МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ГОДОВАН ВЛАДЛЕНА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 547.419.5:577.164.15:616.36

ФАРМАКОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ

НОВИХ ПОХІДНИХ ГЕРМАНІЄВИХ СОЛЕЙ

ДИФОСФОНОВИХ КИСЛОТ З БІОЛІГАНДАМИ

14.03.05 — фармакологія

Дисертація

на здобуття наукового ступеня
доктора медичних наук

Одеса — 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Одеському державному медичному університеті
МОЗ Украї-ни.

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор, член-кореспондент АМН України, заслужений діяч науки і техніки Украї-ни КРЕСЮН Валентин Йосипович, Одеський
державний медичний університет МОЗ України,
м. Одеса, завідувач кафедри загальної та клінічної
фармакології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, академік АМН України ГОЛОВЕНКО Микола Якович, Фізико-хімічний інститут ім. О. В. Богатського НАН України,
м. Одеса, завідувач відділу фізико-хімічної фармакології

доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України БОБИРЬОВ Віктор Миколайович, Вищий державний навчальний заклад України
«Українська медична стоматологічна академія» МОЗ України, м. Полтава, завідувач кафедри експериментальної та клінічної фармакології з клінічною імунологією та алергологією

доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки
і техніки України ЛУК’ЯНЧУК Віктор Дмитрович, Луганський державний медичний університет МОЗ України, м. Луганськ, завідувач кафедри фармакології

Захист відбудеться «04» червня 2008 р. об 11.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 Одеського державного медичного університету (65082, м. Одеса, пров. Валіховський, 2).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Одеського державного ме-ди-чного університету (65082, м. Одеса, пров. Валіховський, 3).

Автореферат розісланий «28» квітня 2008 р.

В.о. вченого секретаря

спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01,

д. мед. н., професор К. Л. Сервецький

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сучасні досягнення біології та медицини незаперечно свідчать про те, що одним із провідних патогенетичних механізмів розвитку ба-гатьох захворювань є порушення морфофункціонального стану клітинних мем-бран Геннис Р. Б., 1997; Владимиров Ю. А., 2000; Болдырев А. А., 2001. З одного боку, це є детермінуючим фактором, а з другого — наслідком тих змін, які виникають в організмі. Доведена універсальність механізмів пошкодження мембран при різних патологічних станах диктує нагальну необхідність пошуку і створення лікарських засобів (ЛЗ) з мембрано-протекторною дією Постнов Ю. В. и соавт., 2000; Stanley W. C. et al., 2005.

Бурхливий розвиток германієорганічної хімії наприкінці ХХ і на початку ХХI століть, широке застосування сполук германію у промисловій індустрії та медицині стали поштовхом для вивчення властивостей цього металу не тільки як екологічно небезпечного чинника, але й як найважливішої ланки біогеоценозів Higuchi I. et al., 1989; Obara K. et al., 1991; Lukevics E. et al., 2005; Shim S.et al., 2007. Разом із тим, встановлено, що значна кількість германію міститься у соєвих бобах, часнику, пшениці, чаї тощо; чимало германію у ба-гатьох цілющих травах, таких як чага, алое, женьшень Asai K., 1980; GoodS., 1998; Massey Р. В., 2002. Доклінічні та клінічні випробування різних ор-ганічних і комплексних германієвмісних сполук показали, що вони позитивно впливають на організм, маючи різносторонні фармакодинамічні властивості, у тому числі протипухлинну, імуномодулюючу, противірусну, нейро-, кардіо-, гепатопротекторну, антигіпоксичну, детоксикаційну, мембра-нопротек-торну та ін. Hongo R., 1998; Кресюн В. И. и соавт., 2000; Воронков M. Г. и соавт., 2002; Lee J. H., et al., 2005; Бабенко М. Н. и соавт., 2005; Shim S. H. et al., 2007; Внукова М. О., 2007; Лук’янчук В. Д. та співавт., 2007.

Висока фармакологічна активність як метал-іона, так і ліганду у переважній більшості випадків виявляється саме у складі комплексних сполук, оскільки живий організм є злагоджено діючою полілігандною системою Акбаров А. Б. и соавт., 1993; Thiele D. J., 2003; Kelleher S. L. et al., 2005. Серед речовин із високими комплексоутворюючими властивостями одне з провідних місць займає оксіетилідендифосфонова кислота (ОЕДФ), яка, поряд із низькою токсичністю, має високу біологічну активність, а її препарати широко застосовуються у клінічній практиці як регулятори мінерального обміну, протипухлинні та противірусні засоби, антидоти при отруєнні токсичними і радіоактивними елементами тощо Кабачник М. И. и соавт., 1989, 1995; Сейфул-лина И. И., 1990; Алексеева Н. В. и соавт., 1998; Константинова М. М., 2002; Grison C. et al., 2006; Murad O. M. et al., 2007; Glorieux F. H., 2007. Важливим є й той факт, що сполукам германію й ОЕДФ притаманна мембраностабілізуюча дія, що реалізується як на рівні іонних каналів, так і фосфоліпідної компоненти клітинних мембран Лукевиц Э. Я. и соавт., 1989; van Voorst F. et al., 2000; Юрьева Э. А. и соавт., 2001; Мегдятов Р. С., 2002. У зв’язку з цим, цілеспрямованим синтезом було створено новий клас біологічно активних речовин (БАР) — германієві солі дифосфонових кислот (оксіетилідендифосфонатогерманати) з різними біолігандами: нікотиновою кислотою (НК) — нікогерм (або МІГУ-4); її активним метаболітом нікотинамідом (НА) — гермамід (або
МІГУ-5); мікроелементом магнієм — гермакорд (або МІГУ-6). Їх вибір для створення нових ЛЗ не випадковий. Істотний внесок у специфічну активність біокомплексів вносять такі чинники, як природа біометалів і біолігандів, тип і фізико-хімічні властивості комплексів, а головне, фізіологічний синергізм й антагонізм складових компонентів Burger К. et al., 2001; Thiele D. J., 2003; Головенко Н. Я., 2004, 2007. Тому як біоліганди було обрано природні для організму метаболіти, які забезпечують його нормальну життєдіяльність, тонко регулюють перебіг порушених процесів, втручаючись у біохімічні процеси на найвищому рівні — ферментів і коферментів, і добре відомі своїми фармакологічними ефектами Кукес В. Г. и соавт., 2001; Guyton J. R., 2007; Nagalski A. et al., 2007. На підставі вищевикладеного можна припустити, що у синтезованих комплексних германієвмісних похідних ОЕДФ наявна висока біологічна актив-ність, фармакологічному вивченню якої і присвячено дану роботу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Матеріали дисертаційної роботи є фрагментом НДР МОЗ України за темою «Комплексне експериментальне вивчення фармакологічної активнос-ті но-вих похідних германійвмісних сполук з біолігандами» (№ держреєстрації 0105U008878), яка виконується на кафедрі загальної та клінічної фармакології Одеського державного медичного університету (ОДМУ) спільно з вченими Одеського національ-ного університету ім. І. І. Мечникова МОН України (ОНУ) й Опольського університету (Поль-ща). Дисертант є відповідальним виконавцем цієї теми.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було з’ясування фармакологічних властивостей із встановленням механізмів дії та особливостей фармакокінетики нового класу БАР на основі похідних оксіетилідендифосфонатогерманатів із різними біолігандами.

