МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

УКРАЇНСЬКИЙ ІНСТИТУТ КЛІНІЧНОЇ ГЕНЕТИКИ

ХАРКІВСЬКОГО ДЕРЖАВНОГО МЕДИЧНОГО УНІВЕРСИТЕТУ

ГУСАР ВЛАДИСЛАВА АНАТОЛІЇВНА

УДК 616.056.7:575.174:575.22:576.311.347:577.21(477)

ОЦІНКА РІЗНОМАНІТТЯ ГАПЛОТИПІВ МІТОХОНДРІАЛЬНОЇ ДНК НАСЕЛЕННЯ УКРАЇНИ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківській медичній академії післядипломної освіти МОЗ України.

Науковий керівник: член-кореспондент АМН України,

доктор медичних наук, професор

Гречаніна Олена Яківна,

Харківський державний медичний

університет МОЗ України,

завідувач кафедри медичної генетики,

Український інститут клінічної генетики

Харківського державного медичного

університету, директор, м.Харків.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук

Акопян Гаяне Рубенівна,

Державна установа "Інститут

спадкової патології АМН України",

заступник директора, завідувач

відділення клінічної генетики, м. Львів;

доктор медичних наук, професор

Тимченко Ольга Іванівна,

Державна установа "Інститут

гігієни та медичної екології

ім. О.М.Марзєєва АМН України",

завідувач лабораторії генетичної

епідеміології, м. Київ.

Захист відбудеться "28" лютого 2008 року о 10годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К64.600.05 в Українському Інституті клінічної генетики Харківського державного медичного університету МОЗ України за адресою: 61022, м.Харків, пр.Правди, 13.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Харківського державного медичного університету: 61022, м.Харків, пр.Леніна, 4

Автореферат розісланий "26" січня 2008 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

к.мед.н. Л.С.Озерова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Після завершення проекту “Геном людини” особливого значення набули дослідження міжіндивідуальних та міжпопуляційних генетичних відмінностей людини на основі аналізу поліморфізму ДНК-маркерів. Вивчення геномного різноманіття дозволяє вирішувати не лише еволюційно-генетичні завдання, але є базою для молекулярної епідеміології спадкових хвороб, генетики мультифакторних захворювань, генетичного картування.

Використання сучасних філогеографічного та філогенетичного підходів дозволяє з високим ступенем достовірності визначати структуру генофонду популяції, досліджувати стародавні міграції, вивчати геногеографічні особливості поширення захворювань у популяції (Wallace D.C., 2005).

Щодо сучасних уявлень, найбільш придатними об’єктами для досліджень вважаються ділянки геному, які відзначаються практичною відсутністю рекомбінації: мітохондріальна ДНК (мтДНК) і нерекомбінуюча частина Y хромосоми. Мінливість означених маркерів пов’язана лише з поступовим накопиченням мутацій. Відсутність рекомбінації в згаданих ділянках дозволяє за допомогою філогенетичного аналізу відновити послідовність мутаційних подій, які сформували гаплотип, і простежити походження й географічне поширення кожної окремої лінії (Wallace D.C. et. al.,1999).

На даний час, філогеографія мтДНК і Y хромосоми людини достатньо добре вивчена, що дозволяє кожній популяції надати докладну молекулярно-генетичну характеристику в контексті інших народів світу. У дослідженнях етногенезу слов'ян накопичена велика кількість етнографічних, лінгвістичних та археологічних даних, однак, вивчення цього аспекту в східнослов'янських популяціях, і зокрема української, усе ще залишається недостатнім.

Відомо, що східнослов’янська спільність сформувалася в результаті складного етногенезу, в якому взяли участь слов’янські групи Центральної Європи й пре-слов’янські популяції Східної Європи такі як: фіно-угорські, балтійські та іранські (гібридизаційна теорія) (Алексеева Т.И.,1973; Алексеева Т.И., Алексеев В.П., 1989). Очевидно, що генетичний профіль даної території склався в результаті взаємного впливу представників різних етнічних груп. Тому співставлення даних по етногенезу слов’янських народів з даними поліморфізму мтДНК сучасного українського населення дозволить з’язувати походження названих груп та оцінити ступінь їх спорідненості.

Отримано дані щодо генетичного поліморфізму мтДНК росіян і білорусів (Кушнеревич Е.И. и др., 2007; Малярчук Б.А., 2001; Belyaeva O. et. al., 2003; Malyarchuk B. et. al., 2001; Malyarchuk B. et. al., 2004; Orekhov V. et. al., 1999), STR-маркерів східних слов'ян (Кравченко С.А. и др., 2002), а також гаплогруп Y-хромосоми в східних українців (Харьков В.Н. и др., 2004), у зв’язку із цим набувають своєї актуальності дослідження мтДНК, спрямовані на пошук генетичних компонентів, що складають сучасний генофонд українців, які мешкають на території України.

Одним з важливих аспектів дослідження мітохондріального геному є вивчення впливу популяційних поліморфізмів (генетичний фон) на експресію патогенних мутацій та прояв мітохондріальної хвороби (Wallace D., 2005). Установлено, що спадкова хвороба Лебера, яка відрізняється надзвичайно широким спектром мутацій мтДНК, набагато частіше виявляється на тлі гаплогрупи J (Torronі A. et. al., 1997; Wallace D.C. et. al., 1999). Виявлено позитивний зв'язок між наявністю поліморфізму субгаплогрупи Н1 і підвищеним ризиком розвитку ознак хвороб Альцгеймера й Паркінсона (Mіshmar D. et. al., 2003; Shoffner J.M. et. al., 1993; Torronі A. et. al., 1994). Тому молекулярний аналіз нейтральних і слабко патогенних мутацій мтДНК, які послідовно накопичуються в материнських філогенетичних лініях, набуває першорядного значення.

