МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ГРЕЧАНА ОЛЕНА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 615. 322: 582. 998. 2]. 076. 2

ФАРМАКОГНОСТИЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ АЗУЛЕНВМІЩУЮЧИХ РОСЛИН РОДУ ARTEMISIA L. ФЛОРИ УКРАЇНИ З МЕТОЮ ОДЕРЖАННЯ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ ПРОТИЗАПАЛЬНОЇ ДІЇ

15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Харків - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі фармакогнозії з курсом ботаніки

Запорізького державного медичного університету,

Міністерство охорони здоров’я України

Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, професор

Мазулін Олександр Владиленович

Запорізький державний медичний університет,

завідувач кафедри фармакогнозії, фармацевтичної хімії

та технології ліків ФПО

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор

Сербін Анатолій Гаврилович

Національний фармацевтичний університет,

завідувач кафедри медичної ботаніки

доктор фармацевтичних наук,

старший науковий співробітник

Коновалова Олена Юріївна

Медичний інститут Української асоціації

народної медицини, м Київ

завідувач кафедри фармацевтичної хімії та фармакогнозії

Захист відбудеться „18” квітня 2008 року о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного

фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий “14“ березня 2008 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук, професор Л.М. Малоштан

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальность теми. Рослинні лікарські засоби займають значну питому вагу в загальному об’ємі лікарських препаратів сучасної медицини.

Природна сировина залишається одним з основних джерел отримання лікарських препаратів, які широко використовуються в медичній практиці, а при лікуванні ряду захворювань є незамінними. Вони часто менш токсичні і мають більш сприятливу фармакологічну дію на організм. Тому, дослідження вітчизняної флори, виділення і вивчення біологічно активних речовин має велике теоретичне і практичне значення.

Великий інтерес має род Artemisia L., види якого використовуються в багатьох країнах світу як джерела протизапальних лікарських засобів. Особливої уваги заслуговують представники, багаті сполуками - похідними азуленів з широким спектром фармакологічної дії (дезинфікуючою, протизапальною, бактеріостатичною, антисептичною тощо). Сировинна база природних джерел біологічно активних азуленів в Україні обмежена. Всебічне морфолого - анатомічне та фітохімічне вивчення, впровадження в практику лікарських засобів з рослинної сировини поширених видів роду Artemisia L., що містять азулени, є актуальною проблемою фармакогнозії.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана відповідно плану науково - дослідних робіт кафедри фармакогнозії з курсом ботаніки Запорізького державного медичного університету з проблеми „Фармація” (№ державної реєстрації 0102U002861, шифр теми ІН 15.00.02.02).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є морфолого - анатомічне та фітохімічне вивчення перспективних азуленвміщуючих видів рослин роду полин: гіркого (Artemisia аbsinthium L.), звичайного (A. vulgaris L.), австрійського (A. austriaca Jacq.).

Для досягнення поставленої мети необхідно вирішити такі задачі:

- узагальнити сучасний стан використання азуленвміщуючих представників видів роду полин;

- провести пошук перспективних азуленвміщуючих видів серед рослин роду полин;

- встановити хімічний склад і вміст основних груп біологічно активних речовин, розробити способи їх отримання;

- встановити накопичення макро- та мікроелементів у рослинній сировині;

- розробити метод кількісного визначення флавоноїдів у рослинній сировині і фітопрепаратах;

- встановити морфолого - анатомічні діагностичні ознаки рослинної сировини видів роду полин флори України;

- встановити терміни накопичення ефірної олії в рослинах в умовах південного сходу України;

- розробити раціональні методи одержання лікарських засобів протизапальної дії з сировини азуленвміщуючих видів роду полин;

- дослідити антимікробну, мікостатічну, протизапальну фармакологічні дії лікарських засобів.

Об’єкти дослідження: рослини роду полин: гіркий, звичайний, австрійський.

Предмет дослідження: порівняльне фармакогностичне і морфолого - анатомічне вивчення азуленвміщуючих видів роду полин: гіркого (A. аbsinthium L.), звичайного (A. vulgaris L.), австрійського (A. austriaca Jacq.).

Методи дослідження: газорідинна хроматографія на микрокапілярних колонках з мас - спектрометричним детектуванням, високоефективна рідинна хроматографія, фотоелектроколориметрія, атомно - абсорбційний спектральний аналіз, УФ -, ІЧ -, ПМР - спектроскопія, мікроскопія.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне морфолого - анатомічне і фітохімічне вивчення трьох азуленвміщуючих видів родини айстрові флори південного сходу України.

Методами УФ-, ІЧ-, ПМР- спектроскопії, капілярної газорідинної і високоефективної рідинної хроматографії встановлено склад компонентів ефірної олії, флавоноїдів і амінокислот у досліджуваних видах.

Вперше методом атомно - абсорбційного спектрального аналізу проведено вивчення вмісту макро- та мікроелементів у рослинній сировині полинів: гіркого, звичайного, австрійського.

Розроблені способи отримання індивідуальних флавоноїдів, фенолкарбонових та урсолової кислот, виділено та ідентифіковано 19 сполук.

Розроблено спектрофотометричний метод кількісного визначення флавоноїдів у траві полину гіркого, настоянці трави полину гіркого.

Практичне значення одержаних результатів. Вивчені нові і перспективні види азуленвміщуючої рослинної сировини роду полин: гіркий, звичайний, австрийський флори України.

Запропоновані способи виділення флавоноїдів, фенолкарбонових та урсолової кислот з рослинної сировини досліджуваних видів.