Для досягнення зазначеної мети розв’язувалися такі задачі:

1. На підставі фізико-хімічних, токсикологічних і загальнофармакологічних досліджень створеного прицільним синтезом класу БАР дати трьом похідним оксіетилідендифосфонатогерманатів відповідні характеристики.

2. У скринінгових дослідженнях визначити вплив синтезованих БАР на стан серцево-судинної системи експериментальних тварин in vitro та in vivo, виявити найефективнішу сполуку та з’ясувати наявність у неї кардіопротектор-ної активності на моделі міокардіодистрофії.

3. Вивчити гепатопротекторні властивості синтезованих сполук на тлі експериментального ураження печінки.

4. На підставі вивчення порушення обміну ліпідів, ферментативної та неферментативної складових антирадикального захисту клітини, фосфоліпідної компоненти й активності маркерних ферментів мембран встановити механізми мембранопротекторної дії синтезованих сполук.

5. Розробити нові підходи до позамодельного аналізу фармакокінетики ліків і за їх допомогою, у порівняльному аспекті, встановити особливості розподілу та виведення цих БАР з організму експериментальних тварин.

6. Проаналізувати одержані результати та верифікувати провідні механізми фармакологічної активності похідних оксіетилідендифосфонатогерманатів із біолігандами.

Об’єкт дослідження: пошук, створення та доклінічне вивчення нових вітчизняних високоефективних і безпечних мембранопротекторів.

Предмет дослідження: встановлення фармакологічної активності й особливостей фармакокінетики нових оригінальних похідних оксіетилідендифосфонатогерманатів із метою створення високоефективних мембранопротекторних лікарських засобів.

Методи дослідження: фармакологічні, фармакокінетичні, біохімічні, біофізичні, морфогістохімічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Представлені дані щодо основ-них параметрів фармакопейної характеристики прицільно синтезованого класу БАР — трьох похідних оксіетилідендифосфонатогерманатів з біолігандами (ніко-герму, гермаміду, гермакорду). Вперше доведено їхню нешкідливість.
Ці спо-луки не мають кумулятивних, місцевоподразнювальних і алергізуючих
влас--тивостей.

Вперше in vitro та in vivo виявлено антигіпертензивний і протиаритмічний ефекти гермакорду. При цьому вперше встановлено, що його вазодилататорна дія має ендотелій-залежну природу, а протиаритмічна активність пов’язана з подовженням потенціалу дії за рахунок фази реполяризації та впливу на пейсмейкерну активність. За цими даними отримано 2 патенти України № 19965 від 15.01.07 р. «Магній-оксіетилідендифосфонатогерманат, який характеризується вазодилататорною дією» та № 20658 від 15.02.07 р. «Біологічно активна протиаритмічна речовина — «Гермакорд».

На моделі ізадринової міокардіодистрофії з фізичним навантаженням впер-ше встановлено, що гермакорд запобігає пошкодженню мембран мітохондрій кардіоміоцитів, тобто має виразний кардіопротекторний ефект, причому як при профілактичному, так і лікувальному введенні.

Вперше доведено, що вивчення нових БАР із передбачуваною мембрано-протекторною дією необхідно проводити на тлі галактозамінового ураження печінки. Вперше встановлено ефективність профілактично-лікувального введення цих сполук при галактозаміновому гепатиті, розкрито провідні патогенетичні механізми їхнього впливу на морфофункціональний стан мембран гепатоцитів та еритроцитів, їхню фосфоліпідну компоненту, перекисне окиснення ліпідів і антирадикальний захист, процеси цитолізу та холестазу, виживаність тварин. Найбільш виразний ефект спостерігався у нікогерму. Вперше виявлено антиексудативну та знеболювальну активність синтезованих сполук.

