КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ГРУБСЬКА ЛЮДМИЛА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 577.115.346: 616.341

СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН ВНУТРІШНЬОЇ МЕМБРАНИ МІТОХОНДРІЙ КЛІТИН СЛИЗОВОЇ ОБОЛОНКИ ТОНКОЇ КИШКИ ЩУРІВ ЗА ДІЇ ІОНІЗУЮЧОЇ РАДІАЦІЇ НИЗЬКОЇ ПОТУЖНОСТІ

03.00.01 – радіобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ — 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у лабораторії фізико-хімічної біології кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Войціцький Володимир Михайлович,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка, професор кафедри біохімії

біологічного факультету.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Кутлахмедов Юрій Олексійович,

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

НАН України, завідувач лабораторії радіоекологічної надійності біосистем відділу біофізики та радіобіології;

доктор медичних наук, старший науковий співробітник

Жирнов Віктор Валентинович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу сигнальних систем клітини.

Захист відбудеться “21”__04 2008 року о _14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, просп. академіка Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “20”_09_ 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У зв’язку з розвитком атомної енергетики, впровадженням в промисловість, науку та медицину методів з використанням іонізуючого випромінювання, його вплив на організми залишається актуальною проблемою сучасності. Питання впливу низькоінтенсивного опромінення на живі організми, вивчення закономірності дії опромінення в малих дозах в сучасний час набуває великого значення. Особливо це актуально для ряду регіонів, які постраждали внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС. Підвищення радіаційного фону в дозах, які перевищують природній фон, призводить до зростання радіаційного навантаження на людину [Жукова А.А, 1997; Коломийцева И.К. и др., 1991; Руднев М.И., 1994]. Опромінення в малих дозах низької інтенсивності не призводить до загибелі організму, але здатне модифікувати різні клітинно-тканинні процеси [Бурлакова Е.Б. и др., 1996].

Для з’ясування механізмів пошкоджуючої дії іонізуючої радіації важливо дослідити структурно-функціональний стан клітини [Барабой В.А. и др., 1983]. Існують дані про деструктивні наслідки впливу іонізуючого випромінювання на мембрани мітохондрій: порушення спряження окиснення та фосфорилювання, інгібування біосинтезу АТФ, що зумовлене високою радіочутливістю ферментів дихального ланцюга [Руднев М.И., 1994]. В кооперативній системі білок-ліпідного матрикса мембран радіаційно-індуковані зміни функціональної активності мітохондрій зумовлені змінами структури мембранних білків та фізико-хімічного стану ліпідного бішару [Коломийцева И.К. и др., 1991].

В радіобіологічних дослідженнях особлива увага зосереджена на структурах та процесах, які мають вирішальне значення в розвитку післярадіаційних ушкоджень [Эйдус Л.Х., 2001]. Одним з найбільш радіочутливих органів є тонка кишка, порушення функції якої вважають глибокими і стійкими, вона відіграє роль селективного бар’єру між організмом і зовнішнім середовищем на шляху надходження поживних речовин у кров і лімфу. В епітелії тонкої кишки якої виділяють 4 основних типи клітин: циліндричні ентероцити (або всмоктуючі), бокаловидні, екзокриноцити, екзокриноцити з ацидофільними гранулами (клітина Панета) та ентерохромафіноцити (клітина Кульчицького). Всмоктуючі клітини переважають серед епітеліальних клітин і складають приблизно 90% всіх клітин [Уголев А.М., 1985]. В науковій літературі є багаточисленні дослідження, що свідчать про розвиток радіаційно-індукованих порушень ультраструктури слизової оболонки тонкої кишки, а саме білкової та ліпідної компоненти плазматичної мембрани клітин слизової оболонки тонкої кишки після разової та хронічної дії іонізуючого випромінювання в сублетальних дозах [Міронова Н.Г. та ін., 1999; Хижняк С.В. та ін., 2000; Кучеренко М.Є. та ін., 2001; Войціцький В. М. та ін., 2004]. Разом з тим, майже відсутні відомості про ефекти іонізуючої радіації низької інтенсивності на мембрани мітохондрій слизової оболонки тонкої кишки щурів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у лабораторії фізико-хімічної біології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка у рамках тем “Розробка наукових основ пошуку біологічно-активних сполук радіозахисної дії” (№ д/р 0101U002291), підрозділу “Дослідження структурно-функціонального стану клітин слизової оболонки тонкої кишки та печінки за умов впливу іонізуючої радіації” та “Визначення біохімічних, генетичних, імунологічних та цитологічних маркерів розвитку патологічних станів організму з метою розробки засобів направленої корекції” (№ д/р 0106U005750), підрозділу “Визначення біохімічних маркерів розвитку різних патологічних станів організму з метою розробки профілактичних та терапевтичних засобів корекції”.

Мета та завдання дослідження. Дослідити ферментативну активність та стан ліпідної компоненти внутрішньої мембрани мітохондрій клітин слизової оболонки тонкої кишки щурів за дії іонізуючої радіації низької потужності.

В зв’язку з цим були поставлені такі завдання:

1. Дослідити дію іонізуючої радіації (0,055 Гр/хв) у дозах 0,1 Гр; 0,5 Гр та 1,0 Гр через 1, 12 та 24 год після опромінення, на:

а) стан окисного фосфорилювання в мітохондріях клітин слизової оболонки тонкої кишки;

б) активність ферментатів дихального ланцюга мітохондрій: НАД•Н–КоQ–оксидоредуктази, сукцинат–КоQ–оксидоредуктази, КоQ–цитохром с–оксидоредуктази та цитохромоксидази;

в) кількісний вміст цитохромів внутрішньої мембрани мітохондрій клітин слизової оболонки тонкої кишки щурів;

г) Н+–АТФазну активність внутрішньої мембрани мітохондрій;

д) вміст та редокс-стан убіхінона внутрішньої мембрани мітохондрій;

е) кількісний та якісний вміст ліпідів внутрішньої мембрани мітохондрій;

2. Проаналізувати структурно-функціональні зміни внутрішньої мембрани мітохондрій клітин слизової оболонки тонкої кишки щурів в залежності від дози та часу після оропмінення.

