НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

ГОРОХОВА НАТАЛЯ АНАТОЛІЇВНА

УДК: 57.043.085.23: 611.013.395

КРІОКОНСЕРВУВАННЯ КУЛЬТИВОВАНИХ ФІБРОБЛАСТОПОДІБНИХ КЛІТИН ШЛЯХОМ ПОВІЛЬНОГО ЗАМОРОЖУВАННЯ І ВІТРИФІКАЦІЇ

03.00.19 – кріобіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник: | доктор біологічних наук, професор

Петренко Олександр Юрійович,

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України,

завідувач відділу кріобіохімії, м.Харків

Офіційні опоненти: | доктор біологічних наук, професор

Гордієнко Євген Олександрович

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, м.Харків

завідувач відділу НТК

доктор ветеринарних наук, професор

Білоконь Віктор Степанович

Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, м. Харків

завідувач відділу біохімії і біотехнології

Захист дисертації відбудеться « 24 » червня 2008 р. о 13-30 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, 61015, м. Харків-15, вул.Переяславська,23

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, за адресою: 61015, Харків-15, вул.Переяславська,23

Автореферат розісланий « 23 » травня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук, професор,

член-кореспондент НАН України Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Завдяки здатності до самооновлення, спрямованого мультилінійного диференціювання і регуляції імунної відповіді мезенхімальні стовбурові клітини останнім часом привертають увагу фахівців у галузях клітинної біології, експериментальної та клінічної медицини. Ці клітини вперше були виділені зі строми кісткового мозку та описані як фібробластоподібні клітини-попередники (Фриденштейн А. и др., 1970). На сьогодні мультипотентні фібробластоподібні клітини (ФПК) виділені зі строми ряду тканин дорослого організму (Zuk P.A. et al., 2002, Shih D.T. et al., 2005). Питання ідентичності властивостей мультипотентних ФПК, вилучених з різних джерел, дотепер залишається відкритим. Враховуючи їх стромальну локалізацію в різних тканинах, Міжнародне товариство клітинної терапії (International Society for Cellular Therapy – далі ISCT) нещодавно прийняло рішення називати ці клітини мультипотентними мезенхімальними стромальними клітинами (МСК) і визначило основні критерії їх ідентифікації (Dominici M. et al., 2006). Згідно з рекомендаціями ISCT до МСК зараховують адгезивні фібробластоподібні клітини з остео-, адипо- і хондрогенним потенціалом диференціювання, позитивні за CD29, CD44, CD73, CD105 і негативні за маркерами гемопоетичних клітин.

За останні роки МСК були виділені з деяких фетальних тканин людини (In’t Anker P.S. et al., 2003, Скоробогатова Н.Г. и др., 2007). Враховуючи те, що потенціал і пластичність МСК знижуються в перебігу онтогенезу (Gоtherstrоm C. et., 2005), пошук МСК серед онтогенетично ранніх джерел, зокрема ФПК ембріонів ранніх стадій органогенезу, сприятиме подальшому вивченню властивостей цих клітин.

Експериментальне і подальше клінічне застосування МСК потребує удосконалення традиційних та розроблення нових методів кріоконсервування, які б дозволили більшою мірою зберегти їх життєздатність і морфофункціональні властивості. Для оцінки ефективності методів кріоконсервування важливим є вибір чутливого та інформативного методу визначення життєздатності клітин. До таких методів можна зарахувати Alamar Blue-тест, який знаходить все більш широке застосування у клітинній біології і кріобіології (Baust J.M. et al., 2002, Mukherjee I.N. et al., 2007). Проте деякі аспекти механізму відновлення Alamar Blue (АВ) і прийнятності його застосування для оцінки метаболічної активності онтогенетично ранніх клітин залишаються недослідженими.

Для кріоконсервування МСК, як правило, застосовують повільне заморожування в середовищах, що містять диметилсульфоксид (ДМСО) (Colter D.C. et al., 2000, Skorobogatova N.G. et al., 2007). Альтернативні технології із залученням вітрифікації, що виключають розвиток кристалізації і цілої групи пов'язаних з нею кріоушкоджень, відкривають нові перспективи для низькотемпературного консервування різних біологічних систем від ізольованих клітин до біоінженерних конструкцій (Liu B.L. et al., 2002) і фрагментів тканин (De Graaf I.A.M. et al., 2007). Але досліджень щодо вивчення ефективності кріоконсервування МСК шляхом вітрифікації до цього часу не проводилося.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота виконана відповідно до плану НДР ІПКіК НАН України у відділі кріобіохімії за темами: № 7 „Вивчення морфофункціональних особливостей регіональних стовбурових клітин ембріонів, їх кріочутливості і механізмів реалізації біологічної активності в умовах культивування і на моделях деяких патологічних станів” (№ ДР 0102U002026); № 34 „Вивчення дії низьких температур на властивості стовбурових клітин та клітин-попередників в умовах експериментальної трансплантації та культивування” (№ ДР 0107U000528); № 39 „Вивчення дії біорегуляторів стовбурових та прогеніторних клітин на моделях in vivo та in vitro” (№ ДР 0107U006894).

Мета і задачі дослідження.

Мета дисертаційної роботи – визначити вплив кріоконсервування шляхом повільного заморожування та вітрифікації на морфофункціональні властивості і здатність до спрямованого диференціювання культивованих фібробластоподібних клітин людини ранніх стадій органогенезу.

Для досягнення мети були поставлені наступні задачі:

1. Визначити імунофенотип і морфофункціональні властивості ФПК ранніх стадій органогенезу в перебігу субкультивування.

2. Вивчити здатність ФПК до індукованого диференціювання в остеогенному та адипогенному напрямах в умовах моношарового культивування.

