КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ГОЛОВАЧ ОЛЕКСАНДРА МИРОСЛАВІВНА

УДК 581.143:546.48:633.11

НАГРОМАДЖЕННЯ ТА РОЗПОДІЛ ІОНІВ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ

В ОРГАНАХ КУКУРУДЗИ

03.00.12–фізіологія рослин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі фізіології та екології рослин Львівського національного університету імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Демків Орест Теодорович,

Інститут екології Карпат НАН України,

старший науковий співробітник

відділу екоморфогенезу рослин.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Мусієнко Микола Миколайович,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

професор кафедри фізіології та екології рослин;

кандидат біологічних наук

Соболь Маргарита Анатоліївна,

Інститут ботаніки імені М.Г. Холодного НАН України,

науковий співробітник

відділу клітинної біології та анатомії.

Захист дисертації відбудеться “24” ____03_ 2008 року о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, просп. Академіка Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд.434.

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “22” __02 2008 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Забруднення навколишнього середовища важкими металами є актуальною та одночасно складною для вирішення проблемою сьогодення. Оскільки функціонування сучасного суспільства неможливе без розвитку промисловості, видобутку корисних копалин, автоперевезень, розширення інфраструктури автошляхів, яка є одним із джерел важких металів, зрозуміло, що масштабність проблеми у майбутньому буде лише зростати. Одним з шляхів вирішення проблеми може бути фіторемедіація, яка полягає у використанні здатності деяких видів рослин поглинати полютанти та акумулювати їх у біомасі. Подальша утилізація біомаси елімінує нагромаджені забруднювачі з середовища (Кравець О.П., 2002; Huang J.W.W. et al., 1997; Lasat M.M., 2002; Pilon-Smith E., 2005; Salt D.E. et al., 1998; Saxenaet al., 1999). У зв’язку з цим актуальним є пошук толерантних видів рослин, здатних накопичувати важкі метали, розподіляти їх у органах та тканинах і одночасно продукувати велику біомасу для зручного їх збору з забрудненої ділянки. Утворення біомаси тісно пов’язане з функціонуванням фотосинтетичного апарату рослин. Як відомо, однією з найвиразніших характеристик стану фотосинтетичного апарату рослин за впливу стресових чинників є вміст пігментів у листку та їх співвідношення (Таран Н.Ю., 1999; Тарчевcкий И.А., Андрианова Ю.Е., 1980).

Не менш важливими є дослідження захисних реакцій рослин, що активуються у відповідь на зростаючий вміст токсиканта у середовищі, та способів підвищення їхніх адаптаційних можливостей. Тому вивчення закономірностей нагромадження та розподілу важких металів в органах рослин, а також особливостей функціонування рослин за впливу важких металів є актуальним.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках тем кафедри фізіології та екології рослин Львівського національного університету імені Івана Франка ОБ-175б “Роль регуляторів росту у формуванні адаптаційного потенціалу рослин до несприятливих умов довкілля ” № ДР U001910 та БР-03П “Механізми стійкості рослин до антропогенного забруднення ґрунтів нафтопродуктами і важкими металами” № ДР U002212.

Мета та задачі дослідження. Метою роботи було оцінити можливість використання рослин кукурудзи для фіторемедіації забрудненого важкими металами середовища.

Для досягнення мети поставлено такі завдання:

виявити закономірності акумуляції іонів свинцю та кадмію у органах кукурудзи та вплив нагромаджених іонів на ріст рослин кукурудзи;

вивчити вплив іонів свинцю на нагромадження калози у клітинних стінках кукурудзи;

дослідити вплив іонів свинцю на вміст фотосинтетичних пігментів та активність ферменту карбоангідрази в органах кукурудзи;

вивчити реакцію проростків кукурудзи на вплив зростаючих та спадаючих концентрацій іонів свинцю;

визначити рівень забруднення важкими металами ґрунтів, що межують з автошляхами, та ступінь їх нагромадження у органах рослин кукурудзи.

Об’єкт дослідження – реакції рослин кукурудзи на присутність важких металів у субстраті.

Предмет дослідження – закономірності нагромадження та розподілу важких металів у органах кукурудзи.

Методи досліджень – морфометричні, люмінесцентні, спектрофотометричні, хроматографічні та атомно-адсорбційні, статистична обробка результатів досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше досліджено зміни у вмісті каротиноїдів – в-каротину, лютеїну, неоксантину, віолоксантину, антераксантину та зеаксантину у листках кукурудзи сорту Закарпатська жовта зубоподібна під впливом іонів свинцю. Показано зниження вмісту основних каротиноїдів рослин – неоксантину, лютеїну та підвищення вмісту в-каротину, пігментів віолоксантинового циклу під впливом іонів свинцю у межах досліджуваних концентрацій. Доведено зростання толерантності проростків кукурудзи, пророщених на розчині ацетату свинцю з концентрацією 10-5 М, до вищих концентрацій важкого металу. Отримано нові дані щодо закономірностей нагромадження калози у клітинних стінках епідермальних клітин кукурудзи залежно від концентрації свинцю в субстраті та стійкості проростків кукурудзи.

Практичне значення одержаних результатів. У результаті проведених досліджень встановлено анатомічні, біохімічні та фізіологічні зміни, що лежать в основі формування стійкості рослин до токсичного впливу іонів свинцю.

Визначено рівень забруднення ґрунтів, що межують з автошляхами. Дані про акумуляцію важких металів – свинцю та кадмію, залежно від відстані до автошляху, а також розподіл іонів важких металів у органах рослин мають важливе значення для практики сільського господарства. На підставі лабораторних та польових досліджень обґрунтовано можливість використання кукурудзи для фіторемедіації забрудненого середовища.