Об’єкт дослідження: разова дія іонізуючої радіації низької потужності на структурно-функціональний стан внутрішньої мембрани мітохондрій клітин слизової оболонки тонкої кишки.

Предмет дослідження: мітохондрії та внутрішня мембрана мітохондрій клітин слизової оболонки тонкої кишки.

Методи дослідження: в роботі використовували радіометричні, біохімічні (визначення активності ферментів електрон-транспортного ланцюга, вмісту цитохромів, убіхінону та ліпідів), полярографічний (визначення показників для оцінки інтенсивності дихальної та фосфорилюючої активності мітохондрій), хроматографічний (визначення вмісту фосфоліпідів та жирних кислот) та методи варіаційної статистики для обробки результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено та проаналізовано разову дії іонізуючого випромінювання низької потужності (0,055 Гр/хв) в дозах 0,1, 0,5 та 1,0 Гр через 1, 12 та 24 год на структурно-функціональний стан внутрішньої мембрани мітохондрій клітин слизової оболонки тонкої кишки щурів.

За умов дослідження виявлено порушення функціонування електрон-транспортного ланцюга, про що свідчить роз’єднання процесів спряження окиснення та фосфорилювання в мітохондріях. Встановлено різнонаправлені зміни активності ферментів внутрішньої мембрани мітохондрій: НАД•Н–КоQ–оксидоредуктази, сукцинат–КоQ–оксидоредуктази, КоQ–цитохром с–оксидоредуктази, цитохромоксидази в ранні терміни (1, 12 год) після дії іонізуючого випромінювання в дозах 0,1, 0,5 та 1,0 Гр. В більш пізні терміни (24 год) після опромінення спостерігали вірогідну активацію досліджуваних ферментів за умов експерименту. Встановлено, що разова дія іонізуючої радіації низької потужності призводить до зменшення величини співвідношення окисненого до відновленого убіхінону у внутрішній мембрані мітохондрій, при цьому найбільш виражені зміни даного показника спостерігали в ранні терміни після опромінення. Це свідчить про інгібування транспорта електронів від І та ІІ комплексу дихального ланцюга мітохондрій до ІІІ. Показано, що зміни вмісту цитохромів груп с і а є однонаправленими, а цитохромів групи b – різнонаправленими. Виявлено суттєве зниження вмісту цитохрома с за опромінення шурів в дозах 0,5 та 1,0 Гр. Встановлено, що в умовах проведених досліджень активність Н+-АТФази внутрішньої мембрани мітохондрій зменшується. При цьому найбільш виражене інгібування спостерігали за опромінення в дозі 1,0 Гр.

Фосфоліпідний склад внутрішньої мембрани мітохондрій зазнає найбільших змін за опромінення низької потужності в дозі 1,0 Гр, що зберігається протягом всього дослідного періоду. Водночас, спостерігається накопичення лізоформ фосфоліпідів за умов дослідження. Показано зростання ступеню насиченості жирнокислотного складу загальної фракції ліпідів за дії іонізуючої радіації в дозах 0,5 та 1,0 Гр.

Встановлені структурно-функціональні порушення внутрішньої мембрани мітохондрій клітин слизової оболонки тонкої кишки розширюють існуючі уявлення про механізми дії іонізуючої радіації в діапазоні доз 0,1 – 1,0 Гр.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати сприяють встановленню радіаційно-біохімічних шляхів дії іонізуючого випромінювання низької потужності, а саме: з урахуванням порушень процесу енергозабезпечення життєдіяльності клітин – окисного фосфорилю-вання у внутрішній мембрані мітохондрій. Одержані результати доповнюють методичні підходи при оцінці радіобіологічних ефектів. Встановлені порушення функціонування мітохондрій досліджуваних клітин слизової оболонки тонкої кишки можуть слугувати науковим обґрунтуванням розробки методів корекції та запобігання пошкоджень структурно-функціонального стану клітин слизової оболонки тонкої кишки за дії іонізуючої радіації. Результати проведених досліджень доцільно враховувати при пошуку нових методів та засобів запобігання радіаційного ураження організму.

Наведені в роботі положення впроваджені в навчальний процес при викладенні курсів “Радіобіологія”, “Радіаційна біохімія”.

Особистий внесок здобувача. Дисертант особисто виконала експериментальні дослідження, провела аналіз наукової літератури за темою роботи, оволоділа необхідними аналітичними та статистичними методами досліджень, брала участь у плануванні експериментальних робіт і підготовці матеріалів до друку. За участю наукового керівника та співавторів публікацій проведено інтерпретацію та узагальнення результатів роботи.

