлооптична та електронна мікроскопія, морфометрія, статистичні методи.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше на основі дослідження маркерів запалення та мозкового пошкодження в ранні строки гострого періоду доведена можливість відображати тяжкість вихідного неврологічного дефіциту у хворих з ішемічним інсультом та встановлені оптимальні терміни їхнього визначення (для кожного показника). Встановлена залежність між вмістом маркера запалення в динаміці гострого періоду та наслідками інсульту, визначені терміни, в які спостерігається найбільш виражена кореляція між вмістом запального маркера та наслідками інсульту на 21-у добу. Доведено, що не стільки рівень показника клітинного пошкодження, або цитокінового маркера запалення при госпіталізації хворого (у 1-у добу), скільки його динаміка на 7-у добу впливає на наслідки інсульту.

Вперше виявлено взаємозв’язок між неврологічними наслідками інсульту на 21-у добу та певною спрямованістю змін концентрації цитокінів у хворого, тобто ступенем дисбалансу про- та протизапальних цитокінів. Це дало підстави визначити відмінності між сприятливим та несприятливим перебігом інсульту.

Вперше показано, що автоімунні реакції на НСБ в гострому періоді інсульту характеризуються певним рівнем та особливостями динаміки залежно від тяжкості неврологічних порушень; встановлено взаємозв’язок між ступенем відновлення неврологічних функцій та рівнем нейроавтосенсибілізації.

Вперше вивчено внесок локально-запальних та нейроімунних реакцій у процес раннього неврологічного погіршення після ішемічного інсульту та охарактеризовано відмінності прогресуючого перебігу інсульту в перші дві доби після розвитку за вмістом маркерів запалення, рівнем мозкового клітинного пошкодження та гемодинамічними показниками.

Вперше створена математична модель прогнозу наслідків інсульту в гострому періоді за допомогою множинного регресійного та дискримінантного аналізів з урахуванням основних показників запально-нейроімунних порушень.

Вперше розроблено спосіб терапевтичної корекції локальних запальних порушень у гострому періоді ішемічного інсульту на основі порівняльної характеристики неспецифічних протизапальних препаратів та показано, що клінічний ефект асоціюється з її спроможністю регулювати цитокінові, гострофазово-запальні та нейроавтоімунні реакції.

Практичне значення отриманих результатів. Встановлено, що показники запалення не тільки відображують вихідний ступінь тяжкості мозкового ураження, а й беруть участь у прогресуванні церебрального післяішемічного пошкодження; обмеження післяішемічного запалення поліпшує наслідки ішемічного інсульту в гострому періоді і цим зумов-лена доцільність застосування протизапальної терапії в його ранні строки.

Показано, що процес раннього неврологічного погіршення після ішемічного інсульту відбувається за участю чинників локального запалення, визначені найважливіші з них та доведена необхідність їх своєчасної корекції.

Розроблено спосіб терапевтичної корекції локальних запальних порушень у гострому періоді ішемічного інсульту на основі порівняльної характеристики неспецифічних протизапальних препаратів, який дає змогу поліпшити ефективність лікування та наслідки гострого періоду, зокрема функціональні, за рахунок пригнічення запально-нейроавтоімунних порушень. Визначена категорія хворих, у яких найбільш доцільно застосування зазначеного способу лікування.

На основі аналізу даних клініко-неврологічного, інструментального та лабораторно-імунобіохімічного дослідження визначені показники, які відображують вихідну тяжкість неврологічного дефіциту, розмір вогнища, запально-нейроавтоімунний статус і корелюють з наслідками інсульту. Розроблена модель прогнозу ішемічного інсульту в його гострому періоді, яка дозволяє з високою точністю передбачити ступінь неврологічного дефіциту (в балах за шкалою NIHSS) та належність до категорії “поліпшення та без такого” в кінці гострого періоду.

Результати дослідження впроваджені в практику роботи неврологічних відділень Центральної міської лікарні м. Києва, міської клінічної лікарні №4 м. Києва, навчальний процес кафедри нервових хвороб Національного медичного університету імені О.О. Богомольця.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною науковою роботою здобувача. Автором проведені аналіз наукової літератури за темою дисертаційної роботи, особисто сформульовані мета та завдання дослідження, розроблена програма дослідження, створено базу даних в програмі “ACCESS”, вибрані методологічні підходи. Головним є вклад дисертанта в проведення комплексного клініко-неврологічного, інстру-ментального, нейроімунологічного та експериментального дослідження. Автором самостійно проведений статистичний аналіз та обробка даних із застосуванням комп’ютерних програм, проаналізовані та узагальнені отримані результати, сформульовані основні положення та висновки; підготовлені та опубліковані результати дослідження.