Матеріали дисертації використовуються при викладанні загальних курсів “Фізіологія рослин”, “Основи екології” та спецкурсів “Стійкість рослин до несприятливих умов довкілля”, “Фітомоніторинг”, “Ріст і розвиток рослин” на біологічному факультеті Львівського національного університету імені Івана Франка.

Особистий внесок здобувача полягає в оволодінні методами досліджень, виконанні експериментальної частини дисертації, статистичній обробці результатів, підборі та опрацюванні даних літератури, а також в аналізі й інтерпретації одержаних результатів за участю наукового керівника, співавторів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися на наукових конференціях та семінарах: Міжнародній конференції “Photosynthesis and Crop Production” (Київ, 2002); Міжнародній конференції студентів і молодих вчених “Екологічні проблеми міст і промислових зон: шляхи їх вирішення” (Львів, 2003); Науковій конференції “Gospodarowanie metodami ekologicznymi na tle zrуwnowaїonego rozwoju poіudniowo-wschodniej Polski” (Жешів, Польща, 2003); Міжнародному науково-практичному семінарі “Перспективність екологічних (органічних) технологій виробництва продукції землеробства і тваринництва” (Львів, 2003);
IV Міжнародній науковій конференції “Промислова ботаніка: стан та перспективи розвитку” (Донецьк, 2003); III Міжнародній науковій конференції “Регуляция роста, развития и продуктивности растений” (Мінськ, Білорусія, 2003); VIII Молодіжній конференції ботаніків у Санкт-Петербурзі (Санкт-Петербург, Росія, 2004); ІІ Міжнародній конференції “Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні аспекти” (Львів, 2004); ІІ Міжнародній науковій конференції студентів, аспірантів та молодих вчених, присвячені й 140–річчю Одеського національного університету ім. І.І.Мечнікова (Одеса, 2005); Науковій конференції молодих учених “Mіodzi naukowcy – praktyce rolniczej” nt. “Dziaіalnoњж rolnicza a ochrona њrodowiska” (Жешів, Польща, 2005); Міжнародному науково-практичному семінарі “Перспективність екологічних (органічних) технологій виробництва продукції землеробства і тваринництва” (Львів, 2005); Міжнародній науковій конференції “Інноваційний розвиток сучасного аграрного виробництва” (Львів, 2005); Науковій конференції молодих учених “Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології” (Ужгород, 2005); Міжнародній науково-практичній конференції “Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики” (Львів, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 наукових праць, із них 6 статей у фахових виданнях, які затверджені переліком ВАК України, та 10 тез доповідей у матеріалах вітчизняних та міжнародних наукових семінарів і конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів та їх обговорення, висновків, рекомендацій для виробництва та списку використаних джерел. Робота викладена на 147 сторінках друкованого тексту, ілюстрована 7 таблицями та 22 рисунками. Список використаних літературних джерел містить 323 найменування.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Досліди проводили у лабораторних та польових умовах на рослинах кукурудзи (Zea mays L.) сорту Закарпатська жовта зубоподібна. У лабораторних умовах насіння пророщували на дистильованій воді та розчинах ацетату свинцю з концентраціями 10-5, 10-4, 10-3 М у темряві в термостаті при температурі 240С. Тридобові етіоловані проростки переносили на розчини ацетату свинцю у концентраціях 10-5, 10-4, 10-3 М. За контроль слугували рослини кукурудзи, вирощені на дистильованій воді без додавання ацетату свинцю. Схему досліду представлено на рис. 1.

Рис. 1. Схема лабораторних досліджень

- середовище пророщування, тривалість 3 доби

?- середовище вирощування, тривалість 7 діб

Для забезпечення сталого іонного складу розчини замінювали кожні 2 доби. Проростки вирощували у контрольованих умовах освітлення (2,0–2,2 тис. лк), температури (20–25°С) та 14-годинному фотоперіоді (Казаков Є.О., 2000). Для аналітичних та гістохімічних досліджень використовували 10-добові проростки кукурудзи. Індекс толерантності розраховували у відсотках як відношення середньої довжини коренів рослин за наявності іонів свинцю у середовищі до середньої довжини коренів контрольних рослин (Wilkins D.A., 1987). Інтенсивність люмінесценції калози визначали на цитофлуорометрі ЛЮМАМ – Р3 (Ленінград, СРСР) (Брайон О.В., 1973; Демкив О.Т., Сытник К.М., 1985). Свіжі поперечні зрізи осьових органів зафарбовували протягом 10 хвилин свіжоприготовленим 0,005% розчином водорозчинного анілінового синього у 0,15 М розчині К2НРО4 (рН 8,2) (Дженсен У., 1965), які у подальшому розглядали під люмінесцентним мікроскопом ЛЮМАМ – Р3 (Ленінград, СРСР), де калоза мала жовте забарвлення. Вміст фотосинтетичних пігментів визначали фотометрично (Методы биохим. исслед. раст., 1987). Паралельно проводили розділення пігментів методом HPLC (Waligуrski P., 2004). Пігменти розділяли на колоні RP-18 (Nucleosil gel, 250x4 mm, 5µm, TECNOCROMA, Барселона, Іспанія), при пропливі сольвенту А 2 мл/хв. Абсорбцію пігментів вимірювали при 440 нм, використовуючи детектор UV-970 (Jasco Corporation, Токіо, Японія) (Garcнa-Plazaola J.I., Becerril J.M., 1999). Площу поверхні під піками вираховували за допомогою програми Program Borwin Chromatography, Software, Version 1,20 (YMBS, Le Fontanie, Франція). Активність карбоангідрази визначали за методом Уілбурга-Андерсена (Косицин А.В., Игошина Т.И., 1986).