Апробація результатів роботи. Основні результати дисертаційної роботи були висвітлені на: Всеукраинской конференции молодых учених (Симферополь, 2003); Міжнародній конференції „Радіобіологічні ефекти: ризики, мінімізація, прогноз” (Київ, 2005); 5th Parnas conference (Київ, 2005); ІХ Українському біохімічному з’їзді (Харків, 2006); Міжнародній конференції „The 35th Annual Meeting of the Europian Radiation Research Society and the 34th Annual Meeting of the Ukranian Society for Radiation Biology” (Київ, 2006); Всеукраїнській науково-практичній конференції Інституту ядерних досліджень НАН України (Київ, 2006); Міжнародній науково-практичній конференції „Віддалені наслідки впливу іонізуючого випромінювання” (Київ, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 4 статті у фахових виданнях та 7 тез у матеріалах вітчизняних та міжнародних конференцій.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду наукової літератури, опису матеріалів та методів дослідження, власних досліджень з обговоренням, заключення, висновків, списку використаної літератури, що включає 276 найменування. Робота викладена на 139 сторінках машинопису, ілюстрована 13 рисунками та 7 таблицями.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження проведено на білих нелінійних щурах-самцях масою 180-200г, яких утримували на стандартному раціоні віварію. Тварин разово тотально опромінювали на установці РУМ-17 рентгенівськими променями в дозі 0,1, 0,5 та 1,0 Гр за таких умов: потужність дози 0,055 Гр/хв, фільтр 0,5 мм Cu та 1 мм Al, сила струму 5 мА, напруга 200 кВ, шкірно-фокусна відстань – 100 см. Тварин декапітували через 1, 12 та 24 год після опромінення.

Експерименти проводились у відповідності до конвенції Ради Європи щодо захисту хребетних тварин, яких використовують в наукових цілях.

Отримання мітохондрій клітин слизової оболонки тонкої кишки (порожня кишка) проводили згідно з методом [Ахмеров Р.Н., 1978] з деякими модифікаціями. Для одержання везикул внутрішньої мітохондріальної мембрани (субмітохондріальних частинок, СМЧ) проводили процедуру дворазового заморожування-відтаювання суспензії мітохондрій [Прохорова М.И., 1982]. Вміст білка в пробі визначали за методом Лоурі [Lowry O.H. et al., 1951].

Ступінь очищення препаратів внутрішньої мембрани мітохондрій контролювали за електронно мікроскопічним дослідженням та активністю маркерних ферментів внутрішньої та зовнішньої мембран мітохондрій, плазматичної мембрани – сукцинатдегідрогенази, моноамінооксидази [Turski W. et al., 1972] та 5ґ-нуклеотидази [Lesko D.M., 1972; Emmelot P., 1964] відповідно.

Інтенсивність дихання та окисного фосфорилювання визначали полярографічним методом, який ґрунтується на реєстрації відновлення оксигену на катоді при подачі певного, залежного від характеристики електроду, потенціалу, який дорівнює 0,65 В [Северин С.Е., 1989]. Вимірювання НАД•Н–КоQ–оксидо-редуктазної (ЕС 1.6.99.3), сукцинат–КоQ–оксидоредуктазної (ЕС 1.3.99.1), КоQ–цитохром с–оксидоредуктазної (ЕС 1.10.2.2), цитохромоксидазної (ЕС 1.9.3.1) та Н+–АТФазної (ЕС 3.6.1.4) активності проводили спектрофото-метрично за загальнопринятими методами [Покровський А.А., 1977; Прохорова М.И., 1982; Wolf Dieter Engel et al., 1980; Francois Moreau, 1972; Пикулев А.Т. и др., 1982].

Принцип визначення вмісту убіхінону полягає в оцінці його повністю окисненої, повністю відновленої форми і в незмінному редокс-стані, що відповідає такому в інтактній клітині [Прохорова М.И., 1982].

Для визначення кількості цитохромів використовували най-інтенсивнішу б-полосу диференційного спектра цитохромів, яку визначали методом [Мохова Е.Н., 1977].

Вміст загальних ліпідів визначали за методом [Chromy V. Et al., 1976], а фосфоліпідів за методом [Вrockhuyse R.M., 1968]. Кількісний аналіз триацилгліцеролів, загального та вільного холестеролу проводили за методами [Fletcher M.J., 1977, Колб В.Г., 1976], жирних кислот проводили за загальноприйнятим методом згідно [Кейтс М., 1975]. Дослідження жирнокислотного складу загальних ліпідів мембрани мітохондрій проводили на базі Інституту біохімії ім О.В. Палладіна у відділі біохімії ліпідів.

Експериментальні дані оброблялись загальноприйнятими методами варіаційної статистики [Плохинский Н.А., 1981; Кучеренко М.Є. та ін., 2001].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Енергетичне забезпечення всмоктування поживних речовин та метаболічних процесів в тонкій кишці в значному ступені здійснюється мітохондріями. Окисно-відновні процеси в дихальному ланцюзі мітохондрій, що каталізуються системою мембранозв’язаних ферментів, протікають при нерівноважному стані переносників та є мішенню для дії іонізуючої радіації [Миронова Н. Г. и др., 2000].

Інтенсивність дихальної та фосфорилюючої активності мітохондрій клітин слизової оболонки тонкої кишки за умов експерименту оцінювали за зміною кількості О2 полярографічним методом.

При розрахунку полярограм ідентифікували метаболічні стани мітохондрій за Чансом: V4S - інтенсивність дихання в стані 2 (до мітохондрій доданий екзогенний субстрат, але немає акцептора фосфату, мкатом О2/хв на мг білка); V3 - інтенсивність дихання в стані 3 (мітохондрії із субстратом окиснення і АДФ, мкатом О2/хв на мг білка); V4АТФ - інтенсивність дихання в стані 4 (в системі вичерпується доданий акцептор фосфату, але концентрація субстратів окиснення продовжує залишатися високою, мкатом О2/хв на мг білка); VДНФ - інтенсивність дихання мітохондрій за умов дії роз’єднувача окисного фосфорилювання 2,4-динітрофенолу (мкатом О2/хв на мг білка); Vf - швидкість фосфорилювання (мкмоль АДФ/хв на мг білка); ДК - дихальний контроль (відношення V3/V4АТФ); АДФ/О - ефективність фосфорилювання доданого АДФ.