Апробація. Матеріали дисертаційної роботи представлені: на 30-у Дунайському симпозіумі з неврології (25-28 серпня 1998 р., Кремс, Австрія), 32-у Скандинавському конгресі неврологів (10-13 червня 1999 р., Оулу, Фінляндія), науково-практичній конференції: “Нейроімунологія в неврології та нейрохірургії” (25-26 квітня 2000 р.), науково-практичній конференції, присвяченій 125-річчю ЦМКЛ (15-16 вересня 2000 р., Київ), науково-практичній конференції “Актуальные вопросы диагностики и лечения сосудисто-мозговой недостаточности и распространенного атеросклероза” (10-12 січня 2003 р., Свалява), на V Міжнародному симпозіумі “Актуальні питання неврології” (23-25 квітня 2003 р., Судак), Всеросійській науково-практичній конференції з міжнародною участю до 100-річчя від дня народження А.Г. Панова “Современное состояние проблемы нейроинфекций”, XIV Всеросійській конференції “Нейро-иммунология” (19-22 мая 2005 г., Санкт-Петербург), на засіданнях Київського міського науково-практичного товариства неврологів та нейрохірургів 26 листопада 2002 р. та 25 жовтня 2005 р., VIII Ювілейному з’їзді всеукраїнського лікарського товариства, присвяченому 15-річчю організації (21-22 квітня 2005 р., Івано-Франківськ), на Першому національному конгресі “Інсульт та судинно-мозкові захворювання” (14-15 вересня 2006 р., м. Київ), на I-у з’їзді судинних та ендоваскулярних хірургів України (16-18 листопада 2006 р., Київ) на Міжнародному медико-фармацевтичному конгресі “Ліки та життя” (7-10 лютого 2007 р., Київ), на науково-практичній конференції з міжнародною участю “Когнітивна діяльність при старінні” (29-30 січня 2008 р., Київ).

Дисертація апробoвана і рекомендована до захисту апробаційною радою зі спеціальності “Нервові хвороби та психіатрія” Національного медичного університету імені О.О. Богомольця МОЗ України.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 38 наукових праць, з яких 23 у фахових наукових виданнях, рекомендованих ВАК України, в тому числі: 1 монографія (в співавторстві) та розділи в двох монографіях, 20 праць у наукових журналах, рекомендованих ВАК України, 10 – у матеріалах та збірниках тез наукових форумів; отримано 3 деклараційних патенти на корисну модель.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 345 сторінках друкованого тексту та складається зі вступу, огляду літератури, розділу про матеріали та методи дослідження, 7 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій. Роботу ілюстровано 75 таблицями, 82 рисунками і 18 мікрофотографіями. Бібліографічний список включає 497 джерел, серед яких 103 – кирилицею та 394 – латиницею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи дослідження. Робота основана на результатах обстеження і лікування 463 хворих з ішемічним інсультом, що перебували в неврологічних клініках ЦМКЛ м. Києва і клінічної лікарні №4 м. Києва за період 1998-2006 рр.

Серед обстежених хворих, яким було проведено клініко-неврологічне, нейровізуалізаційне (магнітно-резонансно-томографічне або комп’ютерно-томографічне), імунобіохімічне та електрофізіологічне обстеження, 207 (44,7%) становили чоловіки і 256 (55,3%) жінки віком від 38 до 81 року, у середньому 62,3±0,45 роки.

У 396 (85,5%) хворих гостре порушення мозкового кровообігу розвинулось у каротидному басейні; з них у 227 (49%) – у лівому каротидному та 169 (36,5%) в басейні правої внутрішньої сонної артерії. У 208 (44,8%) хворих було ураження лівої середньої мозкової артерії (СМА), у 19 (4,2%) – лівої передньої мозкової артерії (ПМА). У 152 (32,8%) пацієнтів гостре порушення мозкового кровообігу відбулось в басейні правої СМА, у 17 (3,7%) – правої ПМА. Інфаркт у судинах вертебрально-базилярного басейну виявлявся в 67 (14,5%) спостережень.