Польові дослідження проводили протягом 2002– 2004 рр., на дернових опідзолених глеєвих легкосуглинистих ґрунтах міської ради міста Мостиськ Львівської області, які межували з автошляхом Львів – Шегині, і були не захищені лісосмугою. Попередник – картопля. Розміри дослідних ділянок становили 10Ч200 м, повторність дослідів – 4-кратна. Інтенсивність руху на автошляху Львів-Шегині – 400–850 автомашин за годину. Польові досліди проводили згідно з загальноприйнятими методиками (Циков В.С., 2003). Перед оранкою у ґрунт вносили гній з розрахунку 40 т/га. Рослинні та ґрунтові проби у польових умовах відбирали періодично протягом вегетаційного сезону. Врожай збирали ручним способом. Середній врожай зерна кукурудзи перераховували до 14% вологості (Грицаєнко З.М. та ін., 2003).

Кількісне визначення вмісту важких металів проводили методом атомно-адсорбційної спектрометрії. Для визначення вмісту важких металів рослинний матеріал та ґрунт висушували за температури 800С до постійного значення. Вміст важких металів визначали на спектрофотометрі С–115 М 1 (“Селмі”, Україна) у пропан-бутановому полум’ї з використанням електротермічного атомізатора “Графіт-2” (“Селмі”, Україна) (Методические рекомендации..., 1981).

Отримані результати опрацьовані статистично з використанням програмного пакету Microsoft Excel для персональних компютерів, достовірність різниці оцінювали за критерієм Ст’юдента, вірогідними вважали зміни, де Р<0,05 (Плохинский М.П., 1981).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Виявлено, що іони свинцю у концентраціях 10-4 та 10-5М незначно впливають на процес проростання насіння, а під впливом іонів свинцю концентрацією 10-3 М схожість насіння кукурудзи знижується на 16,7 % порівняно з контролем. Ростові показники кукурудзи залежно від вмісту іонів свинцю у середовищі вивчали на проростках, вирощених у модельних дослідах у водній культурі. Ці дослідження показали, що, залежно від віку рослин, наявності іонів свинцю у середовищі проростання, концентрації токсичного іону та тривалості його дії, рослини по-різному реагують на вплив стресового чинника. Зі зростанням концентрації свинцю знижується довжина осьових органів проростків кукурудзи, найбільш токсичною виявилась концентрація ацетату свинцю 10-3 М. Більш чутливими до впливу токсичного металу були корені кукурудзи, аніж пагони. Окрім того, пророщування насіння при нижчих концентраціях токсичного іону підвищувало стійкість проростків до наступного впливу вищих концентрацій іонів важких металів. Реакцію проростків кукурудзи на присутність у середовищі росту іонів свинцю у різних концентраціях вивчали також за зміною індексу толерантності (рис. 2).

Рис. 2. Вплив іонів свинцю на індекси толерантності проростків кукурудзи, %. 1) контроль; 2) Н2О>Pb, 10-5М; 3) Н2О>Pb, 10-4М; 4) Н2О>Pb, 10-3М; 5) Pb, 10-5 М>субстрат без Pb; 6) Pb, 10-5М> Pb, 10-5М; 7) Pb, 10-5М>Pb, 10-4М; 8) Pb, 10-5М>Pb, 10-3 М; 9) Pb, 10-3М>субстрат без Pb; 10) Pb, 10-3М>Pb, 10-5М; 11) Pb, 10-3М>Pb, 10-4М; 12) Pb, 10-3М>Pb, 10-3М.

* – достовірно по відношенню до контролю, Р ? 0,05

Виявлено, що індекс толерантності кукурудзи зменшувався зі збільшенням тривалості експозиції на розчинах свинцю. Попереднє пророщування насіння на 10-5 М розчині ацетату свинцю сприяло збільшенню стійкості коренів кукурудзи до вищих концентрацій свинцю. Індекс толерантності кукурудзи, пророщеної на 10-3 М розчині ацетату свинцю, збільшувався з часом експозиції на дистильованій воді, однак залишався на 44–70% нижчим порівняно з контролем. Це може свідчити про післядію токсичних іонів свинцю.

Результати наших досліджень виявили, що ріст осьових органів кукурудзи за умов їх перебування на розчині з концентрацією свинцю 10-3 М пригнічується менше після пророщування насіння на найнижчій використаній нами концентрації ацетату свинцю – 10-5 М, аніж за умов проростання на дистильованій воді чи розчині з концентрацією іонів свинцю 10-3 М. Тому важливо було з’ясувати рівень нагромадження свинцю в органах контрольних та дослідних проростків кукурудзи.

Вміст свинцю у органах проростків кукурудзи зростав прямопропорційно до зростання концентрації іонів свинцю у середовищі їх росту (рис. 3). Під постійним впливом 10-4 М розчину свинцю протягом 10 діб вміст металу у коренях кукурудзи був на 30 % нижчий, ніж у коренів кукурудзи, пророщених на дистильованій воді та пересаджених на 10-4 М розчин ацетату свинцю.