Розроблено спектрофотометричний метод кількісного визначення флавоноідїв в рослинній сировині полину гіркого та настоянці з нього, проект змін до АНД на настоянку полину гіркого.

Встановлені діагностичні морфолого - анатомічні та мікроскопічні ознаки видів роду полин: гіркого, звичайного, австрійського, мітлистого, кримського та лимонного, що дозволяє ідентифікувати рослинну сировину.

Вперше встановлені відмінні морфолого - анатомічні та мікроскопічні ознаки полинів: гіркого, звичайного, австрійського, мітлистого, кримського та лимонного в лікарської сировині (інформаційний лист № 97 - 2006; Випуск 5 з проблеми „Фармація”, протокол № 41 від 19.04.06 р.).

Вперше визначені оптимальні терміни заготівлі лікарської сировини полинів гіркого та звичайного (інформаційний лист № 96 - 2006; Випуск 4 з проблеми „Фармація”, протокол № 41 від 19.04.06 р.).

Матеріали досліджень успішно впроваджені в лабораторії з контролю якості ЗАТ Фармацевтична фабрика „Віола”, системі виробничого об’єднання ЗАТ „Ліки Кіровоградщини”, Державної інспекції з контролю якості лікарських засобів МОЗ АР Крим та Запорізької області інформаційними листами: „Оптимальні терміни заготівлі лікарської сировини полинів гіркого (Artemisia absinthium L.) і звичайного (Artemisia vulgaris L.)”, „Відмінні морфолого - анатомічні та мікроскопічні ознаки рослин роду полин в лікарській сировині”.

Кафедри фармацевтичної хімії Вінницького національного медичного університету, фармації Івано-Франківського державного медичного університету, біології Запорізького національного університету, хімії та екології Запорізького національного технічного університету використовують запропоновані методики в учбовому процесі.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем самостійно зроблений аналіз наукової літератури з досліджуваної проблеми, визначені методичні підходи, відповідно яким виконані всі заплановані дослідження.

Проведені фізико - хімічні дослідження і вивчено склад ефірної олії полинів: гіркого, звичайного, австрійського. Вивчено хімічний склад флавоноїдів, фенолкарбонових та урсолової кислот, амінокислот у траві досліжуваних видів.

Розроблено спосіб кількісного визначення флавоноїдів в траві полинів гіркого і австрійського, настоянці полину гіркого.

Проведено порівняльне морфолого - анатомічне дослідження полинів: гіркого, звичайного, австрійського, мітлистого, кримського, лимонного.

Розроблено оптимальні терміни заготівлі лікарської сировини полинів гіркого (Artemisia absinthium L.) та звичайного (Artemisia vulgaris L.).

Результати експериментальних досліджень дисертантом оброблені за допомогою програмного забезпечення STATISTICA версії 6.1 серії AXXR712D833214FANS, систематизовані і проаналізовані. При виконанні та друкуванні результатів роботи не використовувалось ідей і результатів досліджень співавторів.

Апробація результатів дисертації. Основний зміст дисертаційної роботи докладався і обговорювався на науково - практичних конференціях: VII Міжнародний медичний конгрес студентів і молодих вчених (Тернопіль, 2003), „Актуальные вопросы медицины и фармации” I Межвузовская конференция молодых ученых (Запорожье, 2003), „Інноваційна модель соціально - економічного розвитку Запорізького регіону” (Запоріжжя, 2003), „Історія та перспективи розвитку фармацевтичної науки та освіти” Міжнародна наукова конференція, присвячена 100 - річчю створення фармацевтичного факультету ЗДМУ (Запоріжжя, 2004), „Актуальні проблеми клінічної, експериментальної, профілактичної медицини та стоматології” Всеукраїнська науково - практична конференція студентів та молодих вчених (Донецьк, 2004, 2005), Современные вопросы фармакогнозии (Ярославль, 2004), Наукова конференція студентів та молодих вчених з міжнародною участю (Вінниця, 2004), „Актуальні питання фармацевтичної і медичної науки та практики” (Запоріжжя, 2003, 2004, 2006, 2007), „Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно активних добавок” Науково - практична конференція з міжнародною участю (Тернопіль, 2004), VIII Міжнародний медичний конгрес студентів і молодих вчених (Тернопіль, 2004), „Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України”, VI Національний з’їзд фармацевтів України (Харків, 2005).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 20 наукових праць, в тому числі 11 статей (з них 7 - в наукових фахових виданнях), 2 інформаційних листи, 7 тез доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Загальний об’єм дисертації викладено на 219 сторінках (обсяг основного тексту становить 150 сторінок) і складається зі вступу, огляду літератури, чотирьох розділів експериментальних досліджень, висновків, списку використаної літератури і додатків. Робота ілюстрована 36 рисунками, 35 таблицями, 19 додатками. Список використаних джерел складає 188 найменувань, з них 38 - іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовується вибір теми та її актуальність, формулюються завдання досліджень, визначається наукова новизна та практичне значення досліджень.

У першому розділі проаналізовано та узагальнено дані первинних джерел з ботанічної характеристики, ареалів розповсюдження, сучасного стану вивчення хімічного складу видів роду Artemisia L., його застосуванню в медицині.

У другому розділі обґрунтовується вибір об’єктів дослідження та представлені методи їх вивчення.

У третьому розділі наведені результати дослідження вмісту, фізико - хімічних властивостей та складу ефірних олій. Ефірні олії із зразків рослинної сировини виділяли методом Клєвенджера, після чого вивчали фізико - хімічні показники (табл. 1).

Таблиця 1.