За допомогою вперше розроблених методів позакамерного аналізу фармакокінетичних параметрів встановлено особливості розподілу та виведення цих БАР з організму, які позитивно характеризують їхній фармакокінетичний профіль. Зіставлення фармакокінетики і фармакодинаміки цих сполук із компо-нен-тами їхнього синтезу доводить, що їхня активність пов’язана з дією молекули цілого комплексу. За результатами отримано 3 патенти України, у тому числі 2 — з міжнародною участю: № 19966 від 15.01.07 р. «Спосіб визначення пара-метрів розподілу лікарських засобів у крові, органах і тканинах організму»;
№ 25717 від 27.08.2007 р. «Cпосіб визначення параметрів процесів екскреції лі-кар-ських засобів з організму»; № 29084 від 10.01.2008 р. «Спосіб оцінки абсолютної доступності лікарських засобів до тканин організму».

Практичне значення одержаних результатів. Експериментально доведено можливість пошуку і створення нових високоефективних ЛЗ на основі германієвих солей дифосфонових кислот. На різних моделях патологічних станів вивчено провідні механізми дії принципово нових оригінальних сполук, що має важливе практичне значення, бо обґрунтовує доцільність практичного застосування нового вітчизняного класу БАР у ряду оксіетилідендифосфонато-германатів як безпечних і потенційно високоефективних мембранопротек-тор-них засобів для спрямованої корекції змін клітинних мембран у комплексному лікуванні різних захворювань серця та печінки. Для клінічних випробувань ре-комендовано гермакорд як кардіопротектор із високою антигіпертензивною та протиаритмічною активністю і нікогерм як потенційний ефективний і безпеч-ний гепатопротектор.

Розроблено нові способи визначення параметрів розподілу й екскреції ЛЗ шляхом позамодельного аналізу. Вони дозволяють мінімізувати кількість експериментальних тварин, підвищити точність і вірогідність фармакокінетичних досліджень, незалежно від властивостей і кількості периферичних відсіків (органів і тканин), що неможливо при застосуванні існуючих методів.

Результати роботи внесено у Реєстр галузевих нововведень 2008 р. (випуск № 28–29) та впроваджено у наукову роботу Інституту фармакології та токсикології АМН України, навчальний процес кафедр фармакології та клінічної фармакології Вінницького національного медичного університету ім. М. І. Пирогова, Донецького національного медичного університету ім. М. Горького, Луганського й Одеського державних медичних університетів, Дніпропетровської державної медичної академії, кафедри біотехнології і молекулярної біології Опольського університету (Польща).

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено патентно-інформаційний пошук, здійснено планування роботи, визначено мету і задачі дослідження, методичні підходи, опрацьовано моделі, згідно з якими виконано переважну частину експериментальних досліджень. Проведено статистичну обробку одержаних результатів, їх оформлення у вигляді таблиць і рисунків, проведено аналіз та узагальнення результатів, сформульовано висновки роботи, опубліковано й апробовано основні положення, написано та оформлено дисертаційну роботу*.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були оприлюднені на науково-практичній конференції «Вчені України — вітчизняній фармації» (Харків, 2000), VII Міжнародній науково-практичній конференції «Наука і освіта, 2004» (Дніпропетровськ, 2004), Х ювілейній і ХI міжнародних науково-практичних конференціях «Сучасні досягнення валеології та спортивної медицини» (Одеса, 2004, 2005), I з’їзді фізіологів СНД (Сочі, 2005), науковій конференції «IV читання ім. В. В. Підвисоцького» (Одеса, 2005), I Міжнародній науково-практичній конференції «Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів» (Тернопіль, 2006), XIV Російському національному конгресі «Человек и лекарство» (Москва, 2006), III Національному з’їзді фармакологів України «Фармакологія 2006 — крок в майбутнє» (Одеса, 2006), Всеукраїнській науково-практичній конференції «Сучасні методичні підходи до аналізу стану здоров’я» (Луганськ, 2007), республіканській науково-практичній конференції «Лікування та реабілітація у загальній практиці — сімейній медицині» (Одеса, 2007), підсумковій науково-практичній конференції «Здобутки клінічної та експериментальної медицини» (Тернопіль, 2007), III з’їзді фармакологів Росії «Фармакология — практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), науково-практичній конференції з міжнародною участю, присвяченій 70-річчю кафедри фармакології Вінницького національного медичного університету
ім. М. І. Пирогова «Актуальні проблеми фармакології» (Вінниця, 2007), VII Все-українській науково-практичній конференції з міжнародною участю «Клінічна фармація в Україні» (Харків, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 52 наукові праці, з них — 24 статті у профільних наукових журналах, рекомендованих ВАК України,
5 патентів України, 23 тези у міжнародних і вітчизняних виданнях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 452 сторінках комп’ютерного тексту. Вона складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, 4 розділів власних досліджень, аналізу й узагальнення результатів, висновків, списку використаної літератури. Роботу ілюстровано 92 таблицями, 79 рисунками. Бібліографія включає 550 джерел, у тому числі 248 вітчизняних та російськомовних і 302 іноземних.

* Автор висловлює глибоку вдячність за допомогу у синтезі та вивченні фізико-хімічних властивостей БАР колективу кафедри загальної хімії і полімерів ОНУ ім. І. І. Мечникова під керівництвом з. д. н. т., д. хім. н., проф. І. Й. Сейфуліної; у проведенні досліджень БАР in vitro колективу лабораторії експериментальної терапії ІФТ АМН України під керівництвом двічі лауреата Державної премії, проф. А. І. Соловйова; у розробці нових фармакокінетичних підходів — професорам Опольського університету (Польща) О. В. Жук, В. Г. Зіньковському.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Спрямований синтез нових БАР класу оксіетилідендифосфонатогерманатів здійснювали за методиками, розробленими на кафедрі загальної хімії і полімерів ОНУ ім. І. І. Мечникова під керівництвом з. д. н. т., проф. І. Й. Сейфуліної.