Обстеження хворих проводили за загальним алгоритмом з використанням формалізованих карт, які в подальшому використовували для формування комп’ютерної бази даних за допомогою програми Microsoft Access 2000.

В дослідження включали пацієнтів, у яких з моменту розвитку перших симптомів церебральної катастрофи до госпіталізації в неврологічне відділення пройшло не більше 12 год.

Вираженість неврологічних розладів у хворих оцінювали за шкалою Національного Інституту здоров’я США (NIHSS – National Institute of Health Stroke Scale, USA) на 1-3-ю, на 7-у, 14-у, 21-у добу (Odderson I.R., 1999); повсякденну життєву активність і функціональні наслідки визначали за індексом Бартеля (Barthel D.W., 1965).

Хворим проводили загальноклінічні аналізи крові та сечі, біохімічні аналізи крові, досліджували показники гемостазу: концентрацію фібриногену та фібрину за методом Рутберга, проводили етаноловий тест (Breen F. et al., 1968) визначали активований час рекальцифікації, протромбіновий час (Quick A., 1966). Проводили електрокардіографію, дослідження очного дна, люмбальну пункцію. Діагноз ішемічного інсульту було підтверджено даними магнітно-резонансної томографії (МРТ) головного мозку, у випадку з летального наслідку – патоморфологічним дослідженням. МРТ головного мозку виконували на апараті “FLEXART” (Toshiba) з напруженістю поля 0,5 Тл. Визначення об’єму вогнища ураження проводили за формулою еліпсоїда:

V = 0,52 х А х В х С,

де V – об’єм вогнища ураження і А, В і С – його діаметри; 0,52 – коефіцієнт для підрахунку об’єму неправильного еліпса [Левада О.А., 1999; Сомик К.И. и др., 2002]. Дослідження магістральних судин голови в екстракраніальному відділі та стану інтракраніальної гемодинаміки проводили за допомогою ультразвукового допплерографа “Multigon 500M” (фірма Multigon Industries Inc, США).

Для визначення етіопатогенезу захворювання проводили дуплексне сканування, ехокардіоскопію.

Для лікування 269 хворих традиційними методами застосовували максимально уніфіковану диференційовану терапію, яка передбачала призначення антитромботичних та антиагрегантних препаратів у випадку атеротомботичного інсульту та лакунарного інфаркту та антикоагулянтну терапію у разі кардіоемболічної природи інсульту або прогресуючого перебігу атеротромботичного інсульту за винятком випадків з великим вогнищем ураження.

Вплив неспецифічної протизапальної терапії вивчали у 194 хворих за розробленими нами способами, захищеними деклараційними патентами на корисну модель №10664 та №23237.

Гуморальні нейроавтоімунні реакції у хворих з ішемічним інсультом вивчали за вмістом автоантитіл до нейроспецифічних білків: основного білка мієліну (ОБМ), маркера глії S-100 та нейронспецифічної єнолази (НСЄ) методом твердофазного імуноферментного аналізу [Черенько Т.М., 1989]. Концентрацію НСЄ в сироватці крові визначали за допомогою набору реактивів для кількісного твердофазного методу імуноферментного аналізу (ІФА) за принципом “cендвіча” NSE-EIA<DIAplus> виробництва концерну Ф. Хоффман-Ля Рош і К (Базель, Швейцарія). Концентрацію S-100B в сироватці крові – за допомогою набору реактивів для кількісного імуноферментного аналізу CanAg S-100 EIA “CanAg DiagnosticsAB” (Гетебoрг, Швеція). ОБМ виділяли за модифікацією Палладіна О.В. [О.В. Палладин и соавт., 1970].

Концентрацію С-РП в сироватці крові визначали за допомогою твердофазного методу ІФА. Використовували набір реактивів для кількіс-ного імуноферментного аналізу CRP-EIA KIT виробництва DAI (США).

Концентрацію цитокінів ІЛ-1, ІЛ-6, ІЛ-4, фактора некрозу пухлини альфа (ФНП-б) у сироватці крові визначали за допомогою кількісного твердофазного методу ІФА с використанням комерційних наборів тест-системи “Протеиновый контур” (Санкт-Петербург, Росія).

Експерименти виконані на 39 безпородних білих щурах – самцях з середньою масою тіла 254,6±10,9 г з модельованою гострою фокальною церебральною перманентною ішемією, у яких проведено морфологічні дослідження неокортексу в ділянці сенсомоторної кори.