Фізико - хімічні показники ефірних олій з трави A. absinthium L., A. vulgaris L.,A. austriaca Jacq., яку заготовлювали у передмістях м. Васильківки Запорізької обл.(липень - вересень 2004 - 2006 рр.), n=6

№

з/п | Показник якості | Artemisia

absinthium L. | Artemisia

vulgaris L. | Artemisia austriaca Jacq.

1

2

3

4

5

6

7

8 | Вміст (Х) %

Густина, сD20

Показник заломлення, nD20

Питомий показник обертання, [л]D20

Кислотне число, IA

Ефірне число, IE

Гідроксильне число, IOH

Вміст фенолів, % | 2,35 ± 0,051

0,9167

1,4910

- 5,40

1,43 ± 0,07

45,56 ± 2,49

65,20 ± 2,24

3,82 ± 0,66 | 0,90 ± 0,018

0,8700

1,4776

- 19,00

1,20 ± 0,06

53,00 ± 2,50

68,15 ± 2,30

2,84 ± 0,53 | 3,00 ± 0,065

0,9070

1,4890

- 1,44

3,91 ± 0,15

55,80 ± 2,48

70,35 ± 2,40

5,11 ± 1,22

Методом газорідинної хроматографії на мікрокапілярних колонках з мас- спектрометричним детектуванням у ефірній олії полину гіркого встановлено до 56 сполук, п. австрійського до 43, п. звичайного до 31. Основними складовими ефірної олії полину гіркого були: в - мірцен, ліналоол, Ь - туйон, в - туйон, камфора, в - терпінеол, Ь - терпінеол, туйїловий спирт, борнілацетат, туйїлацетат, в - бурбонен, каріофілен, ar - куркумен, в - селинен, нерил - 2 - метилпропіонат, лінолил - 2 - метилбутират, лінолил - 3 - метилбутират, нерил - 2 - метилбутират, геранил - 2 - метилбутират, інтермедіол, хамазулен, гвайазулен. У ефірній олії полину австрійського у найвищих концентраціях містились: 1,8 - цинеол, Ь - туйон, в - туйон, камфора, туйїлацетат, Ь - терпінеол, карвон, хамазулен, дигідрохамазулен, артемін. У ефірній олії полину звичайного накопичувались: камфен, в - пінен, сабинен, Ь - терпінен, камфора, борнілацетат, Ь - терпінеол, борнеол, карвон, в - фенілетиловий спирт, метилевгенол, хамазулен. Вміст біологічно активних азуленів був максимальним у ефірній олії Artemisia austriaca Jacq. (до 19,77 ± 1,84%), декілька менший - у A. аbsinthium L. (до 16,23 ± 1,33 %) і значно нижчий - у A. vulgaris L. (до 8,90 ± 0,86%) (табл. 2).

Таблиця 2.

Кількісний вміст суми азуленів (% ± Е0,95) у складі ефірних олій видів роду полин(липень - вересень 2004 – 2006 рр) n=6

Місце заготівлі | Artemisia absinthium L. | Artemisia vulgaris L. | Artemisia austriaca Jacq.

Запорізька обл., м. Токмак

Дніпропетровська обл., с. Троїцьке

Запорізька обл., с. Дубова балка

Донецька обл., Артемівський район

АР Крим, Никітський ботанічний сад

Запорізька обл., м. Васильківка | 14,11 ± 1,30

13,45 ± 1,24

14,00 ± 1,28

13,77 ± 1,28

13,80 ± 1,29

16,23 ± 1,33 | 8,90 ± 0,86

8,55 ± 0,80

7,90 ± 0,76

7,96 ± 0,76

8,44 ± 0,82

7,92 ± 0,80 | 23,11 ± 1,89

20,15 ± 1,79

19,77 ± 1,84

19,81 ± 1,82

20,11 ± 1,69

18,8 ± 1,79

З досліджуваних видів нами одержано 14 речовин флавоноїдної природи (рис. 1).

У траві полину австрійського ідентифіковані речовини :1 – 3, 5 – 12; п. гіркого – 1, 2, 7 – 14, п. звичайного - 1 - 4, 9.

Речовина 1 складу С5Н1006 - кристали яскраво - жовтого кольору, розчинялись у спирті етиловому, етилацетаті, диетиловому ефірі; Тпл 329 - 331о С (спирт етиловий), лmax 255, 268пл, 350 нм. Дані УФ -, ІЧ -, ЯМР - спектроскопії, відсутність депресії Тпл ідентичні лютеоліну (5, 7, 3’, 4’ - тетраоксифлавону).

Речовина 2 складу С21Н20011 - кристали яскраво - жовтого кольору, розчинні у спирті етиловому, етилацетаті, формамиді; Тпл 264 - 267о С; лmax 255 - 258, 268пл, 344 нм. Продуктом гідролізу речовини 2 був аглікон (до 60,4%): Тпл 328 - 330оС, лmax 255, 268пл, 348 нм (спирт етиловий). Дані УФ -, ІЧ -, ЯМР - спектроскопії, відсутність депресії Тпл, продукти гідролізу ідентичні лютеолін - 7 - глікозиду (7 - О - в - D - глюкопіранозидо - 5, 3’, 4’ - триоксифлавону). Речовина 3 складу С15Н1007 - голчасті кристали яскраво - жовтого кольору, розчинні у спирті етиловому, етилацетаті та диетиловому ефірі; Тпл 311 - 313о С (спирт етиловий); лmax 258 - 259, 299пл, 372 нм. Дані УФ -, ІЧ - та ПМР - спектроскопії, відсутність депресії Тпл ідентичні кверцетину (3, 5, 7, 3’, 4’ - пентаоксифлавону).