У Харківському спеціалізованому медико-генетичному Центрі (ХСМГЦ) проблема мітохондріальних захворювань вивчається з 1992 року, що створило підґрунтя для проведення перших досліджень мітохондріального геному в Україні. Визначення популяційних характеристик поліморфізму ГВС І (гіперваріабельний сегмент І) контрольного регіону мтДНК у поєднанні з рестрикційним і філогенетичним аналізом індивідуальних геномів мтДНК пробандів з високим ризиком мітохондріальної патології представляється єдиним обґрунтованим підходом для ефективної інтеграції параметрів мітохондріальних гаплотипів у практику прогнозування, діагностики й адекватного лікування мітохондріальних хвороб.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана відповідно до плану наукових досліджень кафедри медичної генетики і ультразвукової діагностики Харківської медичної академії післядипломної освіти (ХМАПО) і кафедри медичної генетики Харківського державного медичного університету (ХДМУ) ("Розробка нових напівспецифічних методів первинної профілактики природженої та спадкової патології" № 0102U001873, "Напрямки сучасної діагностики, патогенетичної терапії і трьохрівневої профілактики спадкової патології" № 0106U001640); у рамках міжнародних проектів "Етногеноміка народів Східної Європи: виявлення гаплотипів мітохондріальної ДНК і Y-хромосоми в популяціях України та їх аналіз методом медіанних мереж", "Всебічний аналіз епідеміології і механізмів експресії мітохондріальних захворювань у слов'янських популяціях східної України". У рамках зазначених тем автором проведені молекулярно-генетичні дослідження зразків мтДНК в українській популяції, аналіз поліморфізмів контрольного та кодуючого регіонів мтДНК у пацієнтів у контексті їх можливого впливу на клінічні прояви захворювання, філогенетичний аналіз мітохондріальних ліній, статистична обробка даних.

Мета і задачі дослідження. Визначити мітохондріальні гаплотипи населення України для оцінки різноманіття й ступеня спорідненості популяцій та впливу генетичного фону на прояв мітохондріальних захворювань.

Виходячи із загальної мети роботи, були поставлені такі завдання:

1. Визначити поліморфізм нуклеотидних послідовностей ГВС І контрольного регіону мтДНК та розрахувати показники генетичної різноманітності в популяційній вибірці й вибірці пацієнтів із клінічно встановленою мітохондріальною патологією.

2. Визначити поліморфізм кодуючого регіону мтДНК у вибірці пацієнтів із клінічно встановленою мітохондріальною патологією.

3. Розрахувати частоти гаплотипів мтДНК.

4. Провести філогенетичний аналіз гаплотипів мтДНК популяційної вибірки в порівнянні з популяціями Європи для оцінки їх різноманіття й ступеня спорідненості.

5. Провести філогенетичний аналіз гаплотипів мтДНК у вибірці пацієнтів для оцінки впливу популяційних поліморфізмів на прояв мітохондріальних захворювань.

Об'єкт дослідження - пацієнти з клінічно встановленою мітохондріальною патологією, популяційна вибірка.

Предмет дослідження - поліморфізм контрольного та кодуючого регіонів мтДНК, гаплотипи мтДНК.

Методи дослідження - молекулярно-генетичні (ПЛР, секвенування, ПДРФ); філогеографічний і філогенетичний аналіз; статистичний аналіз.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше охарактеризовано структуру мітохондріального генофонду населення України за даними поліморфізму нуклеотидних послідовностей ГВС І контрольного регіону й кодуючої області мтДНК. Розраховано показники генетичного різноманіття мтДНК, визначено частоти гаплогруп і філогенетичні відносини гаплотипів мтДНК у популяційній вибірці та вибірці пацієнтів з клінічно встановленою мітохондріальною патологією.

Отримано детальну характеристику мітохондріальних маркерів у сучасній українській популяції з реконструкцією еволюційних процесів у контексті слов'янських народів та популяцій Європи.

Оцінено вплив популяційних поліморфізмів. У вибірці пацієнтів визначені додаткові поліморфізми (генетичний фон) у гаплогрупах U5, Т та Х, які в поєднанні з їх основними мотивами можуть відігравати певну роль у прояві мітохондріальних захворюваннь.

Результати є першими систематизованими даними з етногенезу населення України, отриманими на підставі вивчення поліморфізму ГВС І контрольного регіону й кодуючої області мтДНК, які доводять існування генетичних особливостей мтДНК у сучасних українських популяціях і обгрунтовують потребу їх врахування для ефективного прогнозування, діагностики й профілактики моногенної та мультифакторної патології, асоційованої з функціональною недостатністю мітохондрій.

Практичне значення отриманих результатів. До алгоритму обстеження пацієнтів з мітохондріальною патологією у якості важливого діагностичного елементу включений скринінг поліморфних варіантів мтДНК на гаплогрупи U5, T та X. Створена база даних, яка містить повну клінічну й молекулярно-генетичну інформацію щодо пацієнтів з мітохондріальною патологією.

Молекулярно-генетична характеристика населення України за даними поліморфізму ГВС І контрольного регіону і кодуючої області мтДНК є вагомим внеском у знання про етногенез східнослов'янських популяцій і особливостей генофондів населення Європи та Азії, а отже, може бути використана в антропологічних, археологічних та етнографічних дослідженнях з даної проблеми. Результати аналізу поліморфізму мтДНК у вибірці українців можуть бути основою для створення референтної бази даних при проведенні криміналістичних досліджень на основі типування мтДНК на території України.

Результати дослідження впроваджені в практику ХСМГЦ і відділення нейрогенетики Інституту неврології, психіатрії і наркології АМНУ, що підтверджено відповідними актами. Результати включені в методичні рекомендації, навчальні посібники, підручник "Медична генетика", які використовуються в навчальному процесі для проведення лекцій і практичних занять із студентами ХДМУ, лікарями ХМАПО, у просвітницьких програмах для населення.