Встановлено, що за разової дії іонізуючого випромінювання, при використанні як субстрату дихання малату, суттєвих змін зазнають такі показники, як Vf , ДК та коефіцієнт АДФ/О (табл.1). Їх зменшення свідчить про пригнічення процесу спряження окиснення та фосфорилювання, а зміна саме цих показників вказує на суттєві порушення фосфорилюючої активності мітохондрій. Збільшення V4АТФ свідчить про підвищення проникності мембран мітохондрій для іонів гідрогену, які створюють градієнт електрохімічних потенціалів (Н+). В той же час, співвідношення V4S/V4АТФ, яке визначає активність АТФ-гідролазної реакції, за даних умов також знижується (через 1, 12 год після опромінення в досліджуваних дозах). Це, в свою чергу, може свідчити, що основний внесок в реалізацію дії іонізуючої радіації на інтенсивність фосфорилювання мітохондрій робить порушення транспорту електронів по дихальному ланцюзі та зміни ферментативної активності Н+–АТФази. Пригнічення АТФ-гідролазної активності мітохондрій тонкої кишки за опромінення викликане порушенням роботи ферменту Н+–АТФази.

Використання як субстрату дихання сукцинату дозволило виявити, що саме друга ділянка спряження КоQ–цитохром с–оксидоредуктаза внутріш-ньої мембрани мітохондрій зазнає найбільших пошкоджень за дії даного чинника в умовах досліду, про що свідчать суттєво виражені зміни досліджуваних показників.

Таким чином, порушення процесу окисного фосфорилювання в мітохондріях за разової дії іонізуючого випромінювання в умовах дослідження може свідчити як про порушення роботи електрон-транспортного ланцюга мітохондрій, так і процесу спряження з певними

ілянками цього ланцюга реакції фосфорилювання, що імовірно може бути пов’язано зі втратою цитохрому с або ж з порушенням роботи оксидоредуктаз [Skulachev V.P., 2000]. Зниження показника ДК до одиниці є свідченням роз’єднання процесу окисного фосфорилювання.

Дослідження активності основних ферментів дихального ланцюга мітохондрій: НАД•Н–КоQ–оксидоредуктази, сукцинат–КоQ–оксидоредуктази, КоQ–цитохром с–оксидоредуктази та цитохромоксидази свідчать про їх зміни в умовах дії іонізуючої радіації в дозах 0,1 Гр, 0,5 Гр та 1,0 Гр (рис.1).

Узагальнення отриманих результатів вказує на:

1. Однонаправленість змін в активностях досліджуваних ферментів за іонізуючого випромінювання в дозі 1,0 Гр через 24 год – підвищення їх активності обумовлено, можливо, тісним взаємозв’язком ферментів дихального ланцюга мітохондрій. Окрім змін активності КоQ–цитохром с–оксидо-редуктази, які спостерігаються після дії іонізуючої радіації в дозах 0,5 та 1,0 Гр, що можливо пов’язано з порушенням структури даного комплексу. Виявлене ймовірне інгібування активності ферменту відбувалось внаслідок взаємодії з радикалами оксигену, утвореними в результаті дії іонізуючого випромінювання на мітохондрії.

2. Різнобічний характер прояву дії випромінювання в дозах 0,1 та 0,5 Гр на функціональні властивості мітохондрій. Дія іонізуючої радіації за дози 0,1 Гр призводить до незначного зниження активності досліджуваних ферментів через 1 год після опромінення, а через 12 год спостерігали нормалізацію показників, хоча через 24 год відбувалось підвищення рівня активності даних ферментів (рис.1).

Отримані результати свідчать про зниження вмісту убіхінона та, можливо, порушення структури мембран мітохондрій, що може призводити до конформаційних змін ферментів у місцях зв’язування з убіхіноном.

Наслідком інактивації ферментів та зміни структури цитохромів, в ланцюзі біологічного окиснення порушується транспорт електронів та аеробна фаза дихання, відбувається зменшення вироблення енергії. Таким чином, можна зробити висновок, що уже в перші терміни пострадіаційного періоду пошкоджуються шляхи швидкого постачання субстратів дихання на фоні дефіциту енергопостачання [Кургалюк Н. М. та ін., 2000].

Рис. 2. H+–АТФазна активність у препаратах внутрішньої мембрани мітохондрій клітин слизової оболонки тонкої кишки за дії іонізуючої радіації, (М±m, n=8)

* ? р ? 0,05 відноcнo контролю

Ферментом, що забез-печує синтез АТФ, спряжено з функціонуванням дихального ланцюга мітохондрій є Н+–АТФаза [Скулачев В.П., 1989]. Встановлено, що Н+–АТФазна активність за дії іонізуючого випромінювання в дозі 0,1 Гр, 0,5 та 1,0 Гр зменшується за досліджу-ваних термінів (рис.2). Через 1 год після опромінення щурів в дозі 0,1 та 0,5 Гр - в середньому на 50%, за опромі-нення в дозах 0,1, 0,5, та 1,0 Гр – в середньому на 40% через 12 год після опромі-нення. Водночас, іонізуюча радіація за доз 0,1, 0,5 та 1,0 Гр через 24 год призводить до зниження активності досліджуваного фермента в середньому на 17%, 26% та 59% відповідно.

Неоднозначність відповідної реакції мембранозв’язаних ферментів на дію опромінення обумовлена різними причинами. Наприклад, зростання активності ферментів може бути пов’язано з переміщенням самих каталітичних одиниць в середині мембрани з включенням „резервних” молекул ферменту та зі змінами швидкості надходження субстратів у дихальний ланцюг із циклу трикарбонових кислот та інших джерел. Пригнічення ж активності мембранозв’язаних ферментів та відповідне порушення її функцій є наслідком опосередкованих ефектів з боку інших компонентів мембрани – ліпідів (активація ПОЛ; фосфоліпазного гідролізу; зменшення кількості фосфоліпідів, зміну їх складу, що характеризується перевагою ненасичених, важко окиснювальних жирних кислот; збільшення холестеролу; тощо), а також дефіциту АТФ, деенергизації клітини.