3. Дослідити можливість визначення збереженості, метаболічної і проліферативної активності ФПК ранніх стадій органогенезу за допомогою Alamar Blue-тесту.

4. Вивчити вплив кріоконсервування з використанням повільного програмного заморожування під захистом ДМСО на збереженість, метаболічну активність і здатність до спрямованого диференціювання ФПК ранніх стадій органогенезу.

5. Розробити склад багатокомпонентних розчинів кріопротекторів, що запобігають розвитку кристалізації під час швидкого заморожування і відігрівання.

6. Дослідити вплив кріоконсервування шляхом вітрифікації на морфофункціональні властивості і здатність до спрямованого диференціювання ФПК ранніх стадій органогенезу.

Об'єкт дослідження – стійкість ФПК ранніх стадій органогенезу до різних умов кріоконсервування.

Предмет дослідження – збереженість, адгезивні властивості, метаболічна активність, імунофенотип і диференціювальний потенціал ФПК до і після кріоконсервування.

Методи дослідження: культивування in vitro, кріоконсервування шляхом повільного заморожування і вітрифікації, морфологічні, біохімічні, імуноцитохімічні, біофізичні і статистичні методи. Для оцінки збереженості і вивчення морфофункціональних властивостей клітин застосовували методи світлової мікроскопії; для аналізу експресії маркерних антигенів – метод проточної цитофлуориметрії; для вивчення диференціювального потенціалу – методи культивування в середовищах з індукторами диференціювання з подальшим цитохімічним фарбуванням; для визначення відновленої форми АВ – метод флуоресцентної спектроскопії; для вивчення здатності до склування розчинів кріопротекторів – метод диференціальної скануючої калориметрії (ДСК).

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше встановлено, що культивовані ФПК ранніх стадій органогенезу мають характерний для МСК імунофенотип (позитивні за CD29, CD44, CD73, CD105 і негативні за CD34, CD38, CD45) і здатні до диференціювання в остеогенному й адипогенному напрямах. Показано, що АВ-тест може бути використаний для визначення життєздатності та метаболічної активності ФПК ранніх стадій органогенезу. Уперше встановлено, що застосування багатокомпонентного розчину, що містить ДМСО, етиленгліколь (ЕГ), 1,2-пропандіол (1,2-ПД) і цукрозу, при швидкому заморожуванні і швидкому відігріванні суспензії ФПК у пластикових кріопробірках запобігає розвитку кристалізації і забезпечує збереженість морфофункціональних властивостей ФПК, а також здатності до індукованого диференціювання в остеогенному й адипогенному напрямах.

Теоретичне та практичне значення отриманих результатів. Отримані результати та їх узагальнення доповнюють і поглиблюють сучасні уявлення про морфофункціональні властивості ФПК людини ранніх стадій органогенезу і їхню стійкість до різних умов кріоконсервування.

Проведений у роботі імунофенотипічний аналіз і виявлений диференціювальний потенціал культивованих ФПК людини ранніх стадій органогенезу відкривають перспективу їх використання в експериментальній біології, клітинній терапії і тканинній інженерії як мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин. Результати, що свідчать про збереженість життєздатності, морфофункціональних властивостей і здатності до спрямованого диференціювання ФПК після вітрифікації, доводять перспективність застосування цього підходу для кріоконсервування ФПК. Вітрифікація відносно великого об'єму зразків (0,5 мл) може бути основою для розроблення технологій кріоконсервування тривимірних біоінженерних конструкцій.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно проведений аналіз даних літератури, отримані культивовані ФПК ранніх стадій органогенезу, виконані експериментальні дослідження їхніх морфофункціональних властивостей, імунофенотипу, здатності до індукованого диференціювання в остеогенному і адипогенному напрямах, впливу умов кріоконсервування на наведені показники, проведене статистичне оброблення результатів. Спільно з д.б.н., проф. О.В.Зінченко виконані експерименти з вивчення здатності до склування розчинів кріопротекторів методом ДСК. Автором особисто проведений первинний аналіз даних і зроблені попередні висновки. Спільно з науковим керівником були визначені мета, задачі роботи і способи їх вирішення, інтерпретовані результати і зроблені остаточні висновки. Роботи, опубліковані у співавторстві, відображають результати спільного планування проведення експериментів та обговорення результатів, при цьому особистий внесок здобувача становить:

у роботах [1, 4] – участь у спільному проведенні експериментальних досліджень з вивчення життєздатності і морфофункціональних властивостей клітин ембріональної печінки людини;

у роботах [2, 3, 8, 9, 10] – проведення досліджень з вивчення відновлення Alamar Blue і можливостей Alamar Blue-теста у визначенні збереженості, метаболічної і проліферативної активності ФПК ранніх стадій органогенезу;

у роботах [5, 11, 13] – проведення досліджень з вибору розчинів кріопротекторів для вітрифікації клітин і дослідження морфофункціональних властивостей ФПК після експозиції і швидкого заморожування-відігрівання в цих розчинах;

у роботах [6, 7, 12, 14, 15] – проведення досліджень з вивчення імунофенотипу ФПК і впливу умов кріоконсервування на здатність ФПК до індукованого диференціювання;