Речовина 4 складу С27Н30016 · 3Н20 - кристали яскраво - жовтого кольору, розчинні у спирті етиловому, формамиді. Тпл 190 - 191о С (спирт етиловий); лmax 257 - 258, 299пл, 371 нм. Продуктом гідролізу був аглікон (до 68,2 %); Тпл 311 - 313о С (спирт етиловий); лmax 258 - 259, 299пл, 372 нм. Дані УФ -, ІЧ - та ПМР - спектроскопії, відсутність депресії Тпл, продукти гідролізу ідентичні рутину (5, 7, 3’, 4’ - тетраокси - 3 - в - D - глюкопіранозил - Ь - L - рамнопіранозиду).

Речовина 5 складу С21Н20012 - жовтий порошок, розчинний у спирті етиловому, диметилформамиді, піридині, у гарячій воді; Тпл 168 - 170о С (спирт етиловий); лmax 255, 360 нм. Дані УФ -, ІЧ - та ПМР - спектроскопії, відсутність депресії Тпл ідентичні ізокверцетрину (кверцетин - 3 - в - D - глюкофуранозиду).

Речовина 6 складу С27Н30017 - яскраво - жовтий кристалічний порошок, розчинний у спирті етиловому, диметилформамиді, піридині; Тпл 180 - 184о С (спирт етиловий); лmax 258, 362 нм. Дані УФ -, ІЧ - та ПМР - спектроскопії, відсутність депресії Тпл, продукти гідролізу ідентичні скопарину (кверцетин - 3 - глюкогалактозиду).

Рис. 1 Схема розділення флавоноїдів, які виділено з екстрактів трави Artemisia absinthium L., Artemisia vulgaris L., Artemisia austriaca Jacq.

Речовина 7 складу С15Н1006 - кристали яскраво - жовтого кольору, розчинні у спирті етиловому, диметилформамиді, піридині, нерозчинні у воді, хлороформі; Тпл 277 - 279о С (спирт етиловий); лmax 266, 322пл, 367 нм. Дані УФ -, ІЧ - та ПМР - спектроскопії, відсутність депресії Тпл ідентичні кемпферолу (3, 5, 7, 4’ - тетраоксифлавонолу).

Речовина 8 складу С21Н22О11 - кристали жовтого кольору, розчинні у спирті етиловому, етилацетаті, формамиді, нерозчинні в хлороформі, диетиловому ефірі. Тпл 175 - 178° С (спирт етиловий); лmax 267, 300, 351 нм. Дані УФ -, ІЧ - та ПМР - спектроскопії, відсутність депресії Тпл, продукти гідролізу ідентичні астрагаліну (кемпферол - 3 - О - в - D - глюкопіранозиду).

Речовина 9 складу С16Н1207 - кристали яскраво - жовтого кольору, розчинні у спирті етиловому, диметилформамиді, піридині; нерозчинні у воді, хлороформі, диетиловому ефірі. Тпл 303 - 306о С (спирт етиловий); лmax 253, 267, 370 нм. Дані УФ -, ІЧ - та ПМР - спектроскопії, відсутність депресії Тпл ідентичні ізорамнетину (3, 5, 7, 4’ - тетраокси - 3’ - метоксифлавону).

Речовина 10 складу С22Н22О12 з Тпл 270 - 272° С; лmax 255, 358 нм. Дані УФ -, ІЧ - та ПМР - спектроскопій, відсутність депресії Тпл, продукти гідролізу ідентичні кактицину (ізорамнетин - 3 - О - в - D - галактопіранозиду).

Речовина 11 складу С28Н32016 - кристали жовтого кольору, розчинні у спирті етиловому, диметилформамиді, піридині, у гарячій воді. Тпл 177 - 179° С (етанол); лmax 255, 265, 300, 355 нм. Дані УФ -, ІЧ - та ПМР - спектроскопії, відсутність депресії Тпл, продукти гідролізу ідентичні нарцисину - ізорамнетин - 3 - в - D - глюкопіранозил - (6 - 1) - Ь - L - рамнопіранозиду.

Речовина 12 складу С28Н32017 · 2Н20 - кристали жовтого кольору, розчинні у спирті етиловому, диметилформамиді, піридині, у гарячій воді. Тпл 194 - 197о С (етанол); лmax 255, 265, 365 нм. Дані УФ -, ІЧ - та ПМР - спектроскопії, відсутність депресії Тпл, продукти гідролізу ідентичні ізорамнетин - 3 - в - D - глюкопіранозил - (6 - 1) - в - D - глюкопіранозиду.

Речовина 13 складу С22Н22О13 - кристали яскраво - жовтого кольору, розчинні у спирті етиловому, гарячій воді.Тпл 251 - 252° С (спирт етиловий); лmax 259, 372 нм. Дані УФ -, ІЧ - та ПМР - спектроскопії, відсутність депресії Тпл, продукти гідролізу ідентичні патулитрину (патулетин - 7 - О - в - D - глюкопіранозиду).

Речовина 14 складу С20Н20О8 - кристали яскраво - жовтого кольору, розчинні у спирті етиловому, формамиді, гарячій воді. Тпл 216 - 218° С (спирт етиловий), лmax 267, 300, 351 нм. Дані УФ -, ІЧ - та ПМР - спектроскопії, відсутність депресії Тпл ідентичні артемізетину (5 - гідрокси - 3, 6, 7, 3’, 4’ - пентаметоксифлавону).

Методом високоефективної рідинної хроматографії нами вперше вивчений амінокислотний склад рослинної сировини (табл. 3).