Особистий внесок здобувача. Автор брала особисту участь у проведенні експериментальної частини дисертаційної роботи, філогеографічного й філогенетичного аналізу гаплотипів мтДНК, самостійно проводила статистичну обробку даних, аналіз отриманих результатів та їх узагальнення, співставлення з даними літератури. Автор брала участь у заборі біологічних зразків.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень, які включені в роботу, були представлені: на конференції з геному людини (Human Genome meetіng, 2001, Единбург); І робочій нараді із застосування інформаційних технологій в проблемах біорізноманіття й динаміки екосистем у Північній Євразії (BDENE: WІTA, Новосибірськ, 2001); І Міжнародній студентській конференції з медичної генетики (Харків, 2001); 8 Європейському Конгресі з вроджених порушень метаболізму AEWІEM (Литва, 2002); конференції молодих вчених ХДМУ "Медицина третього тисячоліття" (Харків, 2002, 2007); ІІІ з'їзді медичних генетиків в Україні (Львів, 2002); 7 школі - конференції молодих вчених "Біологія - наука 21 століття" (Пущино, 2003); І та ІІ Українському конгресах із клінічної генетики з міжнародною участю "Метаболічні спадкові захворювання" (Харків, 2003, 2005); 56 щорічній конференції з генетики людини ASHG (США, 2006); міжнародній конференції з медичної генетики "Плід як частина родини" (Харків, 2007); V Європейському Конгресі з неонатального скринінгу ІSNS (Рейк'явік, Ісландія, 2007); науково-практичній конференції з міжнародною участю "Актуальні питання медичної генетики" (Київ, 2007); V Конференції з молекулярної антропології ІSABS (Сплит, Хорватія, 2007). Результати щодо дослідження мінливості мтДНК української популяції увійшли складовою частиною в цикл наукових праць "Мітохондріальні хвороби: проблеми діагностики, лікування та профілактики", що був визнаний гідним Премії Президента України для молодих вчених у галузі науки й техніки 2003 року.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 27 праць: 10 статей, з них 4 – у виданнях, рекомендованих ВАК України, 6 – у наукових спеціалізованих журналах; 1 патент, 16 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 132 сторінках комп’ютерного друку й складається зі вступу, огляду літератури, розділу "Матеріали й методи дослідження", 3 розділів власних досліджень та їх обговорення, висновків, заключення, практичних рекомендацій, переліку використаних джерел літератури, що налічує 131 посилання. Текст дисертації ілюстрований 13 таблицями та 10 рисунками.

ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Для визначення популяційних особливостей поліморфізму мтДНК використано зразки периферійної крові від неспоріднених осіб - етнічних українців, які мешкають на території України. Загальна вибірка склала 239 індивідів, з них 90 були мешканцями м. Харкова (контрольна група, яка була використана для порівняльного аналізу з вибіркою пацієнтів), 149 походили з різних міст і областей України: Луганськ (24), Донецьк (31), Миколаїв (2), Одеса (1), Херсон (2), Запоріжжя (4), Крим (14), Рівно (4), Тернопіль (1), Львів (6), Чернівці (2), Івано-Франківськ (1), Хмельницький (1), Закарпаття (1), Житомир (4), Київ (6), Чернігів (3), Суми (7), Вінниця (3), Черкаси (3), Кіровоград (1), Полтава (10), Дніпропетровськ (18). Молекулярно-генетичні дослідження популяційних зразків проводилися на базі Естонського Біоцентру (м.Тарту).

Матеріалом для дослідження поліморфізму індивідуальних геномів мтДНК були зразки периферійної крові 50 пацієнтів (клінічно гетерогенна група) з м.Харкова, які перебувають на обліку в ХСМГЦ з клінічним діагнозом - мітохондріальна хвороба. Діагноз був встановлений на підставі клініко-генетичних, клініко-генеалогічних, сомато-генетичних досліджень, проведених співробітниками кафедри медичної генетики ХДМУ – к.мед.н., доц. Ю.Б.Гречаніною, к.мед.н., доц. О.П.Здибською, завідувачем відділення дитячої психоневрології ХСМГЦ Н.П.Федосєєвою. Діагноз підтверджений чл.-кор.АМНУ, д.мед.н., професором О.Я.Гречаніною. Молекулярно-генетичні обстеження пацієнтів виконані к.б.н. С.І.Жадановим (Університет Пенсильванії, м. Філадельфія).

Дослідження поліморфізму мтДНК проводилось у декілька етапів.

1. Виділення ДНК із зразків крові з використанням методів фенол-хлороформної екстракції (Sambrook J. еt. al., 1989) і сольової преципітації, згідно інструкції фірми-виробника.

2. Реакція ампліфікації ГВС І мтДНК за допомогою методу ПЛР на ампліфікаторі “MyCycler” (“Biorad”). Оцінку продуктів здійснювали за допомогою електрофорезу в 2% агарозному гелі.

3. Нуклеотидні послідовності ГВС І контрольного регіону й кодуючої області мтДНК визначали за допомогою секвенування на автоматичному секвенаторі ABІ 3730 з використанням набору Bіg Dye Termіnator v3.1 cycle sequencіng Kіt (Applіed Bіosystems). Продукти ПЛР для проведення сиквенсової реакції очищували за допомогою "QІAEX ІІ" (Qіagen) (1/9- Exonuclease І/SAP). Розподіл продуктів реакції проводився з використанням електрофорезу в 4.75% поліакріламідному гелі. Для вирівнювання нуклеотидних послідовностей і детекції нуклеотидних замін використовувалася програма "Sequence Navіgator" (Applіed Bіosystems).