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися і обговорювалися на щорічних конференціях молодих вчених «Холод в біології і медицині» (м. Харків, 2005, 2006, 2007); II міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів «Молодь і поступ біології» (м. Львів, 2006); IX Українському біохімічному з'їзді (м. Харків, 2006); міжнародній конференції «6th Parnas Conference – Molecular Mechanisms of Cellular Signalling» (м.  Краків, Польща, 2007); ІІІ Всеросійському симпозіумі з міжнародною участю «Актуальні питання тканинної і клітинної трансплантології» (м. Москва, Росія, 2007); 2-му з'їзді Українського товариства клітинної біології (м. Київ, 2007); IV з'їзді трансплантологів України (м. Київ, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковані 7 статей, серед яких 5 статей у фахових виданнях, що включені до переліку, затвердженого ВАК України, та 8 тез доповідей міжнародних і національних наукових конференцій.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів власних досліджень та їх обговорення, заключної частини, висновків і переліку цитованої літератури, який містить 230 найменувань джерел. Загальний обсяг дисертації складає 153 сторінки. Робота проілюстрована 4 таблицями і 30 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень

Об’єктом досліджень служили культивовані протягом 3-12-ти пасажів ФПК людини ранніх стадій органогенезу. Для отримання первинної культури застосовували метод культивування тканинних експлантатів (Richards M. et al., 2003). Для часткової дезагрегації фрагментів тканин використовували модифікований неферментативний метод (Petrenko А.Yu. et. аl., 1991). У роботі були використані фрагменти тканин 17 ембріонів людини 5-6 тижнів гестації, отриманих після штучного переривання вагітності з письмової згоди проінформованих донорів відповідно до рекомендацій декларації Ґельсінської Всесвітньої медичної асоціації з проведення біомедичних досліджень. Суспензію тканинних фрагментів і клітин культивували в середовищі б-МЕМ (Sigma, США), що містило 15% сироватки крові ембріонів великої рогатої худоби (ЕС, ТОВ «БіолоТ», Росія), 100 од пеніциліну, 100 мкг стрептоміцину, при 37°С / 95% вологості в атмосфері з 5% СО2. Після досягнення культурою 60-70% конфлуента клітини пересівали з коефіцієнтом 1:2 в середовище б-МЕМ з 10% ЕС.

Підрахунок кількості клітин проводили в камері Горяєва згідно зі стандартними методиками. Збереженість клітин визначали за допомогою прижиттєвого забарвлення трипановим синім (Seglen P.O., 1976). Ефективність прикріплення визначали в умовах моношарового культивування через 24 год після експлантації клітин (Pegg D.E., 1989). Прижиттєву мікроскопію, а також аналіз забарвлених препаратів культур клітин проводили з використанням інвертованого мікроскопа CETI (Голландія), обладнаного цифровою камерою Nikon CoolPix 4500.

Імунофенотипічний аналіз ФПК проводили з використанням моноклональних антитіл CD29-РЕ, CD45-PE, CD105-FITC (Serotec, США), CD34 Class II-FITC, CD 38-RPE (DAKO, Голландія), CD44-FITC, CD73-PE (BD Biosciences, США). Забарвлені зразки аналізували на проточному цитофлуориметрі FACS(BD Biosciences, США).

Остеогенний і адипогенний потенціали ФПК досліджували у процесі культивування протягом 3-х тижнів у середовищах, що індукують диференціювання у вказаних напрямах. Остеогенне середовище складалося з б-МЕМ, 10% ЕС, 100 нМ дексаметазону, 10 мМ в-гліцерофосфату, 0,2 мМ L-аскорбінової кислоти-2-фосфату (Sigma, США). Адипогенне середовище складалося з б-МЕМ, доповненого 10% Adipogenic Stimulatory Supplements № 05403 (StemCell Inc., Канада). Наявність остеогенного диференціювання оцінювали за експресією лужної фосфатази за допомогою набору Fast Blue RR Salt, Naphtol AS-MX Phosphate Alkaline Solution kit № 85 (Sigma, США) і накопиченням мінералізованого матрикса за фарбуванням алізариновим червоним і методом сріблення Ван Коса (Кисели, 1962). Наявність адипогенного диференціювання оцінювали за накопиченням у цитоплазмі клітин вакуолей з нейтральними ліпідами, які виявляли фарбуванням Oil Red О (McBeath R. et al., 2004).

Відновлення АВ (Serotec, США) у ФПК досліджували в перебігу культивування у присутності і за відсутності азиду натрію мМ), антиміцину А (2 мкг), монойодацетату (МИА, 10 мМ), дигитоніну (100 мкг/106 клітин). Відновлення АВ ізольованими мітохондріями визначали в перебігу інкубації при 26o С у середовищі, що містило 200 мМ маннітолу, 50 мМ цукрози, 10 мМ KH2PO4, 0,5 мМ ЕДТА і 30 мМ Трис-HCl (pH 7,4), у присутності екзогенних субстратів дихання та інгібіторів різних комплексів дихального ланцюга (Chance B. et al., 1956, Petrenko А. et al., 1991). Мітохондрії виділяли з печінки щурів методом диференціального центрифугування (Chance B. et al., 1956). Усі маніпуляції із тваринами проводили під ефірним наркозом згідно з “Європейською конвенцією захисту хребетних тварин, що використовуються з експериментальною та іншою науковою метою” (Strasburg, 1986). Визначення загального білка в суспензії мітохондрій проводили за методом Лоурі (Lowry O.H. et al., 1951). У всіх експериментах АВ вносили у концентрації 10% (O'Brien J. et al., 2000), відновлену форму АВ визначали на спектрофлуориметрі Tecan GENios (Австралія) за довжини хвилі збудження 550 нм та емісії 590 нм. Оброблення даних проводили за допомогою програми XFLUOR4 v.4.50. Результати наводили як різницю між флуоресценцією дослідної і контрольної (без мітохондрій або без клітин) проби і виражали в умовних одиницях флуоресценції (УОФ).