Дослідження ліпідної компоненти внутрішньої мембрани мітохондрій клітин слизової оболонки тонкої кишки після опромінення в дозах від 0,1 до 1,0 Гр свідчить, що в мембранних препаратах достовірно зростає вміст загальних ліпідів та сумарний вміст фосфоліпідів через 12 та 24 год після опромінення тварин (табл.2).

В мембранних препаратах контрольних та піддослідних тварин виявлені всі основні фракції фосфоліпідів. За дії рентгенівського випромінювання в залежності від дози та досліджуваних термінів відмічено різнонаправлені зміни вмісту основних фосфоліпідних фракцій, що супроводжується суттєвим перерозподілом вмісту мінорної компоненти фосфоліпідів в мембрані (табл.2). За опромінення щурів в дозі 0,1 Гр показано, що через 1, 12 та 24 год після опромінення вміст фосфоліпідів зростає, тоді як через 1 год після опромінення вміст фосфатидилхоліну (ФХ), фосфатидилетаноламіну (ФЕА) та фосфатидил-інозитолу (ФІ) зменшується в середньому на 30%. Встановлено, що разове опромінення щурів в дозі 0,5 Гр приводить до різнонаправлених змін фракцій ФЛ. Вміст ФХ, ФЕА та фосфатидилсерину (ФС) зменшується на 20-42% через 1 год після опромінення, хоча в більш пізні терміни зростає. Показники вмісту ФІ у внутрішній мембрані мітохондрій зростали через 12 та 24 год після опромінення на 32% та 52% відповідно. Особливе значення в підтримці функціональної структури мітохондріальних ферментів клітин слизової оболонки тонкої кишки займає кардіоліпін (КЛ). Вміст КЛ зменшується в середньому на 16% через 1 та 12 год після опромінення. Після 24 год спостерігається зростання його вмісту на 30%, а сфінгоміеліну (СФМ) – в 2 рази. Опромінення в дозі 1,0 Гр приводить до подібних змін: вміст ФХ достовірно зростає через 1 та 12 год після опромінення в середньому на 24%, ФЕА зростає через 1, 12 та 24 год після опромінення в середньому на 30-40%, тоді як показники вмісту СФМ збільшуються в середньому в 2,5 рази через 12 та 24 год. Зростає вміст і ФС через 12 та 24 год після опромінення на 89% та 57%. Спостерігали збільшення вмісту ФІ через 12 год після опромінення в дозі 1,0 Гр на 49%, хоча через 24 год відмічали зниження на 59% відносно контролю, КЛ достовірно зростав лише через 12 год після опромінення на 27%. Суттєве значення для клітини має підвищення рівня лізоформ ФХ і ФЕА в мембранах. Вміст лізоформ ФЛ зростає після всіх досліджуваних термінів пропорційно доз опромінення 0,1, 0,5 та 1,0 Гр: ЛФХ – в 1,5-10 раз, ЛФЕА – в 2-5 раз.

Таким чином, дія іонізуючої радіації низької потужності призводить до зростання відносного вмісту сфінгомієліну, а також різнонаправлених змін вмісту фосфотидилсерину та фосфотидилінозитолу. Необхідно відмітитпаратах внутрішньої мембрани мітохондрій клітин слизової оболонки тонкої кишки після дії іонізуючої радіації, (М±m, n=8)

підвищення відносного вмісту лізоформ фосфоліпідів у внутрішній мітохондріальній мембрані за всіх умов впливу іонізуючого випромінювання, що свідчить про радіаційно-індуковані порушення мембран.

Виявлено суттєве зниження вмісту холестеролу у внутрішній мембрані мітохондрій за опромінення в дозах 0,1, 0,5 та 1,0 Гр. Водночас вірогідно зростав показник через 1 год після опромінення в дозі 0,1 Гр на 48% та через 1 та 12 год після опромінення в дозі 1,0 Гр – на 42% та 157% відносно контролю (табл.3). Подібні зміни відмічали і при дослідженні вмісту етерів холестеролу внутрішньої мембрани мітохондрій. Вміст триацилгліцеролів знижується за всіх досліджуваних доз та термінів опромінення, лише зростає даний показник на 62% відносно контролю через 24 год після опромінення в дозі 0,5 Гр.

Таблиця 3

Вміст нейтральних ліпідів (мкг/мг білка) у препаратах внутрішньої мембрани мітохондрій клітин слизової

0,5 Гр |

1 год

12

24 | 14,260,79

10,420,60*

8,070,51* | 3,890,20*

2,710,18*

1,950,09* | 36,831,21*

47,291,44*

95,214,68*

1,0 Гр | 1 год

12

24 | 14,470,87

23,761,16*

42,962,48* | 3,500,17*

6,680,42*

11,231,03* | 30,970,96*

38,501,11*

29,920,77*

к відомо, склад ліпідів та їх жирних кислот визначає структурний стан мембран. І саме порушення їх вмісту за дії іонізуючої радіації є найбільш раннім проявом. Ступінь ненасиченості ланцюгів фосфоліпідів зумовлює в’язкість мембрани, впливає на активність її ферментів, латеральне перенесення мембранних компонентів та ранню адаптаційну відповідь клітини на зміни навколишнього середовища [Владимиров Ю.А., 1983].