Ультратонкі зрізи товщиною 600 А виготовляли на ультратомах LKB (Швеція) і Reicherdt-Jung (Австрія) та вивчали за допомогою електронного мікроскопа ЕМ-400Т фірми “PHILIPS” (Нідерланди). Напівтонкі зрізи завтовшки 1 000 А, забарвлювали метиленовим синім-піронином та вивчали за допомогою світлооптичного мікроскопа Axiophot фірми “OPTON” (Німеччина). Морфометричний аналіз серійних напівтонких та ультратонких зрізів проводили за допомогою системи аналізу зображень IBAS-2000 фірми “KONTRON” (Німеччина).

Тварин було розділено на 5 груп – групу контролю (псевдооперовані щури) і 4 дослідні групи з моделлю церебральної ішемії по 9 щурів у кожній: група “нелікованих тварин”; щури, що отримували пентоксифілін в дозі 50 мг/кг на добу – “традиційно ліковані” (І група); щури, що отримували пентоксифілін у дозі 50 мг/кг і мелоксикам в дозі
30 мг/кг на добу (ІІ група); щури, що отримували мелоксикам у дозі
30 мг/кг на добу і пентоксифілін в дозі 200 мг/кг на добу (ІІІ група).

Препарати вводили тваринам інтраперитонеально в разовій дозі через 3 год після судинної події протягом 7 діб.

Результати досліджень та їх обговорення. Дослідження стану післяішемічного локального запалення на підставі аналізу вмісту цитокінів засвідчило, що у хворих з ішемічним інсультом у першу добу вміст ІЛ-1в, ІЛ-6, ФНП-б, ІЛ-4 у сироватці крові достовірно підвищувався і становив відповідно (108,43±5,21), (138,23±5,27), (80,47±4,75), (87,25±4,02) пг/мл (p<0,01 порівняно з контролем). Рівень цитокінів, за винятком ІЛ-1в, достовірно корелював (p<0,001) з неврологічним дефіцитом у 1-у добу, причому коефіцієнт кореляції був вдвічі вищим для ІЛ-6, ніж для ФНП-б (відповідно r=0,537 і r=0,209), а між ступенем тяжкості неврологічних розладів та рівнем ІЛ-4 спостерігалась обернена помірна кореляція (r=-0,402).

Попри наявність клініко-імунобіохімічних корелятивних зв’язків, середні концентрації ІЛ-6 та ІЛ-4 не завжди достовірно відрізнялися. Так, середній вміст ІЛ-6 у хворих з легким неврологічним дефіцитом у 1-у добу був достовірно нижчим, ніж у разі значного неврологічного дефіциту (p<0,001). Однак у хворих з неврологічним дефіцитом середньої тяжкості та тяжким концентрації ІЛ-6 не відрізнялись

Виявлено, що у разі тяжкого ступеня неврологічних порушень концентрація ІЛ-4 була достовірно нижчою, порівняно з такою при легких неврологічних розладах (p<0,01). Це підтверджує, що розвиток локального запалення – результат дисбалансу в системі регуляції медіаторів і рівень запальних реакцій може залежати від недостатньої продукції протизапальних цитокінів, зокрема ІЛ-4, а не тільки від підвищеної активності прозапальних медіаторів.

Середні концентрації ФНП-б і ІЛ-1в у першу добу після судинної події не відрізнялися за різних ступенів тяжкості ішемічного інсульту (p>0,05).

Враховуючи важливе значення в доформуванні інфаркту, що може тривати кілька діб, не тільки величини початкової концентрації прозапальних медіаторів, яка, можливо, генетично зумовлена активністю імунної системи, а й подальших її змін протягом 7-и діб, коли запальні реакції досягають максимального розвитку, ми провели клініко-імунобіохімічне порівняння динаміки рівня цитокінів з 1-ї по 7-у добу та зміни бала неврологічного дефіциту протягом 7-и та 21-ї доби у хворих з нефатальним інсультом.

На 7-у добу достовірно знижувався вміст ІЛ-6 – до (76,84±4,31) пг/мл, водночас його середні концентрації залишались значно вищими за контрольний рівень (p<0,01).