Для кріоконсервування ФПК з використанням повільного заморожування до суспензії клітин у середовищі культивування повільно по краплях додавали рівний об'єм середовища 199, що містило 20% ДМСО і 40% ЕС, і після еквілібрації за температури 4°С протягом 15 хв отриману суспензію заморожували у кріопробірках Corning зі швидкістю 1°С/хв до –80 °С, після чого переносили в рідкий азот. Відігрівання проводили на водяній бані при 37°С. Кріопротектор видаляли шляхом повільного розведення деконсервованої суспензії середовищем 199 з 10% ЕС у співвідношенні 1:10 з подальшим центрифугуванням при 200 g протягом 10 хв.

Для розроблення складу розчинів для вітрифікації використовували композиції з ДМСО, ЕГ, 1,2-ПД і цукрози в різних концентраціях. Первинний скринінг ефективних композицій проводили за візуальною оцінкою наявності кристалізації (Baudot А. et al., 2004) при швидкому заморожуванні аліквот розчинів об’ємом 0,5 мл у кріопробирках Corning шляхом занурення в рідкий азот і відігріванні на водяній бані при 40°С. Термограми заморожування-відігрівання відібраних в результаті первинного скринінгу розчинів реєстрували за допомогою термопари МК 121-89 і самописця ENDIM. Здатність до склування розчинів досліджували методом ДСК у процесі нагрівання зі швидкістю 0,5°С/хв (Boutron P. et al., 1986).

Для кріоконсервування культивованих ФПК шляхом вітрифікації розчин кріопротекторів додавали до суспензії клітин за кімнатної температури в два етапи, після чого кріопробірки занурювали в рідкий азот. Відігрівання проводили на водяній бані при 40°С. Для видалення кріопротекторів використовували ступеневе розведення суспензії клітин 0,5 М розчином цукрози і подальше центрифугування. Осади клітин розводили середовищем культивування і використовували для подальших досліджень. Експерименти з вивчення впливу експозиції з розчинами кріопротекторів на морфофункціональні властивості клітин містили всі описані вище етапи, окрім заморожування.

Отримані результати статистично обробляли, використовуючи t-тест Стьюдента.

Матеріали і методи, використані в дисертаційній роботі, розглянуті і схвалені комісією з біоетики ІПКіК НАН України.

Результати власних досліджень та їх обговорення

Отримання і властивості культивованих ФПК. Первинні культури адгезивних клітин ембріонів людини 5-6 тижнів гестації мали гетерогенний склад. Починаючи з 4-ї доби культивування, спостерігали виселення з тканинних експлантатів епітеліоїдних і фібробластоподібних клітин, які згодом формували зони росту. На 14-ту добу культивування клітини формували моношар. У ході подальшого субкультивування спостерігали уніфікацію складу культур і через 3-4 пасажі сформований клітинний шар складався з клітин з фібробластоподібною морфологією. Основна маса фібробластоподібних клітин характеризувалась невеликими розмірами, веретеноподібною морфологією, високим ядерно-цитоплазматичним співвідношенням. Вони активно проліферували в культурі, що виявлялося за наявністю великої кількості клітин на різних стадіях мітозу і швидким формуванням конфлуентного моношару.

Імунофенотипічний аналіз культур ФПК 4-го – 12-го пасажів показав, що близько 95% клітин (рис. ) експресували CD29, CD44, CD73, CD105. При цьому відзначена відсутність експресії гемопоетичних маркерів CD34, CD38, CD45. Таким чином, ФПК ранніх стадій органогенезу мають імунофенотип, характерний для МСК кісткового мозку та МСК інших тканин дорослої людини (Pittenger M.F. et al., 1999, Ip J.E. et al., 2007).

Через 3 тижні після перенесення субкультивованих ФПК до середовища, яке індукувало диференціювання в остеогенному напрямі, виявлялася експресія раннього маркера остеогенезу – лужної фосфатази. Фарбування культур алізариновим червоним і сріблення за Ван Косом виявили відкладення солей кальцію, що свідчить про характерне для остеобластів накопичення мінералізованого матрикса. При культивуванні ФПК в адипогенному середовищі спостерігали появу великих округлих клітин з вакуолями нейтральних ліпідів, що профарбовувалися Oil Red О. За умови культивування ФПК в середовищі без специфічних індукторів диференціювання не спостерігали спонтанного диференціювання в остеогенному та адипогенному напрямах. Ці дані свідчать про здатність ФПК до спрямованого остеогенного і адипогенного диференціювання.

Таким чином, виявлені специфічні біологічні властивості культивованих ФПК, такі як характерний імунофенотип і здатність до спрямованого диференціювання, підтверджують їх належність до МСК.

Важливе значення має дослідження властивостей клітин в перебігу субкультивування. Узагальнюючи отримані результати (табл. ), можна зазначити, що ефективність прикріплювання ФПК в перебігу субкультивування не змінюється і становить 95%. Характерний для МСК імунофенотип і здатність до двохлінійного диференціювання зберігались у процесі культивування до 12-го пассажу. При цьому відсотковий вміст клітин з імунофенотипом МСК не змінювався в перебігу субкультивування ФПК.

Таким чином, наведені результати свідчать, що отримані культури ФПК характеризуються стабільністю своїх морфофункціональних властивостей у перебігу тривалого культивування в межах 12-ти пасажів.