Встановлено, що за разової дії іонізуючого випромінювання в дозі 0,1 Гр відбувається достовірне зменшення коефіцієнту насиченості жирних кислот загальної фракції ліпідів внутрішньої мембрани мітохондрій, хоча за опромінення в дозах 0,5 та 1,0 Гр спостерігали зростання даного показника, тоді як сам вміст окремих насичених та ненасичених жирних кислот ліпідів внутрішньо мітохондріальної мембрани змінювався за всіх досліджуваних доз.

Ці зміни впливають на структуру та функції мітохондрій як цілого. З одного боку, зі збільшенням жорсткості мембрани погіршуються умови функціонування мембранозв’язаних ферментів. З іншого боку, збільшення пасивної проникності ліпідного бішару для іонів та метаболітів свідчить про порушення бар’єрної функції мембрани. Нарешті, присутність в ліпідному бішарі вільних жирних кислот, лізоформ фосфоліпідів чи інших продуктів деградації ліпідів, впливає на структуру внутрішньої мембрани і погіршує умови функціонування мембранозв’язаних ферментів.

ВИСНОВКИ

1. Проведено комплексні дослідження структурно-функціонального стану внутрішньої мембрани мітохондрій клітин слизової оболонки тонкої кишки щурів за разової дії іонізуючого випромінювання низької потужності (0,055 Гр/хв) в дозах 0,1, 0,5 та 1,0 Гр через 1, 12 та 24 год після тотального опромінення. Встановлено роз’єднання процесу окисного фосфорилювання, порушення функціонування ферментів електрон-транспортного ланцюга, пригнічення Н+-АТФазної активності, зміни вмісту цитохромів груп с, b, а та убіхінону, модифікацію ліпідного та жирнокислотного складу цієї мембрани.

2. Порушення окисного фосфорилювання в ранні терміни після дії іонізуючої радіації за досліджуваних доз пов’язано із пригніченням здатності до фосфорилювання, зменшенням ефективності фосфорилювання та роз’єднанням окисного фосфорилювання в мітохондріях.

3. Встановлено різнонаправлені змінив активностях ферментів дихального ланцюга мітохондрій: НАД•Н–КоQ–оксидоредуктази, сукцинат–КоQ–оксидоредуктази, КоQ–цитохром с–оксидоредуктази та цитохром-оксидази після одноразової дії іонізуючого випромінювання низької потужності. Зі збільшенням післярадіаційного терміну до 24 год виявлено активацію ферментів електрон-транспортного ланцюга за умов експерименту, найбільше значення спостерігається за опромінення в дозі 0,5 Гр.

4. Встановлене зменшення величини співвідношення окисненого до відновленого убіхінону у внутрішній мембрані мітохондрій, що свідчить про активацію передачі електронів через убіхінон. При цьому найбільш виражені зміни даного показника спостерігали в ранні терміни після опромінення (1, 12 год) в середньому на 25-48%.

5. Виявлено кількісні зміни цитохромів груп с, b та а у внутрішній мембрані мітохондрій після дії іонізуючої радіації в дозах 0,1, 0,5 та 1,0 Гр через 1, 12 та 24 год після опромінення. Зменшення концентрації цитохромів с спостерігали за доз 0,5 та 1,0 Гр в середньому на 20-60%, водночас як за дози 0,1 Гр його кількість зростає на 40-80%.

6. Разова дія іонізуючого випромінювання низької потужності призводить до пригнічення активності Н+-АТФази внутрішньої мембрани мітохондрій. За опромінення в дозах 0,1 та 0,5 Гр відмічено зменшення виявленого ефекту зі збільшенням часу після опромінення, тоді як за дози 1,0 Гр інгібування ферменту посилюється зі зростанням терміну дії опромінення до 24 год на 60%.

7. Показано перерозподіл вмісту фосфоліпідних фракцій та холестеролу внутрішньої мембрани мітохондрій за умов впливу іонізуючої радіації. Виявлено підвищення відносного вмісту лізоформ фосфотидилхоліну та фосфотидилетаноламіну за умов досліджень, при цьому найбільше їх накопичення спостерігалося через 24 год після опромінення за дози 1,0 Гр.

8. Виявлено модифікацію жирнокислотного складу внутрішньої мембрани мітохондрій за умов досліджень, про що свідчить зменшення коефіцієнту насиченості жирних кислот за дози 0,1 Гр та його збільшення зі зростанням дози опромінення, а також зміна вмісту окремих жирних кислот (пальмітинової, стеаринової, лінолевої, арахідонової, докозопентаєнової).

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Кисіль О.О., Клепко А.В., Биць Н.В., Левченко Л.В. (Грубська Л.В.), Хижняк С.В. Вплив іонізуючого випромінювання та кадмію на функціональний стан мітохондрій ентероцитів тонкого кишечника // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Серія: Біологія. – 2003. – Вип. 39-41. - C.24-26. (Здобувачем проаналізовано літературу, визначено активність сукцинатдегідрогенази, АТФази мітохондрій ентероцитів тонкої кишки щурів при окремій та сумісній дії опромінення та кадмію).

2. Степанова Л.І., Клепко А.В., Ромась І.І., Лапоша О.А., Левченко Л.В. (Грубська Л.В.) Ліпопероксидація та антиокислювальна активність апікальної мембрани ентероцитів слизової оболонки тонкої кишки після дії іонізуючої радіації // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Серія: Біологія. – 2005. – Вип. 45-46. - C.49-50. (Здобувачем проаналізовано літературу, особисто досліджено вміст дієнових кон’югатів, виконано обробку та аналіз результатів).