У сировині, зібраній у період цвітіння ідентифіковано до 17 амінокислот, 8 з яких (лейцин, ізолейцин, фенілаланін, метионін, лізин, гістидин, треонін, валін) є незамінними. Найбільшу кількість амінокислот встановлено в траві п. гіркого (21,41 ± 0,209 мг%) та п. звичайного (21,36 ± 0,227 мг%), декілька менші концентрації характерні для п. австрійського (19,30 ± 0,173 мг%).

Таблиця 3.

Вміст амінокислот у траві рослин роду полин, яку заготовляли в м. Бердянськ Запорізької області (червень - серпень, 2003 - 2006 рр.) (мг на 100 г), (x ± E0,95), n = 6.

Амінокислота, Rf (система № 1) | Artemisia absinthium L. | Artemisia vulgaris L. | Artemisia austriaca Jacq.

1 | 2 | 3 | 4

Аспарагінова кислота (0,16) | 2,38 ± 0,273 | 2,20 ± 0,227 | 1,41 ± 0,150

Треонін (0,18) | 0,64 ± 0,054 | 0,66 ± 0,052 | 0,53 ± 0,047

Серин (0,15) | 0,67 ± 0,057 | 0,72 ± 0,062 | 0,60 ± 0,617

Глютамінова кислота (0,17) | 1,82 ± 0,162 | 1,57 ± 0,152 | 1,43 ± 0,144

Пролін (0,24) | 1,73 ± 0,172 | 1,30 ± 0,135 | 1,99 ± 0,182

Гліцин (0,21) | 0,66 ± 0,062 | 0,60 ± 0,059 | 0,53 ± 0,052

Аланін (0,20) | 0,77 ± 0,062 | 0,73 ± 0,072 | 0,66 ± 0,065

Цистеїн (0,12) | 0,11 ± 0,011 | 0,05 ± 0,006 | 0,04 ± 0,004

Валін (0,43) | 7,03 ± 0,062 | 7,82 ± 0,071 | 7,08 ± 0,071

Метионін (0,39) | 0,20 ± 0,020 | 0,26 ± 0,020 | 0,15 ± 0,020

Ізолейцин (0,72) | 0,56 ± 0,533 | 0,57 ± 0,555 | 0,52 ± 0,519

Лейцин (0,64) | 0,96 ± 0,941 | 0,94 ± 0,094 | 0,87 ± 0,087

Тирозин (0,57) | 0,72 ± 0,073 | 0,55 ± 0,056 | 0,56 ± 0,057

Фенилаланін (0,32) | 0,78 ± 0,774 | 0,92 ± 0,091 | 0,80 ± 0,081

Гістидин (0,10) | 0,48 ± 0,048 | 0,50 ± 0,052 | 0,49 ± 0,050

Лізин (0,05) | 1,09 ± 0,102 | 1,22 ± 0,121 | 0,98 ± 0,099

Аргінін (0,04) | 0,81 ± 0,082 | 0,75 ± 0,073 | 0,66 ± 0,065

Сума амінокислот | 21,41 ± 0,209 | 21,36 ± 0,227 | 19,30 ± 0,173

Всі досліджувані види полинів містили в своєму складі полісахариди. Вміст їх суми у траві п. звичайного складав до 12,78 %, у п. гіркому - до 8,89 %, у п. австрійському - до 10,85 %.

Виділення фенолкарбонових та урсолової кислот проводили з густих екстрактів після розбавлення чотирикратною кількістю дистильованої води. Осад відстоювали протягом 24 годин (t ± 3о С) та відокремлювали. Розділення проводили на колонці з поліамідним сорбентом. Елюати об’єднували, підкисляли до рН=2. Речовини екстрагували сумішшю: етиловий ефір - н - бутанол (1:1,5), упарювали, концентрували.

З трави всіх трьох видів вивчаємих рослин були виділені та ідентифіковані: хлорогенова, неохлорогенова та кавова кислоти. У траві полину гіркого виявлена також розмаринова кислота, у траві полину звичайного - урсолова.

Речовина 15 складу С30Н48О3 - біла кристалічна речовина, Тпл 280 - 282о С (спирт етиловий). Розчинна у диетиловому ефірі, хлороформі, ацетоні та етилацетаті. УФ - спектр був ідентичним похідним Ь - амирану, лмакс 310 нм. Дані УФ -, ІЧ - спектроскопії, відсутність депресії Тпл ідентичні з урсоловою кислотою.

Речовина 16 складу С16Н18О9 - безбарвні голчасті кристали, Тпл 201 - 202о С (спирт етиловий). В УФ - спектрі лмакс: 330, 300 нм. Дані УФ -, ІЧ - спектроскопії, відсутність депресії Тпл ідентичні з хлорогеновою кислотою.

Речовина 17 складу С18Н18О9 - білий аморфний порошок з Тпл 204 - 206о С; [Ь]D20 + 2,6 (з 1,0 спирту етилового). В УФ - спектрі лмакс: 320, 300, 245 нм. Дані УФ -, ІЧ - спектроскопії, відсутність депресії Тпл ідентичні з неохлорогеновою кислотою.

Речовина 18 складу С18Н16О8 - яскраво - жовті голчаcті кристали з Тпл 203 - 204о С (спирт етиловий). В УФ - спектрі лмакс: 327, 287 та 245 нм. Дані УФ -, ІЧ - спектроскопії, відсутність депресії Тпл ідентичні з розмариновою кислотою.

Речовина 19 складу С9Н8О4 - білий аморфний порошок з Тпл 207 - 209о С (спирт етиловий). В УФ - спектрі лмакс: 345, 325 нм. Дані УФ -, ІЧ - спектроскопії, відсутність депресії Тпл ідентичні з кавовою кислотою.