4. За допомогою рестрикційного аналізу (метод ПДРФ) визначали гаплогрупи відповідно до класифікації гаплотипів мтДНК (Macaulay V.A. et.al., 1999b). Використовували наступні рестрикційні ферменти: AluI, Nla ІІІ, Hіnf І, BstO І (MVA І), Acc І, Bst І, Hae ІІІ, BSU RІ, Ava ІІ, Tas І, MSE І (TRU ІІ), Hae ІІІ. Оцінку продуктів рестрикції проводили в 2% - 3% агарозному гелі.

Будову медіанних мереж здійснювали з використанням алгоритму Reduced Medіan за допомогою програми Network 3.1.1.1. (Bandelt H.-J. et.al., 1995). Для оцінки генетичної різноманітності досліджуваних вибірок використовували пакет статистичних програм для популяційної генетики Arlequіn ver 3.01 (), що включає показники молекулярного різноманіття нуклеотидних послідовностей (D і ир), тест на селективну нейтральність (Tajіma's neutralіty test, D). Для порівняльного аналізу використовувалась інформація про нуклеотидні послідовності ГВС І контрольного регіону й рестрикційний поліморфізм кодуючого регіону мтДНК в інших європейських та азійських популяціях (Кушнеревич Е.И. и др., 2007; Malyarchuk B. et. al., 2004; Rіchards M. et. al.,2000).

Результати досліджень та їх обговорення.

Аналіз поліморфізму нуклеотидних послідовностей ГВС І мтДНК у популяційній вибірці українців з визначенням параметрів генетичного різноманіття. Виявлено 102 поліморфні позиції (91 транзиція, 11 трансверсій). Виявлені транзиції представлені з перевагою піримідинових замін (С>Т, Т>С) над пуриновими (А>G, G>A) у співвідношенні 69:22. Визначені найбільш варіабельні поліморфні позиції мтДНК - 16093, 16189, 16311 і 16362. Виявлено 153 гаплотипів мтДНК (64.0% від загальної кількості індивідів). Носії унікальних гаплотипів склали 7.1%. Найбільш частий гаплотип (10.0%) відповідає Cambridge reference sequence (CRS) (Anderson S. et. al., 1981).

Для аналізу структури популяції розрахували показники генетичного різноманіття на підставі нуклеотидних послідовностей ГВС І мтДНК, які склали D=0.992±0.0019 і ир=5.19, відповідно. Рівень генетичного різноманіття ГВС І мтДНК у популяції українців (D=0.992) виявився вищим ніж в європейських популяціях: Данії (D=0.934), Іспанії (баскі) (D=0.936), Португалії (D=0.934), Білорусі (D=0.937), Естонії (D=0.989), Швеції (D=0.988), Італії (Альпи) (D=0.993), Туреччини (D=0.988), і наближений за значеннями до азійських популяцій Монголії (D=0.993), Близького Сходу і Середньої Азії (D=0.995) (Belyaeva O. et. al., 2003; Sіmonі L. et. al., 2000). Отримані результати вказують на те, що українська популяція є найбільш генетично гетерогенною групою, що відповідає даним про її складне багатоетапне формування. Співставлення отриманих результатів з даними етногеографії та археології висвітлює багатокомпонентну етнічну структуру сучасної української популяції, у складі якої виявляються фінно-угорський, кельтсько-германський та іранський субстрати (Алексеева Т.И., 1973; Алексеева Т.И., Алексеев В.П., 1989; Седов В.В., 2002, 2003).

Для визначення ступеня генетичної подібності між групами східних, південних і західних слов'ян проаналізовано поширеність загальних і рідкісних типів мтДНК за даними літератури й власних досліджень. Із 507 типів ГВС І (64 в росіян, 56 у білорусів, 87 у боснійців, 66 у словенців, 234 у поляків), проаналізованих у східних (Belyaeva O. et. al., 2003; Malyarchuk B., Derenko M., 2001; Orekhov V. et. al., 1999), південних (Malyarchuk B. et. al., 2003) і західних слов'ян (Malyarchuk B. et. al., 2002), 47 типів зустрічалися в усіх вибірках, у тому числі й у популяційній вибірці українців. 5 з 47 загальних типів ГВС І (16304, 16311, 16298 і 16069-16126, включно CRS), які визначають відповідні гаплогрупи Н, V і J, виявились ідентичними в східних, південних і західних слов'ян і найпоширенішими в європейських популяціях.

Частка індивідів серед українців, що мають спільні типи ГВС І з росіянами, склала 10.0%, білорусами – 4.2%, боснійцями – 15.5, словенцями – 11.3%. Поряд із цим, у популяційній вибірці українців виявлені типи, що визначають гаплогрупи U4 і U5 (маркери фіно-угорського компоненту). Також виявлений одиничний тип ГВС І гаплогрупи Z (азійська лінія) спільний з росіянами.

У вибірках південних слов'ян широко представлений спектр спільних з вибіркою українців типів ГВС І, що визначають гаплогрупи Н, pre-V, U3, U4, U5, К, J, Т, I, W. При цьому, гаплогрупа U3, представлена, головним чином, у південній Європі та на Близькому Сході й не виявлена в багатьох популяціях центральної та північної Європи (Rіchards M. et. al., 1996, 2000).

Частка індивідів в українській популяції, що мають спільні типи ГВС І із західними слов'янами, склала 37.6%. Cлід відзначити присутність в євроспецифічній структурі типів ГВС І (Н, pV, V, U3, U4, U5, U8, К, J, Т, І, W) одиничного типу гаплогрупи U8 (16146-16342), яка не зустрілась у південних слов'ян, росіян та білорусів. Означений рідкісний гаплотип мтДНК відзначається найбільш давньою філогенією в басків і, як припускають, привнесений їхніми предками в Європу із Західної Азії (Gonzalez A. M. et. al., 2006).