Рис. 3. Вміст свинцю у коренях (А) та пагонах (Б) 10-добових проростків кукурудзи. Склад середовища проростання насіння кукурудзи, тривалість перебування – 3 доби: а) дистильована вода, б) Pb, 10-5 М, в) Pb, 10-4 М, г) Pb, 10-3М. Склад середовища росту, тривалість перебування – 7 діб: 1) дистильована вода, 2) Pb, 10-5М, 3) Pb, 10-4М, 4) Pb, 10-3М

* – достовірно по відношенню до контролю, Р ? 0,05

Із зростанням концентрації свинцю у середовищі різниця у нагромадженні металу у коренях кукурудзи збільшувалася. Пророщені на 10-5М розчині ацетату свинцю проростки кукурудзи після експозиції на 10-3 М розчині свинцю нагромаджували у коренях на 60% менше іонів свинцю, аніж пророщені на дистильованій воді та пересаджені на 10-3 М розчин свинцю. Подібним чином на збільшення концентрації іонів свинцю у середовищі росту реагували проростки кукурудзи, насіння яких пророщували на 10-4 М розчині ацетату свинцю – вміст свинцю у коренях був на 51% меншим, аніж у коренях проростків кукурудзи, пророщених на дистильованій воді та пересаджених на 10-3 М розчин свинцю. Слід також відмітити, що вміст свинцю у коренях проростків кукурудзи, які постійно перебували на 10-3 М розчині свинцю протягом 10 діб, виявився на 25% нижчий, аніж у коренях проростків кукурудзи, пророщених на дистильованій воді і експонованих 7 діб на 10-3М розчині свинцю. Переміщення іонів свинцю з коренів у надземну частину дуже обмежене: пагони проростків кукурудзи мали низький вміст свинцю у той час як його концентрація у середовищі була високою (рис. 3Б).

Аналізуючи ці дані у зв’язку з попередніми результатами росту проростків кукурудзи, можна зробити висновок про те, що у рослин з підвищеною толерантністю, паралельно з ростом осьових органів, утворюються нові сайти зв’язування іонів свинцю у клітинній стінці, а також, ймовірно, запускаються інші бар’єрні механізми уникання потрапляння іонів свинцю у цитоплазму клітини, як, наприклад, синтез калози.

У відповідь на проникнення свинцю у клітини кукурудзи, в клітинних стінках нагромаджується калоза. У клітинних стінках епідермісу та паренхіми колеоптиля, тканинах епідермісу та мезофілу листків контрольних проростків кукурудзи калоза, зафарбована аніліновим синім, люмінесціювала у вигляді зерен, тоді як у стінках трахеїд спостерігали свічення калози у вигляді суцільного шару. Під впливом 10-3 М свинцю інтенсивне свічення калози спостерігали у клітинних стінках епідермісу та 2-3 шарах паренхіми колеоптиля. У шарах паренхіми колеоптиля, розмішених ближче центрального циліндра, калоза мала вигляд зерен або їх скупчень. Під впливом свинцю у середовищі збільшувалось нагромадження калози навколо провідних пучків листків кукурудзи. Інтенсивна люмінесценція комплексу аніліновий синій–калоза, яка, очевидно, свідчить про збільшення вмісту калози у цих тканинах, спричиняла підвищення фонового свічення навколо клітин.

Відносний вміст калози у клітинних стінках епідермісу кореня та пагона оцінювали за інтенсивністю її люмінесценції у забарвлених аніліновим синім зрізах органів кукурудзи. Виявлено, що під впливом іонів свинцю збільшувалось нагромадження калози у клітинних стінках епідермісу коренів та пагонів кукурудзи, що водночас різко відрізнялось у рослин, насіння яких пророщували на дистильованій воді та розчинах ацетату свинцю. У клітинних стінках коренів кукурудзи, пророщених на розчині ацетату свинцю із концентрацією 10-5 та 10-4 М та пересаджених на розчин свинцю з концентрацією 10-3 М, інтенсивність люмінесценції калози була вищою відповідно на 44 і 62%, ніж у контролі, але водночас була відповідно нижчою на 22 та 13%, аніж у рослин, пророщених на дистильованій воді та пересаджених на розчин свинцю з концентрацією 10-3М. Слід також відмітити, що інтенсивність люмінесценції калози в клітинах коренів кукурудзи, пророщених на розчині ацетату свинцю концентрацією 10-3М та пересаджених на середовище без свинцю, вдвічі перевищувала інтенсивність люмінесценції калози контрольних рослин.

Важливою функціональною і надійною діагностичною ознакою адаптаційного процесу у рослин є вміст та якісний склад пігментів, що використовується для визначення стійкості рослин до вмісту важких металів в субстраті (Krupa Z. et al., 1996). Під впливом використаних нами концентрацій свинцю змінювався вміст і співвідношення пігментів фотосинтезу (табл.1).

Таблиця 1.

Вплив свинцю на вміст фотосинтетичних пігментів в пагонах 10-добових проростків кукурудзи

* – достовірно по відношенню до контролю, Р ? 0,05

Під впливом іонів свинцю, вміст пігментів у листках 10-добових проростків кукурудзи обернено корелював до концентрації токсичного металу у середовищі вирощування проростків. Вміст пігментів у проростках кукурудзи з насіння, пророщеного на дистильованій воді з наступним пересаджуванням на розчин ацетату свинцю концентрацією 10-3 М, порівнювався з вмістом пігментів у проростках з насіння, пророщеного на розчині ацетату свинцю концентрацією 10-5 М, з наступним пересаджуванням на розчин ацетату свинцю концентрацією 10-3 М. Виявлено, що вміст хлорофілу а зменшувався на 13 і 11% порівняно з контролем, хлорофілу b на 35 та 20%, каротиноїдів на 22 і 9%. Отримані дані засвідчують наявність адаптаційних властивостей у рослин кукурудзи, пророщених на розчині ацетату свинцю концентрацією 10-5 М, до подальшого впливу вищих концентрацій токсичних іонів. У пагонах проростків кукурудзи, пересаджених з розчину ацетату свинцю концентрацією 10-4 М на дистильовану воду, вміст хлорофілу а знижувався на 12%, хлорофілу b на 31%, каротиноїдів на 19% порівняно з контролем. Збільшене співвідношення хлорофілів а/b у дослідних варіантах було результатом сильнішого зменшення вмісту хлорофілу b порівняно до хлорофілу а. Ймовірно, синтез хлорофілу b більш чутливий до токсичної дії свинцю ніж синтез хлорофілу а.