Для більш повної характеристики культур ФПК вивчали метаболічний і проліферативний потенціал клітин з використанням АВ-тесту, який застосовувався раніше для визначення життєздатності і проліферативної активності інших типів клітин (Voytik-Harbin S.L. et al., 1988, White M.J. et al., 1996, Gloeckner H. et al., 2001, Петренко Ю.А., 2006). На першому етапі досліджень визначали прийнятність АВ-тесту як методу оцінки сумарної метаболічної активності клітин. Згідно однієї з гіпотез (Shahan T.A. et al., 1994, Springer J.E. et al., 1998), АВ відновлюється тільки цитохромоксидазою. Проведене нами порівняльне вивчення флуоресценції АВ і споживання кисню ізольованими мітохондріями з використанням роз’єднувача, різних субстратів та інгібіторів окислювального фосфорилювання дозволило зробити висновок, що АВ здатен виступати як акцептор електронів для ряду компонентів дихального ланцюга. У роботах (O’Brien J. et al., 2000, Gonzalez R.J. et al., 2001) показано, що цитозольні і мікросомальні оксидоредуктази також здатні відновлювати АВ. Таким чином, можна дійти висновку про те, що відновлення АВ є інтегральним показником метаболічної активності клітин, який відображає роботу мітохондріальних, цитоплазматичних і мікросомальних оксидоредуктаз.

Таблиця 1

Морфофункціональні властивості ФПК ранніх стадій органогенезу в перебігу субкультивування

Морфофункціональний показник | Пасаж

4-й | 12-й

Ефективність

прикріплювання, % | 95,2 ± 1,6 | 94,8 ± 2,3

Диференціювальний потенціал

Остеогенний | + | +

Адипогенний | + | +

Імунофенотип, %

CD29+ | 95,9±2,2 | 98,4±2,1

CD44+ | 94,7±2,4 | 98,2±1,3

CD73+ | 95,6±0,9 | 98,2±2,0

CD105+ | 96,8±2,1 | 97,7±2,4

CD34- | 94,1±1,3 | 95,4±1,4

CD38- | 95,5±2,3 | 96,8±2,0

CD45- | 95,4±1,7 | 98,3±1,4

Цей висновок став підгрунтям подальших досліджень з оцінки внеску мітохондріального і гліколітичного шляхів у сумарну метаболічну активність ФПК ранніх стадій органогенезу. З рис. 2 видно, що внесення до культурального середовища інгібіторів дихального ланцюга (антиміцин А або азид натрію) приводило до зниження інтенсивності флуоресценції АВ на 20-30%. У той же час у присутності інгібітора гліколізу МИА інтенсивність флуоресценції відновленого АВ знижувалася на 80%. Отримані результати свідчать про те, що гліколіз є найактивнішим метаболічним процесом у ФПК, що є властивим для клітин ембріонального походження.

З рис. 2 також видно, що внесення до середовища культивування дигітоніну, що ушкоджує мембрану клітин, практично повністю запобігало відновленню АВ. При цьому спостерігали забарвлення клітин трипановим синім. Отримані дані показують, що відновлення АВ може бути використане як тест на збереженість, оскільки здійснюється тільки клітинами з інтактною мембраною.

Основною функцією МСК в умовах експансії є проліферація. Ключову роль у запусканні механізмів проліферації і диференціювання відіграє адгезія ФПК до поверхні субстрату (Folkman., Moscona A., 1978, Frisch S.M. et al., 1996). Вивчення залежності відновлення АВ від проліферативної активності ФПК і ролі адгезії у цьому процесі проводили під час культивування клітин на пластику з різними адгезивними властивостями. За умови культивування ФПК на адгезивному пластику практично всі клітини розпластувались і мали типову фібробластоподібну морфологію. У ході культивування спостерігали поділ клітин, який супроводжувався лінійним накопиченням відновленої форми АВ. Так, через 24 год після посіву інтенсивність флуоресценції АВ складала 2045 ± 183, через 48 год – 4864 ± 482, а через 72 год – 7571 ± УОФ/лунка. У разі використання неадгезивного пластику клітини в перебігу культивування не розпластувались, залишалися округлими і практично повністю втрачали здатність відновлювати АВ. Наведені дані, з одного боку, свідчать про те, що відновлення АВ може бути використане для оцінки проліферативної активності клітин у культурі, а з іншого – підтверджують роль адгезії в реалізації метаболічно активних процесів клітин.

Кріоконсервування культивованих ФПК. Збереженість ФПК, оцінена за забарвленням трипановим синім, до кріоконсервування складала 94,6 ± 1,1%. Кріоконсервування ФПК шляхом заморожування зі швидкістю 1 °С/хв під захистом 10% ДМСО і 25% ЕС приводило до зниження збереженості на 7%. При цьому флуоресценція АВ після кріоконсервування зменшувалася на 15%. Наведені дані підтверджують виявлену нами високу чутливість АВ-тесту. Експерименти з культивування деконсервованих клітин в остеогенному і адипогенному середовищах показали, що ФПК зберігають здатність до спрямованого диференціювання у вказаних напрямах. Таким чином, кріоконсервування суспензії ФПК з використанням повільного заморожування дозволяє значною мірою зберегти життєздатність, метаболічну активність і здатність ФПК до спрямованого диференціювання.

Недоліком повільного заморожування є те, що із застосуванням цього підходу не вдається ефективно консервувати більш складні системи, такі як біоінженерні конструкції тканин, які розробляють із залученням стовбурових клітин, зокрема МСК. Для кріоконсервування таких об'єктів показана ефективність вітрифікації (Liu B.L. et al., 2002, Mukherjee I.N. et al., 2007). Під час вивчення можливості використовування вітрифікації для кріоконсервування суспензії ФПК на першому етапі роботи був визначений склад розчинів кріопротекторів, який би дозволив виключити кристалізацію під час швидкого заморожування і відігрівання у стандартних пластикових кріопробирках. З метою зменшення сумарної токсичності без зниження здатності до склування використовували композиції кріопротекторів з різними механізмами токсичності. На підставі візуального аналізу (табл. 2) було обрано два розчини з найменшими концентраціями кріопротекторів, у процесі швидкого заморожування і відігрівання яких не спостерігали розвиток кристалізації. Розчини позначили ДЕПЦ-1 (10% ДМСО, 20% ЕГ, 20% 1,2-ПД, 0,5 М цукрози) і ДЕПЦ-2 (10% ДМСО, 15% ЕГ, 15% 1,2-ПД, 1 М цукрози). За допомогою методу термографії з використанням мідь-константанової термопари було показано, що у обраних нами умовах (заморожування 0,5 мл розчину в кріопробірці шляхом занурення в рідкий азот, відігрівання на водяній бані при 40°С) досягаються високі швидкості заморожування (початкова швидкість 400°С/хв) і відігрівання (початкова швидкість 550°С/хв).