Фармакологічну активність трьох БАР вивчено на 185 білих нелінійних та лінії ICR мишах масою 18–20 г, 1310 щурах-самцях лінії Вістар молодого та статевозрілого віку масою 180–220 г, 15 безпородних кішках, 12 кролях породи шиншила, 19 морських свинках гладкошерстої породи масою 200–250 г віком 22–24 тижні. Досліди проводилися відповідно до вимог GLP, методичних рекомендацій ДФЦ МОЗ України Стефанов О. В., 2001 та комісії з біоетики ОДМУ (протокол № 52В від 04.01.2008 р.).

Гостра токсичність БАР вивчалася при внутрішньоочеревинному (в/о) та пероральному введенні, підгостра — протягом 28 діб при в/о їх введенні; субхронічна та хронічна — відповідно 3 і 6 міс при пероральному шляху їх застосування за загальноприйнятими методами Стефанов О. В., 2001. Дослідження кумулятивних властивостей проводили за методом Ю. С. Кагана і В. В. Станкевича (1964), а також вивчали місцевоподразнювальну Hayes A. W., 1989 та антигенну Алексеева О. Г., 1988 дію.

Дослідження аналгезуючої активності проводилося на моделі «оцтових
кор-чів» за методом R. L. Wood et al. (1941). Протизапальну активність вивчали на моделі карагенінового і зимозанового набряків, які викликали субплантарним введенням 1 % розчину карагеніну і 2 % суспензії зимозану відповідно Стефанов О. В., 2001. Вводили БАР тваринам внутрішньошлунково (в/ш) за
1 год до застосування флогогенів дозою 25 мг/кг маси (ЛД10 при в/ш прийомі).

Дослідження кардіовазотропної дії БАР in vitro виконано на ізольованих препаратах смужок папілярних м’язів міокарда морських свинок, а також груд-ного відділу аорти та ворітної вени щурів Pegram B. L., 1980; Блаттнер Р. и соавт., 1989; Soloviev А. et al., 2003. Вплив БАР на судинний тонус у гострому експерименті при їх одноразовому в/в уведенні дозами 1/10 ЛД50 вивчався протягом 4 год класичним кров’яним методом у кішок на тлі барбітуратового наркозу (етамінал-натрію, 30 мг/кг, в/о) Хилкин А. М. и соавт., 1979. Визначався діастолічний (ДАТ) і систолічний (САТ) артеріальний кров’яний тиск (АКТ). Вплив синтезованих сполук на АКТ також вивчали на моделі артеріальної гіпертензії (АГ), яку спричиняли застосуванням протягом 4 тижнів дієти з високим вмістом натрію хлориду Соколова Р. И. и соавт., 1977. Вимірювали АКТ сфігмографічним методом на хвостовій артерії. Вводили БАР в/о дозою 1/20 ЛД50. Оцінку протиаритмічної дії in vivo проведено на тлі аконітинової аритмії Серединская Н. Н., 1989. Реєстрували ЕКГ у II стандартному відведенні на
4-канальному електрокардіографі фірми "Simens". Уводили БАР в/о дозою 1/20 ЛД50 у двох режимах: за 30 хв до введення аконітину (профілактично) і через 30 хв після його застосування (лікувально).

На тлі моделі міокардіодистрофії, яку спричиняли підшкірним введенням протягом 7 діб ізадрину з розрахунку 100 мг/кг маси з наступним 7-денним фізичним навантаженням Стефанов О. В., 2001, вивчали вплив профілактичного та лікувального введення гермакорду дозами 1/10 і 1/20 ЛД50 на метаболізм міокарда. У мітохондріях визначали вміст аденілових нуклеотидів (АН) Jaworek D. et al., 1974; аденілатний заряд виражали у вигляді коефіцієнта Аткінсона Кресюн В. И., 1983. Інтенсивність поглинання кисню (О) мітохондріями серця щурів визначали манометричним методом з використанням апарата Варбурга Umbreit W. W. et al., 1972; Кресюн В. И., 1983. Убування неорганічного фосфору (Рн) у пробах визначали за методом E. L. Lowry, J. A. Lopez (1946) у модифікації В. Н. Скулачева (1962). За одержаними величинами розраховували ступінь спряження окиснення та фосфорилювання (коефіцієнт співвідношення Р:О). Про АТФ-азну активність мітохондрій серцевого м’яза судили за зростанням у середовищі інкубації Рн Lowry E. L., Lopez J. A., 1946. Для визначення активності Mg2+-АТФ-ази додавали 1 мМ уабаїну фірми "Sigma". Активність Na+, K+-АТФ-ази розраховували як різницю між активностями сумарної (Mg2+, Na+, K+-АТФ-ази) і Mg2+-АТФ-ази. Виділення мітохондрій та їх очищення проводили за методами Прохорова М. И., 1982.