Отже, результати проведеного аналізу продемонстрували найбільшу подібність структури типів ГВС І в українців до західних і південних слов'ян, а серед східних слов'ян – до росіян. З погляду оцінки генетичної позиції українців у контексті слов'янських народів, отримані дані, які засвідчують їх генетичну подібність і вказують на єдність походження, тоді як ступінь розходжень генофондів імовірно обумовлений інтенсивністю історичної взаємодії із сусідніми неслов’янськими популяціями (Седов В.В., 2003).

З огляду на істотну роль процесів метисації та асиміляції як основного фактора у формуванні антропологічних особливостей різних груп слов'ян і враховуючи наявність фіно-угорського й кельтсько-германського компонентів у мітохондріальному генофонді українців, проведено порівняльний аналіз частот відповідних типів ГВС І мтДНК за власними даними й даними літератури (Malyarchuk B.A. et. al., 2002). У загальній вибірці українців, фінів (192) і германців (506 – германомовні популяції південної, західної, північно-західної Німеччини й Австрії) виявлено 7 спільних типів ГВС І з 26 досліджених, що зокрема визначають гаплогрупи Н, рre-V, К, U4, Т та I. При порівняльному аналізі вибірок українців і фінів спільних типів ГВС І виявилось 9 (гаплогрупи Н, рV, К, U4, J, Т, І), а при порівнянні з вибіркою германців – 23 (гаплогрупи Н, рV, К, U2, U4, U5, J, Т, І). Незважаючи на те, що в багатьох європейських популяціях зустрічаються практично всі типи мтДНК, вдалося визначити типи ГВС І, які розділяють дані вибірки. Для вибірки українців це виявився Н-субкластер з мотивами у ГВС І 16189-16356-16362 (1.2%), 16304 і 16311 (2.0% і 2.5% відповідно). Подібні типи ГВС І поширені в германців, із частотою 1.1%, 1.1% і 0.9% відповідно, у фінів частота реєстрації ГВС І 16304 і 16311 складає 1.0% (Malyarchuk B.A. et. al., 2002). Особливою знахідкою виявилася різниця в частоті типу ГВС І 16356, який визначає гаплогрупу U4: досить високий відсоток у вибірці українців (1.6%) порівняно з вибірками фінів і германців (0.5% і 0.4% відповідно) вказує на його ймовірне походження із центрально-східної Європи або поширення в східну Європу шляхом міграцій слов'ян. Відносно високою частотою в українців відзначилася гаплогрупа U5 з мотивами 16192-16256-16270 і 16256-16270-16399 (1.2% і 1.6%, відповідно). Установлено високий відсоток гаплогрупи J з мотивами 16069-16126 в українців порівняно з германцями (5.0% і 0.2% відповідно), що за відсутності реєстрації у фінів, імовірно пояснюється близькосхідною міграцією в Європу (Rіchards M. et. al., 1996). Слід зазначити, що параметри структури поліморфізму ГВС І мтДНК у популяційній вибірці українців добре збігаються з результатами досліджень поліморфізму Y-хромосоми (Харьков В.Н. и др., 2004). Виявлена багатокомпонентна структура, яка складається з гаплогруп E, F (включаючи G і I), J, N3, P, R1a1. За частотою даних гаплогруп також показано подібність з фіно-угорськими і балто-слов’янськими популяціями.

Результати, які отримано, дозволяють зробити висновок про те, що східні слов'яни і, зокрема українці, сформувалися в результаті взаємодії слов'янських груп центральної Європи й поширилися далі шляхом міграцій на схід.

Аналіз поліморфізму нуклеотидних послідовностей ГВС І мтДНК у вибірці хворих із клінічно встановленою мітохондріальною патологією. Потреба дослідження поліморфізмів мтДНК у контингенті пацієнтів із клінічно встановленою мітохондріальною патологією є обґрунтована з огляду на високу ймовірність впливу еволюційно нейтральних нуклеотидних замін на пенетрантність патогенних мутацій та експресію мітохондріальних захворювань (Torronі A. et. al., 1997; Wallace D.C. et. al., 1999). Для перевірки даного припущення проводилося дослідження поліморфізму індивідуальних геномів мтДНК у хворих з клініко-лабораторними ознаками мітохондріальної патології.

У вибірці пацієнтів (N=50) виявлено 55 поліморфних позицій (51 транзиція, 4 трансверсії). Транзиції характеризувалися перевагою піримідинових замін (С>Т, Т>С) над пуриновими (А>G, G>A) у відсотковому співвідношенні: C – 40.73%, T – 27.90%, A – 23.05%, G – 8.32%. Визначені найбільш варіабельні позиції ГВС І мтДНК – 16189 і 16294. Результати дослідження поліморфних позицій, які отримали, узгоджуються з даними (Малярчук Б.А., Деренко М.В., 2001), які пов’язують притаманну для них нестабільність з підвищеною швидкістю зворотних мутацій у сусідніх нуклеотидних позиціях, що у свою чергу обумовлює високу частоту спорадичних випадків мітохондріальних хвороб (Иллариошкин С.Н. и др., 2002).

Показники генетичної різноманітності у вибірці пацієнтів. При дослідженні 50 пацієнтів виявлено 36 гаплотипів мтДНК (72% від загальної кількості індивідів). Носії унікальних гаплотипів склали 60.0%. Найбільш частий гаплотип (14.0%) відповідав CRS (Anderson S. et. al., 1981). Показники генетичної різноманітності дослідженої вибірки склали D=0.990±0.007 і ир=6.13, відповідно.