Виявлено, що вміст ФНП-б на 7-у добу достовірно знижувався в 85,5% випадків та більш точно, ніж у 1-у добу, асоціювався з певним ступенем тяжкості неврологічних порушень під час госпіталізації. Різниця між рівнем цитокіну у хворих з вихідним легким та середньо-тяжким неврологічним дефіцитом ((41,29±4,31) та (72,69±8,95) пг/мл відповідно, а також з легкими і тяжкими неврологічними розладами ((41,29±4,31) та (68,75±7,43) пг/мл стає достовірною (р=0,001). Це зумовлено зниженням на 7-у добу концентрації цитокіну у разі легких неврологічних розладів до контрольного рівня. На відміну від ФНП-б, вміст ІЛ-6, хоча і знижувався значною мірою на 7-у добу, проте достовірно перевищував контрольні показники у разі легкого неврологічного дефіциту. Імовірно, зменшення концентрації ФНП-б до нормального рівня більш адекватно відображує відсутність прогресування післяішемічних запальних порушень у хворих з легкими пошкодженнями мозкової тканини, що корелює зі сприятливими наслідками легкого інсульту.

На 7-у добу після ішемічного інсульту спостерігалося незначне зниження концентрації ІЛ-4 до (79,53±4,89) пг/мл, (р=0,226). Середній вміст цитокіну в сироватці залишався вищим за контроль у всіх хворих незалежно від вихідного ступеня тяжкості неврологічних розладів (р<0,01). Водночас, незважаючи на статистично незначущі зміни концентрації ІЛ-4 на 7-у добу, кореляційні зв’язки з початковим неврологічним дефіцитом слабшали (r=-0,417 та r=-0,27 відповідно на
1-у та на 7-у добу), хоча залишались достовірними. Цей факт можна пояснити тим, що зміни концентрації ІЛ-4 на 7-у добу не були односпрямованими в усіх хворих, а також, можливо, залежали не лише від ступеня тяжкості неврологічних порушень при надходженні, а й від динаміки неврологічного статусу.

При аналізі динаміки неврологічних розладів на 7-у добу було встановлено, що у 40 (58,8%) хворих зменшувався неврологічний бал за NIHSS, у 28 (49,2%) – він не змінювався або збільшувався. Слід зазначити, що негативна неврологічна динаміка переважно відображувала результати раннього неврологічного погіршення в перші 24-48 год після інсульту.

При аналізі вмісту ІЛ-6 та ФНП-б у хворих з різною динамікою неврологічних функцій протягом 24-48 год виявлено, що кращому регресу неврологічних розладів на 7-у добу відповідали більш низькі концентрації цитокінів у 1-у добу порівняно з хворими без позитивної динаміки неврологічного статусу – ((123,63±6,28) проти (158,38±7,72) пг/мл (р=0,001) та ((70,55±4,7) проти (96,57±9,69) пг/мл (р=0,009) та більший спад концентрації цитокіну. Слід зазначити, що для ІЛ-6 спад на 7-у добу у випадках поліпшення в 1,4 перевищував аналогічний показник у хворих без поліпшення, а для ФНП-б – в 5,1 разу, що свідчить про різну клініко-патогенетичну значущість чинників запалення.

Твердження, що однією з можливих причин відстроченого пошкодження ішемізованої зони мозку, тісно пов’язаного з динамікою неврологічного статусу, можуть бути запальні реакції за участю активованої мікроглії з гіперпродукцією прозапальних цитокінів, високий рівень яких зберігається протягом 7 діб, припускає зв’язок вмісту прозапального цитокіну в крові та неврологічного статусу хворого. Ймовірно існує збалансована взаємодія прозапальних та протизапальних медіаторів, яка обмежує патологічний розвиток локальної запальної події і сприяє адекватному відновленню неврологічних порушень у випадку позитивної динаміки неврологічних функцій і їхній дисбаланс у запально-нейроімунному каскаді корелює з відсутністю позитивної динаміки неврологічного статусу хворих.

Аналіз динаміки неврологічних порушень на 21-у добу дав змогу виділити такі групи хворих: з повним відновленням неврологічних функцій, поліпшенням неврологічного статусу – в цю групу ввійшли хворі, клінічний бал яких зменшувався на 4 та більше, пацієнти без істотного (менше ніж на 4) зменшення неврологічного бала, хворі з погіршенням неврологічного статусу (збільшення бала неврологічного дефіциту хоча б на 1). Поліпшення неврологічного статусу констатовано у 52 (38,8%) пацієнтів, відсутність динаміки спостерігалася у 45 (33,6%), погіршення стану – у 19 (14,2%), померло 18 (13,4%) хворих. Порівняння вмісту цитокінів у хворих з різним перебігом гострого періоду інсульту, засвідчило, що його наслідки на 21-у добу залежали від концентрації цитокінів у 1-у добу.