Дослідження останніх років показали, що за умов оксидного стресу каротиноїди виявляють модулюючий вплив на фізичний стан мембран, що ґрунтується на реакціях перетворення ксантофілового циклу (Havaux M., Niyogi K.K. 1998). Тому наступним етапом дослідження було вивчення змін у вмісті пігментів віолоксантинового циклу та лютеїну, неоксантину, в-каротину. Встановлено, що під впливом свинцю зменшується вміст лютеїну та неоксантину. Одночасно збільшується вміст в-каротину у листках проростків кукурудзи під впливом іонів свинцю (рис.4).

Рис. 4. Вміст в-каротину у листках 10-добових проростків кукурудзи під впливом іонів свинцю. 1) контроль; 2) Н2О>Pb, 10-5М; 3) Н2О>Pb, 10-4М; 4) Н2О>Pb, 10-3М; 5) Pb, 10-5 М > субстрат без Pb; 6) Pb, 10-5М> Pb, 10-5М; 7) Pb, 10-5М>Pb, 10-4М; 8) Pb,  10-5М> Pb, -3 М; 9) -3М> субстрат без Pb; 10) Pb,  10-3М>Pb, 10-5М; 11) Pb, 10-3М>Pb,  10-4М; 12) -3М>Pb, -3М

* – достовірно по відношенню до контролю, Р ? 0,05

Результати проведених нами досліджень свідчать, що вміст в-каротину збільшувався в усіх дослідних варіантах. Пророщені на 10-5М розчині ацетату свинцю проростки кукурудзи мали найвищий вміст в-каротину у листках. Так, у листках проростків, насіння яких пророщували на дистильованій воді, розчинах ацетату свинцю 10-5 та 10-3 М, а тоді вирощували на 10-3 М розчині свинцю, вміст в-каротину перевищував відповідно у 3,2, 6,0 та 3,6 рази вміст в-каротину у листках контрольних рослин. Під впливом іонів свинцю концентрацією 10-5М протягом 10 діб вміст в-каротину у листках кукурудзи збільшився у 4,5 рази порівняно з контролем. У проростків кукурудзи, які пересаджували з середовища проростання – 10-5 М та 10-3 М розчинів свинцю на середовище без свинцю, вміст в-каротину у листках кукурудзи був вищим відповідно у 4,5 та 2,8 рази порівняно з контролем. Збільшення вмісту в-каротину у фотосинтетичних тканинах під дією іонів свинцю може бути однією з адаптивних відповідей проростків кукурудзи на спричинений стрес.

У варіантах, де спостерігали збільшення стійкості кукурудзи до важкого металу, збільшувався вміст антераксантину та зеаксантину, у нестійких – збільшення вмісту віолоксантину та зеаксантину відбувалися при зменшенні вмісту антераксантину (рис.5).

Рис. 5. Вміст віолоксантину (А), антераксантину (Б) та зеаксантину (В) у листках 10-добових проростків кукурудзи під впливом іонів свинцю. Деепоксидаційний статус (Г) пігментів віолоксантинового циклу у листках 10-добових проростків кукурудзи під впливом іонів свинцю. 1) контроль; 2) Н2О>Pb, 10-5М; 3) Н2О>Pb, 10-4М; 4) Н2О>Pb, 10-3М; 5)Pb, 10-5 М>субстрат без Pb; 6) Pb, 10-5М> Pb, 10-5М; 7) Pb, 10-5М>Pb, 10-4М; 8) Pb, 10-5М>Pb, 10-3 М; 9) Pb, 10-3М>субстрат без Pb; 10) Pb, 10-3М>Pb, 10-5М; 11) Pb, 10-3М>Pb, 10-4М; 12) Pb, 10-3М>Pb, 10-3М.

* – достовірно по відношенню до контролю, Р ? 0,05

Зважаючи на постульовані функції, віолоксантиновий цикл може бути одним з основних адаптаційних механізмів, відповідальних за захист фотосинтетичних мембран від перекисного окиснення ліпідів (Havaux and Niyogi, 1999) та утворення антиоксидантних сполук у тилакоїдних мембранах. Цим фотопротектором є зеаксантин, що здатний гасити синглентний кисень та інші вільні радикали (Latowski D. et al., 2004). Окрім того, реакція епоксидації призводить до нівеляції пошкоджень, викликаних вільними радикалами у ФС II та ФС I, індукуючи реорганізацію фотосистем, наприклад, через ресинтез апопротеїнів D1 та D2 (Matysiak R., Lorenc-Pluciсska G., 2000). Каротиноїди як сполуки ліпідної природи з ненасиченими подвійними зв’язками, можуть регулювати рухомість мембран хлоропластів і забезпечувати їх нормальне функціонування у змінених умовах існування рослин (Прядкина Г.А., 2005).