Таблиця 2

Візуальний аналіз кристалізації розчинів кріопротекторів, різних за складом, у процесі швидкого заморожування і швидкого відігрівання (n=5).

Розвиток

кристалізації |

Склад розчину

10% ДМСО

0,5 М цукрози | 1 М цукрози

10% ЕГ

10% 1,2-ПД | 15% ЕГ

15% 1,2-ПД | 20% ЕГ

20% 1,2-ПД | 25% ЕГ

25% 1,2-ПД | 10% ЕГ

10% 1,2-ПД | 15% ЕГ

15% 1,2-ПД | 20% ЕГ

20% 1,2-ПД | 25% ЕГ

25% 1,2-ПД

Під час заморожування | +–––––––

Під час відігрівання | + | +–– | +–––

Примітка: «+» – біле забарвлення і помутніння зразку внаслідок розвитку кристалізації;

«–» – зразок прозорий.

Фазові переходи і склування розчинів ДЕПЦ-1 і ДЕПЦ-2 вивчали за допомогою методу ДСК під час нагрівання зі швидкістю 0,5°С/хв. Відомо, що в процессі відігрівання розчину з аморфного стану за умови, якщо швидкість відігрівання не є достатньою для запобігання кристалізації, спостерігають такі фази: склоперехід з аморфного стану в стан переохолодженої рідини, кристалізація і плавлення льоду (MacKenzie A.P., 1977; Boutron P. et al., 1982, 1986). Як видно з рис. 3, ДСК термограми відігрівання розчинів ДЕПЦ-1 і ДЕПЦ-2 відображають послідовність фаз, характерних для повільного відігрівання розчинів з аморфного стану.

Менша площа піку кристалізації на термограмі ДЕПЦ-1 свідчить про його кращу склотвірну здатність порівняно з ДЕПЦ-2 і дозволяє зробити висновок, що критична швидкість відігрівання, за якої буде унеможливлено кристалізацію, для розчину ДЕПЦ-1 буде меншою, ніж для ДЕПЦ-2. Однак, з огляду на той факт, що ДЕПЦ-2 містить меншу сумарну концентрацію кріопротекторів і може бути менш токсичним, у подальших експериментах з вітрифікації ФПК застосовували обидва розчини.

Після експозиції ФПК у розчинах ДЕПЦ-1 і ДЕПЦ-2 та відмивання кріопротекторів було відзначено зниження на 20% збереженості, метаболічної активності і здатності клітин до адгезії порівняно з контролем (табл. ). Після експозиції і наступного заморожування-відігрівання та відмивання кріопротекторів було виявлено суттєву різницю в ефективності досліджуваних розчинів. Так, у разі використання ДЕПЦ-2 збереженість була нижчою на 45%, а ДЕПЦ-1 – на 20% порівняно з контролем. Метаболічна активність, оцінена за відновленням АВ, за умови використання ДЕПЦ-2 знижувалась на 70%, а ДЕПЦ-1 – на 45% порівняно з контролем. Ефективність прикріплювання до пластику за умови використання ДЕПЦ-2 знижувалась на 60%, а ДЕПЦ-1 – на 40% порівняно з контролем. Крім того, після заморожування-відігрівання в ДЕПЦ-2 близько 70% прикріплених клітин не були здатні до розпластування, залишалися округлими і під час подальшого культивування гинули. У разі використання ДЕПЦ-1 клітини розпластувались і проліферували в культурі.

Слід зазначити, що у процесі відігрівання суспензії клітин, кріоконсервованих під захистом ДЕПЦ-2, розвивався процес кристалізації. Отримані результати показують, що ушкодження клітин у разі використання ДЕПЦ-1 зумовлено в основному токсичністю компонентів розчину, а у разі використання ДЕПЦ-2 – як токсичністю розчину, так і пошкоджуючим впливом кристалізації на етапі заморожування-відігрівання. Тому для подальших експериментів був обраний ДЕПЦ-1.

У процесі культивування клітин, кріоконсервованих шляхом вітрифікації з використанням ДЕПЦ-1, в остеогенному і адипогенному середовищах була відзначена здатність до спрямованого диференціювання, що підтверджує збереженість диференціювального потенціалу ФПК після кріоконсервування шляхом вітрифікації.

Таблиця 3.

Вплив експозиції з розчинами кріопротекторів і швидкого заморожування-відігрівання на морфофункціональні властивості культивованих ФПК (n=15)

Експериментальні групи | Збереженість, % | Метаболічна активність за АВ-тестом, УОФ/лунка | Ефективність прикріплювання,%

Контроль | 90,3 ± 2,9 | 29630 ± 3499 | 94,2 ± 2,8

Експозиція з розчином та видалення кріопротекторів

ДЕПЦ-1 | 71,7 ± 2,1* | 23741 ± 3872 | 75,4 ± 4,1*

ДЕПЦ-2 | 71,8 ± 2,6* | 25513 ± 2465 | 77,9 ± 4,4*

Експозиція, заморожування-відігрівання та видалення кріопротекторів

ДЕПЦ-1 | 70,6 ± 2,8* | 18434 ± 4913* | 55,1 ± 5,9*

ДЕПЦ-2 | 39,9 ± 4,1* | 7432 ± 1884* | 35,5 ± 3,5*

Примітка: * - відмінності статистично значущі (p < 0,05) у порівнянні з контролем.