Для вивчення гепатопротекторної дії БАР здійснено адекватний вибір моделі токсичного гепатиту. Гепатити відтворювались одноразовим в/ш уведенням ССl4 дозою 5 мл/кг маси тварин у вигляді 50 % масляного розчину Watanabe A. et al., 1976 і в/о застосуванням галактозаміну дозою 400 мг/кг у вигляді 20 % водного розчину Венгеровский А. И., Саратиков А. С., 1988. Вибір моделі був здійснений на підставі дослідження морфофункціонального стану біомембран еритроцитів за показниками їх флуоресцентного зондування (ФЗ) за допомогою універсального — 1-анілінонафталін-8-сульфонат (1,8-АНС) і гідрофобного — N-феніл-1-нафтиламін (1-ФНА) зондів, а також показниками їх фосфоліпідної компоненти, морфологічними дослідженнями печінки і виживаністю щурів. Вивчення впливу БАР на виживаність проведено при кількох режимах в/о введення нікогерму і гермаміду у трьох дозах (1/10, 1/20, 1/40 ЛД50): профілактичному (за 7 діб до введення ССl4 та галактозаміну), лікувальному (протягом 7 діб після введення токсикантів) і профілактично-лікувальному (за 7 днів до і протягом 7 днів після введення гепатотоксинів). У подальшому всі дослідження гепатопротекторної актив-ності БАР проведені на тлі галактозамінового гепатиту при їх профілак-тично-лікувальному в/о введенні дозами 1/20 ЛД50. Як референс-препарат викори-с-товувався гептрал виробництва "Abbott SpA" (Італія), який вводили в/о дозою 10 мг/кг маси.

З метою порівняльного вивчення ефективності компоненти синтезу нових БАР уводили в еквімолярній кількості відповідно до молекулярної ваги сполуки: нікотинову кислоту (1 % розчин для ін’єкцій в ампулах по 1 мл, ЗАТ «Фармацевтична фірма “Дарниця”», Україна) дозою 7 мг/кг; нікотинамід (1 % розчин для ін’єкцій в ампулах по 1 мл, ЗАТ «Биохимик», Росія) дозою 11 мг/кг; маг-ній (20 % розчин для ін’єкцій магнію сульфату в ампулах по 5 мл, ЗАТ «Фар-ма-цевтична фірма “Дарниця”», Україна) дозою 6 мг/кг; германій (1-гідро-гер-ман-тран, синтезований на кафедрі загальної хімії і полімерів ОНУ
ім. І. І. Меч-никова) дозою 9 мг/кг, ОЕДФ (2 % розчин етидронової кислоти,
фл. по 50 мл виробника «Мосхимфармпрепараты», Росія) дозою 9 мг/кг.

У сироватці крові та печінці визначалась активність маркерних ферментів: аланінамінотрансферази (АЛТ), аспартатамінотрансферази (АСТ), лужної фос-фатази (ЛФ), гамма-глутамілтрансферази (ГГТ) за допомогою наборів «Био-Ла-Тест» (PLIVA-Lachema Diagnostika, Чехія). Паралельно в еритроцитах і гомогенаті печінки визначали вміст продуктів ПОЛ — дієнових кон’югатів (ДК) за методом В. А. Костюка і співавт. (1984), малонового діальдегіду (МДА) за методом И. Д. Стальной, Т. Г. Гаришвили (1977); одночасно вивчалась активність ключових ферментів антирадикального зихисту (АРЗ) клітини — супероксиддисмутази (СОД) за методом О. П. Макаревича, П. П. Голикова (1983) і каталази Королюк М. А. и соавт., 1988, перекисна резистентність еритроцитів (ПРЕ) Бенисович В. И., Идельсон Л. И., 1973, сумарна пероксидазна активність плазми крові (СПА) Микаэлян Э. М. и соавт., 1984, вміст альфа-токоферолу за методом Р. Ш. Киселевича, С. И. Скварко (1972) у модифікації Н. К. Рудакової-Шиліної, Н. П. Матюхової (1982). Вміст загальних фос-фоліпідів (ФЛ) у ліпідних екстрактах, виділених з еритроцитів і тканини печінки, визначався методом Folch J. et al. (1957). Фракціонування ФЛ проводили методом одномірної висхідної тонкошарової хроматографії на пластинах Крылов В. И. и соавт., 1975. Вміст індивідуальних ФЛ — лізофосфатидилхоліну (ЛФХ), сфінгомієліну (СФМ), фосфатидилхоліну (ФХ), фосфатидилета-нол-аміну (ФЕА) і фосфатидилсерину (ФС) — оцінювали шляхом «згорання» вмісту окремих фосфоліпідних плям з наступним визначенням ліпідного фосфору Зубер В. Л., 1982. Також визначали вміст загального холестерину (ХС) методом В. В. Меньшикова (1987) і розраховували коефіцієнт співвідношення ХС/ФЛ.

Вміст БАР в органах і тканинах щурів був визначений раніше за описаною у нашій лабораторії методикою при їх одноразовому в/о введенні з розрахунку 37,5 мг германію на 1 кг маси Кресюн В. Й. і співавт., 2000; Відавська Г. Г., 2001. Розрахунок параметрів розподілу БАР проводили з використанням методів позамодельного аналізу Smith D. A. et al., 2000; Gueorguieva I. et al., 2004. Площі під фармакокінетичними концентраційними кривими розраховували за методами трапецій і статистичних моментів Соловьев В. Н. и соавт., 1980; Boroujerdi M., 2002. Для розрахунків констант елімінації термінальної ділянки концентраційної кривої і констант рівноваги використовували лінійний регресійний аналіз зважених величин Cornish-Bowden A., 2004. Вивчення особливостей процесів розподілу та виведення БАР проводилося з використанням розроблених нами методів позамодельного аналізу.

Морфологічні дослідження тканин виконували з використанням стандартних методів контролю Луппа Х., 1980. Для визначення ліпідів зрізи забарвлювали суданом III і нільським блакитним; гістохімічне виявлення PAS-позитивних речовин проводили за допомогою методу А. Л. Шабадаша (1949). Гістологічні препарати досліджували методом світлової мікроскопії на мікроскопі "Carl Zeiss Axiostar plus" (Німеччина). Отримані зображення аналізували за допомогою програмного забезпечення «ВидеоТесТ-Мастер Морфология» виробництва ООО «ВидеоТесТ» (Росія).