Проведено порівняльний аналіз параметрів мтДНК у вибірках пацієнтів та контрольної групи (90 індивідів з популяційної вибірки). У контрольній вибірці виявлено 62 гаплотипи мтДНК (68.0% від загальної кількості індивідів). Відсоток носіїв унікальних гаплотипів дорівнював 56.6%. Найбільш частий гаплотип (11.0%) відповідав CRS (Anderson S. et. al., 1981). Індекси генетичної різноманітності склали D=0.990±0.004 і ир=5.18, відповідно, а отже співпадали з результатами дослідження пацієнтів з мітохондріальною патологією, що належать до даної популяції. Отримані параметри структури мтДНК у вибірках пацієнтів і контролю свідчать про високий рівень генетичного різноманіття в дослідженій українській популяції. Для європейських популяцій дані показники є значно нижчими (D=0.96, ир=3.87) (Rіchards M. et. al., 1996; Sіmonі L. et. al., 2000).

З метою поглиблення уявлень про ступінь генетичної мінливості й нейтральності поліморфізмів мтДНК за показниками їх співвідношення проведено порівняльний аналіз показників генетичної різноманітності з використанням Таджима-тесту (Tajima's D) (Tajima, 1989a, ). Отримано негативні значення як для вибірки пацієнтів (D = - 1.777), так і для контрольної групи (D = - 2.006). Незважаючи на приналежність пацієнтів і контролю до однієї популяції, показники у вибірці пацієнтів демонстрували подібність до популяції італійців (D = - 1.771) і баварців (D = - 1.783), а в контрольній вибірці – до популяції тосканців (D = - 2.025), мешканців Сардинії (D = - 2.035) і албанців (D = - 2.031) (Belledі M. et. al., 2000). Виявлені відмінності у вибірках пацієнтів і контролю можуть свідчити про високий рівень генетичної гетерогенності мітохондріопатій у дослідженій українській популяції. Однак, це припущення вимагає спеціальної перевірки.

Визначення поліморфізму кодуючого регіону мтДНК у вибірці пацієнтів. З огляду на значний поліморфізм гіперваріабельних позицій мтДНК (Малярчук Б.А., 1995; Малярчук Б.А., Деренко М.В., 2001) та високу ймовірність його модифікуючого впливу на клінічний перебіг мітохондріопатій і характер поліорганних уражень (Гречанина Ю.Б., 2003), проведено секвенаційний аналіз генів тРНК lys і тРНК leu, розташованих у кодуючому регіоні мтДНК. Мутації в цих генах визнані як основна причина цілого ряду важких нейром’язових захворювань (Shoffner J.M., Wallace D.C., 1994). Дві мутації з дефектом в І комплексі дихального ланцюга, які, зустрічаються найчастіше: MELAS3243G і MERRF8344G (Chіnnery P.F. et. al., 1998; Wallace D.C. et. al., 1988), в обстеженій вибірці не були знайдені. Поряд із цим, у генах тРНК lys і тРНК leu виявлені чисельні поліморфізми: 21 гомоплазмічна позиція, з якої 13 були синонімічні й 8 несинонімічні (3505A/G Thr>ala, 8448T/C Мet>thr, 8472C/T Рro>leu2, 8584G/A Ala>thr, 8701A/G Thr>ala, 8794C/T His>tyr, 8836A/G Мet>val, 8860G Thr>ala).

У гені тРНК lys виявлені додаткові поліморфізми, притаманні для певного типу ГВС І: для групи Н - 8448T/C, U - 8337T/C, J - 8018T/C, Т - 8697G/A, W - 8614T/C, 8610T/C, 8251G/A, 8994G/A, Х - 8701A/G, N1b - 8251G/A, N1а - 8164C/T, А - 8856G/A, С - 8584G/A. Отримані результати співпадають з даними (Finnila S. et.al., 2001; Herrnstadt C. et.al., 2002).

В індивідів з типами ГВС І, приналежними до гаплогрупи U та її субкластерів, у гені тРНКleu виявлено найбільшу кількість випадків поліморфізму 3197T/C, який для цієї гаплогрупи вважається предковим (Fіnnіla S. et. al., 2001). Він не виявлявся в жодному з інших типів ГВС І, за виключенням типу, що визначає гаплогрупу Х. Інші поліморфізми в гені тРНК leu були виявлені в типах ГВС І, які визначають гаплогрупи Н – 3705G/A, J – 3624A/G, Х – 3594C/T, N1а – 3336T/C, С – 3552T/A.

Зважаючи на дані щодо високого рівня мутаційних замін, які виникали в процесі кліматичної адаптації за мірою географічного розповсюдження мітохондріальних ліній (для європейських гаплогруп: Н – 0.48, J – 0.66, І,W,X – 0.63, Т – 0.31) (Wallace D., 2005), проведено вибіркове секвенування кодуючого регіону мтДНК у трьох пацієнтів з типами ГВС І, які визначають гаплогрупи Н, Т і Х. У пацієнта з гаплогрупою Н (16304G) виявлено поліморфізми 8860G, 15326A/G і знайдено мутацію 14553С/Т (Val>ile) у слабкоконсервативній ділянці комплексу ND6, роль якої до кінця не визначена. У пацієнта з гаплогрупою Т (16126-16209-16294-16296) виявлено широкий спектр популяційних поліморфізмів (Fіnnіla S. et. al., 2001): 1888G/A, 8697G/A, 8860G, 11251A/G, 11719G/A, 11812A/G, 14766C/T, 14905G/A, 15326A/G, 15452C/A, 15607A/G, 15928G/A. У пацієнта з гаплогрупою Х (16126-16189A-16223-16278) виявлено поліморфізми 14470T/C, 1719G/A й знайдено нову мутацію в еволюційно консервативній ділянці комплексу ND5 12706C (Phe>leu). Мутацію не знайдено в тканинах матері пробанда, але виявлено в тканинах пацієнта в стані гетероплазмії (мутаційний поріг ~50 %) (Zhadanov S.I. et.al., 2007), що може свідчити про ймовірність виникнення мутації 12706C de novo в процесі гаметогенезу матері пробанда. Означена мутація є частою генетичною причиною нейродегенеративних розладів з пізньою маніфестацією, таких як хвороба Паркінсона; а поряд із цим асоціюється з важкими неврологічними станами в новонароджених і дітей першого року життя, які найчастіше клінічно проявляються у вигляді синдрому Лі (Жаданов С.И. и др., 2006; Zhadanov S.І. et. al., 2007).