З’ясувалось, що середні концентрації ІЛ-6 та ФНП-б у 1-у добу у хворих з поліпшенням неврологічного статусу в кінці гострого періоду достовірно відрізнялись від таких у пацієнтів без поліпшення ((129,85±5,62) та (147,36±5,06) пг/мл, р=0,042, і (71,62±5,49) та (89,31±5,67) пг/мл, р=0,024).

Порівняння середніх концентрацій ІЛ-4 у хворих залежно від наслідку інсульту в гострому періоді зазначило, що за вмістом протизапаль-ного цитокіну достовірно відрізнялись не тільки хворі з поліпшенням неврологічних функцій та негативною їх динамікою ((102,44±3,38) та (68,20±4,76) пг/мл, р=0,001), але й пацієнти, в яких були відсутні істотні неврологічні зрушення ((102,44±3,39) та (86,09±4,86) пг/мл, р=0,006). Звертає на себе увагу обернено пропорційна залежність між концентра-цією ІЛ-4 та наслідками гострого періоду: хворі з вищим вихідним рівнем ІЛ-4 відновлювались краще. Це цілком узгоджується з тезою, що однією із складових поганих функціональних наслідків та неповного відновлення неврологічних функцій у світлі запально-нейроімунної концепції вторин-ного пошкодження мозку у випадку гострої ішемії може бути відносно низький рівень протизапальних цитокинів порівняно з прозапальними.

За вмістом ІЛ-1в, хворі з незадовільним відновленням невроло-гічних функцій та ті, які відновили неврологічні порушення, достовірно не відрізнялись (р=0,15). Можливо, це зумовлено тим, що ІЛ-1в секретується великою кількістю різних клітин, активація яких унаслідок ішемії призводить до підвищеного рівня цитокіну і він відіграє лише пускову роль в ініціації післяішемічного запалення.

Більш об’єктивним показником при моніторингу запальної відповіді, який дає змогу нівелювати методичні відмінності, а також вплив індивідуальної імунологічної реактивності хворих, зокрема гіперергічної, слід вважати величину спаду показника (табл. 1).

Таблиця 1

Кореляційні зв’язки між тяжкістю неврологічного дефіциту
на 21 добу після інсульту та рівнем прозапальних цитокінів

Показник | ІЛ-6

1 доба | ФНП-б

1 доба | ІЛ-6

7 доба | ФНП-б 7 доба | Спад
ІЛ-6 | Спад ФНП-б

Бал за NIHSS | 0,43* | 0,35* | 0,64* | 0,65* | 0,67* | 0,67*

Наслідки (поліпшення, без поліпшення) | 0,36* | 0,32* | 0,53* | 0,57* | 0,68* | 0,55*

Примітка. * p < 0,05 – достовірність коефіцієнта кореляції.

Встановлено, що наслідки гострого періоду інсульту більшою мірою залежали від величини спаду ІЛ-6 на 7-у добу (r=0,68), ніж від його абсолютних концентрацій у 1-у та 7-у добу (r=0,36 та r=0,53 відповідно). Це, ймовірно, відображує зв’язок маркера запалення з трансформацією вогнища ішемії.

Виявлено тісну кореляцію між наслідками гострого періоду інсульту та концентрацією іншого прозапального цитокіну – ФНП-б на
7-у добу (r=0,65 порівняно з r=0,35 у 1-у добу), ще тісніша обернена кореляція спостерігалась зі спадом маркера на 7-у добу (r=0,67).

Встановлено, що поліпшення неврологічних функцій на 21-у добу асоціюється зі спадом ІЛ-6 на 7-у добу % (52,5%). Для ФНП-б цей показник у випадку сприятливих наслідків становив 24,5%. Сприятливий наслідок прогнозували у разі підвищення вмісту ІЛ-4 на 1-у добу у 2,25 разу порівняно з контролем, з чутливістю тесту 76,3% та специфічністю 55,2%.