Усі отримані результати обробляли загальноприйнятими в медико-біологічних дослідженнях методами статистичного аналізу з використанням стандартних пакетів комп’ютерних програм Лапач С. Н. и соавт., 2002.

Результати дослідження. Вивчені фізико-хімічні властивості синтезованих БАР їх позитивно характеризують: усі сполуки без специфічного запаху, є негігроскопічними, стійкими до температури, добре розчинними у воді.

Дослідження гострої токсичності показало, що синтезовані БАР належать до класу малотоксичних речовин: при в/о введенні ЛД50 нікогерму становила 339,0 мг/кг, гермаміду — 560,5 мг/кг, гермакорду — 373,0 мг/кг. Результати вивчення токсичності при повторних введеннях, а також кумулятивних, місцевоподразнювальних й антигенних властивостей свідчать про нешкідливість син-тезованих похідних оксіетилідендифосфонатогерманатів.

Вивчення вазотропної активності синтезованих БАР. У дослідах in vitro на ізольованих препаратах грудного відділу аорти, які перебували у фазі скорочення в результаті аплікації розчину Кребса з підвищеним до 60 мМ/л вмістом іонів калію, встановлено, що вірогідний вазодилататорний ефект мав тільки гермакорд концентрацією 10-4 М/л (у середньому на 38,3±5,2 % від максимальної амплітуди гіперкалієвої контрактури). На препаратах з інтактним ендотелієм додавання до буферного розчину гермакорду концентрацією 10-5 М/л приводило до вірогідного зниження амплітуди скорочення — у середньому на 21,2±3,7 % від максимальної амплітуди скорочення, — спричиненого норадре-на-ліном. На тлі деендотелізації препаратів судин щурів вазодилататорний ефект гермакорду не реєструвався, що свідчить про його ендотелій-залежну при-роду. Важливо відзначити, що амплітуда спричиненого гермакордом розслаблення гладких м’язів була помітно більш виразною у м’язів, активованих хлористим калієм, ніж у судинних препаратів, активованих норадреналіном. Згідно зі ствердженням групи авторів Lehen’ky V. et al., 2002, цей факт свідчить про те, що потенціал-керовані кальцієві канали у плазматичній мембрані гладком’язових клітин судин більш чутливі до вазодилататорних сполук, які синтезуються ендотелієм, ніж рецептор-керовані кальцієві канали, пов’язані зі звільненням внутрішньоклітинного депонованого кальцію.

Для підтвердження одержаних результатів in vitro була проведена серія досліджень вазодилататорної дії БАР у гострому експерименті на нормотензивних наркотизованих кішках. Згідно з сучасними вимогами до антигіпертензивних засобів, перспективними є сполуки, які знижують АКТ на 25 мм рт. ст. Було встановлено, що одноразове в/о введення нікогерму і гермакорду дозами 1/10 ЛД50 через 3 год спостереження приводило до статистично вірогідного зменшення АКТ: у середньому САТ — на 26,4 %, ДАТ — на 29,7 %; причому і ні-ко-герм, і гермакорд спричиняли виразний вазодилататорний ефект. У зв’язку з цим, були проведені дослідження у хронічному експерименті. На моделі стійкої сольової АГ гермакорд виявився найефективнішою антигіпертензивною БАР: протягом 28 днів спостереження САТ практично не підвищувався (рис. 1).

Рис. 1. Вплив синтезованих БАР на систолічний артеріальний кров’яний тиск

на тлі моделі стійкої артеріальної гіпертензії

На рис. 1–3: * — вірогідність порівняно з контролем (Р<0,05).

Оцінка протиаритмічної активності синтезованих БАР in vitro дозволила зробити висновок про те, що тільки гермакорд концентраціями 10-6 і 10-5 М/л впливав на зміну максимально відтвореної частоти скорочення ізольованої смужки папілярного м’яза серця морської свинки. Наступною серією експериментів при низьких частотах стимуляції (коли одному імпульсу стимуляції відповідає одне повноцінне скорочення) було встановлено, що гермакорд дозозалежно подовжував фазу реполяризації (тривалість ф2). Найбільш стабільні зміни часу ф2 при зростанні частоти стимуляції були виявлені при концентрації гермакорду, яка дорівнює 10-6 М/л. Позитивно характеризувало цю сполуку і те, що вона практично не впливала на фазу деполяризації (тривалість ф1). Де-таль-не вивчення впливу гермакорду на процеси реполяризації за динамікою змін співвідношення А2/А1 підтвердило дані, одержані при низьких частотах стимуляції. При збільшенні частоти стимуляції інтактного міокарда перфузія ізольованої смужки папілярного м’яза розчином Тіроде з додаванням герма-кор-ду концентрацією 10_ М/л приводила до більш швидкого і більш виразного зменшення співвідношення А2/А1, що свідчило про вирівнювання амплітуди скорочення незавершеної фази реполяризації до завершеної (рис. 2).

З точки зору клініки, збільшення потенціалу дії, ефективного рефрактерного періоду без подовження періоду деполяризації — дуже важлива і цінна якість будь-якого протиаритмічного засобу. Це приводить до зменшення автоматизму, збудливості та провідності серцевої тканини і з успіхом може використовуватися для лікування хворих із аритміями, що спостерігаються як при по-рушенні утворення імпульсу (ектопічні ритми, переважно обумовлені механізмом повторного входу хвилі збудження (re-entry): екстрасистолії, миготлива аритмія, пароксизмальна тахікардія тощо), так і зміні провідності (різноманітні

Рис. 2. Зміни співвідношення А2/А1 при збільшенні частоти стимуляції папі-лярного м’яза морської свинки при перфузії розчином Тіроде з добавленням гермакорду в концентрації 10-6 М/л

блокади тощо) Грэхем-Смит Д. Г. и соавт., 2000; Катцунг Б., 2007. Це підтверджується і виявленою за допомогою реєстрації серії скорочень ворітної вени щурів властивістю гермакорду впливати на пейсмейкерну активність, що проявляється синхронізацією ритму вторинних водіїв із ритмом основної частоти і приводить до нормалізації ритму скорочень.