3. Левченко Л.В. (Грубська Л.В.), Клепко А.В., Войціцький В.М., Кучеренко М.Є. Енергетичний стан мітохондрій ентероцитів тонкої кишки щурів за дії рентгенівського випромінення // Доповіді Національної академії наук України. - 2006. - №7. - С.179-182. (Здобувачем проаналізовано літературу, визначено б-кетоглутаратдегідрогеназну, сукцинатдегідро-геназну активність мітохондрій ентероцитів слизової оболонки тонкої кишки щурів та підготовлено матеріали до друку).

4. Степанова Л.І., Кисіль О.О., Левченко Л.В. (Грубська Л.В.), Бабич Л.В. Оцінка вмісту фосфоліпідів та їхнього жирнокислотного складу в апікальній мембрані ентероцитів за дії іонізуючої радіації та кадмію // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Серія: Біологія. – 2006. – Вип. 47-48. - C.6-8. (Здобувачем проаналізовано літературу, досліджено вміст фосфоліпідів та здійснено статистичну обробку результатів).

5. Клепко А.В., Кисіль О.О., Левченко Л.В. (Грубська Л.В.) Вплив іонізуючої радіації та кадмію на стан мітохондрій ентероцитів // Актуальные вопросы современного естествознания – 2003: Всеукраинская конференция молодых учених. Симферополь, 11-13 апреля 2003г. – Симферополь: Новая эра, 2003. - С.43-44.

6. Клепко А.В., Левченко Л.В. (Грубська Л.В.), Войтенко В.В., Войціцький В.М. Довготривала дія іонізуючого випромінення та кадмію на процеси окиснення та фосфорилювання в мітохондріях ентероцитів тонкої кишки // Радіобіологічні ефекти: ризики, мінімізація, прогноз: Матеріали міжнародної конференції. Київ, 22-24 березня 2005р. – К: НЦРМ АМН України, 2005. - С.24-25.

7. Войцицький В.М., Хижняк С.В., Клепко А.В, Левченко Л.В. (Грубська Л.В.), Ромась И.И., Войтенко В.В. Возможность нарушения сигнальной функции активных форм кислорода при радиационно-индуцируемом угнетении функциональной активности дыхательной цепи митохондрий энтероцитов тонкой кишки // Рецепция и внутриклеточная сигнализация: Международная конференція. Пущино, 6-8 июня 2005г. – М: Пущинский научный центр, 2005. – С. 229-231.

8. Voitsitskiy V., Klepko A., Kysil O., Levchenco L. (Grubska L.), Hyzhnayk S. Mitochondrial membrane contribution to radiation-induced disturbance of enterocyte Ca2+-homeostasis // 5th Parnas conference. Kyiv, 2005. – К: Укр. біохім. журн. – 2005. - Т.77, №2. - С.84.

9. Войцицький В.М., Клепко А.В., Кисиль Е.А., Степанова Л.И., Левченко Л.В. (Грубська Л.В.), Прохорова А.В. Состояние энергетической системы митохондрий энтероцитов тонкой кишки в условиях хронического действия ионизирующей радиации низкой интенсивности // V съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность). Москва, 10-14 апреля 2006г. – М: Из-во РАН, 2006. - Том 1. - С. 142.

10. Войціцький В.М., Грубська Л.В., Клепко А.В., Лапоша О.А., Войтенко В.В. Ліпідний склад внутрішньої мембрани мітохондрій ентероцитів тонкої кишки за дії іонізуючого випромінення низької потужності // ІХ Український біохімічний з’їзд. Харків, 24-27 жовтня 2006р. – К: НАН України, 2006. - Том 2. - С.141-142.

11. Voitsitskiy V., Klepko A., Grubska L., Stepanova L., Laposha O., Prohorova A. Shifts mitochondrial electron transporting chain enzymes activities after small intestine enterocytes irradiation with low intensity // The 35th Annual Meeting of the Europian Radiation Research Society. Kyiv, 22-25 August 2006. – К: Чорнобильінтерінформ, 2006. - P.145.

АНОТАЦІЯ

Грубська Л.В. “Структурно-функціональний стан внутрішньої мембрани мітохондрій клітин слизової оболонки тонкої кишки щурів за дії іонізуючої радіації низької потужності” – рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.01 – радіобіологія. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2008.

Проведено комплексні дослідження структурно-функціонального стану внутрішньої мембрани мітохондрій клітин слизової оболонки тонкої кишки щурів за разової дії іонізуючого випромінювання низької потужності (0,055 Гр/хв) в дозах 0,1, 0,5 та 1,0 Гр через 1, 12 та 24 год після тотального опромінення. Встановлено роз’єднання окисного фосфорилювання, порушення функціонування ферментів електрон-транспортного ланцюга, пригнічення активності Н+–АТФази, зміни вмісту цитохромів груп с, b, а та убіхінону, модифікацію ліпідного та жирнокислотного складу внутрішньої мембрани мітохондрій. Зміна активності мембранозв’язаних ферментів внутрішньої мембрани мітохондрій та відповідне порушення їх функцій є наслідком опосередкованих ефектів з боку інших компонентів мембрани – ліпідів (зменшення кількості сумарних фосфоліпідів та перерозподіл вмісту окремих фосфоліпідів, що характеризується зростанням вмісту ненасичених, важко окиснювальних жирних кислот, збільшення холестеролу, тощо), а також дефіциту АТФ, деененргизації клітини.

В кооперативній системі білок-ліпідного матрикса мембран радіаційно-індуковані зміни функціональної активності мітохондрій зумовлені змінами структури мембранних білків та фізико-хімічного стану ліпідного бішару. Встановлені структурно-функціональні порушення внутрішньої мембрани мітохондрій клітин слизової оболонки тонкої кишки розширюють існуючі уявлення про механізми дії іонізуючої радіації в діапазоні доз 0,1 – 1,0 Гр. Дане дослідження доповнює методичні підходи при оцінці радіобіологічних ефектів в динаміці дії протипроменевих засобів.