Встановлено, що вміст вільних катехинів в період масового цвітіння складав в траві п. австрійського 3,295 ± 0,3703 %, п. гіркого - 3,090 ± 0,3511 %, п. звичайного - 2,102 ± 0,3301 %. Накопичення суми каротиноїдів (перераховуючи на - каротин) та аскорбінової кислоти відповідно: у траві п. австрійського до 30,10 ± 1,16 мг % та 0,113 ± 0,0111 %; у траві п. гіркого - до 26,19 ± 1,13 мг % та 0,105 ± 0,0101 %, у траві п. звичайного - до 12,19 ± 0,65 мг % та 0,095 ± 0,0103 %.

У траві рослин методом атомно - абсорбційної спектрометрії визначено вміст 21 неорганічного елементу: В (до 90,32 ± 9,33 мкг/г), Mg (до 0,020 ± 0,0015 мг/г), Mn (до 0,22 ± 0,02 мкг/г), Fe (до 0,29 ± 0,03 мг/г), Cu (до 0,0016 ± 0,0001 мг/г), Pb (до 0,03 ± 0,0003 мг/г), Sn (до 0,18 ± 0,02 мкг/г), Ca (до 11,18 ± 1,10 мкг/г), Se (до 5,90 ± 0,58 мкг/г), Мо (до 5,55 ± 0,56 мкг/г), Cd (до 0,66 ± 0,07 мкг/г), Zn (до 0,66 ± 0,05 мкг/г), Ni (до 0,34 ± 0,03 мкг/г), Sn (до 13,44 ± 1,22 мкг/г), Co (до 0,16 ± 0,02 мкг/г). V (до 0,09 ± 0,008 мкг/г), Cr (до 0,05 ± 0,04 мкг/г), Sr (до 0,18 0,02 мкг/г), К (до 3,51 0,342 мг/г), Bi < 0,02 мг/г, Ag < 0,02 мг/г, загальної золи (до 12,15 %).

У четвертому розділі на основі електронної мікроскопії вперше приводяться відмінні морфолого - анатомічні та мікроскопічні ознаки видів роду полин: гіркого, звичайного, австрійського, мітлистого, кримського, лимонного.

П. гіркий має нижню епідерму листка сильно звивистостінну, оболонки клітин тонкостінні; продихи, порівнюючи з клітинами епідерми, великих розмірів, злегка підводяться, аномоцитного типу будови. На клітинах епідерми велика кількість Т - подібних волосків, що створюють повстяне вкриття нижньої сторони листка. Залозки численні, великих розмірів, занурені в мезофіл; Т - подібні волоски у п. гіркого, на відміну від інших видів, мають від двох до п’яти дрібних клітин основи, до яких прикріплюється Т - подібна клітина. Клітини верхньої епідерми багатогранні або звивистостінні, з тонкими стінками. Стовбчаста паренхіма з верхнього боку дворядна, з нижнього - однорядна; губчаста - три - п’ятишарова. Листочки обгортки заокруглені, з широким краєм бахроми; з абаксиального боку опушені Т - подібними волосками, серед яких спостерігаються і залозки. Клітини довгасті, прямокутні. Жіночі квітки мають вузький трубчастий віночок; обостатеві квітки, на відміну від таких у п. звичайного, мають дзвониковий віночок, на якому спостерігається найбільша кількість залозок.

П. звичайний має нижню звивистостінну епідерму листків, продихи досить часто зустрічаються, великих розмірів, аномоцитного типу. Епідерма повстяно вкрита Т - подібними волосками, серед яких (не часто) розташовуються залозки. Верхня епідерма представлена багатогранними, з прямими або із злегка звивистими стінками, переважно без продихів та трихом, клітинами. Трихоми як правило розташовуються біля жилок або на їхній поверхні. Листочки обгортки суцвіть кошиків довгасті, по краю бахромчасті, з абаксиального боку густо опушені Т - подібними волосками, серед яких зрідка зустрічаються залозки. Більш за все залозок зустрічається на віночку обостатевих квіток.

П. австрійський має мілкоклітинну епідерму з потовщеними зовнішніми та внутрішніми оболонками, густо вкриту Т - подібними волосками, що побудовані з однієї або двох коротеньких невеликих базальних клітин та верхньої, з невеликою основою і довгим двостороннім виростом, і це робить її Т - подібною. Серед волосків спостерігаються багатоклітинні залозки зі схожою будовою із залозками всіх видів вивчаємих полинів і характерною для родини айстрові. Продихи, порівнюючи з клітинами епідерми, великих розмірів, нечасто зустрічаються, аномоцитного типу будови. Листочки обгорток кошиків мають еліптичну форму, загострену верхівку, з абаксиального боку густо вкриті Т - подібними волосками, серед яких зустрічаються залозки.

Вміст ефірної олії у період цвітіння в сировині п. австрійського до 3,00 ± 0,065 %, у п. гіркого - до 2,35 ± 0,051 %, у п. звичайного - до 0,90 ± 0,018 %.

Максимальні концентрації флавоноїдів в рослинній сировині відмічені в період цвітіння (серпень - вересень) відповідно: у траві п. австрійського до 3,00 ± 0,06 %; п. гіркого - до 1,27 ± 0,05 %; п. звичайного - до 0,67 ± 0,08 %.

У п’ятому розділі наведено результати дослідження біологічної активності лікарських засобів на базі Запорізького міського венеричного диспансеру (ліц. № 450606 від 11.07.2002 р.) та кафедри клінічної і лабораторної діагностики КМАПО ім. П.Л. Шупика. Біологічні експерименти виконувались з урахуванням положень „Загальних етичних принципів експериментів на тваринах (Україна, 2001).