Результати експериментів in vitro корелювали з даними, отриманими при профілактичному та курсовому введенні БАР тваринам на тлі моделювання порушення серцевого ритму. На моделі аконітинової аритмії було встановлено, що оксіетилідендифосфонатогерманати, які застосовували як з профілактичною, так і лікувальною метою, сприяли відновленню серцевого ритму. Найбільш ефективну протиаритмічну дію мав гермакорд. На 14-ту добу спостереження у 2,5 рази, а на 28-му добу — у 5 разів зменшувалася кількість тварин з екстрасистолією та у 2–2,5 рази — із шлуночковою тахікардією. Найголовнішим, мабуть, було те, що середня тривалість шлуночкової тахікардії на 14-ту добу зменшувалася під впливом гермакорду вдвічі, а на 28-му добу — майже утричі, а фібриляції шлуночків взагалі не спостерігалося. При цьому його профілактичне введення було удвічі ефективнішим, ніж лікувальне. Необхідно наголосити, що на тлі сольової дієти введення даної сполуки вірогідно запобігало розвитку не тільки АГ, а й порушень ритму серця (екстрасистолії, шлуночкові тахікардії, фібриляції шлуночків), які спостерігались у щурів без лікування. При застосуванні гермакорду тривалість аритмій на 14-ту добу зменшувалась удвічі, а на 28-му — майже утричі, фібриляція шлуночків зовсім не наставала. Таким чином, тільки гермакорд мав виразну протиаритмічну й антигіпертензивну активність.

Ці дослідження стали передумовою до вивчення впливу гермакорду на метаболічні процеси у міокарді на тлі експериментальної міокардіодистрофії. Міокардіодистрофія є найбільш адекватною поставленим задачам дослідження моделлю, тому що навіть легкі форми цієї патології призводять до прихованих пошкоджень мембран мітохондрій Акопян В. П. и соавт., 1999. Було встановлено, що запропонована модель міокардіодистрофії на піку розвитку (7-ма доба) призводила до вірогідного зменшення на 25,6 % сумарного вмісту АН (рис. 3). Найбільш лабільним був вміст АТФ, кількість якого зменшувалася майже удвічі. Це виявлялося у дискоординації співвідношення різних фракцій, про що свідчить вірогідне зменшення коефіцієнта Аткінсона на 22,9 %. Повне відновлення показників порівняно з контролем відбувалося практично на 21-шу добу експерименту. Введення гермакорду як з профілактичною, так і лікувальною метою виявило однаково виразну ефективність (див. рис. 3).

Рис. 3. Динаміка змін нуклеотидного пулу в мітохондріях серця щурів на тлі експериментальної міокардіодистрофії та введення гермакорду

У першому випадку БАР запобігала зменшенню вмісту АН й утримувала на рівні контролю співвідношення фракцій. У другому — істотно скорочувала терміни відновлення пулу АН та окремих фракцій до контрольних величин: на 12-ту добу проти 21-ї доби при нелікованій міокардіодистрофії.

Виявлені зміни вмісту макроергічних фосфатів при нелікованій міокардіодистрофії та позитивного впливу на ці показники гермакорду потребують, по-перше, з’ясування причини, через яку відбувається зменшення аденілового пулу; по-друге, дають підставу для подальшого поглибленого вивчення впливу цієї БАР на ті процеси у мітохондріях, які детермінують синтез АН, а саме: тканинне дихання, окиснювальне фосфорилювання та їхнє спряження. Експерименти показали, що при нелікованій міокардіодистрофії спостерігається виразне роз’єднання цих процесів, особливо на 7-му добу, коли Р зменшилося майже удвічі, а О — на 25 %, що призвело до зменшення співвідношення Р:О на 30,4 % (Р<0,05); водночас зменшувався вміст АН. Гермакорд, введений з профілактичною метою, запобігав розвитку міокардіодистрофії, тобто Р, О та Р:О вірогідно не змінювалися протягом усього експерименту, а при його введенні з лікувальною метою усі досліджувані показники поверталися до контрольних величин на 12-ту добу.

Міокардіодистрофія також призводила на 7-му добу до пригнічення активності загальної та Mg2+-залежної АТФ-ази мітохондрій серцевого м’яза (відносно контролю відповідно на 21,9 та 31,8 %, Р<0,05). Активність Na+, K+-АТФ-ази (на 14,6 %, Р>0,05) тільки виявляла тенденцію до підвищення. Як наслідок, на 40,5 % (Р<0,05) зменшувався коефіцієнт їх співвідношення. Скоріше за все, ці зміни мають адаптивний характер й спрямовані на економну витрату енергетичних фосфатів, потреба в яких істотно зростає при міокардіодистрофії. Підвищення активності Na+, K+-АТФ-ази свідчить про пошкодження мембрани, тобто послаблення зв’язку ферменту з її фосфоліпідною компонентою. Довільне ж відновлення показників до рівня контролю відбувалося тільки на 21-шу добу. Гермакорд істотно впливав на активність АТФ-аз мітохондрій серця. При його профілактичному застосуванні активність ферментів протягом усього періоду розвитку патологічного процесу практично не змінювалася. Його введення з лікувальною метою відновлювало активність ферментів і коефіцієнт їх співвідношення до величин контролю вже на 12-ту добу, тобто утричі швидше порівняно з довільним відновленням. Таким чином, проведені дослідження свідчать про те, що поряд з антигіпертензивною і протиаритмічною активністю гермакорд має виразний кардіопротекторний ефект.