Результати, які отримали, дозволяють припустити вплив популяційного генетичного фону на інтенсивність мутаційних процесів і фенотипову експресію захворювання.

Порівняльний аналіз частоти та структури гаплотипів мтДНК у популяційній вибірці, групі пацієнтів з мітохондріальною патологією та контролі. З метою оцінки впливу генетичного фону на прояв мітохондріальних захворювань в українській популяції проведені розрахунки частот мітохондріальних гаплотипів.

Переважна більшість (95.6%) гаплогруп мтДНК у популяції українців відповідала європеоїдному компоненту, на що вказувала присутність гаплогруп: H (33.5%), pre-V (2.9%), V (5.4%), HV (3.7%), J (11.7%), T (6.7%), U (20.9%), K (2.9%), І (2.1%), W (2.1%), X (2.5%) та N (1.2%). Із частотою 2.0% знайдені одиничні типи мтДНК із числа гаплогруп, що притаманні азійським популяціям. Найбільш репрезентативними в мітохондріальному генофонді українців виявилися гаплогрупи H, U, J, T (72.8%) із широким спектром підтипів гаплогрупи U: U2 (1.7%), U3 (2.5%), U4 (3.7%), U5 (10.8%), U7 (0.4%), U8 (0.4%).

Контрольна вибірка індивідів, підібрана для визначення особливостей розподілу гаплогруп мтДНК у контингенті пацієнтів з мітохондріальною патологією, на загал відповідала популяційним параметрам, про що свідчили аналогічний спектр і частоти основних гаплогруп мтДНК: H – 23.0% (33.5% у популяції), pre-V – 3.3% (2.9%), V – 6.6% (5.4%), HV – 4.4% (3.7%), J – 13.3% (11.7%), T – 7.7% (6.7%), U – 20.0% (20.9%), K – 3.3% (2.9%), І – 1.1% (2.1%), W – 2.2% (2.1%) та X – 2.2% (2.5%). Гаплогрупи H, U, J, T були найбільш репрезентативно представлені й у контролі, й популяції: 64,4% та 72.8% відповідно.

Результати дослідження контингенту пацієнтів продемонстрували наявність 9 основних євроспецифічних гаплогруп: H – 24.0% (23.0% у контролі), pre-V – 2.0% (3.3%), V – 2.0% (6.6%), J – 12.0% (13.3%), T – 16.0% (7.7%), U – 18.0% (20.0%), І – 2.0% (1.1%), W – 2.0% (2.2%) та X – 8.0% (2.2%), які зустрічалися із сумарною частотою 86.0% (79,4% у контролі). Частка азійських ліній (гаплогрупи A і C) склала 4.0% (2.0% у популяції, 0.0% у контролі). Найбільш поширеними виявилися гаплогрупи H, U, J, T: 70.0% при 64,4% у контролі. Мінорні європейські гаплогрупи N1b і N1а зареєстровані із частотами 6.0% і 4.0%, відповідно (1.1% і 0.0% у контролі).

У вибірці пацієнтів не виявлено гаплогрупи HV, U2, U4, U7 та К, які були наявні в контролі й на загал у популяції. З іншого боку, серед пацієнтів з більш високою частотою зустрічалися гаплогрупи: U5 – 14.0% (12.2% у контролі), Т – 16.0% (7,7% у контролі) та Х – 8.0% (2.2% у контролі). Основні мотиви (послідовність нуклеотидних замін, що визначають гаплогрупу) гаплогруп U5, Т і Х містять варіабельну позицію 16189. Позиція 16294, яка входить до основного мотиву гаплогрупи Т, також є найбільш варіабельною. Цей факт дозволяє припустити, що високий відсоток гаплогруп U5, Т і Х може бути обумовлений підвищеною варіабельністю даних позицій. Це узгоджується із сучасними уявленнями, що транзиції становлять третину від точкових мутацій, які спостерігаються при спадкових захворюваннях людини (Малярчук Б.А., 1995).

Філогенетичний аналіз гаплотипів у популяційній вибірці. Проведений аналіз дозволив одержати просторову структуру виявлених гаплотипів мтДНК у сучасних українських популяціях.

Мітохондріальний генофонд українців демонструє спільність і різноманітність мітотипового складу популяції. Представлено 11 основних європейських мітохондріальних гаплогруп - H, V, HV, J, T, U, K, I, W, X, N і 5 азійських - A, B, C, D і Z. Виявлено генетичну подібність із генофондами європейських популяцій, що є свідченням на користь спільності їх походження від єдиної давньоєвропейської популяції. Однак, істотна роль процесів асиміляції і метисації в етногенезі українців обумовлює наявність в їх генофонді спільних типів з германомовними (16294-16304-16311, 16294-16304, 16274-16304, 16304-16311) та фіно-угорськими популяціями (“саамський мотив” U5b1 16144-16189-16270). Результати, які отримано, добре узгоджуються з даними інших дослідників (Алексеева Т.И., 1973; Малярчук Б.А., 2001; Малярчук Б.А., Деренко М.В., 2001; Седов В.В., 2003; Malyarchuk B., Derenko M., 2001; Tambets K. et. al., 2004).