Для комплексної оцінки змін у вмісті пігментів віолоксантинового циклу використовують деепоксидаційний статус – відношення сумарного вмісту антераксантину та зеаксантину до вмісту віолоксантину, антераксантину та зеаксантину. Дослідженнями встановлено, що деепоксидаційний статус збільшується у стійких та зменшується у нестійких до впливу свинцю листках проростків кукурудзи (рис. 5Г). Таким чином, даний показник характеризує фізіологічний стан рослин.

Відомо, що під дією важких металів знижується фіксація СО2, що зумовлено індукованим важкими металами закриванням продихів (Prasad M.N.V., Strzalka K., 1991; Нога Н.І., Головач О.М., 2005) та інгібуванням активності ферментів (Гуральчук Ж.З., 1994). Згідно результатів наших досліджень, активність карбоангідрази зменшувалась з підвищенням концентрації іонів свинцю у середовищі вирощування. Активність була вищою у пагонах і саме у пагонах пригнічувалась сильніше іонами свинцю. Так, активність карбоангідрази у пагонах 10-добових проростків кукурудзи, пророщених на дистильованій воді, після 7-добової експозиції на 10-5, 10-4 та 10-3М розчинах свинцю зменшилася відповідно на 21, 51 та 66% порівняно з контролем. Привертає увагу факт збільшення стійкості проростків кукурудзи, насіння яких пророщували на 10-5М розчині свинцю, до вищих концентрацій важкого металу. Так, у пророщених на 10-5 М розчині свинцю та експонованих на 10-4 М, 10-3 М розчинах свинцю пагонах кукурудзи, активність карбоангідрази була нижчою відповідно на 33 та 59% порівняно з контролем та відповідно вищою на 37 та 19% порівняно з активністю ферменту у пагонах проростків, насіння яких пророщували на дистильованій воді та вирощували на 10-4 та 10-3 М розчинах свинцю. Подібну залежність спостерігали у коренях кукурудзи.

Слід зауважити, що більшість досліджень, що стосуються впливу важких металів на рослинні організми, виконуються експериментально в лабораторіях і є модельними. Практично недослідженими залишаються вміст важких металів у ґрунтах, розташованих поблизу джерел забруднення токсичними металами, та розподіл металів у органах рослин. Тому важливим етапом досліджень було вивчення вмісту важких металів у ґрунтах, що межують з автошляхами, та у рослинах кукурудзи, що росли на них.

Встановлено розподіл важких металів залежно від відстані до автодороги. Дослідження показали, що переважна більшість важких металів нагромаджується у ґрунтах уздовж автодороги на відстані 0–25 м, утворюючи ділянку інтенсивного забруднення. Вміст кадмію у дернових опідзолених оглеєних легкосуглинистих ґрунтах, що межували з автошляхом Львів–Шегині, перевищував гранично допустиму концентрацію у 1,2–1,8 рази на відстані до 25 метрів від автошляху. Зі збільшенням віддалі від автошляху вміст важких металів зменшується, що свідчить про аеротехногенне розповсюдження важких металів. У ґрунтах середнього рівня забруднення (26–100 метрів від автодороги) спостерігається зниження вмісту важких металів на 15%, у ґрунтах ділянки низького забруднення (101–200 метрів) – на 20%. Характер і швидкість розповсюдження пилу, що містить важкі метали, ймовірно, залежить від напряму та інтенсивності потоків повітря. Зрозуміло, що насадження вздовж полотна автодороги виконують функцію біологічного бар’єру, ефективно затримуючи металоносний пил. Слід зауважити, що не завжди обабіч доріг присутні деревно-чагарникові насадження, тому частина ґрунтів, на яких вирощують сільськогосподарську продукцію, залишається незахищеною. Тому важливим є пошук таких видів рослин, здатних до нагромадження важких металів у вегетативних органах, з великою біомасою для зручного збору, а також до утворення щільного та високого бар’єру для просування металоносного пилу. Як свідчать наші дослідження, кукурудза відповідає цим вимогам.

Відомо, що кадмій легко потрапляє в рослини і розподіляється між різними їх частинами (Гуральчук Ж.З., 2001). Для зменшення його надходження в харчові ланцюги, істотними є знання механізмів поглинання та процесів розподілу у рослинах. На рисунку 6А представлено розподіл кадмію в органах кукурудзи сорту Закарпатська жовта зубоподібна.

Рис. 6. Вміст кадмію (А) та свинцю (Б) у органах рослин кукурудзи які вирощували на відстані до 5 м від автошляху. 1) ґрунт; 2) корені; 3) стебла; 4) листки; 5) обгортки качанів; 6) насіння

* – достовірно по відношенню до вмісту кадмію (А) та свинцю (Б) у органах кукурудзи на відстані 151-200 м від автошляху, Р ? 0,05

У коренях рослин кукурудзи виявлено високий вміст кадмію, що у кілька разів перевищував його вміст у ґрунті. Надходженню кадмію у корені сприяла слабокисле рН ґрунту, на якому проводили дослідження. У стеблах, листках та обгортках кукурудзи визначено невеликі кількості кадмію, а у насінні – сліди металу. Вміст іонів кадмію зменшувався у такій послідовності: корені > листки > стебло = обгортки качанів > насіння (для рослин кукурудзи, що росли поблизу автошляху).