Одним з найважливіших показників наявності гострофазового запалення вважається С-РП. Середні концентрації С-РП у крові достовірно перевищували нормальний рівень у 58 (74,4%) хворих та становили 9,80±5,84 мг/л. Спостерігалось збільшення концентрацій С-РП за умови зростання ступеня тяжкості ішемічного інсульту, хоча і не виявлено достовірних відмінностей між різними за тяжкістю неврологічного дефіциту групами хворих у 1-у добу. Дослідження С-РП на 7-у добу після інсульту у хворих засвідчило, що концентрації С-РП залишалися достовірно вищими порівняно з донорськими рівнями ((9,6±0,6) мг/л, р<0,05) та істотно не відрізнялися від вмісту маркера у 1-у добу. Це узгоджується з загальною уявою про “сценарій” розвитку локального післяішемічного запалення, кульмінація якого припадає на перший тиждень після судинної події.

При порівнянні рівня гострофазового маркера у хворих різних груп виявлено, що концентрації С-РП у пацієнтів з повним відновленням або поліпшенням неврологічних функцій у кінці гострого періоду достовірно нижчі, ніж у хворих з погіршенням неврологічного статусу ((7,14±0,72) і (15,47±2,32) мг/л відповідно, р=0,001). Хворі з фатальними наслідками ішемічного інсульту мали більш високий середній рівень С-РП (р=0,002) не тільки порівняно з пацієнтами з повноцінним відновленням, а і з хворими, що відновилися неповністю (10,40±1,13) мг/л.

Хворі з концентрацією С-РП, що перевищувала середнє значення (9,8 мг/л) у 1-у добу мали вищий відносний ризик незадовільних наслідків у гострому періоді, який становив 3,47 (95% СІ 1,64-7,37; p<0,05). Найбільший відносний ризик незадовільного відновлення – 5,47 (95% СІ 1,44-0,68; р<0,02) спостерігався у пацієнтів з рівнем С-РП понад 13 мг/л, причому середні концентрації маркера в хворих з фатальними наслідками дорівнювали (16,38±1,53) мг/л, а відносний ризик летального наслідку в когорті хворих з концентрацією С-РП понад 13 мг/л становив 9,32 (95% СІ 2,05-42,36). Патофізіологічне значення асоціації між рівнем С-РП та прогнозом не до кінця зрозуміле. Експериментальними дослідженнями показано, що С-РП може брати безпосередню участь у судинному пошкодженні [Di Napoli M. еt al., 2001]. Також вважається, що підвищення рівня С-РП може посилювати коагуляцію через експресію тканинного фактора і, таким чином, погіршувати наслідки інсульту, зумовлювати фатальний вихід [Willcox B.J. at al., 2004].

Виявлений зв’язок між підвищеним рівнем С-РП у хворих в першу добу після розвитку інсульту та якістю відновлення неврологічних функцій може бути свідченням ролі запального каскаду у вторинному нейрональному пошкодженні після гострої церебральної ішемії. Можливо, у хворих з підвищеним рівнем С-РП відбувається поширення інфаркту мозку за рахунок трансформації ішемічної напівтіні, що, корелює з незадовільним наслідком, тобто таким чином виявляється внесок післяішемічного запалення в мозкове ішемічне пошкодження. Слід зазначити, що підвищений рівень С-РП спостерігався і у 12% хворих з лакунарним інсультом; у 9% хворих з великовогнищевим інсультом концентрації С-РП у крові не перевищували показники здорових донорів; близько 25% пацієнтів мали нормальний рівень С-РП після інсульту. Такі факти можна пояснити індивідуальною імунологічною реактивністю хворих та тим, що інсульт не індукує повний спектр гострозапальних реактантів.

Інформативними показниками порушення ГЕБ, ризику розвитку автоімунних реакцій вважають НСБ: основний білок мієліну (ОБМ), маркер глії – білок S-100 та нейронспецифічну єнолазу (НСЄ). Дослід-ження рівня S-100 засвідчило, що в усі терміни обстеження його вміст достовірно (p<0,001) переважав контрольний показник ((0,08±0,035) нг/мл). На 3-ю добу спостерігався пік концентрації білка S-100 15-кратне збільшення його вмісту – до (1,21±0,098) нг/мл, на 7-у добу рівень S-100 хоча і зменшувався (до (0,75±0,08) нг/мл), але достовірно переважав вміст в 1-у добу що, ймовірно, характеризувало особливості метаболізму та кінетику вивільнення нейроспецифічного білка з гліальних клітин при їх пошкодженні. Встановлено позитивний достовірний корелятивний зв’язок між концентрацією білка S-100 і розміром інфаркту (r=0,54). На 3-ю добу в хворих з великими інфарктними вогнищами виявлялись найвищі концентрації білка ((1,99±0,15) нг/мл). Достовірно відрізнялись за вмістом S-100 хворі із середніми та малими розмірами вогнищ ішемії – відповідно (1,14±0,10) і (0,59±0,14) нг/мл.