Філогенетичний аналіз гаплотипів у вибірці пацієнтів. Проведений аналіз дозволив виявити поліморфні позиції у ГВС І, що притаманні різним гаплогрупам мтДНК.

При цьому, в основних мотивах типів мтДНК у вибірці пацієнтів визначено різні комбінації популяційних поліморфізмів (субгаплогрупа U5 - 16192 і 16256 в поєднанні з 16270) і додаткові поліморфізми (гаплогрупа Т - 16193, 16239, 16243 і 16356, U5 – 16193, Х - 16126, 16192, 16294 і 16309), які не спостерігалися в популяційній вибірці та контролі. Це дозволило припустити, що дані варіанти поліморфізмів обумовлені підвищеною варіабельністю позицій 16189 і 16294, які є в основних мотивах вищевказаних гаплогруп. З огляду на дані (Малярчук Б.А., Деренко М.В., 2001) про можливий вплив гіперваріабельних позицій на інтенсивність мутаційних процесів у сусідніх позиціях, було припущено, що означені комбінації поліморфізмів, які складають генетичний фон, можуть відігравати певну роль у прояві мітохондріальних захворювань.

Таким чином, дослідження поліморфізму мтДНК у популяції українців дало можливість виявити геногеографічні особливості мітохондріальних захворювань, оцінити вплив генетичного фону на їх прояв і використовувати розподіл гаплотипів в якості діагностичної "матриці" при обстеженні пацієнтів з мітохондріальною патологією.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі проведена оцінка генетичної різноманітності й ступеню споріднення мітохондріальних гаплотипів населення України. Визначено поліморфізм індивідуальних геномів мтДНК пробандів із клінічно встановленою мітохондріальною патологією для оцінки впливу генетичного фону на прояв мітохондріальних захворювань у обстеженій популяції.

1. Визначено 102 поліморфних позиції ГВС I мтДНК у популяційній вибірці, серед яких виявилися найбільш варіабельними: 16093, 16189, 16311, 16362. У вибірці пацієнтів із клінічно встановленою мітохондріальною патологією визначено 55 поліморфних позиції з найбільш варіабельними – 16189 і 16294.

2. Розраховані показники генетичної різноманітності (D і ир) в обстежених вибірках, що склали 0.992±0.0019 і 5.19; 0.990±0.007 і 6.13, відповідно. Рівні показників свідчать про високу генетичну гетерогенність та присутність фіно-угорського й германського субстратів у сучасній популяції українців, що ймовірно обумовлена істотною роллю процесів метисації та асиміляції. Визначена подібність із генофондами західних та південних слов’ян, а серед східних слов’ян - з росіянами обумовлена спільністю їх походження.

3. Визначений поліморфізм у генах тРНКlys і тРНКleu кодуючого регіону мтДНК у вибірці пацієнтів із клінічно встановленою мітохондріальною патологією. Виявлена 21 гомоплазмічна позиція (13 синонімічних і 8 несинонімічних). Знайдені мутації в пацієнтів з типами ГВС I мтДНК, які визначають гаплогрупи Н (14553С/Т Val>ile ND6) і Х (12706C Phe>leu ND5). Результати, які отримали, дозволяють припустити вплив популяційного генетичного фону на інтенсивність мутаційних процесів і фенотипову експресію захворювання.

4. Розраховані частоти гаплотипів у популяційній вибірці, які вказують на наявність виразного європеоїдного компоненту, що був представлений відповідними гаплогрупами (H, pre-V, V, HV, J, T, U, K, I, W, X, N). Їх сумарна частота склала 95.6%. Найбільшу поширеність мають гаплогрупи H, U, J, T (72.8%). Також виявлені азійські гаплогрупи A, B, C, D і Z із частотою 2.0%.

5. Розрахунок частот гаплотипів у вибірці пацієнтів із клінічно встановленою мітохондріальною патологією продемонстрував наявність євроспецифічних гаплогруп: H, pre-V, V, J, T, U, I, W та X, сумарна частота яких склала 86.0%. Азійські гаплогрупи (А і C) виявлені із частотою 4.0%. Показана висока частота гаплогруп U5 (14.0%), Т (16.0%) і Х (8.0%) в досліджуваній вибірці, у порівнянні із контрольною, яка, найімовірніше, обумовлена гіперваріабельністю позицій 16189 і 16294, що утримуються в основних нуклеотидних мотивах даних гаплогруп.

6. Детальний філогенетичний аналіз гаплотипів у популяції українців продемонстрував подібність із генофондами європейських популяцій. Наявність спільних типів мтДНК із фіно-угорськими та германськими популяціями обумовлена істотною роллю процесів асиміляції і метисації в етногенезі українців.

7. Філогенетичний аналіз гаплотипів у вибірці пацієнтів виявив додаткові популяційні поліморфізми (генетичний фон) у гаплогрупах U5, Т та Х, які в поєднанні з їх основними мотивами, можуть відігравати певну роль у прояві мітохондріальних захворювань.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

З огляду на отримані результати, запропоновано долучити до алгоритму медико-генетичного консультування пацієнтів з мітохондріальною патологією проведення рестрикційного аналізу кодуючого регіону мтДНК (скринінг поліморфних сайтів) на відповідні гаплогрупи U5, T та X.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гусар В.А. Мінливість та поліморфізм мітохондріальної ДНК української популяції // Журнал АМН України. – 2006. – Т.12, №4. – С.739-749.

2. Жаданов С.И., Гречанина Е.Я., Гречанина Ю.Б., Гусар В.А., Федосеева Н.П., Шурр Т. Изучение митохондриальных заболеваний в Украине: случай мутации ND5 de novo, значение патогенетических механизмов генных дефектов мтДНК