Отримані результати свідчать про можливість застосування методу вітрифікації для кріоконсервування культивованих ФПК і можуть бути основою для наступного розроблення методів кріоконсервування більш складних конструкцій.

ВИСНОВКИ

У роботі наведені теоретичне узагальнення та вирішення наукової проблеми низькотемпературного консервування фібробластоподібних клітин людини ранніх стадій органогенезу, що мають імунофенотип і диференціювальні властивості мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин.

1. Імунофенотипічний аналіз показав, що культивовані фібробластоподібні клітини людини ранніх стадій органогенезу експресують характерний для МСК імунофенотип (позитивні за CD29, CD44, CD73, CD105 і негативні за CD34, CD38, CD45); вміст клітин з даним імунофенотипом становить близько 95% і не змінюється у перебігу субкультивування до 12-го пасажу.

2. Встановлено, що фібробластоподібні клітини людини ранніх стадій органогенезу здатні до індукованого диференціювання в остеогенному і адипогенному напрямах в умовах моношарового культивування.

3. Аlamar Вlue-тест є чутливим методом визначення збереженості, метаболічної та проліферативної активності фібробластоподібних клітин ранніх стадій органогенезу; Аlamar Вlue відновлюється в клітинах з неушкодженою мембраною, що адгезували до субстрату, і рівень його флуоресценції зростає в процесі культивування.

4. Кріоконсервування шляхом повільного заморожування під захистом 10% диметилсульфоксида дозволяє значною мірою зберегти життєздатність і метаболічну активність фібробластоподібних клітин людини ранніх стадій органогенезу, а також їх здатність до диференціювання в остеогенному і адипогенному напрямах.

5. Показано, що під час швидкого заморожування й відігрівання розчинів, що містять 10% диметилсульфоксида, 20% етиленгліколя, 20% 1,2-пропандіола і 0,5 М цукрози або 10% диметилсульфоксида, 15% етиленгліколя, 15% 1,2-пропандіола і 1 М цукрози, об’ємом 0,5 мл у пластикових кріопробірках виключається розвиток кристалізації.

6. Застосування розчину, що містить 10% диметилсульфоксида, 20% етиленгліколя, 20% 1,2-пропандіола і 0,5 М цукрози, для вітрифікації суспензії культивованих фібробластоподібних клітин людини ранніх стадій органогенезу дозволяє зберегти їх морфофункціональні властивості та здатність до диференціювання в остеогенному і адипогенному напрямах.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Петренко Ю.А. Влияние высокомолекулярных соединений на жизнеспособность и функциональную активность клеток эмбриональной печени человека до и после криоконсервирования / Ю.А. Петренко, Н.А. Горохова, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 3. — С. 375 — 379.

2. Определение метаболической активности свежевыделенных и криоконсервированных клеток эмбриональной печени человека с помощью Alamar Blue-теста / Ю.А. Петренко, Н.А. Горохова, Б.П. Сандомирский, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № . — С. 599—606.

3. The reduction of Alamar Blue by peripheral blood lymphocytes and isolated mitochondria / Yu.A. Petrenko, N.A. Gorokhova, E.N. Tkachova, A.Yu. Petrenko // Укр. Біохім. Журн. — 2005. — Vol. 77, № 5. — Р.100—105.

4. Morphological and functional assessment of human fetal liver cells in long-term culture / P. Todorov, R.Konakchieva, J. Dimitrov, V. Novachkov, D. Kyurkchiev, N. Tchoob, S. Drokin, N. Gorokhova // Проблемы криобиологии. — 2006. — Т. 16, № 2. — С. 201—206.

5. Горохова Н.А. Выбор криозащитной среды для витрификации суспензии эмбриональных фибробластоподобных клеток / Н.А. Горохова, Ю.А. Петренко, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 1. — С. 50—58.

6. Выделение и дифференцировка стромальных клеток из тканей плодов и взрослого человека / А.Ю. Петренко, С.П. Мазур, Ю.А. Петренко, Н.Г. Скоробогатова, Н.А. Горохова, Н.А. Волкова // Трансплантология. — 2007. — Т. 9, № 1. — С. 218—220.

7. Культивирование стромальных клеток-предшественников в трехмерных носителях / Ю.А. Петренко, А.Ю. Петренко, В.И. Лозинский, И.В. Гурин, Н.А. Горохова, Н.А. Волкова, Б.П. Сандомирский // Трансплантология. — 2007. — Т. 9, № 1. — С. 221—223.

8. Горохова Н.А. Alamar Blue-тест как метод определения жизнеспособности клеток до и после криоконсервирования / Н.А. Горохова, Ю.А. Петренко // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 4. — С. 728—729.

9. Gorokhova N.A. Alamar Blue-test as a method of assessing metabolic activity of human embryonic cells / N.A. Gorokhova, Yu.A. Petrenko, E.N. Tkachova // Збірник тез Другої міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів [„Молодь і поступ біології”]. — Львів, 2006. — С. 353—354.

10. Изучение активности метаболических процессов в клетках по восстановлению ресазурина / Н.А. Горохова, Ю.А. Петренко, Е.Н. Ткачева, А.Ю. Петренко // IX Український біохімічний з’їзд : Тез. доп. — Харків, 2006. — С. 117.

11. Горохова Н.А. Криоконсервирование фетальных фибробластоподобных клеток человека методом витрификации / Н.А. Горохова // Проблемы криобиологии. — 2006. — Т. 16, № 4. — С. 423.