Спостерігали деякі відмінності між нагромадженням кадмію та свинцю у органах рослин кукурудзи. Насамперед, відмінності стосувалися концентрування важких металів у коренях кукурудзи: вміст кадмію був вищим у 2,1 – 3,0 рази від його вмісту у субстраті, тоді як вміст свинцю у коренях був на 1,9 –3,8 нижчим, аніж його вміст у ґрунті. Корені були основним органом нагромадження як кадмію, так і свинцю: у них там виявлено 63 – 81% від загальної кількості свинцю, виявленого у цілій рослині.

Надходження іонів свинцю з коренів у надземні органи було дуже обмеженим, у стеблах рослин кукурудзи знаходили 3,8 – 10,1% від загальної кількості свинцю. Листки кукурудзи нагромаджували 4,8–19,0%, обгортки качанів кукурудзи містили 6,2–13,2% від кількості свинцю, виявленого у цілій рослині. Такі дані можуть бути свідченням того, що листки та обгортки качанів кукурудзи накопичують свинець атмосферного походження. Отже, згідно наших досліджень (рис. 6Б.), вміст іонів свинцю у органах кукурудзи зменшується у послідовності: корені > листки >обгортки качанів > стебло > насіння (для рослин кукурудзи, що росли поблизу автошляху).

Проведені нами дослідження виявили необхідність моніторингу земель, які використовуються для вирощування сільськогосподарської продукції, оскільки з кожним роком посилюється техногенне навантаження на навколишнє середовище. Вирощування кукурудзи на ґрунтах уздовж автодороги на відстані 0–25 м обмежувало поширення пилу, що містить важкі метали.

Пропонуються наступні можливості використання рослин кукурудзи, які росли поблизу джерела забруднення:

насіння, у якому, згідно результатів наших досліджень, виявлено слідові кількості важких металів, можна використати для виробництва біоетанолу;

у коренях виявлено високий вміст важких металів, тому їх необхідно вибирати з ґрунту та утилізовувати;

оскільки на листках нагромаджується пил, що містить важкі метали, надземні органи кукурудзи також слід утилізовувати;

розробити технології переробки забрудненої рослинної біомаси – використання її як біопалива та виробництва тепло- чи електроенергії.

ВИСНОВКИ

Реакція рослин кукурудзи на дію іонів свинцю залежить від концентрації і тривалості дії стресора та проявляється у пригніченні росту осьових органів. Водночас реакція рослин кукурудзи, насіння яких пророщували на розчинах ацетату свинцю (10-5 – 10-3 М) та дистильованій воді, на вищі чи нижчі концентрації металу різко відрізняється.

Рослини кукурудзи сорту Закарпатська жовта зубоподібна здатні нагромаджувати важкі метали у вегетативних органах. Вміст кадмію у коренях кукурудзи у 2,1–3,0 рази перевищує його вміст у ґрунті. Нагромадження іонів свинцю у коренях кукурудзи зумовлює сильніший інгібуючий вплив важкого металу на ріст коренів кукурудзи порівняно з пагонами.

Нагромадження калози у клітинних стінках епідермісу коренів та пагонів кукурудзи під впливом свинцю є протекторною реакцією клітин на дію полютанта. У нестійких до стресового чинника проростків кукурудзи нагромадження калози корелює з вмістом свинцю у середовищі. З підвищенням стійкості проростків кукурудзи до іонів свинцю захисна роль калози, ймовірно, зменшується.

Під впливом свинцю відбуваються зміни у фотосинтетичному апараті листків кукурудзи: збільшується співвідношення хлорофілів а/b внаслідок сильнішого зменшення вмісту хлорофілу b порівняно з вмістом хлорофілу а. Зменшення вмісту основних пігментів фотосинтезу – хлорофілу а та хлорофілу b, та допоміжних – лютеїну та неоксантину супроводжується істотним збільшенням вмісту сильного антиоксиданта – в-каротину.

Деепоксидаційний статус пігментів віолоксантинового циклу, що за впливу стресового чинника зростає у рослин з підвищеною стійкістю до свинцю та знижується у чутливих, може бути інформативним показником фізіологічного стану рослин.

Фермент карбоангідраза виявилась чутливою до впливу іонів свинцю. Рослини з більшою стійкістю до впливу іонів свинцю характеризуються вищою активністю карбоангідрази порівняно з нестійкими.

На підставі аналізу індексу толерантності, вмісту фотосинтетичних пігментів та калози встановлено, що пророщування насіння кукурудзи на 10-5 М розчині свинцю сприяло адаптації проростків до дії вищих концентрацій металу.

Найвищий вміст важких металів виявлено у ґрунтах, що знаходяться 0-25 метрів від автошляху. На листках кукурудзи нагромаджуються свинець та кадмій, який міститься у викидах автотранспорту. Тому для фітоочищення забрудненого важкими металами субстрату та попередження переміщення металоносного пилу рекомендується вирощувати кукурудзу на ґрунтах, що межують з автошляхами.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Головач О.М , Демків О.Т. Фіторемедіація – ефективний метод очищення забруднених важкими металами ґрунтів // Науковий вісник Львівської національної академії ветеринарної медицини імені С.З. Гжицького. –2003. – Т. 5, №4. – С. 21-27.

Головач О., Козловський В., Демків О. Забруднення сільськогосподарських ґрунтів важкими металами та характер їх перерозподілу у рослинах кукурудзи // Вісник. Львів. Ун-ту, біологія. –2004. – Випуск 38. – С. 205-211. (Дисертантом проаналізовано літературу, виконано експериментальну частину, проведено статистичну обробку, аналіз та узагальнення результатів, підготовлено матеріал до публікації).