Ключові слова: іонізуюче випромінювання низької потужності, внутрішня мембрана мітохондрій, тонка кишка, окисне фосфорилювання, ферменти електрон-транспортного ланцюга, Н+–АТФаза, цитохроми, убіхінон, ліпіди, жирні кислоти.

АННОТАЦИЯ

Грубская Л.В. “Структурно-функциональное состояние внутренней мембраны митохондрий клеток слизистой оболочки тонкой кишки крыс при действии ионизующей радиации низкой мощности” – рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.01 – радиобиология. – Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2008.

Впервые проведено и проанализовано комплексные радиобиологи-ческие и биохимические исследования одноразового действия ионизующего излучения низкой мощности в дозах 0,1, 0,5 и 1,0 Гр через 1, 12 и 24 ч на структурно-функциональное состояние внутренней мембраны митохондрий клеток слизистой оболочки тонкой кишки крыс.

На основании проведенных исследований установлено, что изменение активности ферментов внутренней мембраны митохондрий сопровождалось изменением ее липидного состава, что говорит о взаимосвязи и взаимодействии белковой и липидной компонентов внутренней мембраны митохондрий. Определено нарушение функционирования електрон-транспортной цепи уже после облучения в дозе 0,1 Гр. Об этом свидетельствует разобщение сопряжения окисления и фосфорилирования в митохондриях клеток слизистой оболочки тонкой кишки крыс, которое усугубляется с увеличением дозы облучения.

Установлены разнонаправленные изменения активности основных ферментов дыхательной цепи митохондрий: НАД•Н–КоQ–оксидоредуктазы, сукцинат–КоQ–оксидоредуктазы, КоQ–цитохром с–оксидоредуктазы, цитохромоксидазы в ранние сроки (1, 12 ч) после действия ионизирующего излучения низкой мощности в дозах 0,1, 0,5 и 1,0 Гр. В более поздние сроки (24 ч) после облучения наблюдали достоверную активацию ферментов в условиях эксперимента. Исследование количественного состава цитохромов внутренней мембраны митохондрий клеток слизистой оболочки тонкой кишки крыс свидетельствует, что изменения содержания цитохромов групп с и а являются однонаправленными, а цитохромов группы b – разнонаправленными. Установлено существенное снижение содержания цитохрома с после облучения крыс в дозах 0,5 и 1,0 Гр. Действие ионизирующего излучения низкой мощности приводит к угнетению активности Н+-АТФазы внутренней мембраны митохондрий. После облучения в дозах 0,1 и 0,5 Гр отмечено уменьшение эффекта с увеличением времени после облучения, тогда как при дозе в 1,0 Гр ингибирование ферментативной активности усиливается с увеличением срока после действия радиации.

Результаты сравнительного исследования качественного и количественного состава липидов внутренней мембраны митохондрий клеток слизистой оболонки тонкой кишки указывают на количественное перераспределение отдельных фосфолипидных фракций, а также холестерола в результате облучения. Обнаружено повышение относительного содержания лизоформ фосфолипидов в условиях исследований. Установлены изменения содержания жирних кислот липидов внутренней мембраны митохондрий в условиях исследований, о чем свидетельствует уменьшение коэфициента насыщенности жирних кислот при дозе 0,1 Гр и его увеличение с повышением дозы облучения, а также изменение в составе отдельных жирних кислот (пальмитиновой, стеариновой, линолевой, арахидоновой, докозопентаеновой).

Установленые структурно-функциональные нарушения внутренней мембраны митохондрий клеток слизистой оболочки тонкой кишки крыс расширяют существующие представления о механизмах действия ионизирующей радиации низкой мощности. Проведенные исследования дополняет методические подходы при оценке радиобиологических эффектов в динамике действия противолучевых средств.

Ключевые слова: ионизирующее излучение низкой мощности, внутренняя мембрана митохондрий, тонкая кишка, окислительное фосфорилирование, ферменты электрон-транспортной цепи, Н+-АТФаза, цитохромы, убихинон, липиды, жирные кислоти.

ANNOTATION

Grubska L.V. The structure-functional state of the mitochondrial inner membrane of the rats small intestine mucosa cells exposed to ionizing radiation with low intensity. – Manuscript.

Dissertation for the candidate of biological sciences degree in speciality 03.00.01 – Radiobiology. - Kyiv National Taras Shevchenko University, Kyiv, 2008.

The complex investigations of the structure-functional state of the mitochondrial inner membrane of the rats small intestine mucosa cells under the single exposed to ionizing radiation in the dose 0,1; 0,5 and 1 Gy with dose input 0,055 Gy/min were carried out. Animals were decapitated in 1, 12 and 24 hours after total irradiation. The discoupling of the oxidative phosphorylation, the disturbance functions of the electron-transport chain enzymes, the suppression of ATP-ase activity, the change of the contents of cytochroms groups: a, b and c and ubiquinone, the modification of the lipid and fatty acids composition of the mitochondrial inner membrane of small intestine mucosa cells were revealed. The main disturbance of the protein and the lipid components of the inner mitochondrial membrane under the conditions of the investigations were analyzed. The changes of the membrane-chain enzymes of the mitochondrial inner membrane and appropriate disturbance of their functions were established as the result of indirect effects by other components of membrane – lipids (the decrease of quantity of the phospholipids, the change of their composition what characterized by the predominance of unsaturated fatty acids, and the increase of cholesterol, at all.), and by deficit of ATP and by the deenergization of the cells.

The established structure-functional disturbances of the mitochondrial inner membrane of small intestine mucosa cells