12. The effect of cryopreservation on the differentiation potential of human fetal fibroblast-like cells / N.A. Gorokhova, Yu.A. Petrenko, N.A. Volkova, A.I. Pravduk, A.Yu. Petrenko // Abstracts of the 6th Parnas Conference Molecular Mechanism Signalling, Krakоw, Poland. — Acta Biochimica Polonica. — 2007. — Supplement 2. — P. 15.

13. Горохова Н.А. Жизнеспособность клеток после экспозиции и быстрого замораживания-отогрева в многокомпонентных витрифицирующих растворах / Н.А. Горохова // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 2. — С. 199.

14. Multilineage differentiation of human stromal cells isolated from different sources / A.Yu. Petrenko, Yu.A. Petrenko, N.G. Skorobogatova, A.I. Pravduk, N.A. Gorohova, N.A. Volkova, S.P. Mazur, V.P. Grischuk // ІІІ Всероссийский симпозиум с международным участием [«Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» ] : Сб. тезисов. — Москва, 2007. — С. 90.

15. Growth and differentiation of human stromal cells in two- and three-dimensional carriers / A.Yu. Petrenko, Yu.A. Petrenko, A.I. Pravduk, N.A. Gorokhova, V.I. Lozinsky, L.G. Damshkaln, I.V. Gurin, Yu.V. Malutin, I.A. Borovoy, N.G. Skorobogatova, N.A. Volkova, S.P. Mazur // 2-ий З’їзд українського товариства клітинної біології : Тез. доп. — Київ, 2007. — С. 213.

АНОТАЦІЇ

Горохова Н.А. Кріоконсервування культивованих фібробластоподібних клітин шляхом повільного заморожування і вітрифікації. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 –кріобіологія. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2008.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню морфофункціонального стану культивованих фібробластоподібних клітин (ФПК) людини ранніх стадій органогенезу після кріоконсервування шляхом повільного заморожування під захистом диметилсульфоксида (ДМСО) та вітрифікації в багатокомпонентних розчинах кріопротекторів.

Установлено, що близько 95% клітин в культурах ФПК 4-го – 12-го пассажів експресують характерний для мезенхімальних стромальних клітин імунофенотип – позитивні за маркерами CD29, CD44, CD73, CD105 і негативні за маркерами CD34, CD38, CD45. Виявлено здатність культивованих ФПК до індукованого диференціювання в остеогенному і адипогенному напрямах.

Кріоконсервування клітин зі швидкістю 1/хв до -80С під захистом 10% ДМСО дозволяє значною мірою зберегти життєздатність і метаболічну активність ФПК, а також їх здатність до спрямованого остеогенного і адипогенного диференціювання.

Досліджено можливість ефективного кріоконсервування суспензії ФПК шляхом вітрифікації. Показано, що застосування розчину, що містить ДМСО, етиленгліколь, 1,2-пропандіол і цукрозу, для вітрифікації культивованих ФПК ранніх стадій органогенезу дозволяє зберегти їх морфофункціональні властивості та здатність до диференціювання в остеогенному і адипогенному напрямах.

Ключові слова: кріоконсервування, вітрифікація, фібробластоподібні клітини, мезенхімальні стромальні клітини, кріопротектори, життєздатність.

Горохова Н.А. Криоконсервирование культивированных фибробластоподобных клеток путем медленного замораживания и витрификации. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 – криобиология. Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2008.

Диссертационная работа посвящена исследованию морфофункционального состояния культивированных фибробластоподобных клеток (ФПК) человека ранних стадий органогенеза после криоконсервирования путем медленного замораживания под защитой диметилсульфоксида (ДМСО) и витрификации в многокомпонентных растворах криопротекторов. В задачи исследования входило: определить иммунофенотип и морфофункциональные свойства ФПК ранних стадий органогенеза в ходе субкультивирования; изучить способность ФПК к индуцированной дифференцировке в остеогенном и адипогенном направлениях в условиях монослойного культивирования; исследовать возможность определения жизнеспособности, метаболической и пролиферативной активности ФПК с помощью Alamar Blue-теста; изучить влияние криоконсервирования с использованием медленного программного замораживания под защитой ДМСО на сохранность, метаболическую активность и способность к направленной дифференцировке ФПК ранних стадий органогенеза; разработать состав многокомпонентных растворов криопротекторов, предотвращающих развитие кристаллизации при быстром замораживании и отогреве; исследовать влияние различных этапов криоконсервирования путем витрификации на морфофункциональные свойства и способность к направленной дифференцировке ФПК ранних стадий органогенеза.

Иммунофенотипический анализ культур ФПК 4-го – 12-го пассажей показал, что около 95% клеток экспрессируют CD29, CD44, CD73, CD105, при этом отмечается отсутствие экспрессии гемопоэтических маркеров CD34, CD38, CD45. При культивировании ФПК в средах, содержащих индукторы остео- и адипогенной дифференцировок, была выявлена способность ФПК к направленной дифференцировке в указанных направлениях. Характерный для мезенхимальных стромальных клеток (МСК) иммунофенотип и способность к двулинейной дифференцировке сохранялись при культивировании ФПК до 12-го пассажа.

Ингибиторный анализ восстановления Alamar Blue (АВ) в изолированных митохондриях позволил установить, что АВ способен выступать как акцептор электронов для ряда компонентов дыхательной цепи. Показано, что восстановление АВ является интегральным показателем метаболической активности клеток, отражающим работу митохондриальных, цитоплазматических и микросомальных оксидоредуктаз, при этом основной вклад в метаболическую активность ФПК ранних стадий органогенеза вносит гликолиз. Показано, что восстановление АВ может быть