Головач О.М., Демків О.Т. Поглинання і розподіл іонів свинцю у органах рослин та реакція на токсичну дію іона // Науковий вісник Львівської національної академії ветеринарної медицини імені С.З. Гжицького. –2005. –Т. 7, №2, Ч. 6. – С. 33-38.

Головач О.М., Демків О.Т. Вплив іонів свинцю на проростання і ріст рослин кукурудзи // Науковий вісник Львівської національної академії ветеринарної медицини імені С.З. Гжицького. – 2005. –Т. 7, №4, Ч. 1. – С. 24-29.

Головач О., Козловський В., Демків О. Нагромадження та розподіл свинцю в органах проростків кукурудзи // Науковий вісник Львівської національної академії ветеринарної медицини імені С.З. Гжицького. – 2006. – Т.8, № 2, Ч.3. – С. 50-54. (Дисертантом проаналізовано літературу, проведено польові та лабораторні дослідження, статистичну обробку та аналіз результатів, підготовлено матеріал до друку).

Головач О.М., Демків О.Т. Вплив свинцю на ріст, вміст фотосинтетичних пігментів та активність карбоангідрази у проростків кукурудзи. // Физиология и биохимия культ. растений. – 2006. – Т. 38, № 4. – С. 353-358.

Головач О.М., Козловський В.І., Демків О.Т. Можливості використання кукурудзи (Zea mays L.) для фіторемедіації техногенно забруднених ґрунтів // Збірник наукових праць Уманського державного аграрного університету. – 2003. – Спец. випуск “Біологічні науки і проблеми рослинництва”.– С. 847-850. (Дисертантом проаналізовано літературу, зібрано зразки ґрунтів та органів рослин для визначення вмісту важких металів, проведено статистичну обробку, аналіз результатів досліджень, підготовлено матеріал до друку).

Holovach O., G№sior J., Demkiv O. Zanieczyszczenie gleb uprawnych w s№siedstwie autostrady w rejonie Szegini metalami ciкїkimi i sposoby ich fitooczyszcienia // Mіodzi naukowcy – praktyce rolniczej nt. “Dziaіalnoњж rolnicza a ochrona њrodowiska”: I Ogуlnopolska Mіodzieїowa Konferencja Naukowa. Rzeszуw, 19–21 kwietnia 2005 r. – Rzeszуw, 2005. – S. 23-27.

Golovach O.M., Demkiv O.T. Influence of lead on growth, chlorophyll synthesis and intensity of it luminescence in Zea mays L. seedling // Photosynthesis and Crop Production: International Conference. Kiev, 7–11 October 2002. – Kiev, 2002. – P. 50.

Головач О. Вміст важких металів у ґрунтах і рослинах кукурудзи (Zea mays L.) примагістральних ділянок автошляхів Львівщини // Екологічні проблеми міст і промислових зон: шляхи їх вирішення: Міжнародна конференція студентів і молодих вчених. Львів, 11–13 квітня 2003 р.– Львів, 2003. – С. 91–93.

Hoіowacz A., Hoіowacz M., Demkiw O. Zastosowanie fitoremedjacji і hodowla koni huculskich w gospodarstwach ekologicznych // Gospodarowanie metodami ekologicznymi na tle zrуwnowaїonego rozwoju poіudniowo-wschodniej Polski: Konferencjа Naukowа. Rrzeszуw, 25 kwietnia 2003 r. – Rrzeszуw, 2003. – S. 40.

Головач О.М. Токсична дія свинцю на синтез та інтенсивність люмінесценції хлорофілу проростків кукурудзи (Zea mays L.) // Промислова ботаніка: стан та перспективи розвитку: IV Міжнародна наукова конференція. Донецьк, 17–19 вересня 2003 р. – Донецьк, 2003. – С. 99–101.

Головач О.М. Влияние свинца на интенсивность люминесценции каллозы // Регуляция роста, развития и продуктивности растений: III Междунар. науч. конфер. Минск, 8–10 октября 2003 г. – Минск, 2003. – С. 199.

Головач А.М. Особенности адаптации растений кукурузы к токсическому действию ионов свинца // VIII Молодежная конференция ботаников в Санкт-Петербурге. Санкт-Петербург, 17–21 мая 2004 г. – Санкт-Петербург, 2004. – С. 119–120.

Головач О. Активність карбоангідрази у проростків кукурудзи за дії іонів свинцю // Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні аспекти: ІІ Міжнародна конференція. Львів, 18–21 серпня 2004 р. – Львів, 2004. – С. 224.

Головач О.М. Структурні механізми толерантності рослин кукурудзи до дії іонів свинцю // ІІ Междунар. науч. конф. студ., аспир. и молодых ученых, посв. 140 – летию ОНУ им. И.И.Мечникова. Одеса, 28 марта–1 апреля 2005 г.– Одеса, 2005. – С. 20.

Holovach O., Jemioіa-Rzemiсska M., Strzaіka K. Pigment composition of maize leaves under lead ions influence // Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології: Наукова конференція молодих учених.– Ужгород, 1–3 грудня 2005 р.– Ужгород, 2005. – С. 38–39.

АНОТАЦІЯ

Головач О.М. Нагромадження і розподіл іонів важких металів в органах кукурудзи. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.12 – фізіологія рослин. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2007.

Дисертація присвячена дослідженню особливостей нагромадження іонів свинцю і кадмію в органах кукурудзи та вивченню реакцій кукурудзи на присутність важких металів у субстраті. Встановлено, що під впливом іонів свинцю відбуваються зміни у нагромадженні калози у клітинних стінках епідермісу, вмісті фотосинтетичних пігментів, активності карбоангідрази.

Вивчено особливості реакції