Враховуючи універсальність механізмів пошкодження біологічних мембран при різних патологічних станах, наступним етапом роботи стало дослідження мембранопротекторної активності синтезованих БАР на тлі токсичних уражень печінки з метою більш поглибленого вивчення механізмів дії оксіетилідендифосфонатогерманатів і виявлення в їх ряду найбільш ефективних гепатозахисних речовин. Для цього здійснено вибір найбільш адекватної щодо ме-ти та задач дослідження експериментальної моделі пошкодження біомем-бран. Верифікація моделей токсичного ураження печінки — чотирихлористого та галактозамінового — за допомогою ФЗ мембран еритроцитів виявила, що ос-новними патогенетичними ланками цих пошкоджень є зміна «плинності» лі-під-ного матриксу в бік збільшення його «жорсткості». В експериментах із введен-ням ФЗ АНС встановлено, що при обох гепатитах істотно погіршується мор-фо-функціональний стан поверхневих шарів мембран еритроцитів. Крім цього, якщо при ССl4-гепатиті вже на 1-шу добу інтегральний показник — інтенсивність сумарної флуоресценції (Fmol) — зменшувався у 10 разів, то при галактозаміновому — удвічі. З часом ці зміни зростали, і при ССl4-гепатиті на 7-му добу Fmol зменшилася більш ніж у 20 разів, а при галактозаміновому — усього на 24,6 %. На 12-ту добу Fmol при галактозаміновому гепатиті не відрізнялася від контролю, а після введення ССl4 була майже у 2,5 рази меншою, ніж у контролі. Внаслідок цих змін у поверхневих шарах мембран істотно збільшилися константи зв’язування зонда (Кс), кількість центрів зв’язування (N) та зменшилася константа дисоціації ФЗ (Кd) як показники зворотної Кс. Ці зрушення за вираз-ністю та часовими проявами повністю збігалися зі змінами молярної флуоресценції (Fmol) і майже удвічі були більш виразними при ССl4-гепатиті, ніж при галактозаміновому. Таким чином, ССl4 спричиняв більш ре-активні і суттєві негативні зміни морфофункціонального стану мембран, ніж галактозамін. Це також підтвердили дослідження змін фосфоліпідної компонен-ти мембран еритроцитів і морфогістохімічне вивчення тканини печінки. Тому для подальшого вивчення гепатозахисної дії синтезованих БАР обрана галактоз-амінова модель токсичного ураження печінки, що за клінічним перебігом, його тяжкістю та біохімічними, морфофункціональними і патоморфологічними змінами найбільше наближається до безсимптомно перебігаючих гострих і хро-нічних гепатитів, які роблять вагомий внесок у процес прогресування захворювань печінки Ногаллер А. М., 2000; Kuntz E. et al., 2002; Радченко В. Г., 2005.

З метою скринінгу гепатозахисної дії синтезованих БАР було проведено се-рію експериментів з вивчення впливу двох сполук — нікогерму і гермаміду — дозами 1/10, 1/20 і 1/40 ЛД50 на виживаність щурів як при галактозаміновому, так і чотирихлористому гепатитах. Виявлено, що введення БАР збільшувало виживаність тварин залежно від типу гепатотоксину, умов введення сполук і дозового режиму. Найбільш ефективним було введення БАР дозами 1/20 ЛД50 за 7 діб до застосування токсикантів із наступним 7-денним введенням, тобто профілактично-лікувальним способом.

Вивчення впливу синтезованих сполук на процеси цитолізу і холестазу при галактозаміновому гепатиті, які є основними детермінуючими чинниками хронізації процесу та фіброзоутворення, виявило, що всі БАР ефективно запобігали змінам активності маркерних ферментів печінки. Найефективнішим виявився нікогерм: активність АЛТ і АСТ у печінці залишалася незмінною навіть на 1-шу добу після введення токсиканту; у сироватці крові активність АСТ нормалізувалася на 2-гу добу, а АЛТ — на 3-тю. При введенні нікогерму активність ГГТ у сироватці крові та печінці відновлювалася на 2-гу добу розвитку гепатиту. При цьому не спостерігалось її катастрофічного підвищення на 1-шу добу, як при нелікованому гепатиті (у 4–5 разів). Введення нікогерму запобігало змінам активності ЛФ у печінці навіть на 1-шу добу розвитку гепатиту. У сироватці крові вона дещо була підвищеною (у 1,4 разу), проте на 5-ту добу досягала контрольних величин. Інші синтезовані БАР і референс-препарат гептрал також виявили виразну ефективність на тлі галактозамінового гепатиту, однак за силою дії поступалися нікогерму.

Необхідно наголосити, що вищевикладені дані свідчать про те, що у гепатопротекторному впливі синтезованих сполук біоліганди НК, НА та магній не відіграють вирішальної ролі; скоріше ця активність пов’язана з наявністю у молекулі цих БАР елемента германію, особливо дифосфонатів, або з дією цілої молекули. Для з’ясування цього моменту було проведено серію експериментів з порівняльного вивчення гепатозахисної активності складових компонентів синтезованих БАР на тлі галактозамінового гепатиту. Дослідження фармакологічної активності НК, НА та магнію, у відповідних еквімолярних до структури синтезованих сполук дозах, свідчило, що самі біоліганди практично не впливали на глибину змін і терміни відновлення активності ферментів цитолізу та холестазу при токсичному гепатиті. Проте простежувалася тенденція до покращання цих