Ефірна олія п. австрійського має виражену бактеріостатичну дію на штами St. aureus (АТСС - 25923), В. subtilis (АТСС - 6633) та Е. coli (АТСС - 25922). Декілька знижена бактеріостатична активність була відмічена до таких штамів бактерій як St. aureus (клініч.) та мікс - флори (St. aureus, Str. рyogenes, Neisseria gonorrhea, Е. сoli). Ефірна олія п. звичайного виявляла виражену бактеріостатичну активність відносно St. aureus (АТСС - 25923) та B. subtilis (АТСС - 6633) і менш виражену активність до Е. coli (АТСС - 25922), Str. рyogenes (клініч.) та St. aureus (АТСС - 25923). Ефірна олія п гіркого мала виражену бактеріостатичну активність відносно Str. рyogenes (клініч.). Помірні зони затримки росту були відмічені при дії на St. aureus (АТСС - 25923), B. subtilis (АТСС - 6633), Ps. aeruginosa (АТСС - 7853) та Е. coli (АТСС - 25922).

Ефірна олія п. австрійського мала виражену мікостатичну дію на Microsporum canis (клініч.), Alternaria alternate (клініч.), Trichophyton rubrum (клініч.). Ефірна олія п. звичайного більш виражену мікостатичну активність виказувала до Candida albicans (клініч.) та Microsporum canis (клініч.), менш виражену мікостатичну активність виявлено до Rhodotorula rubra (клініч.), Alternaria alternate (клініч.) та Trichophyton rubrum (клініч.). Ефірна олія п. гіркого мала виражену мікостатичну активність відносно Rhodotorula rubra (клініч.). Помірні зони відмічено при дії олії на Microsporum gyps. (клініч.) та Microsporum canis (клініч.). Бактеріостатичний ефект олій тривалий, діаметр зони затримки росту не змінювався на протязі місяця.

На трьох моделях запалення - формаліновому, трипсиновому, гіалуронідазному набряках лапок щурів, екстракційні мазі та ліофільні екстракти з рослинної сировини полину гіркого та австрійського виявляли виражений протизапальний ефект. В якості препарату порівняння використовувалі ацетилсаліцилову кислоту (25 мг/кг). Відмічено антифлогогенну активність екстракційної мазі з A. absinthium L. та A. austriaca Jacq. (25 мг/кг) на моделі формалінового набряку, відповідно через 4 години до 26,4 2,9% та 37,2 2,9% (група порівняння 23,0 2,0%), р < 0,001. На моделі трипсинового набряку за той же час, відповідно - до 33,4 3,1% та 42,5 3,7% (група порівняння 29,9 3,0%), р < 0,001. На моделі гіалуронідазного набряку, відповідно до 29,3 2,5% та 39,5 2,2% (в порівнянні з кислотою ацетилсаліциловою: 32,7 2,9%). Для ліофільних екстрактів з A. absinthium L. та A. austriaca Jacq. (25 мг/кг ) також відмічено антифлогогенну активність на моделі формалінового набряку, відповідно через 4 години до 25,4 2,7% та 39,2 2,9%, р < 0,001. На моделі трипсинового набряку через той же час відповідно - до 35,3 3,7% та 44,4 3,1%, р < 0,001. На моделі гіалуронідазного набряку - до 30,3 2,5% та 41,5 2,2%, р < 0,001.

Більш виражена біологічна дія екстракційної мазі та ліофільного екстракту з трави п. австрійського пов’язувалось з високим вмістом флавоноїдів та ефірної олії в складі лікарських засобів.

ВИСНОВКИ

1. Проведено системне вивчення біологічно активних речовин азуленвміщуючих видів роду Artemisia L. На основі порівняльного вивчення якісного та кількісного вмісту біологічно активних речовин (ефірних олій, азуленів, флавоноїдів, каротиноїдів, макро- та мікроелементів, органічних, фенолкарбонових, урсолової та аскорбінової кислот) науково обґрунтовано можливість створення нових лікарських засобів з бактеріостатичною, мікостатичною, протизапальною активністю.

2. Були вивчені фізико - хімічні властивості і вміст ефірних олій в траві Artemisia аbsinthium L., Artemisia vulgaris L., Artemisia austriaca Jacq. Вперше методом газо - рідинної хроматографії на мікрокапілярних колонках у ефірній олії полину гіркого встановлена присутність до 56 компонентів, у ефірній олії полину австрійського - до 43, у ефірній олії полину звичайного - до 31.

3. Вперше виділено та ідентифіковано методами УФ -, ІЧ -, та ПМР - спектроскопії флавоноїди у траві полину гіркого: астрагалін, ізорамнетин - 3 - в - D - глюкопіранозил - (6 - 1) - в - D - глюкопіранозид, патулитрин; у полину австрійському: лютеолін, лютеолін - 7 - глікозид; у полину звичайному: лютеолін, лютеолін - 7 - глікозид, кверцетин - 3 - в - D - глюкофуранозид, скопарин, астрагалін, кактицин, нарцисин.

4. Вперше методом високоефективної рідинної хроматографії ідентифіковано до 17 амінокислот, 8 з яких (лейцин, ізолейцин, фенилаланін, метионін, лізин, гістидин, треонін, валін) є незамінними. Загальний вміст амінокислот у траві п. гіркого складав до 21,41 0,209 мг %, п. звичайного - до 21,36 0,227 мг %, п. австрійського - до 19,30 0,173 мг %.

5. Вперше з трави полинів гіркого, звичайного і австрійського були виділені і ідентифіковані: хлорогенова, неохлорогенова, урсолова, кавова та розмаринова кислоти.