Пік концентрації нейронального маркера НСЄ виявлено, аналогічно S-100, на 3-ю добу після розвитку інсульту ((32,33±2,93) нг/мл проти (20,72±1,58) нг/мл у 1-у добу, р=0,002). На 7-у добу вміст НСЄ зменшувався і достовірно не відрізнявся від рівня під час госпіталізації ((22,67±6,31) нг/мл; р=0,41), залишаючись вищим за контроль.

Концентрація НСЄ та розмір інфаркту також позитивно корелювали між собою (r=0,41). Показано, що концентрація нейро-нального антигену у разі великих вогнищ майже в 4 рази перевищує його вміст у разі дрібних вогнищ інфаркту. З’ясувалось, що середні концентрації білків S-100 та НСЄ вищі у хворих з атеротромботичним та кардіоемболічним генезом інсульту за такі у пацієнтів з лакунарним інфарктом. Водночас, з урахуванням розміру вогнища відмінності стають недостовірними.

Нами виявлено, що вміст НСЄ та S-100 пов’язаний з наслідками інсульту на 21-у добу. Встановлено кореляційний зв’язок між концентраціями НСЄ на 3-ю добу та балом неврологічного дефіциту на 21-у добу (r=0,51) та ще більш тісний зв’язок на 7-у добу (r=0,56), хоча коефіцієнт кореляції виявився меншим, ніж для S-100 (r=0,85).

Найінформативніший з точки зору прогнозу гострого періоду виявився показник спаду концентрації НСБ на 7-у добу, який найтісніше корелював з наслідками інсульту (коефіцієнт кореляції становив: для
S-100 – 0,87, для НСЄ – 0,66. Це дає підстави вважати, що зміни вмісту маркера в ранні строки гострого періоду є чутливим індикатором процесу доформування інфарктного ядра і дозволяють, таким чином, прогнозувати перебіг та наслідки ішемічного інсульту. Методом логістичної регресії встановлено, що спад концентрації S-100, за якого можна прогнозувати поліпшення на 21-у добу становив 32,38% з чутливістю тесту 89,3% та специфічністю – 90%;

У разі спаду концентрації НСЄ більше за 15% (чутливість тесту – 85%, специфічність – 30%) можна прогнозувати сприятливі наслідки в гострому періоді інсульту. Загальний відсоток вірно передбачених наслідків становив 61,7% (для S-100 цей показник був значно вищим – 89,4%).

Особливим аспектом дослідження було з’ясування взаємозв’язку між наслідками інсульту в гострому періоді та вмістом гліального і нейронального маркерів, які визначали разом. Основні тенденції залежності тяжкості неврологічних порушень на 21-у добу від вмісту НСЄ та S-100 на 3-ю добу при спільному їх визначенні полягали в тому, що у разі концентрацій НСЄ, нижчих за 30 нг/мл, та S-100 – нижчих за 1 нг/мл спостерігались найменші величини неврологічного бала за шкалою NIHSS (3-9). Водночас виражений неврологічний дефіцит констатували як у разі високого вмісту НСЄ, незалежно від концентрації S-100, так і у разі високого вмісту гліального маркера (незалежно від концентрації НСЄ). Проте, слід зазначити, що найтяжчі неврологічні розлади визначали за одночасно високих концентрацій НСЄ та S-100. Це узгоджується з тезою про гліально-нейрональну інтеграцію, оскільки гліальні клітини відіграють важливу роль у підтриманні нейронального гомеостазу, а гліальне клітинне пошкодження робить внесок у нейрональну дисфункцію.

Важливою ланкою в каскаді післяішемічного запалення є автоімунні реакції до специфічних антигенів мозку, ініціювання яких – один з найважливіших аспектів ушкоджувальної дії цитокінів