6. Вперше методом атомно - абсорбційної спектрометрії в траві полинів гіркого, звичайного та австрійського встановлений вміст 21 макро- та мікроелемента. В період бутонізації відмітили максимальне накопичення: калію, магнію, марганцю, заліза, міді.

7. Проведене морфолого - анатомічне та мікроскопічне вивчення рослин видів роду полин: гіркого, звичайного, австрійського, мітлистого, кримського, лимонного. Встановлені відрізняючі діагностичні ознаки рослинної сировини, що дозволило проводити їх ідентифікацію.

8. Вивчено накопичення біологічно активних вуглеводів, дубильних речовин, вітамінів у вегетаційний період. Максимальні концентрації ефірної олії та азуленів у ній відмічені в період цвітіння (серпень - вересень) у траві полину австрійського до 3,00 0,06 % (20,15 1,99 %), гіркого - до 2,50 0,01 % (15,12 1,50 %), звичайного - до 1,15 0,02 % (9,20 0,88 %). Встановлено оптимальні терміни заготівлі рослинної сировини.

9. Розроблено метод спектрофотометричного визначення суми флавоноїдів у траві рослин. Максимальне накопичення відмічено у період цвітіння (серпень - вересень) у траві п. австрійського (до 3,00 0,06%), гіркого - до 2,23 0,09%, звичайного - до 0,67 0,08%.

10. Ефірні олії полинів гіркого, звичайного та австрійського виявляли виражену бактеріостатичну дію відносно до: S. aureus, Bc. subtilis, E. coli, мікс - флори (S. aureus, Str. рyogenes, Neisseria gonorrhea, E. сoli). Мікостатична дія виявлялась до: Microsporum canis, Alternaria alternate, Trichophyton rubrum, Candida albicans, Rhodotorula rubra.

11. З трави A. absinthium L. і A. austriaca Jacq. одержано олійні та ліофілізовані екстракти, які в експериментах на тваринах знижували формаліновий, трипсиновий та гіалуронідазний набряки в порівнянні з дією кислоти ацетилсаліцилової, виявляя при цьому ефективну протизапальну дію.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Виды родов Artemisia L., Achillea L. флоры юго-востока Украины - перспективные источники радиопротекторных БАД /Е.В. Гречаная, В.Н. Герасимов, Б.Б. Гавриленко, А.В. Мазулин //Інноваційна модель соц. - екон. розвитку Запорізького регіону: Зб. наук. праць I наук. - практ. конф. - Запоріжжя, 2003. C. 198 - 204. (Автор особисто проводила мікроелементний аналіз, статистично обробляла одержані дані).

2. Гречаная Е.В., Мазулин А.В. Фитохимическое исследование перспективных видов рода Artemisia L. //Актуальні питання фармац. та мед. науки та практики: Зб. наук. праць. - Запоріжжя, 2003. - Вип. Х - С. 134 - 137. (Автор особисто проводила лабораторно-інструментальний аналіз, складала висновки та готувала статтю до друку).

3. Гречаная Е.В., Герасимов В.Н. Сравнительное фитохимическое изучение видов рода полынь //Матер. VII міжнар. мед. конгресу студентів і молодих вчених. - Т., 2003. - С. 248.

4. Гречаная Е.В. Экологическое исследование представителей рода Artemisia L. на содержание нитратов //Актуальные вопросы медицины и фармации: Тез. докл. I межвуз. конф. молодых ученых. - Запорожье, 2003. - С. 34 - 35.

5. Гречаная Е.В. Физико-химические свойства и компонентный состав эфирного масла полыни австрийской //Матеріали наук. конф. студентів та молодих вчених з міжнар. участю. - Вінниця, 2004. - С. 307.

6. Гречаная Е.В. Накопление микроэлементов в растительном сырье видов рода полынь флоры юго-востока Украины //Актуальні проблеми клініч., експерим., профілакт. медицини та стоматології: Матеріали всеукр. наук. - практ. конф. студентів та молодих вчених. - Донецьк, 2004 - С. 189.

7. Гречаная Е. Фитохимическое исследование эфирного масла полыни горькой флоры юго - востока Украины //Матеріали VIII міжнар. мед. конгресу студентів і молодих вчених. - Т., 2004. - С. 221.

8. Гречаная Е.В., Мазулин А.В., Сур С.В. Перспективные виды рода Artemisia L. флоры Украины //Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно активних добавок: Матеріали наук. - практ. конф. з міжнар. участю. - Т., 2004. - С. 91 - 93.

9. Гречаная Е.В., Сур С.В., Мазулин А.В. Фармакогностическое изучение азуленсодержащих видов рода Artemisia L. //Актуальні питання фармац. та мед. науки та практики: Зб. наук. ст. - Запоріжжя, 2004. - Вип. ХІІІ - С. 209 - 213. (Автор особисто проводила експериментальні дослідження, статистично обробляла одержані результати).

10. Гречаная Е.В., Ростокина А.И. Фитохимическое изучение полыни горькой //Актуальні проблеми клін., експерим., профілакт. Медицини та стоматології: Матеріали всеукр. наук. - практ. конф. студентів та молодих вчених. - Донецьк, 2005. - С. 179 - 180.

11. Гречана О.В., Мазулін О.В., Кейтлін І.М. Дослідження флавоноїдного складу рослинної сировини та настоянки з Artemisia absinthium L. //Актуальні питання фармац. та мед. науки та практики: Зб. наук. ст. - Запоріжжя, 2006. - Вип. ХV, т.1. - С. 192 - 195. (Автор особисто проводила експериментальні дослідження, статистично обробляла